Name: Rana kłuta dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego: metoda badania neurogenezy i regeneracji mózgu kręgowców (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-04T23:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Poznaj metodę rany kłutej w mózgu dorosłego danio pręgowanego do badania neurogenezy i regeneracji OUN. Protokół obejmuje indukcję urazu mechanicznnego, immunohistochemię oraz analizę markerów proliferacji komórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy N. Borel i jej zespołowi rybni, M. Rastegarowi za pomoc w mikroskopii oraz T. Dickmeisowi za komentarze do manuskryptu. Jesteśmy wdzięczni za wsparcie ze strony UE IP ZF-Health, FP7-HEALTH-2007-B2, NeuroXsys, Sieci Interreg ds. Biologii Syntetycznej w Dolinie Górnego Renu (NSB-Górny Ren) oraz sieci EraSysBio finansowanej przez BMBF.

Danio pręgowany były utrzymywane w obiekcie rybnym Instytutu Toksykologii i Genetyki (ITG) w Instytucie Technologii w Karlsruhe (KIT). Doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z niemieckimi standardami ochrony zwierząt i zostały zatwierdzone przez rząd Badenii-Wirtembergii, Regierungspräsidium Karlsruhe, Niemcy (Aktenzeichen 35-9185.81/G-272/12 "Adulte Neurogenese").
1. Generowanie rany kłutej w kresomózgowiu
<ol>
	<li>znieczulenie
	<ol>
		<li>Aby przygotować roztwór podstawowy trikainy (ester etylowy kwasu 3-aminobenzoesowego, zwany również 3-aminobenzoesanem etylu) należy użyć 400 mg trikainy w proszku i rozpuścić ją w 97,9 ml wody i 2,1 ml 1 M buforu Tris/HCl (pH 9). Dostosuj pH do 7. Przygotować 5 ml porcji i przechowywać je w temperaturze -20 °C do momentu użycia.</li>
		<li>Przenieś odpowiednią liczbę 0,5-1 rocznych danio pręgowanego z ich zbiorników do plastikowych klatek dla myszy. Uwaga: Czaszka dorosłego danio pręgowanego w wieku około 12 miesięcy jest nadal stosunkowo miękka i można ją łatwo przebić igłą (patrz sekcja 1.2.3 i ryc. 1A).</li>
		<li>Aby znieczulić dorosłego danio pręgowanego, połącz 5 ml tricaine (roztwór podstawowy) w plastikowej klatce krzyżowej z ~ 100 ml czystej wody w akwarium (końcowe stężenie tricainy 0,02% (w/v) tricainy).</li>
		<li>Inkubuj ryby w środkach znieczulających, aż przestaną się ruszać (45-60 sekund).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uraz kresomózgowia
	<ol>
		<li>Umieść pojedynczego znieczulonego danio pręgowanego w szczelinie w bloku pianki nasączonej trikainą.</li>
		<li>Pod mikroskopem preparacyjnym ze światłem od góry delikatnie chwyć rybę jedną ręką i ustaw ją w taki sposób, aby umożliwić dostęp do głowy od góry.</li>
		<li>Drugą ręką wepchnij strzykawkę 30 G (strzykawka insulinowa ze zintegrowaną igłą) pionowo przez czaszkę do przyśrodkowego obszaru jednej półkuli kresomózgowia (ryc. 1A-1B). Półkule kresomózgowia są widoczne przez czaszkę. Upewnij się, że wprowadzona zmiana nie jest głębsza niż 2 mm (ryc. 1C). Uwaga: Zdecydowanie zaleca się, aby wprowadzać zmianę zawsze do tej samej półkuli, aby ułatwić identyfikację miejsca zmiany podczas preparowania mózgu z czaszki.</li>
		<li>Po wprowadzeniu urazu kresomózgowia należy umieścić rybę w świeżej wodzie dla ryb. Trzymaj do 10 ryb w 2-litrowej klatce dla myszy wypełnionej wodą dla ryb w celu regeneracji i podłącz klatkę myszy do systemu przepływu wody. Uwaga: Wskaźnik przeżycia wynosi zwykle ~ 97%, jeśli ryby są zdrowe i nie przeprowadzono wcześniej żadnych innych eksperymentów na rybach. Dodawanie antybiotyków do wody dla ryb nie jest konieczne. Po wyzdrowieniu ryby zachowują się normalnie: pływają, żerują i łączą się w pary.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Analiza skutków uszkodzenia kresomózgowia
<ol>
	<li>Rozwarstwienie i fiksacja mózgu
	<ol>
		<li>Odzyskane ryby należy ponownie znieczulić w różnych punktach czasowych po uszkodzeniu (zazwyczaj 1, 3, 5 i 14 dni po uszkodzeniu (DPL)) 0,02% (w/v) trikainy, jak powyżej, i poddać je eutanazji, umieszczając je w lodowatej wodzie na 5 minut.</li>
		<li>Umieść rybę na papierowej chusteczce nasączonej solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i oddziel głowę od ciała, przecinając za skrzelami ostrym nożycem.</li>
		<li>Trzymaj głowy w 1x PBS przez 5 minut, aby umożliwić krwawienie. Uwaga: Spowoduje to odpływ krwi z tkanki, co może zakłócić dalsze kroki w protokole.</li>
		<li>Utrwal głowice na noc w temperaturze 4 °C w 4% paraformaldehydzie (PFA) w PBS lub 4 godziny w temperaturze pokojowej (RT).</li>
		<li>Umyj stałe głowice dwukrotnie 1x PBS na szalce Petriego.</li>
		<li>Dokładnie wypreparuj mózgi w 1x PBS pod mikroskopem preparacyjnym23. Zmiana jest zwykle widoczna pod mikroskopem preparacyjnym. Mózgi bez widocznych zmian należy wyrzucić.</li>
		<li>Przenieść mózgi do 2 ml probówek reakcyjnych wypełnionych 1,5 ml 100% metanolu (MeOH) i odwrócić probówki 5x przed inkubacją w temperaturze -20 °C przez co najmniej 16 godzin. Uwaga: Mózgi mogą być przechowywane przez kilka miesięcy w MeOH w temperaturze -20 °C, dopóki nie będą potrzebne do immunohistochemii lub hybrydyzacji in situ.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie tkanek do immunohistochemii
	<ol>
		<li>Nawadniaj mózgi za pomocą malejącej serii metanolu w plastikowych probówkach o pojemności 2 ml (kolejno 75% MeOH (1x PBS, 0,1% Tween-20 = PTW); 50% MeOH, 25% MeOH. Inkubować mózgi (15 mózgów/2 ml probówek reakcyjnych) przez 5 minut w każdym roztworze.</li>
		<li>Myj mózgi w PTW przez 5 minut. Powtórz 4x ze świeżym PTW.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Osadzanie mózgów do sekcji
	<ol>
		<li>W celu zatopienia należy przenieść mózgi z probówki reakcyjnej o pojemności 2 ml w PTW do wnęk tacki na kubki do formowania z polietylenu za pomocą pipety transferowej (średnica 5 mm).</li>
		<li>Przygotować 2% agarozę (klasa DNA) w 1x PBS w kolbie Erlenmeyera. Podgrzej go w kuchence mikrofalowej o mocy 600 W, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Przygotuj 50 ml na 10 mózgów. Przed użyciem pozwól agarozie ostygnąć przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Trzymaj agarozę na wstępnie podgrzanym bloku grzewczym (60 °C) podczas osadzania mózgów, aby zapobiec krzepnięciu.</li>
		<li>Wyjmij 1x PBS z formy zawierającej jeden mózg za pomocą pipety Pasteura (średnica 1 mm). Uważaj, aby nie uszkodzić mózgu.</li>
		<li>Wlej agarozę do formy i wypełnij ją całkowicie. Następnie użyj igły do preparowania, aby zawirować mózg w agarozie, aby zmyć PTW, co ułatwia osadzenie mózgu.</li>
		<li>Ustaw mózg w formie brzuszną stroną do dołu, grzbietem do góry i ułóż go prosto.</li>
		<li>Niech agaroza ostygnie. Aby uzyskać szybsze chłodzenie, umieść formę na lodzie. Powtórz kroki.</li>
		<li>Powtórz 2.3.3-2.3.6 dla wszystkich mózgów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przycinanie bloku agarozy
	<ol>
		<li>Za pomocą igły do rozwarstwiania wyjmij blok agarozy.</li>
		<li>Ostrą żyletką przetnij agarozę na tylnym końcu mózgu. Upewnij się, że ta płaszczyzna jest równoległa do kresomózgowia.</li>
		<li>Przetnij agarozę na przednim końcu mózgu. Następnie odwróć klocek tak, aby stanął na tylnej płaszczyźnie.</li>
		<li>Usuń nadmiar agarozy, przecinając równolegle do grzbietowej i brzusznej strony mózgu. Następnie odwróć mózg z powrotem tak, aby leżał na brzusznej stronie.</li>
		<li>Przytnij blok do ściętego trójkąta, w którym kresomózgowie znajduje się na mniejszej płaszczyźnie (ryc. 2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie wibratomu do cięcia
	<ol>
		<li>Przygotuj wibratomat zgodnie z instrukcjami producenta. Użyj nowej żyletki i wymień ją po 10 mózgach.</li>
		<li>Napełnij kąpiel buforową 1x PBS do poziomu, który sięga tylko do dna ostrza.</li>
		<li>Umieść małą kropkę superglue na górze krążka próbki wibratomu.</li>
		<li>Ostrożnie umieść płaszczyznę, która znajduje się za mózgiem na superglue. Klej stwardnieje, gdy tylko zetknie się z 1x PBS w kąpieli buforowej wibratomowej.</li>
		<li>Włożyć krążek z próbką wraz z próbką do tacki buforowej za pomocą manipulatora mikrotomu.</li>
		<li>Użyj manipulatora, aby obrócić tarczę próbki do żądanej pozycji. Ustaw blok w kąpieli buforowej w taki sposób, aby kresomózgowie znajdowało się tuż pod powierzchnią, z grzbietową częścią mózgu skierowaną w stronę ostrza. Następnie dokręć zacisk kluczem imbusowym 3 mm i wyjmij manipulator. Uwaga: Śruba mocująca lub jedno z urządzeń mocujących nie może znajdować się nad szczeliną w krążku próbki; W tych pozycjach zaciśnięcie tarczy próbki nie jest możliwe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzielenie mózgu na sekcje
	<ol>
		<li>Przygotuj 24-dołkową płytkę, aby zebrać skrawki. Na każdy mózg, który ma być podzielony na sekcje, napełnij jedną studzienkę 1 ml buforu blokującego (0,1% (v/v) 10% Tween-20, 0,2% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 1% (v/v) dimetylosulfotlenku (DMSO) w PBS).</li>
		<li>Rozpocznij cięcie przy grubości 50 μm, prędkości 1 mm/s i częstotliwości 70 Hz za pomocą wibrującego mikrotomu.</li>
		<li>Użyj syntetycznej szczotki (1 mm), aby zebrać cienkie plasterki agarozy, gdy schodzą z ostrza, i zebrać je na płytce 24-dołkowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Immunohistochemia na skrawkach wibratomu
	<ol>
		<li>Blokuj niespecyficzne miejsca wiązania przez 1 godzinę w RT w buforze blokującym (0,1% (v/v) 10% Tween 20, 0,2% (w/v) BSA, 1% (v/v) DMSO w PBS).</li>
		<li>Usunąć supernatant i dodać 250 μl przeciwciała rozcieńczonego w buforze blokującym przez noc w temperaturze 4 °C. Alternatywnie, inkubować przeciwciało pierwszorzędowe przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Następnie prać 3x przez 10 min w PTW. Uwaga: Do barwienia PCNA należy użyć rozcieńczenia 1:400 (mysi anty-PCNA. Szczegóły w tabeli materiałów). W tym samym czasie można inkubować wiele przeciwciał pierwszorzędowych.</li>
		<li>Inkubować skrawki w przeciwciałie drugorzędowym przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie myć 3x przez 10 minut w PTW. Uwaga: Rozcieńczenie 1:1,000 w PTW, szczegółowe informacje znajdują się w tabeli materiałów. W tym samym czasie można inkubować wiele przeciwciał drugorzędowych.</li>
		<li>Fakultatywnie: Najlepsze wyniki uzyskuje się, gdy skrawki są przechowywane w PTW przez noc w temperaturze 4 °C, aby umożliwić wypłukanie nieswoistie związanych przeciwciał drugorzędowych. W takim przypadku należy ponownie wymienić PTW przed montażem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hybrydyzacja in situ RNA dorosłego mózgu (alternatywnie do immunohistochemii)
	<ol>
		<li>Wypreparowanie i unieruchomienie mózgu (taka sama procedura jak w przypadku immunohistochemii):
		<ol>
			<li>Hybrydyzacja sondy.</li>
			<li>Uwodnić mózgi w probówkach reakcyjnych o pojemności 2 ml zgodnie z opisem immunohistochemii.</li>
			<li>Inkubować mózgi w proteinazie K (ProtK; 10 μg/ml stężenia końcowego) w PTW przez 30 minut. Po czasie inkubacji usuń ProtK/PTW i ponownie utrwal mózgi przez 20 minut w BT-Fix (4% PFA, 4% sacharozy, 0,12 mM CaCl2, 77 mM Na2HPO4, 23 mM NaH2PO4).</li>
			<li>Umyj mózgi 5x przez 5 minut w PTW (0,1% (v/v) Tween-20 w PBS).</li>
			<li>Usuń PTW i przepłucz mózgi w 500 μl buforu HYB (50% (v/v) dejonizowany formamid, 5x SSC, 500 μg/ml tRNA drożdży, 50 μg/ml heparyny, 0,1% Tween-20, 9 mM kwasu cytrynowego). Poczekaj, aż mózgi opadną na dno probówki, a następnie wyrzuć supernatant i dodaj 500 μl czystego buforu HYB i inkubuj w temperaturze 65-70 °C przez 3-4 godziny.</li>
			<li>Rozcieńczyć sondę RNA do 1:200 lub 1:400 (w zależności od sondy) w 400 μl końcowej objętości buforu HYB. Podgrzewać rozcieńczoną sondę RNA w temperaturze 70 °C przez 5 minut.</li>
			<li>Usunąć supernatant z mózgu i dodać sondę RNA, inkubować w temperaturze 65-70 °C (O/N). Wszystkie roztwory buforowe do płukania powinny być wstępnie podgrzane i utrzymywane w temperaturze 70 °C. </li>
		</ol>
		</li>
		<li>Etykietowania
		<ol>
			<li>Umyć mózgi w temperaturze 65-70 °C (podczas wszystkich 4 etapów mycia) 500 μl buforu płuczącego 1 (50% formamidu, 1x SSC, 0,05% Tween 20) dwa razy przez 30 minut. Zastąp bufor 1 buforem 2 (2x SSC, 0,1% Tween 20) i inkubuj przez 15 minut. Usuń bufor 2 i umyj mózgi w buforze 3 (0,2x SSC, 0,1% Tween 20) przez 30 minut, powtórz ten krok 2 dwukrotnie. Zastąp bufor 3 buforem 4 (0,1x SSC, 0,05% Tween 20 w PTW), inkubuj przez 5 minut.</li>
			<li>Usunąć supernatant i myć przez 5 minut w 500 μl PTW w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Osadź mózgi w 2% agarozie (w 1x PBS) i wytnij skrawki wibratomu (50-100 μm) zgodnie z opisem dla immunohistochemii.</li>
			<li>Myć 1x przez 5 min w buforze blokującym 500 μl (1x PBS, 0,1% Tween-20, 0,2% (w/v) BSA, 1% (v/v) DMSO).</li>
			<li>Usunąć supernatant i dodać 500 μl buforu blokującego na 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Usunąć supernatant i dodać 300 μl przeciwciała sprzężonego z anty-Dig AP rozcieńczonego w stosunku 1:4 000 w buforze blokującym.</li>
			<li>Inkubować o/n w temperaturze 4 °C.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Barwienie NBT/BCIP
		<ol>
			<li>Mycie 5x przez 15 min buforem PTW przy RT.</li>
			<li>Spłukać 1x w buforze do barwienia. Prać dwukrotnie po 5 minut w buforze barwiącym (100 mM Tris/HCl pH 9,5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween-20).</li>
			<li>Usunąć supernatant i zabarwić 500 μl roztworu barwiącego (3,5 μl chlorku 4-nitroniebieskiego tetrazolu (NBT) i 5-bromo-4-chloro-3-indolilofosforanu (BCIP) na 1 ml buforu barwiącyego).</li>
			<li>Zatrzymaj plamienie, spłukując od 3 do 5 razy PTW.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montaż sekcji
	<ol>
		<li>Zamontuj sekcje na szkiełkach za pomocą rozpuszczalnego w wodzie, niefluorescencyjnego medium montażowego (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Szkiełka należy przechowywać w lodówce w temperaturze 4°C. Uwaga: Zabarwienie utrzymuje się przez kilka tygodni, a nawet miesięcy.</li>
		<li>Przeanalizuj szkiełka pod mikroskopem złożonym lub konfokalnym</li>.
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+in+the+mammalian+brain%3A+significant+answers+and+significant+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions.</a> Neuron. 70, 687-702 (2011).</li>
<li>Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+and+brain+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish.</a> Dev Neurobiol. 72, 429-461 (2012).</li>
<li>Robel, S., Berninger, B., Gotz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stem+cell+potential+of+glia%3A+lessons+from+reactive+gliosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The stem cell potential of glia: lessons from reactive gliosis.</a> Nat Rev Neurosci. 12, 88-104 (2011).</li>
<li>Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dissection+of+reactive+astrogliosis+and+glial+scar+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation.</a> Trends Neurosci. 32, 638-647 (2009).</li>
<li>Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+zebrafish+-+from+embryo+to+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult.</a> Neural Dev. 8, 3(2013).</li>
<li>Zupanc, G. K., Sirbulescu, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+and+neuronal+regeneration+in+the+central+nervous+system+of+teleost+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis and neuronal regeneration in the central nervous system of teleost fish.</a> Eur J Neurosci. 34, 917-929 (2011).</li>
<li>Zupanc, G. K., Sirbulescu, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teleost+fish+as+a+model+system+to+study+successful+regeneration+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Teleost fish as a model system to study successful regeneration of the central nervous system.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 367, 193-233 (2013).</li>
<li>Adolf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+and+acquired+features+of+adult+neurogenesis+in+the+zebrafish+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon.</a> Dev Biol. 295, 278-293 (2006).</li>
<li>Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+and+neurogenesis+in+the+adult+zebrafish+brain%3A+origin%2C+proliferation+dynamics%2C+migration+and+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate.</a> Dev Biol. 295, 263-277 (2006).</li>
<li>Zupanc, G. K., Hinsch, K., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation%2C+migration%2C+neuronal+differentiation%2C+and+long-term+survival+of+new+cells+in+the+adult+zebrafish+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Proliferation, migration, neuronal differentiation, and long-term survival of new cells in the adult zebrafish brain.</a> J Comp Neurol. 488, 290-319 (2005).</li>
<li>Chapouton, P., Jagasia, R., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+in+non-mammalian+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates.</a> Bioessays. 29, 745-757 (2007).</li>
<li>Hinsch, K., Zupanc, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+long-term+persistence+of+new+neurons+in+the+adult+zebrafish+brain%3A+a+quantitative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Generation and long-term persistence of new neurons in the adult zebrafish brain: a quantitative analysis.</a> Neuroscience. 146, 679-696 (2007).</li>
<li>Lindsey, B. W., Darabie, A., Tropepe, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+composition+of+neurogenic+periventricular+zones+in+the+adult+zebrafish+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The cellular composition of neurogenic periventricular zones in the adult zebrafish forebrain.</a> J Comp Neurol. 520, 2275-2316 (2012).</li>
<li>Marz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+progenitor+cell+subtypes+in+the+ventricular+zone+of+the+zebrafish+adult+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon.</a> Glia. 58, 870-888 (2010).</li>
<li>Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+response+following+stab+injury+in+the+adult+zebrafish+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon.</a> Dev Dyn. 240, 2221-2231 (2011).</li>
<li>Grandel, H., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+adult+neural+stem+cell+activity+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates.</a> Dev Genes Evol. 223, 131-147 (2013).</li>
<li>Ayari, B., El Hachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prokineticin+2+expression+is+associated+with+neural+repair+of+injured+adult+zebrafish+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon.</a> J Neurotrauma. 27, 959-972 (2010).</li>
<li>Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stab+wound+injury+of+the+zebrafish+telencephalon%3A+a+model+for+comparative+analysis+of+reactive+gliosis%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis.</a> Glia. 60, 343-357 (2011).</li>
<li>Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+regeneration+in+a+zebrafish+model+of+adult+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury.</a> Dis Model Mech. 5, 200-209 (2012).</li>
<li>Kizil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+neurogenesis+from+neural+progenitor+cells+requires+injury-induced+expression+of+Gata3%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3.</a> Dev Cell. 23, 1230-1237 (2012).</li>
<li>Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+the+adult+zebrafish+brain+from+neurogenic+radial+glia-type+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors.</a> Development. 138, 4831-4841 (2011).</li>
<li>Kyritsis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+inflammation+initiates+the+regenerative+response+in+the+adult+zebrafish+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain.</a> Science. 338, 1353-1356 (2012).</li>
<li>Gupta, T., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+organs+from+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of organs from the adult zebrafish.</a> J Vis Exp. (37), (2010).</li>
<li>Shin, J., Park, H. C., Topczewska, J. M., Mawdsley, D. J., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+cell+fate+analysis+in+zebrafish+using+olig2+BAC+transgenics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Neural cell fate analysis in zebrafish using olig2 BAC transgenics.</a> Methods Cell Sci. 25, 7-14 (2003).</li>
<li>Armant, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide%2C+whole+mount+in+situ+analysis+of+transcriptional+regulators+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide, whole mount in situ analysis of transcriptional regulators in zebrafish embryos.</a> Dev Biol. 380, 351-362 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisujemy tutaj metodę wywoływania urazu kresomózgowia poprzez wciskanie igły przez czaszkę dorosłego danio pręgowanego oraz analizę komórkowej i molekularnej reakcji na to uraz za pomocą immunohistochemii i hybrydyzacji in situ . Główną przewagą tej techniki nad innymi istniejącymi podejściami jest jej prostota, szybkość i opłacalność. Dlatego ta technika, która pozwala na produkcję wielu uszkodzonych mózgów w krótkim czasie, może być łatwo połączona z ekranem hybrydyzacji in situ na dużą skalę w celu zidentyfikowania genów odgrywających rolę w regeneracji i neurogenezie.
Kluczowy jest wiek dorosłego danio pręgowanego, na którym dochodzi do urazu. Jeśli ryby są starsze niż 1,5 roku, czaszka jest zbyt twarda i możliwe, że czaszka jest zepchnięta w dół lub złamana, a nie czysto perforowana. W przeciwieństwie do tego, u młodszych ryb (młodszych niż 4 miesiące) nadal zachodzi dużo neurogenezy, co może prowadzić do fałszywie dodatnich wyników dotyczących neurogenezy reaktywnej.
Kolejnym krytycznym krokiem w tym podejściu jest sprawdzenie skuteczności rany kłutej i wykluczenie, że obie półkule są zranione. Można to monitorować, barwiąc skrawki przeciwciałem anty-PCNA. W prawidłowo wprowadzonej zmianie PCNA powinno być znacznie podwyższone tylko w jednej z półkul.
Należy pamiętać, że wywołany uraz mechaniczny będzie miał kilka skutków ubocznych, takich jak nieswoista ablacja komórek, zwiększona śmierć komórek z powodu wtórnego zwyrodnienia, zapalenie i zniszczenie bariery krew-mózg oraz uszkodzenie strefy komorowej, a w konsekwencji przepływ płynu mózgowo-rdzeniowego do miąższu mózgu. Wydaje się jednak, że zranione ryby w niewielkim stopniu cierpią z powodu urazu. W ciągu 2 minut znów swobodnie pływają, a normalne zachowanie żywieniowe zostaje przywrócone w ciągu około 4 godzin. Po 3 tygodniach uraz nie jest już widoczny morfologicznie. W naszych rękach z kilkuset operacji nie straciliśmy ani jednej ryby, mimo że mieliśmy 100% wskaźnik urazów oceniany histologicznie po 5 dniach od zmiany.
W ostatnich latach u danio pręgowanego opracowano inne techniki, takie jak podejścia transgeniczne, w celu przeprowadzenia ablacji specyficznej dla tkanki lub typu komórki2. Chociaż techniki te są bardzo eleganckie i minimalnie inwazyjne, opierają się na generowaniu skomplikowanych konstruktów DNA i ustanowieniu kilku stabilnych linii transgenicznych danio pręgowanego, co może być bardzo żmudne i czasochłonne. Dlatego proste podejścia mechaniczne, takie jak test opisany w tym protokole, pozostają ważnym narzędziem do badania neurogenezy i regeneracji mózgu dorosłych.

Ssaki mają bardzo ograniczoną zdolność do generowania nowych neuronów podczas dorosłego życia, a neurogeneza dorosłego mózgu jest głównie ograniczona do dwóch regionów kresomózgowia położonych w strefie podkomorowej (SVZ) komór bocznych i strefie podziarnistej (SGZ) zakrętu zębatego w hipokampie1. Ssaki nie są również w stanie skutecznie naprawić uszkodzeń mózgu spowodowanych chorobami neurodegeneracyjnymi, udarem lub urazami. Utracone neurony nie są zastępowane, a zamiast tego obserwuje się proliferację różnych typów komórek glejowych, w tym astrocytów, mikrogleju i oligodendrocytów. W wyniku tego procesu proliferacyjnego zwanego reaktywną glejozą, uszkodzona tkanka mózgowa jest zamykana przez tworzenie blizny glejowej, która hamuje regenerację neuronów i aksonów2-4.
W przeciwieństwie do ssaków, ryby teleostowe, takie jak danio pręgowany, obficie tworzą nowe neurony w dojrzałych stadiach i mają wysoki potencjał regeneracyjny i proliferacyjny do naprawy zmian w ośrodkowym układzie nerwowym2,5-7. Mózg dorosłego danio pręgowanego zawiera 16 odrębnych nisz nerwowych komórek macierzystych, które generują dużą liczbę nowych neuronów w ciągu całego życia8-11. Neurony urodzone w tych specyficznych strefach proliferacji mózgu dorosłego danio pręgowanego migrują do obszarów docelowych, gdzie dojrzewają i integrują się z istniejącymi sieciami neuronalnymi8,10,12-15.
Wśród stref progenitorowych zidentyfikowanych u dorosłego danio pręgowanego, strefa komorowa kresomózgowia jest jedną z najlepiej zbadanych nisz neuronalnych komórek macierzystych. Komórki w tej niszy progenitorowej można podzielić na trzy różne typy pod względem ich morfologii, szybkości podziału i ekspresji różnych markerów glejowych lub neuronalnych. Komórki typu I i typu II są promieniowymi komórkami glejowymi, które mają długie wyrostki. Wyrażają markery komórek macierzystych, w tym GFAP, nestynę i S100β. Komórki typu I nie proliferują, podczas gdy komórki typu II proliferują powoli, o czym świadczy ekspresja markerów proliferacji, takich jak antygen jądrowy proliferacji komórek (PCNA) i włączenie analogów desoksytymidyny. Komórki typu III są szybko dzielącymi się komórkami, które są zaangażowane w stanie się neuronalnymi progenitorami i ekspresją genów markerów nerwowych, takich jak PSA-NCAM5,16.
Chociaż zdolności regeneracyjne ryb teleost są dobrze udokumentowane, tylko kilka publikacji opisało i szczegółowo zbadało mechanizmy komórkowe i molekularne związane z regeneracją neuronów u dorosłego kresomózgowia w odpowiedzi na uraz15,17-22. Aby rozszyfrować mechanizmy związane z regeneracją i naprawą ośrodkowego układu nerwowego u dorosłych ryb danio pręgowanego oraz zrozumieć podobieństwa i różnice między konstytutywną i regeneracyjną neurogenezą, opracowaliśmy model uszkodzenia kresomózgowia u dorosłych osób pręgowanych. W tym miejscu opiszemy wizualnie, jak wygenerować uraz w jednej z półkul kresomózgowia za pomocą igły strzykawki, zachowując jednocześnie przeciwległą stronę nieuszkodzoną, jako kontrolę wewnętrzną. Pokażemy również, jak monitorować zmiany po uszkodzeniu w proliferacji komórek i ekspresji genów za pomocą immunohistochemii i testów hybrydyzacji in situ.

<table><tbody><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma</td><td>335.2</td><td></td></tr><tr><td>10x DPBS (-/-)</td><td>Technologie życia</td><td>14200-083</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 30 G (Omnican 40)</td><td>B.Braun Melsungen</td><td>916162</td><td></td></tr><tr><td>Tacka na kubki z polietylenu&nbsp;</td><td>Polysciences, Inc</td><td>17177C-3</td><td></td></tr><tr><td>PeqGOLD Agaroza uniwersalna&nbsp;</td><td>Peqlab</td><td>35-1020</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Biochrom</td><td>W 2835919108</td><td></td></tr><tr><td>Aqua Poly/Mount</td><td>Polysciences, Inc</td><td>18606-20</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Carl Roth</td><td>9127.1</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Carl Roth</td><td>A994.2</td><td></td></tr><tr><td>Igła preparcyjna</td><td>Carl Roth</td><td>KX93.1</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Carl Roth</td><td>335.2</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 414</td><td>Sch&ouml; ffler und W&ouml; rner</td><td><a href="http://62.157.117.162/BP2NAV500/ItemDetail_NAV.aspx? ItemID=06%201362%200020">06 1362 0020</a></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka</td> podstawowe <td>Labonord</td><td>5305103</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe 24 x 60 mm</td><td>Szalki Petriego</td><td>5305060</td><td></td>labonordowe</tr><tr><td>, 94 mm</td><td>Greiner bio-one</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Sokoła, 15 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>płytka 24-dołkowa</td><td>Greiner bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-S100 (1:500)</td><td>Dako</td><td>Z031101-2</td><td></td></tr><tr><td>anty-PCNA (1:400)</td><td>Dako</td><td>M087901</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP (1:1,000)</td><td>Aves</td><td>Labs GFP-1020</td><td></td></tr> przeciwciało <tr><td>sprzężone z AP anti-Dig&nbsp;</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>5-bromo-4-chloro-3-indolilofosforan (BCIP)&nbsp;</td><td>Roche Diagnostics</td><td>1383221</td><td></td></tr><tr><td>4-Nitroniebieski chlorek tetrazolu (NBT)&nbsp;</td><td>Roche Diagnostics</td><td>1383213</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Roche Diagnostics</td><td>1092766</td><td></td></tr><tr><td>Tacka na kubki do formowania z polietylenu&nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>17177C-3</td><td></td></tr><tr><td>Wibratome VT1000S</td><td>Mikroskop</td> konfokalny Leica <td></td><td></td></tr><tr><td>Sp5 DM6000</td><td>Mikroskop</td> preparacyjny Leica <td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon SMZ 645</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe płaskodenne płytki do hodowli tkankowych&nbsp;</td><td>Katalog Sokół&nbsp;</td><td></td><td></td>353226</tr><tr><td>Student Dumont #5 Kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Danio rerio Tg(olig2:EGFP)</td><td>Shin et al.24</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Danio rerio Szczepy WT (np. , AB2O2)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rana kłuta dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego: metoda badania neurogenezy i regeneracji mózgu kręgowców

Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Dorosłe rybki pręgowane mają niesamowitą zdolność do regeneracji swojego ośrodkowego układu nerwowego po urazach. Aby zbadać odpowiedź komórkową i mechanizmy molekularne zaangażowane w regenerację i naprawę ośrodkowego układu nerwowego (OUN) dorosłego danio pręgowanego, opracowaliśmy model uszkodzenia kresomózgowia u dorosłych ryb pręgowanych.
W tym podejściu, ręcznie generujemy uraz, wpychając igłę strzykawki insulinowej do dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego. W różnych dniach po urazie ryby są uśmiercane, ich mózgi są wycinane i barwione za pomocą immunohistochemii i / lub hybrydyzacji in situ (ISH) z odpowiednimi markerami do obserwacji proliferacji komórek, glehaju i neurogenezy. Przeciwległa półkula nieuszkodzona służy jako kontrola wewnętrzna. Ta metoda, w połączeniu na przykład z głębokim sekwencjonowaniem RNA, może pomóc w badaniach przesiewowych w poszukiwaniu nowych genów odgrywających rolę w neurogenezie, regeneracji i naprawie dorosłego kresomózgowia dorosłego danio pręgowanego.

Stosując schemat postępowania opisany w niniejszym artykule, w prawej półkuli telencefalonu dorosłego zebrafisha wprowadzono uszkodzenie (Ryciny 1A-1B). Prawidłowe zranienie prowadzi do powstania kanału uszkodzenia, który rozciąga się od strony grzbietowej do brzusznej przez całe pallium telencefalonu (Rycina 3C). Uszkodzenie powinno być ograniczone do jednej z półkul i nie powinno przekraczać komory środkowej. Kanał uszkodzenia jest widoczny w mikroskopii pola jasnego (Rycina 3C) i ulegnie zagojeniu po około 35 dniach15.
Wcześniej wykazano, że po zranieniu w dniach od 3 do 7 dpl metodą immunohistochemiczną można wykryć zwiększoną ekspresję antygenu proliferujących komórek jądrowych (PCNA; Rysunek 3A) oraz białka S100β (Rysunek 3B)15. Barwienie PCNA i S100β nakłada się na siebie, co wskazuje na proliferację komórek glei radialnej.
Ponadto, w celu wizualizacji komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPCs), u ryb Tg(olig2:EGFP) przeprowadzono test z raną kłutą24. Po barwieniu przeciwciałem anty-GFP wykrywalna jest akumulacja OPC w bliskim sąsiedztwie kanału uszkodzenia (Ryc. 3D). Akumulacja ta jest przejściowa, a skupiska OPC nie są już obserwowane w 35 dpl15.
Jeśli uszkodzenie nie zostało wprowadzone prawidłowo, kanał uszkodzenia nie będzie widoczny, a nadekspresja PCNA i S100β lub akumulacja OPC nie będą wykrywalne. PCNA jest najczulszym markerem uszkodzenia mózgu. W celu weryfikacji skuteczności rany kłutej oraz wykluczenia uszkodzenia obu półkul, zdecydowanie zaleca się zawsze barwienie przekrojów przeciwciałem anty-PCNA. W przypadku prawidłowo wprowadzonego uszkodzenia, poziom PCNA powinien być znacząco podwyższony (do 4-krotnie15) tylko w jednej z półkul. Choć w większości przypadków wystarczające jest użycie przeciwległej, nieuszkodzonej strony jako kontroli wewnętrznej do monitorowania zmian w ekspresji genów, wysoce zaleca się porównanie ekspresji genów w półkuli kontrolnej z ekspresją w półkulach telencefalicznych mózgów typu dzikiego. W ten sposób można wykryć wszelkie systemowe efekty uszkodzenia wpływające na ekspresję genów w obu półkulach.
Test rany kłutej w połączeniu z systematycznym przesiewem ekspresji regulatorów transkrypcji (TRs) (25 oraz Schmidt et al., niepublikowane) może być również wykorzystany do identyfikacji genów TR o potencjalnej roli w neurogenezie i regeneracji (Ryciny 4A-4C).
Dzięki temu podejściu zidentyfikowano szereg czynników ekspresywnych w telencefalonie, których ekspresja ulega specyficznej upregulacji w odpowiedzi na uraz (Rycina 4A-C).
<img alt="Schemat iniekcji do mózgu rybki zebrafish, ilustrujący celowanie w telencefalon; opisana anatomia, podana skala." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51753/51753fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schematyczne przedstawienie kłucia telencefalonu u dorosłej rybki zebrafish. A) Igła strzykawki insulinowej jest wbijana przez czaszkę dorosłej rybki zebrafish w celu wywołania urazu telencefalonu. Biała przerywana linia wyznacza granicę między dwiema półkulami telencefalonu, a zielony krzyżyk wskazuje miejsce rany kłutej. B) Widok grzbietowy mózgu dorosłej rybki zebrafish. Wskazano główne obszary mózgu. Zielony krzyżyk pokazuje miejsce wywołanego urazu. C) Końcówka igły służącej do wywołania urazu telencefalonu ma długość 2 mm. Opisano: cebulkę węchową (ob), telencefalon (tel) oraz dach wzrokowy (ot).
<img alt="Schemat budowy mózgu owada z opisanymi sekcjami: ob, tel, ot, cb, m; do badań neuroanatomicznych." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51753/51753fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Schematyczny obraz mózgu dorosłego danio pręgowanego w przyciętym bloku agarozy tuż przed sekcjonowaniem w wibratomie. Góra obrazu to strona przednia. Opisane struktury: opuszka węchowa (ob), telencefalon (tel), wzgórze optyczne (ot), móżdżek (cb) oraz rdzeń przedłużony (m). Pasek skali: 500 μm.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna tkanki mózgu: ekspresja PCNA, S100β, olig2:EGFP; pallium, subpallium." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51753/51753fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Odpowiedzi regeneracyjne po obrażeniu raną kłutą. A-D) Mózg dorosłego zebrafisha w 5 dni po urazie (dpl). A-B) Marker proliferacji PCNA (A) oraz marker gleju radialnego S100β (B) wykazują zwiększoną ekspresję w strefie komorowej (strzałki) po zadaniu rany kłutej. (C) Kanał urazu jest widoczny w oświetleniu w polu jasnym (strzałki). Strefę komorową zaznaczono zieloną linią. (D) Komórki prekursorowe oligodendrocytów (olig2:EGFP+) gromadzą się w miejscu urazu (strzałki). Pasek skali: 200 μm. Na wszystkich panelach prawa półkula jest półkulą uszkodzoną. Góra odpowiada stronie grzbietowej. Przerywana linia od A do D wskazuje granicę między pallium a subpallium.
<img alt="Schematy hybrydyzacji in situ, ekspresja eomesa i sox4a, regiony mózgu: pallium i subpallium." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51753/51753fig4highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Przykład genów o zwiększonej ekspresji w odpowiedzi na uraz kłuty. Zwróć uwagę na silną nadekspresję (strzałki) mRNA eomesa (A, B) oraz sox4a (C) w prawej półkuli telencefalicznej (półkula z urazem), monitorowaną za pomocą hybrydyzacji in situ w 5 dpl. Lewa półkula nie jest uszkodzona i służy jako kontrola. (B) Przedstawia większe powiększenie grzbietowego regionu telencefalu z panelu A. Kierunek grzbietowy jest skierowany w górę. Pasek skali: 200 μm dla A i C oraz 55 µm dla B. Linia przerywana w A i C oznacza granicę między pallium a subpallium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51753/51753fig4highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">SKRÓTY</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AP</td>
			<td>Fosfataza alkaliczna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP</td>
			<td>5-bromo-4-chloro-3'-indylofosforan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Seryjna albumina bydlęca</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNS</td>
			<td>Ośrodkowy układ nerwowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dig</td>
			<td>Digoksygenina</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Dimetylosulfotlenek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dpl</td>
			<td>Dni po uszkodzeniu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eomesa</td>
			<td>Eomesodermin homolog a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP</td>
			<td>Gialne kwasowe białko włókienkowe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hr</td>
			<td>Godzina</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYB buffer</td>
			<td>Bufor do hybrydyzacji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISH</td>
			<td>Hybrydyzacja in situ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeOH</td>
			<td>Metanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBT</td>
			<td>Nitro-błękit tetrazoliowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPCs</td>
			<td>Komórki prekursorowe oligodendrocytów</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fosforanowy bufor solny</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCNA</td>
			<td>Jądrowy antygen proliferujących komórek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Paraformaldehyd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProtK</td>
			<td>Proteinaza K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSA-NCAM</td>
			<td>Polysjalilowana cząsteczka adhezji komórkowej neuronów</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTW</td>
			<td>PBS, 0,1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA</td>
			<td>Kwas rybonukleinowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT</td>
			<td>Temperatura pokojowa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGZ</td>
			<td>Strefa podziarnista</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sox4a</td>
			<td>SRY-box containing gene 4a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC</td>
			<td>Sól-cytrynian sodu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SVZ</td>
			<td>Strefa podkomorowa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRs</td>
			<td>Regulatory transkrypcji</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

Aby rzucić światło na komórkowe i molekularne mechanizmy neurogenezy i regeneracji dorosłego danio pręgowanego, opracowaliśmy protokół inwazyjnej chirurgii powodującej mechaniczne urazy u dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego i późniejszego monitorowania zmian w ugodzonej półkuli za pomocą immunohistochemii lub hybrydyzacji in situ.

Rana kłuta dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego: metoda badania neurogenezy i regeneracji mózgu kręgowców

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zbadanie odpowiedzi komórkowej oraz mechanizmów molekularnych zaangażowanych w neurogenezę dorosłych oraz regenerację i naprawę ośrodkowego układu nerwowego. U danio pręgowanego osiąga się to najpierw poprzez manualne wywołanie urazu poprzez nakłucie prawej półkuli głownej dorosłej ryby danio pręgowanego. Następnie, pięć dni po urazie, ryba zostaje uśmiercona, a jej mózg jest wypreparowany i zatopiony w agarozie w celu przygotowania przekrojów w kriosztacie.Następnie przekroje mózgu barwi się metodą immunohistochemiczną lub hybrydyzacją in situ z odpowiednimi markerami. W celu obserwacji proliferacji komórek, gliogenezy i neurogenezy uzyskuje się wyniki wykazujące zwiększoną ekspresję markera proliferacji PCNA, markera radioglialnego S100 beta oraz komórek prekursorowych oligodendrocytów znakowanych oli2-EGFP w strefie komorowej po zadaniu rany kłutej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami opartymi na podejściu transgenicznym w celu uzyskania ablacji specyficznej dla tkanki lub typu komórek jest jej prostota, szybkość i efektywność kosztowa, co pozwala na przygotowanie wielu uszkodzonych mózgów w krótkim czasie.Po znieczuleniu dorosłych danio pręgowanych, zgodnie z protokołem tekstowym, umieść poszczególne ryby w nacięciu w bloku ręcznika papierowego nasączonego Tricą, pod mikroskopem stereologicznym z oświetleniem górnym. Delikatnie przytrzymaj rybę jedną ręką i zorientuj ją w taki sposób, aby umożliwić dostęp do głowy od góry za pomocą strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 30 G. Drugą ręką wprowadź igłę pionowo przez czaszkę, na głębokość nie większą niż dwa milimetry, w obszar przyśrodkowy jednej półkuli mózgu.Po zadaniu urazu głowy umieść rybę w świeżej wodzie dla ryb. Po zakończeniu czynności przenieś rybę z powrotem do systemu przepływu wody. Po okresie rekonwalescencji ryb przez pożądany czas i ich eutanazji zgodnie z protokołem tekstowym, uśmierć je na lodzie i użyj ostrych nożyczek, aby przeciąć obszar za skrzelami i oddzielić głowę od reszty ciała.Inkubować głowy w 1x PBS przez pięć minut, aby umożliwić usunięcie krwi. Następnie przenieść głowy do 4% paraformaldehydu w PBS i inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub przez cztery godziny w temperaturze pokojowej. Po utrwaleniu przemyć głowy dwukrotnie w 1x PBS w szalce Petriego.Następnie, pod mikroskopem stereotypowym, ostrożnie wypreparuj mózgi w PBS. Odrzuć wszystkie mózgi, w których nie widać widocznej zmiany. Przenieś mózgi do probówek reakcyjnych o pojemności dwóch mililitrów wypełnionych 1,5 mililitrami 100% metanolu i odwróć probówki pięć razy, a następnie inkubuj je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez co najmniej 16 godzin.Aby nawodnić tkankę do immunohistochemii, inkubuj mózgi przez pięć minut w każdym z kolejnych stężeń malejących serii metanolu, a następnie użyj PBS tween 20 lub PTW, aby przemyć mózgi pięciokrotnie. Każde płukanie powinno trwać pięć minut. Następnie, w celu zatopienia mózgów, użyj pipety transferowej, aby umieścić je w wgłębieniach tacy z polietylenowych form do odlewów; rozpuść 2% agros w 1x PBS, podgrzewając go w kuchence mikrofalowej przy mocy 600 W.Pozostaw agros do schłodzenia przez trzy minuty przed użyciem. Następnie ostrożnie usuń PTW z jednego mózgu przed użyciem aros do całkowitego wypełnienia formy. Użyj igły sekcyjnej, aby zamieszać mózg w aros w celu wypłukania PTW, a następnie zorientuj mózg stroną brzuszzną do dołu i grzbietową do góry, ustawiając go prosto przed ponownym schłodzeniem agros.Używając igły do sekcji, wyjmij blok agros z formy. Następnie za pomocą ostrej żyletki przetnij agros równolegle do talon cephalon w tylnej części mózgu. Teraz przetnij agros w przedniej części mózgu, zanim obrócisz blok tak, aby stał na płaszczyźnie tylnej.Usuń nadmiar agaru, wykonując cięcia równolegle do strony grzbietowej i brzusznej mózgu. Następnie obróć mózg z powrotem tak, aby spoczywał na stronie brzusznej. Na koniec przytnij blok do kształtu ściętego trójkąta, w którym cefalon znajduje się na mniejszej płaszczyźnie.Po przygotowaniu viomu zgodnie z instrukcjami producenta, należy użyć roztworu XPBS do napełnienia kąpieli buforowej w taki sposób, aby poziom cieczy zaledwie osiągnął dno ostrza. Następnie na górnej części tarczy próbki wibratoma należy nanieść małą kroplę superkleju. Po tym carefully należy umieścić na superkleju powierzchnię bloku znajdującą się po tylnej stronie mózgu.Użyj manipulatora mikrotomu, aby włożyć dysk z próbkami do tacy z buforem i obrócić go do pożądanej pozycji. Następnie za pomocą klucza imbusowego 3 mm dokręć śrubę i zdejmij manipulator. Umieść blok w kąpieli buforowej w taki sposób, aby cephalon znajdował się tuż pod powierzchnią, a grzbietowa strona mózgu była skierowana w stronę noża, aby wykonać przekroje mózgów.Przygotuj płytkę 24-dołkową do zbierania przekrojów, dodając jeden mililitr buforu blokującego na jeden mózg do dołków płytki znajdującej się przy wibrotomie. Rozpocznij sekcjonowanie przy grubości 50 µm, prędkości 1 mm/s i częstotliwości 70 Hz. Używając syntetycznego pędzla, pobieraj cienkie plastry tkanki w momencie ich oddzielania się od ostrza i zbieraj je do płytki 24-dołkowej.Aby przeprowadzić immunohistochemię, należy zablokować miejsca niespecyficzne przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji usunąć bufor i dodać 250 µL przeciwciała rozcieńczonego w buforze blokującym; inkubować przez noc w temperaturze 4 °C lub przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, a następnie użyć PTW do trzykrotnego przemycia próbek przez jedną minutę każdorazowo. Następnie należy inkubować z przeciwciałami wtórnymi przez dwie godziny w temperaturze pokojowej.Przemyć skrawki trzykrotnie. Do montowania skrawków należy użyć rozpuszczalnego w wodzie, niewyświetlającego medium montażowego. Następnie przeanalizować próbki pod mikroskopem złożonym lub konfokalnym.W przypadku prawidłowego wykonania, rana prowadzi do powstania kanału uszkodzenia, który rozciąga się od strony grzbietowej do brzusznej przez palam ogona cephalon i który zagoi się po 35 dniach. Wcześniej wykazano za pomocą immunohistochemii, że zranienie wywołuje zwiększenie ekspresji PCNA oraz S 100 beta, a nakładający się wzorzec w trzecim do siódmego dnia po uszkodzeniu wskazuje na proliferację radialnych komórek glejowych.Rycina ta przedstawia przejściową akumulację prekursorowych komórek oligodendrocytów lub OPC w bliskim sąsiedztwie rany kłutej wywołanej u transgenicznych ryb olig two EEG FP, która nie jest już obserwowana w 35. dniu po uszkodzeniu. Jeśli uszkodzenie nie zostanie wprowadzone prawidłowo, kanał uszkodzenia nie będzie widoczny. W takim przypadku nie można wykryć nadekspresji PCNA i S 100 beta ani akumulacji OPC.Jak przedstawiono w niniejszym opracowaniu, systemowy screening ekspresji, porównujący regulatory transkrypcji w mózgach ryb z uszkodzeniami oraz w mózgach typu dzikiego, pozwolił na zidentyfikowanie szeregu czynników wykazujących ekspresję w telencefalonie, których poziom wzrasta w odpowiedzi na uraz. Metoda rany schodkowej w połączeniu na przykład z głębokim sekwencjonowaniem RNA i/lub hybrydyzacją in situ może pomóc w identyfikacji nowych genów zaangażowanych w neurogenezę dorosłych osobników, regenerację i naprawę u danio przebrzmiałego.

stab-wound-injury-zebrafish-adult-telencephalon-method-to-investigate

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Obrażenie od rany kłutej u dorosłych rybek cebra: Metoda badania neurogenezy i regeneracji mózgu kręgowców

Ten film opisuje technikę mikrodysekcji mózgu dorosłego danio pręgowanego. Metoda ta pomaga w uzyskaniu neuorosfer pochodzących z całego mózgu, które można dalej badać.

Sekcja mózgu danio pręgowanego: technika neurobiologii ryb

W tym artykule demonstrujemy metodę manipulowania ekspresją genów w komórkach komorowych dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego za pomocą antysensownych oligonukleotydów morfolino. Przedstawiamy tę metodę jako skuteczny i szybki protokół, który można wykorzystać do badań funkcjonalnych w mózgu dorosłego kręgowca.

Mikromanipulacja ekspresją genów w mózgu dorosłego danio pręgowanego za pomocą mikroiniekcji oligonukleotydów morfolino do komory mózgowej

Chociaż obwodowy układ nerwowy (PNS) jest zdolny do znacznej naprawy po urazie, niewiele wiadomo o komórkowych i molekularnych mechanizmach rządzących tym zjawiskiem. Korzystając z żywego, transgenicznego danio pręgowanego i powtarzalnego testu przecięcia nerwów, możemy badać dynamiczne zachowania komórek glejowych podczas degeneracji i regeneracji nerwów.

Przekrój nerwu ruchowego i obrazowanie poklatkowe zachowań komórek glejowych u żywych danio pręgowanego

Po przecięciu kręgosłupa, dorosłe rybki pręgowane wracają do stanu funkcjonalnego w ciągu sześciu tygodni po urazie. Aby wykorzystać przezroczystość larw i szybszy powrót do zdrowia, przedstawiamy metodę transekcji rdzenia kręgowego larwy. Po przecięciu obserwujemy regenerację czuciową rozpoczynającą się po 2 dniach od urazu i ruch zgięcia C po 3 dniach od urazu.

Przekrój rdzenia kręgowego u larw danio pręgowanego

Ten protokół opisuje syntezę, charakterystykę i wstrzykiwanie monomerycznych peptydów amyloidu-β42 do generowania toksyczności amyloidu u dorosłych ryb pręgowanego w celu stworzenia modelu choroby Alzheimera, a następnie analizy histologiczne i wykrywanie agregacji.

Modelowanie toksyczności i neurodegeneracji amyloidu-β42 w mózgu dorosłego danio pręgowanego

Przedstawiona tutaj jest metoda elektroporacji do dostarczania plazmidowego DNA i znakowania komórek ependymoglialnych u dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego. Protokół ten jest szybką i skuteczną metodą wizualizacji i śledzenia pojedynczych komórek eścidendomoglialnych i otwiera nowe możliwości zastosowania elektroporacji w szerokim zakresie manipulacji genetycznych.

Metoda elektroporacji do dostarczania in vivo plazmidowego DNA w kresomózgowiu dorosłego danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy metodę obrazowania embrionalnego mózgu danio pręgowanego in vivo, aż do stadium larwalnego i młodocianego. Ta mikroinwazyjna procedura, zaadaptowana z podejść elektrofizjologicznych, zapewnia dostęp do szczegółów komórkowych i subkomórkowych dojrzałego neuronu i może być połączona z badaniami optogenetycznymi i neurofarmakologicznymi w celu scharakteryzowania funkcji mózgu i interwencji farmakologicznej.

Obrazowanie in vivo w pełni aktywnej tkanki mózgowej u wybudzonych larw i osobników młodocianych danio pręgowanego poprzez usunięcie czaszki i skóry

Zmodyfikowaliśmy model spadku masy Marmarou dla dorosłego danio pręgowanego, aby zbadać szeroki zakres patologii po uszkodzeniu mózgu (TBI) i mechanizmy leżące u podstaw późniejszej regeneracji neuronów. Ten model TBI jest skalowalny, indukuje łagodne, umiarkowane lub ciężkie TBI i podsumowuje niejednorodność obrażeń obserwowaną u ludzi.

Skalowalny model do badania skutków obrażeń spowodowanych siłą u dorosłych danio pręgowanych

Opisano model mechanicznego uszkodzenia mózgu u dorosłego danio pręgowanego, aby zbadać mechanizmy molekularne regulujące ich wysoką zdolność regeneracyjną. Metoda wyjaśnia, jak stworzyć ranę kłutą w tektum nerwu wzrokowego wielu gatunków małych ryb w celu oceny odpowiedzi regeneracyjnych za pomocą fluorescencyjnego barwienia immunologicznego.

Model rany kłutej dorosłego nerwu wzrokowego z wykorzystaniem danio pręgowanego i medaka do analizy porównawczej zdolności regeneracyjnych

Zdolny do funkcjonalnego powrotu do zdrowia po urazie rdzenia kręgowego, dorosły danio pręgowany jest głównym modelowym systemem do wyjaśnienia wrodzonych mechanizmów regeneracji neuronów. Tutaj opisujemy testy wytrzymałości pływackiej i zachowania podczas pływania jako funkcjonalne odczyty regeneracji rdzenia kręgowego.

Ocena wytrzymałości pływackiej i zachowań związanych z pływaniem u dorosłych danio pręgowanego

Obecny protokół opisuje metodę wywoływania specyficznych tkankowo i wysoce powtarzalnych urazów u larw danio pręgowanego za pomocą laserowego systemu uszkodzeń połączonego z automatyczną platformą mikroprzepływową do obsługi larw.

Kontrolowane półautomatyczne urazy indukowane laserem do badania regeneracji rdzenia kręgowego u larw danio pręgowanego

Poznaj metodę rany kłutej w mózgu dorosłego danio pręgowanego do badania neurogenezy i regeneracji OUN. Protokół obejmuje indukcję urazu mechanicznnego, immunohistochemię oraz analizę markerów proliferacji komórkowej.

Rana kłuta dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego: metoda badania neurogenezy i regeneracji mózgu kręgowców

Przeglądaj więcej filmów