Name: Naczyniowy transfer genów z metalowych powierzchni stentów przy użyciu wektorów adenowirusowych połączonych przez hydrolizowalne środki sieciujące (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: Poznaj metodę implantacji stentu uwalniającego geny w tętnicy szyjnej wspólnej szczura, oceniającą ekspresję transgenu lucyferazy. Technika obejmuje angioplastykę z użyciem cewnika Fogarty oraz bioluminescencyjne obrazowanie naczyń.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych do ujawnienia.

<ol><li>Boeckle, S., Wagner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+targeted+gene+delivery%3A+chemical+modification+of+viral+vectors+and+synthesis+of+artificial+virus+vector+systems%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+J%22%5BJournal%5D)">Optimizing targeted gene delivery: chemical modification of viral vectors and synthesis of artificial virus vector systems.</a> AAPS J. 8, E731-E742 (2006).</li>
<li>Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+targeted+viral+vectors+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Engineering targeted viral vectors for gene therapy.</a> Nat Rev Genet. 8, 573-587 (2007).</li>
<li>Campos, S. K., Barry, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+advances+and+future+challenges+in+Adenoviral+vector+biology+and+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Current advances and future challenges in Adenoviral vector biology and targeting.</a> Curr Gene Ther. 7, 189-204 (2007).</li>
<li>Bangari, D. S., Mittal, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+strategies+and+future+directions+for+eluding+adenoviral+vector+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Current strategies and future directions for eluding adenoviral vector immunity.</a> Curr Gene Ther. 6, 215-226 (2006).</li>
<li>Barry, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+delivery+of+therapeutic+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Systemic delivery of therapeutic viruses.</a> Curr Opin Mol Ther. 11, 411-420 (2009).</li>
<li>De Laporte, L., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrices+and+scaffolds+for+DNA+delivery+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Matrices and scaffolds for DNA delivery in tissue engineering.</a> Adv Drug Deliv Rev. 59, 292-307 (2007).</li>
<li>Gustafson, J. A., Price, R. A., Greish, K., Cappello, J., Ghandehari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silk-elastin-like+hydrogel+improves+the+safety+of+adenovirus-mediated+gene-directed+enzyme-prodrug+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">Silk-elastin-like hydrogel improves the safety of adenovirus-mediated gene-directed enzyme-prodrug therapy.</a> Mol Pharm. 7, 1050-1056 (2010).</li>
<li>Kidd, M. E., Shin, S., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+hydrogels+for+lentiviral+gene+delivery+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Fibrin hydrogels for lentiviral gene delivery in vitro and in vivo.</a> J Control Release. 157, 80-85 (2012).</li>
<li>Lei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+active+DNA%2Fcationic+polymer+polyplexes+into+hydrogel+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Incorporation of active DNA/cationic polymer polyplexes into hydrogel scaffolds.</a> Biomaterials. 31, 9106-9116 (2010).</li>
<li>Lei, Y., Rahim, M., Ng, Q., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronic+acid+and+fibrin+hydrogels+with+concentrated+DNA%2FPEI+polyplexes+for+local+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Hyaluronic acid and fibrin hydrogels with concentrated DNA/PEI polyplexes for local gene delivery.</a> J Control Release. 153, 255-261 (2011).</li>
<li>Jang, J. H., Schaffer, D. V., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+biomaterial+systems+to+enhance+viral+vector+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Engineering biomaterial systems to enhance viral vector gene delivery.</a> Mol Ther. 19, 1407-1415 (2011).</li>
<li>Salvay, D. M., Zelivyanskaya, M., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+by+surface+immobilization+of+plasmid+to+tissue-engineering+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene delivery by surface immobilization of plasmid to tissue-engineering scaffolds.</a> Gene Ther. 17, 1134-1141 (2010).</li>
<li>Moss, A. J., Hamburger, S., Moore, R. M., Jeng, L. L., Vol Howie, L. J. Advance Data. 191, National Center for Health Statistics Vital and Health Statistics. (1991).</li>
<li>Gristina, A. G., Naylor, P., Myrvik, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infections+from+biomaterials+and+implants%3A+a+race+for+the+surface%29%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Prog+Technol%22%5BJournal%5D)">Infections from biomaterials and implants: a race for the surface).</a> Med Prog Technol. 14, 205-224 (1988).</li>
<li>Santerre, J. P., Woodhouse, K., Laroche, G., Labow, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+biodegradation+of+polyurethanes%3A+from+classical+implants+to+tissue+engineering+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Understanding the biodegradation of polyurethanes: from classical implants to tissue engineering materials.</a> Biomaterials. 26, 7457-7470 (2005).</li>
<li>Tang, L., Eaton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+responses+to+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Inflammatory responses to biomaterials.</a> Am J Clin Pathol. 103, 466-471 (1995).</li>
<li>Zimmerli, W., Sendi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+implant-associated+infection%3A+the+role+of+the+host%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of implant-associated infection: the role of the host.</a> Semin Immunopathol. 33, 295-306 (2011).</li>
<li>Fishbein, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphosphonate-mediated+gene+vector+delivery+from+the+metal+surfaces+of+stents%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 159-164 (2006).</li>
<li>Levy, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+adenovirus+gene+delivery+using+antiviral+IgG+complexation%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Localized adenovirus gene delivery using antiviral IgG complexation.</a> Gene Ther. 8, 659-667 (2001).</li>
<li>Ma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anchoring+of+self-assembled+plasmid+DNA%2Fanti-DNA+antibody%2Fcationic+lipid+micelles+on+bisphosphonate-modified+stent+for+cardiovascular+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Anchoring of self-assembled plasmid DNA/anti-DNA antibody/cationic lipid micelles on bisphosphonate-modified stent for cardiovascular gene delivery.</a> Int J Nanomedicine. 8, 1029-1035 (2013).</li>
<li>Hu, W. W., Lang, M. W., Krebsbach, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+adenovirus+immobilization+strategies+for+in+situ+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Development of adenovirus immobilization strategies for in situ gene therapy.</a> J Gene Med. 10, 1102-1112 (2008).</li>
<li>Jang, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+immobilization+of+hexa-histidine-tagged+adeno-associated+viral+vectors+for+localized+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Surface immobilization of hexa-histidine-tagged adeno-associated viral vectors for localized gene delivery.</a> Gene Ther. 17, 1384-1389 (2010).</li>
<li>Bengali, Z., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Delivery+by+Immobilization+to+Cell-Adhesive+Substrates%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Bull%22%5BJournal%5D)">Gene Delivery by Immobilization to Cell-Adhesive Substrates.</a> MRS Bull. 30, 659-662 (2005).</li>
<li>Holmes, C. A., Tabrizian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate-mediated+gene+delivery+from+glycol-chitosan%2Fhyaluronic+acid+polyelectrolyte+multilayer+films%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Substrate-mediated gene delivery from glycol-chitosan/hyaluronic acid polyelectrolyte multilayer films.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 5, 524-531 (2013).</li>
<li>Pannier, A. K., Wieland, J. A., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+polyethylene+glycol+enhances+substrate-mediated+gene+delivery+by+nonspecifically+immobilized+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Surface polyethylene glycol enhances substrate-mediated gene delivery by nonspecifically immobilized complexes.</a> Acta Biomater. 4, 26-39 (2008).</li>
<li>Wang, C. H., Pun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate-mediated+nucleic+acid+delivery+from+self-assembled+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Substrate-mediated nucleic acid delivery from self-assembled monolayers.</a> Trends Biotechnol. 29, 119-126 (2011).</li>
<li>Fishbein, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+delivery+of+gene+vectors+from+bare-metal+stents+by+use+of+a+biodegradable+synthetic+complex+inhibits+in-stent+restenosis+in+rat+carotid+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries.</a> Circulation. 117, 2096-2103 (2008).</li>
<li>Fishbein, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+vector+tethering+to+metal+surfaces+via+hydrolyzable+cross-linkers+for+the+modulation+of+vector+release+and+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Adenoviral vector tethering to metal surfaces via hydrolyzable cross-linkers for the modulation of vector release and transduction.</a> Biomaterials. 34, 6938-6948 (2013).</li>
<li>Mittereder, N., March, K. L., Trapnell, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+concentration+and+bioactivity+of+adenovirus+vectors+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the concentration and bioactivity of adenovirus vectors for gene therapy.</a> J. Virol. 70, 7498-7509 (1996).</li>
<li>Forbes, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+NO+and+ROS+production+by+AdiNOS+transduced+vascular+cells+through+supplementation+with+L-Arg+and+BH4%3A+Implications+for+gene+therapy+of+restenosis%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Modulation of NO and ROS production by AdiNOS transduced vascular cells through supplementation with L-Arg and BH4: Implications for gene therapy of restenosis.</a> Atherosclerosis. 230, 23-32 (2013).</li>
<li>Niinomi, M., Nakai, M., Hieda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+new+metallic+alloys+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Development of new metallic alloys for biomedical applications.</a> Acta Biomater. 8, 3888-3903 (2012).</li>
<li>Brito, L. A., Chandrasekhar, S., Little, S. R., Amiji, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-viral+eNOS+gene+delivery+and+transfection+with+stents+for+the+treatment+of+restenosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Online%22%5BJournal%5D)">Non-viral eNOS gene delivery and transfection with stents for the treatment of restenosis.</a> Biomed Eng Online. 9, 56(2010).</li>
<li>Egashira, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+delivery+of+anti-monocyte+chemoattractant+protein-1+by+gene-eluting+stents+attenuates+in-stent+stenosis+in+rabbits+and+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Local delivery of anti-monocyte chemoattractant protein-1 by gene-eluting stents attenuates in-stent stenosis in rabbits and monkeys.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27, 2563-2568 (2007).</li>
<li>Ohtani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stent-based+local+delivery+of+nuclear+factor-kappaB+decoy+attenuates+in-stent+restenosis+in+hypercholesterolemic+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Stent-based local delivery of nuclear factor-kappaB decoy attenuates in-stent restenosis in hypercholesterolemic rabbits.</a> Circulation. 114, 2773-2779 (2006).</li>
</ol>

Opracowanie protokołu i badania przedstawione w tym artykule były częściowo wspierane przez granty American Heart Association Scientist Development (IF. 0735110N i MC 10SDG4020003), grant amerykańskiego National Heart, Lung, and Blood Institute HL 72108 (R.J.L.) oraz U.S. National Heart, Lung, and Blood Institute T32 007915 (S.P.F.). Cewniki do angioplastyki zostały podarowane przez NuMED (Hopkinton, NY). Autorzy pragną podziękować za pomoc sekretarską Pani Susan Kerns.

Przedstawiony protokół opisuje operacyjną metodę dostarczania genów za pośrednictwem substratu, osiąganą poprzez odwracalne przyłączanie wektorów adenowirusowych do bezpowłokowych powierzchni ze stali nierdzewnej. Chociaż technika ta została opracowana w konkretnym celu terapii genowej restenozy naczyniowej opartej na stentach, ma znacznie szersze zastosowanie w dziedzinie biomateriałów, implantów biomedycznych i terapii genowej.
Chociaż w prezentowanych badaniach wykorzystano wyłącznie stal n...

Skuteczność terapii genowej jako metody terapeutycznej jest utrudniona przez słabą zdolność wektorów terapii genowejdo kierowania 1,2. Brak odpowiedniego ukierunkowania skutkuje subterapeutycznymi poziomami ekspresji transgenu w miejscu docelowym i prowadzi do szerokiego rozprzestrzeniania się wektorów do narządów niedocelowych3, w tym tych odpowiedzialnych za narastanie odpowiedzi immunologicznej zarówno przeciwko wektorowi, jak i kodowanemu produktowi terapeutycznemu4,5. Jednym z potencjalnych sposobów zrównoważenia rozwiązłości transdukcji i promowania celowania jest wprowadzenie wektorów genowych w pożądane miejsce w formie, która uniemożliwia ich swobodne rozprzestrzenianie się przez krew i limfę. Zazwyczaj takie wysiłki opierają się na miejscowo wstrzykiwanych systemach dostarczania składających się z wektorów wirusowych lub niewirusowych zmieszanych z fibryną, kolagenem lub hydrożelowymi matrycami hydrożelowymi kwasu hialuronowego6-10, które są zdolne do przejściowego podtrzymywania wektorów genowych w miejscu wstrzyknięcia poprzez fizyczne uwięzienie ich w sieci polimerowej.
Innym ogólnie przyjętym paradygmatem dla miejscowej terapii genowej jest immobilizacja wektorów genowych na powierzchni wszczepionych protez11,12. Stałe implanty medyczne (stenty wewnątrznaczyniowe, oskrzelowe, urologiczne i żołądkowo-jelitowe, rozruszniki serca, sztuczne stawy, siatki chirurgiczne i ginekologiczne itp.) są stosowane rocznie u dziesiątek milionówpacjentów13. Chociaż ogólnie skuteczne, urządzenia te są podatne na powikłania, które nie są odpowiednio kontrolowane przez obecne praktyki medyczne14-17. Wszczepialne urządzenia protetyczne stanowią wyjątkową okazję, aby służyć jako platformy zastępcze dla leczenia zlokalizowaną terapią genową. Z farmakokinetycznego punktu widzenia derywatyzacja powierzchniowa implantów medycznych przy stosunkowo niskich dawkach wejściowych wektorów genowych skutkuje zarówno osiągnięciem wysokich lokalnych stężeń wektorów genowych na granicy implant/tkanka, jak i spowolnieniem kinetyki ich eliminacji z tego miejsca. W wyniku przedłużającego się pobytu i zwiększonego wychwytu przez docelową populację komórek, unieruchomienie wektora minimalizuje rozprzestrzenianie się wektora genowego. W ten sposób zmniejsza się niezamierzone inokulowanie tkanek niebędących przedmiotem zwalczania.
Powierzchniowe wiązanie wektorów genów na wszczepialnych biomateriałach (określane również jako dostarczanie genów za pośrednictwem substratu lub dostarczanie genów w fazie stałej) zostało wdrożone w hodowlach komórkowych i eksperymentach na zwierzętach przy użyciu zarówno specyficznych (antygen-przeciwciało18-20, awidyna-biotyna21,22), jak i niespecyficznychinterakcji 23-26 (ładunek, van der Waals). Kowalencyjne przyczepianie wektorów do powierzchni wszczepionego urządzenia było wcześniej uważane za niefunkcjonalne, ponieważ zbyt silne wiązania z powierzchnią uniemożliwiają internalizację wektora przez komórki docelowe. Niedawno wykazano, że ograniczenie to można przezwyciężyć poprzez zastosowanie spontanicznie hydrolizowalnego środka sieciującego stosowanego jako ogniwa łączące zmodyfikowaną metaliczną powierzchnię stentu i białek kapsydu wektora adenowirusowego27,28. Co więcej, szybkość uwalniania wektora i przebieg w czasie ekspresji transgenu in vitro i in vivo można modulować za pomocą hydrolizowalnych środków sieciujących wykazujących różną kinetykę hydrolizy28.
Niniejszy artykuł dostarcza szczegółowego protokołu odwracalnego kowalencyjnego przyłączania wektorów adenowirusowych do aktywowanej powierzchni metalu i wprowadza użyteczny zestaw eksperymentalny do badania następujących po sobie zdarzeń transdukcji in vitro w hodowanych komórkach mięśni gładkich i śródbłonka oraz in vivo w modelu angioplastyki stentowej szczura na tętnicy szyjnej.

<table><tbody><tr><td>Dyski siatkowe ze stali nierdzewnej 316</td><td>Electon Microscopy Sciences</td><td>E200-SS</td><td></td></tr><tr><td>Ogólne stenty ze stali nierdzewnej klasy 304</td><td>Laserage</td><td>na zamówienie</td><td></td>niestandardowe</tr><tr><td>AdeGFP</td><td>University of Pennsylvania Vector Core</td><td>AD-5-PV0504</td><td></td></tr><tr><td>AdLuc</td><td>University of Pennsylvania Vector Core</td><td>AD-5-PV1028</td><td></td></tr><tr><td>AdEMPTY</td><td>University of Pennsylvania Vector Core</td><td>A858</td><td></td></tr><tr><td>Cy3(NHS)2</td><td>GE Healthcare</td><td>PA23000</td><td></td></tr><tr><td>Sepharose 6B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6B100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>UV 96-dołkowe płytki</td><td>Costar</td><td>3635</td><td></td></tr><tr><td>Fluorometria 96-dołkowe płytki</td><td>Costar</td><td>3915</td><td></td></tr><tr><td>Hodowla komórkowa 96-dołkowe płytki</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP)</td><td>Pierce Thermo Scientific</td><td>20490</td><td></td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>Pierce Thermo Scientific</td><td>20290</td><td></td></tr><tr><td>sulfo-LC-SPDP</td> Spektrofotometr <td>Pierce Thermo Scientific</td><td>21650</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Urządzenia molekularne&nbsp;</td><td>SpectraMax 190</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofluorometr</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>SpectraMax Gemini EM</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator z wytrząsarką orbitalną</td><td>VWR</td><td>1575R</td><td></td></tr><tr><td>Piec z poziomym przepływem powietrza</td><td>Wirówka Shel Lab</td><td>1350 FM</td><td></td></tr><tr><td>Centra-CL2&nbsp;</td><td>Międzynarodowa firma sprzętowa</td><td>426</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowy mieszalnik wirowy</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>02-215-370</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny Eclipse TE300</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>Kamera CCD TE300</td><td></td></tr><tr><td>DC 500 System PCR</td> w czasie rzeczywistym <td>Leica</td><td>DC-500</td><td></td></tr><tr><td>7500</td><td>Applied Biosystems</td><td>niedostępne</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Stacja bioluminescencyjna</td><td>Spectrum Perkins-Elmer</td><td>niedostępna</td><td></td></tr><tr><td>Sól dipotasowa EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED2P</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca frakcja albuminy V (BSA)</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Linia komórkowa A10&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL-1476</td><td></td></tr><tr><td>Komórki śródbłonka aorty bydlęcej</td><td>Lonza</td><td>BW-6002</td><td></td></tr><tr><td>Lucyferyna, sól potasowa</td><td>Złoto</td><td>Biotechnologia LUCK-1Ge</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443-250G</td><td></td></tr><tr><td>PBS bez wapnia i magnezu</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny/streptomycyny</td><td>Gibco</td><td>11540-122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, wysoka glukoza</td><td>Corning cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsyna/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA micro kit</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td></td></tr><tr><td>Power Sybr Green PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Opyczna 96-dołkowa płytka reakcyjna</td><td>Applied Biosystems</td><td>N8010560</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optyczna folia samoprzylepna</td><td>Applied Biosystems</td><td>4360954</td><td></td></tr><tr><td>Cephazolin&nbsp;</td><td>Apotex</td><td>niedostępny</td><td></td></tr><tr><td>Loxicom (Meloksykam)</td><td>Norbrook</td><td>niedostępny</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna sodowa</td><td>APP Farmaceutyki</td><td>niedostępne</td><td></td></tr><tr><td>Ketavet (Ketamina)</td><td>VEDCO</td><td>niedostępne</td><td></td></tr><tr><td>Anased (Ksylazyna)&nbsp;</td><td>Lloid</td><td>niedostępny</td><td></td></tr><tr><td>Foran (Isoflurane)&nbsp;</td><td>Baxter</td><td>niedostępny</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywione kleszczyki do tęczówki Moria</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej</td><td>11370-31</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywione, bardzo cienkie kleszcze Graefe</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5</td><td>Narzędzia do nauki o nauce</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Vannas</td><td>Narzędzia do nauki o naprawie</td> plastycznej <td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>Precyzyjne nożyczki - ToughCut</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td>Fine Science Tools</td><td>14101-14</td><td></td></tr><tr><td>Szew Vicryl (5-0)</td><td>Ethicon</td><td>J385</td><td></td></tr><tr><td>Nić do szwów (jedwab 4/0)&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-40</td><td></td></tr><tr><td>Klipsy do szwów Michel</td><td>Fine Science Tools</td><td>12040-02</td><td></td></tr><tr><td>Rozszerzacz ran (wziernik oka Lancaster)</td><td>KLS Martin</td><td>34-149-07</td><td></td></tr><tr><td>Sterylizator gorących kulek</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Aplikator do spinek do szwów Michel</td><td>Fine Science Tools</td><td>112028-12</td><td></td></tr><tr><td>Insyte Autoguard 24 G IV cewnik</td><td>Beckton-Dickinson</td><td>381412</td><td></td></tr><tr><td>2F Cewnik Fogarty</td><td>Edwards Lifesciences</td><td>120602F</td><td></td></tr><tr><td>Rurka teflonowa</td><td>Vention</td><td>041100BST</td><td></td></tr><tr><td>Cewnik PTA</td><td>NuMed</td><td>na zamówienie</td><td></td></tr><tr><td>Gaziki</td><td>Kendall Healthcare</td><td>9024</td><td></td></tr><tr><td>Aplikatory bawełniane</td><td>Solon Manufacturing</td><td>WOD1003</td><td></td></tr> Strzykawka <tr><td></td><td>Saline Baxter</td><td>281321</td><td></td></tr><tr><td>10 ml (Luer-Lok)</td>Strzykawka <td>Beckton-Dickinson</td><td>309604</td><td></td></tr> 1 <tr><td>ml (Luer-Lok)</td>Maszynki do strzyżenia <td>309628</td><td></td> <td>Beckton-Dickinson</td></tr><tr><td>z ostrzem #40</td><td>Oster&nbsp;</td><td>78005-314</td><td></td></tr><tr><td>Taśma chirurgiczna Transpore</td><td>3M</td><td>MM 15271</td><td></td></tr><tr><td>Maść weterynaryjna Puralube</td><td>Pharmaderm</td><td>niedostępna</td><td></td></tr></tbody></table>

naczyniowy transfer genów z metalowych powierzchni stentów przy użyciu wektorów adenowirusowych połączonych przez hydrolizowalne środki sieciujące

Vascular Gene Transfer from Metallic Stent Surfaces Using Adenoviral Vectors Tethered through Hydrolysable Cross-linkers

Restenoza w stencie stanowi poważne komplikacje procedur rewaskularyzacji opartych na stentach, szeroko stosowanych do przywrócenia przepływu krwi przez krytycznie zwężone segmenty tętnic wieńcowych i obwodowych. Stenty wewnątrznaczyniowe zdolne do przestrajalnego uwalniania genów o działaniu przeciwrestenotycznym mogą stanowić strategię alternatywną dla obecnie stosowanych stentów uwalniających leki. Aby osiągnąć translację kliniczną, stenty uwalniające geny muszą wykazywać przewidywalną kinetykę uwalniania wektora genowego unieruchomionego przez stent i specyficznej dla miejsca transdukcji naczyń krwionośnych, unikając jednocześnie nadmiernej reakcji zapalnej zwykle związanej z powłokami polimerowymi stosowanymi do fizycznego uwięzienia wektora. W artykule opisano szczegółową metodologię bezpłaszczowego wiązania wektorów genów adenowirusa ze stentami w oparciu o odwracalne wiązanie cząstek adenowirusa z powierzchnią stali nierdzewnej modyfikowaną polialliloaminą bisfosfonianem (PABT) za pomocą hydrolizowalnych środków sieciujących (HC). Do połączenia wektora ze stentem wykorzystano rodzinę dwufunkcyjnych (reaktywnych amino i tiolowo) HC o średnim t1/2 hydrolizy estrów w łańcuchu w zakresie od 5 do 50 dni. Procedura immobilizacji wektora jest zwykle przeprowadzana w ciągu 9 godzin i składa się z kilku etapów: 1) inkubacja próbek metalu w wodnym roztworze PABT (4 godziny); 2) deprotekcja grup tiolowych zainstalowanych w PABT tris(2-karboksyetylo)fosfiną (20 min); 3) zwiększenie zdolności reaktywnej tiolu powierzchni metalu poprzez reakcję próbek z polietylenoiminą derywatyzowaną grupami pirydylodititowymi (PDT) (2 godz.); 4) konwersja grup PDT do tioli z ditiotreitolem (10 min); 5) modyfikacja adenowirusów za pomocą HC (1 godz.); 6) oczyszczanie zmodyfikowanych cząstek adenowirusowych metodą chromatografii kolumnowej z wyłączeniem wielkości (15 min) oraz 7) immobilizacja tiolowo-reaktywnych cząstek adenowirusa na powierzchni tiolowanej stali (1 godz.). Technika ta ma szeroki potencjał zastosowania poza stentami, ułatwiając inżynierię powierzchni urządzeń bioprotetycznych w celu zwiększenia ich biokompatybilności poprzez dostarczanie genów za pośrednictwem substratu do komórek łączących się z wszczepionym materiałem obcym.

Eksperymenty dotyczące uwalniania wektora
Przytwierdzanie wektorów adenowirusowych do powierzchni implantów, w tym urządzeń interwencyjnych, takich jak stenty naczyniowe, pozwala na zbliżenie wektora do miejsca występowania choroby, co częściowo niweluje brak fizycznego ukierunkowania wektorów. Aby jednak uzyskać efekty terapeutyczne poprzez transdukcję tkanki docelowej, wektor musi zostać uwolniony z powierzchni (Rysunek 2). Postawiono hipotezę, że zastosowan...

Te badania donoszą o odwracalnym przyczepianiu wektorów genów adenowirusa do bezpowłokowych metalowych powierzchni stentów i modelowych dysków siatkowych. Przedłużone uwalnianie cząstek wirusa kompetentnych do transdukcji, uzależnione od hydrolizy środków sieciujących stosowanych do immobilizacji wektorów, skutkuje trwałą, specyficzną dla miejsca ekspresją transgenu w komórkach naczyniowych i stentowanych tętnicach.

Naczyniowy transfer genów z metalowych powierzchni stentów przy użyciu wektorów adenowirusowych połączonych przez hydrolizowalne środki sieciujące

In-stent restenosis presents a major complication of stent-based revascularization procedures widely used to re-establish blood flow through critically ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest implantacja stentu uwalniającego gen do tętnicy szyjnej wspólnej szczura laboratoryjnego oraz określenie zakresu i lokalizacji następującej ekspresji transgenu w czasie. W tym celu w gałęzi tętnicy szyjnej zewnętrznej wykonuje się arteriotomię, aby uzyskać dostęp naczyniowy do tętnicy szyjnej wspólnej. Przez tętnicę szyjną wspólną wprowadza się nadmuchany cewnik Fogarty'ego o rozmiarze 2 French, aby usunąć śródbłonek i uszkodzić warstwę środkową.Następnie stent uwalniający geny montuje się na cewniku do angioplastyki i wprowadza do środkowego segmentu wspólnej tętnicy szyjnej z uszkodzeniem wywołanym balonem, a na koniec go rozwija, aby określić ekspresję lucyferazy w tętnicy. Lucyferynę sformułowaną z żelem onic aplikuje się w obszarze okołonaczyniowym, a następnie wykonuje obrazowanie bioluminescencyjne. Ostatecznie można uzyskać wyniki pozwalające na porównanie różnych formulacji stentów uwalniających geny pod kątem zakresu i czasu trwania transdukcji tkanki naczyniowej.Zaletą zapobiegania natychmiastowej restenozie i zakrzepicy w stencie za pomocą terapii genowej jest to, że stanowi ona najbardziej bezpośredni sposób monitorowania ekspres

vascular-gene-transfer-from-metallic-stent-surfaces-using-adenoviral

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Przeniesienie genów naczyniowych z powierzchni metalowych stentów z wykorzystaniem wektorów adenowirusowych mocowanych za pomocą rozkładalnych środków łączących

Opisano metodę transferu genów w leczeniu niedokrwiennej niewydolności serca z wykorzystaniem modelu zawału mięśnia sercowego u świń. Nasza prosta i powtarzalna metoda pozwala na łatwą ocenę skuteczności różnych transferów genów w sposób bardzo prosty i odtwarzalny.

Transfer genów w przedklinicznym modelu niedokrwiennej niewydolności serca

Opisujemy metodę programowania komórek macierzystych do nadekspresji czynników terapeutycznych dla angiogenezy za pomocą biodegradowalnych nanocząsteczek polimerowych. Opisane procesy obejmują syntezę polimerów, transfekcję komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej in vitro oraz walidację skuteczności zaprogramowanych komórek macierzystych w promowaniu angiogenezy w mysim modelu niedokrwienia kończyn tylnych.

Programowanie komórek macierzystych do angiogenezy terapeutycznej z wykorzystaniem biodegradowalnych nanocząstek polimerowych

Przykład terapii genowej adenowirusa w ludzkich rogówkach z hodowlą narządów cukrzycowych jest przedstawiony w kierunku normalizacji opóźnionego gojenia się ran i znacznie zmniejszonej ekspresji markerów nabłonkowych komórek macierzystych w tych rogówkach. Opisano również optymalizację tego procesu w kulturach nabłonka rąbka włokanego wzbogaconych komórkami macierzystymi.

Adenowirusowa terapia genowa w keratopatii cukrzycowej: wpływ na gojenie się ran i ekspresję markerów komórek macierzystych w rogówkach i komórkach nabłonka rąbka ludzkiego hodowanych w narządach

Ta metoda polega na wprowadzeniu transgenu do śródbłonka tętnic szyjnych królika. Wprowadzenie transgenu pozwala na ocenę biologicznej roli produktu transgenu zarówno w normalnych tętnicach, jak i w modelach chorobowych. Metoda jest również przydatna do pomiaru aktywności sekwencji regulatorowych DNA.

In vivo (in vivo) Transfer genów do śródbłonka tętnicy szyjnej wspólnej królika

Ta metoda opisuje umieszczanie przeszczepów żył interpozycyjnych u królików, transdukcję przeszczepów i osiągnięcie trwałej ekspresji transgenu. Pozwala to na badanie fizjologicznych i patologicznych ról transgenów i ich produktów białkowych w przeszczepionych żyłach oraz testowanie terapii genowych w chorobach przeszczepów żył.

Króliczy model trwałej ekspresji transgenu w przeszczepach interpozycji żyły szyjnej do tętnicy szyjnej wspólnej

Ten protokół ma na celu opisanie izolacji hepatocytów świń i dostarczania genów ex vivo w celu leczenia modeli chorób metabolicznych poprzez autologiczny przeszczep komórek. Chociaż ten konkretny model cieszy się wyjątkowymi zaletami, które sprzyjają skutecznej terapii, aplikacja jest istotną podstawą do zajęcia się dodatkowymi chorobami i wskazaniami.

Terapia genowa hepatocytów ex vivo za pośrednictwem wektora lentiwirusowego do autologicznego przeszczepu u świń

Opisany tutaj protokół umożliwia badaczom specyficzne modyfikowanie kapsydów adenowirusa w wybranych miejscach za pomocą prostej chemii. Można generować osłonięte cząsteczki wektorów adenowirusa i ukierunkowane wektory transferu genów, a także badać interakcje wektora z gospodarzem.

Połączone genetyczne i chemiczne modyfikacje kapsydów wektorów transferu genów opartych na adenowirusie do ekranowania i celowania

Opisano metody generowania dużych ilości rekombinowanych adenowirusów, które następnie mogą być użyte do transdukcji rodzimego nabłonka dróg moczowych gryzoni, co pozwala na ekspresję transgenów lub regulację w dół produktów genów endogennych.

Ekspresja transgenów w natywnym nabłonku dróg moczowych pęcherza moczowego za pomocą transdukcji za pośrednictwem adenowirusa

Ten protokół opisuje, w jaki sposób dośledzionowa iniekcja małego RNA spinki do włosów dostarczanego przez AAV8 osiąga taką samą skuteczność knockdownu genu w wątrobie jak iniekcja do żyły wrotnej, co stanowi prostszą procedurę ze znacznie niższą śmiertelnością i powikłaniami okołooperacyjnymi i pooperacyjnymi.

Skuteczny knockdown genu w wątrobie poprzez wstrzyknięcie do śledziony małego RNA dostarczonego przez serotyp 8 (AAV8) wirusa związanego z adenowirusem

Tutaj przedstawiono protokół implantacji przeszczepu naczyniowego z wykorzystaniem inżynierii tkankowej do tętnicy szyjnej myszy za pomocą techniki mankietowej, dostarczając odpowiedniego modelu zwierzęcego do badania mechanizmów regeneracji tkanki naczyniowej.

Implantacja przeszczepu naczyniowego z wykorzystaniem inżynierii tkankowej w tętnicy szyjnej myszy za pomocą techniki mankietowej

Poznaj metodę implantacji stentu uwalniającego geny w tętnicy szyjnej wspólnej szczura, oceniającą ekspresję transgenu lucyferazy. Technika obejmuje angioplastykę z użyciem cewnika Fogarty oraz bioluminescencyjne obrazowanie naczyń.

Naczyniowy transfer genów z metalowych powierzchni stentów przy użyciu wektorów adenowirusowych połączonych przez hydrolizowalne środki sieciujące (Wideo) | JoVE Journal

Naczyniowy transfer genów z metalowych powierzchni stentów przy użyciu wektorów adenowirusowych połączonych przez hydrolizowalne środki sieciujące

Przeglądaj więcej filmów