Name: Obrazowanie wewnątrzkomórkowych sygnałów Ca2+ w astrocytach prążkowia od dorosłych myszy przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników wapnia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Poznaj metodę obrazowania sygnałów wapniowych w astrocytach prążkowia myszy przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników wapnia. Technika ta umożliwia badanie dynamiki wapnia w komórkach glejowych in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Większość prac i zaangażowany personel były wspierane przez NS060677 grantów NIH, a częściowo przez granty NIH MH099559 i MH104069 (dla BSK). Część prac była również wspierana przez Fundację CHDI.

Wszystkie protokoły dla zwierząt były zgodne z Przewodnikiem Amerykańskich Narodowych Instytutów Zdrowia dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na UCLA.
1.1) Przygotuj mikropipetę i ładowanie wirusa AAV2/5
<ol>
	<li>Do wstrzykiwania wirusa należy używać drobnych mikropipet ze szkła borokrzemianowego. Pociągnij mikropipetę za pomocą dwuetapowego programu ciągnięcia za pomocą pionowego ściągacza. Ukosuj pipetę pod kątem 40° za pomocą młynka do pipet. Pipeta, która jest idealna do użycia, będzie miała średnicę końcówki 20 - 40 μm i długość trzpienia 6 - 7 mm. Autoklaw pipetę i narzędzia chirurgiczne. Wiertło jest sterylizowane przez przetarcie 70% etanolem.</li>
	<li>Wirus AAV2/5-GfaABC1D.cyto-GCaMP3.SV40 (1,5 x10 13 gc/ml) należy przechowywać w temperaturze -80 °C w podwielokrotnościach 10 μl. Tuż przed zabiegiem wyjmij porcje z zamrażarki i przechowuj je na lodzie, aż zostaną użyte do napełnienia mikropipety.</li>
	<li>Napełnić mikropipetę wirusem za pomocą pompki strzykawkowej. Szczelnie połącz jeden koniec kawałka rurki, przez złączkę zaciskową rurki o odpowiednim rozmiarze, ze szklaną strzykawką ze wzmocnionym tłokiem. Przymocuj autoklawowaną mikropipetę do drugiego końca rurki za pomocą wyjmowanej złączki zaciskowej z igłą o odpowiednim rozmiarze.</li>
	<li>Przed załadowaniem wektora wirusa należy usunąć pęcherzyki powietrza z systemu pompowania, w tym rurki, strzykawki i mikropipety, wypełniając system olejem mineralnym zabarwionym czerwienią Sudan IV (~1 mg/50 ml) w strzykawce z igłą o pojemności 1 ml (27 G).</li>
	<li>Umieść czysty kawałek parafilmu pod szklaną mikropipetą i dozuj 5 - 10 μl wektora wirusowego na parafilm.</li>
	<li>Zassać wektor wirusowy, przesuwając tłok strzykawki do tyłu z prędkością 0,5 μl/min i zaznaczyć granicę między wektorem a olejem na szklanej pipecie.</li>
</ol>
1.2) Znieczulenie, strzyżenie włosów, unieruchomienie głowy i przygotowanie do kraniotomii
<ol>
	<li>Umieść mysz (P49-63, C57BL/6) w komorze wypełnionejN2OiO2 oraz 5% izofluranem. Oceń głębokość znieczulenia na podstawie utraty celowości ruchu i spowolnienia oddechu (~60 - 90/min). Obetnij włosy na głowie, gdy mysz jest znieczulona.</li>
	<li>Dopasuj mysz do ramy stereotaktycznej, z głową zabezpieczoną nausznikami, a nosem umieszczonym w systemie znieczulenia i wentylacji. Utrzymuj ciągły izofluran na poziomie 2 - 3%. Nałóż maść na sztuczne łzy na oba oczy, ponieważ myszy tracą odruch mrugania pod narkozą.</li>
	<li>Podawać 0,05 ml buprenorfiny (0,1 mg/ml) we wstrzyknięciu podskórnym w celu złagodzenia bólu.</li>
	<li>Oczyść obszar operacyjny 10% jodonu powidonu i 70% alkoholu trzy razy, naprzemiennie między dwoma roztworami i zaczynając od jodu powidonu. Zacznij od przodu i wytrzyj w kierunku tyłu, aby usunąć już obcięte włosy.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie skóry na czubku głowy, które zaczyna się między oczami, a kończy między uszami.</li>
</ol>
1.3) Kraniotomia i mikrozastrzyki
<ol>
	<li>Usuń okostną, przesuwając ją bawełnianym wacikiem, a następnie osusz powierzchnię czaszki wacikami dentystycznymi. Zrób znak wokół miejsca wstrzyknięcia i wywierć wokół krawędzi znaku za pomocą małego stalowego zadzioru napędzanego wiertłem o dużej prędkości.</li>
	<li>Usuń kość i oczyść powierzchnię solą fizjologiczną.</li>
	<li>Umieścić pipetę w lewym prążkowiu grzbietowym bocznym o następujących współrzędnych (mm): przednio-tylny +0,8, przyśrodkowo-boczny: +2,0, grzbietowo-brzuszny od powierzchni pialnej: -2,4 13. Należy zauważyć, że te współrzędne oznaczają, że końcówka igły do mikroiniekcji znajduje się tuż nad prążkowiem grzbietowo-bocznym (ryc. 1A, B), co oznacza, że tylko nieznacznie wnika w to jądro. Unikaj uszkadzania naczyń krwionośnych. Jeśli pipeta znajdzie się dokładnie na naczyniu krwionośnym, nieznacznie wyreguluj współrzędne o ~0,1 - 0,2 mm.</li>
	<li>Wstrzyknięcie należy rozpocząć z szybkością wstrzykiwania ustawioną na 0,2 μl/min i zazwyczaj wstrzyknąć od 1 do 1,5 μl wirusa.</li>
	<li>Po wstrzyknięciu należy pozostawić pipetę na miejscu na 10 minut, a następnie powoli wyjąć pipetę.</li>
	<li>Zakończ zamykając ranę pooperacyjną zewnętrznym szwem nylonowym z ciągłym szwem.</li>
</ol>
1.4) Odzyskiwanie
<ol>
	<li>Umieść mysz w czystej klatce na poduszce grzewczej na 24 godziny. Nie zwracaj myszy, która przeszła operację, do towarzystwa innych zwierząt, dopóki nie wyzdrowieje. Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka.</li>
	<li>Dodać trimetoprim sulfametoksyazol (5 ml na 500 ml wody, zawierający 40 mg trimetoprimu i 200 mg sulfametoksyzolu) w wodzie na tydzień. Buprenorfinę należy podawać dwa razy dziennie przez okres do 3 dni po zabiegu.</li>
	<li>Utrzymuj mysz w 12-godzinnym cyklu jasno-ciemnym, karmioną i pojoną codziennie oraz ważoną raz dziennie do 3 dni po zabiegu. W ciągu tych 3 dni każda mysz z utratą masy ciała większą niż 10% jest uważana za zagrożoną i zostanie poddana eutanazji, zamiast zostać poddana eksperymentom.</li>
	<li>Osobno zmieniaj klatkę myszy dwa razy w tygodniu i monitoruj ogólny stan zdrowia co najmniej raz dziennie. Zazwyczaj mysz jest używana w ciągu 2-3 tygodni po stereotaktycznych mikroiniekcjach.</li>
</ol>
2. Przygotowanie ostrego wycinka mózgu do konfokalnego obrazowania Ca2+
2.1) Przygotowanie roztworów do cięcia i nagrywania.
<ol>
	<li>Przygotować roztwór tnący składający się z (mM): 194 sacharozy, 30 NaCl, 4,5 KCl, 10 D-glukozy, 1 MgCl2, 1,2 NaH2PO4 i 26 NaHCO3 nasyconych 95%O2 i 5% CO2 .</li>
	<li>Przygotować roztwór rejestrujący składający się z (mM): 124 NaCl, 4,5 KCl, 1 MgCl2, 10 D-glukozy, 2 CaCl2, 1,2 NaH2PO4 i 26 NaHCO3; pH 7,3 - 7,4, 290 - 295 mOsm, nasyconych 95%O2 i 5% CO2 . Napełnić zlewkę do przechowywania wycinków mózgu roztworem do nagrywania i utrzymywać ją w temperaturze 34 °C.</li>
</ol>
2.2) Krojenie
<ol>
	<li>Dwa do trzech tygodni po stereotaktycznych mikroiniekcjach głęboko i nieuleczalnie znieczulij mysz, a następnie odetnij jej głowę.</li>
	<li>Wyjmij mózg i użyj ostrza, aby usunąć niewstrzykniętą prawą półkulę, a lewą zamontuj na tacy z wibratomem za pomocą super kleju. Napełnij tackę wibratomu lodowatym buforem do cięcia na zimno i nasycaj ją 95% O2 i 5% CO2 .</li>
	<li>Wytnij koronalne lub strzałkowe plastry mózgu prążkowia o grubości 300 μm. Zwykle można zebrać 4 - 5 koronalnych lub 6 - 7 strzałkowych wycinków prążkowia.</li>
	<li>Przenieść plastry do zlewki z ramkami ogrzanej w temperaturze 34 °C i przechowywać je tam przez 30 minut, a następnie przechowywać w temperaturze pokojowej w celu późniejszego zarejestrowania.</li>
	<li>Inkubować wycinki mózgu w natlenionym buforze rejestrującym w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut przed obrazowaniem [Ca2+]i.</li>
</ol>
3. Immunohistochemia (IHC)
<ol>
	<li>Dwa tygodnie po wstrzyknięciu wirusa wykonaj perfuzję transsercową myszy za pomocą PBS, a następnie 10% formaliny w PBS.</li>
	<li>Usuń, utrwal przez noc i krioprotekuj mózg w buforowanej 30% sacharozie przez co najmniej 2 dni.</li>
	<li>Przygotować skrawki o grubości 40 μm za pomocą mikrotomu kriostatu.</li>
	<li>Przepłukać skrawki 3 razy PBS w odstępie 10 minut.</li>
	<li>Inkubować skrawki przez 1 godzinę w PBS z 10% normalną surowicą kozią i 0,5% Triton X-100.</li>
	<li>Skrawki inkubować przez noc w temperaturze 4 °C w przeciwciałie pierwszorzędowym przygotowanym w PBS z 0,5% Triton X-100. Stosowane pierwszorzędowe przeciwciała były następujące: kurczak anty-GFP 1:1,000, mysi anty-S100β 1:400, mysi anty-NeuN 1:600, mysia syntetaza antyglutaminy 1:300.</li>
	<li>Przepłukać skrawki 3 razy PBS w odstępach 10 minut.</li>
	<li>Inkubować skrawki z przeciwciałami drugorzędowymi przygotowanymi w PBS z 10% normalną surowicą kozią przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Drugie przeciwciała były następujące: koza anty-mysz Alexa546 1:500, koza anty-kurczak Alexa488 1:500.</li>
	<li>Zamontuj sekcje na szkiełkach podstawowych, wysusz i nałóż kilka kropli środka montażowego zapobiegającego blaknięciu, a następnie powoli przykryj sekcje szklanym szkiełkiem nakrywkowym. Przechowywać szkiełka w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Rób zdjęcia pod mikroskopem konfokalnym z 40-krotną soczewką olejkową o aperturze numerycznej 1,3.</li>
</ol>
4. Obrazowanie konfokalne [Ca2+]i
UWAGA: Obrazowanie [Ca2+]i zostało wykonane przy użyciu mikroskopu konfokalnego z 40-krotnym obiektywem zanurzonym w wodzie o aperturze numerycznej 0,8.
<ol>
	<li>Między 1 a 5 godziną po pokrojeniu umieścić plasterek w komorze rejestrującej i połączyć go z natlenionym buforem nagrywającym w temperaturze pokojowej o natężeniu przepływu 1 - 2 ml na minutę. Następnie umieść platynową harfę z nylonowymi strunami na wierzchu plasterka, aby zminimalizować ruch podczas eksperymentu.</li>
	<li>Wizualizuj i lokalizuj prążkowie grzbietowe z luminescencją jasnego pola pod obiektywem 10-krotnego zanurzenia w wodzie.</li>
	<li>Przełącz się na soczewkę obiektywu 40X zanurzoną w wodzie i włącz linię 488 nm lasera argonowego. Zmieniając płaszczyznę ogniskowej, znajdź komórki znajdujące się około 20 μm poniżej powierzchni plasterka, wykazujące podstawową fluorescencję w somie, gałęziach i gałęziach. Warto zauważyć, że uszkodzone komórki zwykle wykazują poziom fluorescencji powyżej średniej, czego należy unikać.</li>
	<li>Użyj trybu "skanowanie ramek", aby rozpocząć skanowanie. Zazwyczaj natężenie lasera ustawione na 0,5 – 5% maksymalnej mocy wyjściowej jest wystarczające do zobrazowania [Ca2+]i za pomocą cyto-GCaMP3. Do monitorowania dynamiki [Ca2+]i na całym terytorium astrocytów zaleca się "skanowanie ramki" z szybkością skanowania 1 sekundę na klatkę lub krótszą, ale należy o tym zdecydować w zależności od danego eksperymentu.</li>
	<li>W razie potrzeby, aby zobrazować [Ca2+]i w procesach, należy użyć 2-3-krotnego powiększenia cyfrowego do monitorowania 1 - 2 astrocytów w całym polu widzenia.</li>
	<li>Aby uniknąć nasycenia pikseli podczas nagrywania, użyj trybu wyszukiwania "HiLo", aby pseudopokolorować komórki. Zawsze zaczynaj od "nagrania pilotażowego" przez około 5 minut, aby sprawdzić, czy czerwony kolor pojawia się jako wskaźnik nasycenia. Jeśli tak, zmniejsz moc wyjściową lasera lub obniż wartości PMT/wzmocnienia/przesunięcia i wykonaj kolejne nagranie pilotażowe, aby sprawdzić, czy wartości pikseli mieszczą się w zakresie nienasyconym. Zazwyczaj połączone parametry używane do obrazowania astrocytów [Ca2 +] i w prążkowiu są następujące: moc wyjściowa lasera 0,5 - 5% (z 10 mW), PMT 550 - 650 woltów, wzmocnienie 2,0 - 3,5X i przesunięcie 0 - 5%.</li>
</ol>

<ol><li>Agulhon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+role+of+astrocyte+calcium+in+neurophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology.</a> Neuron. 59, 932-946 (2008).</li>
<li>Khakh, B. S., North, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromodulation+by+extracellular+ATP+and+P2X+receptors+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuromodulation by extracellular ATP and P2X receptors in the CNS.</a> Neuron. 76, 51-69 (2012).</li>
<li>Gourine, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+control+breathing+through+pH-dependent+release+of+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP.</a> Science. 329, 571-575 (2010).</li>
<li>Florian, C., Vecsey, C. G., Halassa, M. M., Haydon, P. G., Abel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-derived+adenosine+and+A1+receptor+activity+contribute+to+sleep+loss-induced+deficits+in+hippocampal+synaptic+plasticity+and+memory+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-derived adenosine and A1 receptor activity contribute to sleep loss-induced deficits in hippocampal synaptic plasticity and memory in mice.</a> J Neurosci. 31, 6956-6962 (2011).</li>
<li>Shigetomi, E., Jackson-Weaver, O., Huckstepp, R. T., O'Dell, T. J., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPA1+channels+are+regulators+of+astrocyte+basal+calcium+levels+and+long-term+potentiation+via+constitutive+D-serine+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">TRPA1 channels are regulators of astrocyte basal calcium levels and long-term potentiation via constitutive D-serine release.</a> J Neurosci. 33, 10143-10153 (2013).</li>
<li>Tong, X., Shigetomi, E., Looger, L. L., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators+and+astrocyte+calcium+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators and astrocyte calcium microdomains.</a> Neuroscientist. 19, 274-291 (2013).</li>
<li>Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+targeted+optical+sensor+to+monitor+calcium+signals+in+astrocyte+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes.</a> Nat Neurosci. 13, 759-766 (2010).</li>
<li>Shigetomi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+microdomains+within+entire+astrocyte+territories+and+endfeet+with+GCaMPs+expressed+using+adeno-associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses.</a> J Gen Physiol. 141, 633-647 (2013).</li>
<li>Shigetomi, E., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+near+plasma+membrane+and+global+intracellular+calcium+dynamics+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Measuring near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics in astrocytes.</a> J Vis Exp. 26, (2009).</li>
<li>Reeves, A. M., Shigetomi, E., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+loading+of+calcium+indicator+dyes+to+study+astrocyte+physiology%3A+key+limitations+and+improvements+using+morphological+maps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Bulk loading of calcium indicator dyes to study astrocyte physiology: key limitations and improvements using morphological maps.</a> J Neurosci. 31, 9353-9358 (2011).</li>
<li>Li, D. D., Agulhon, C., Schmidt, E., Oheim, M., Ropert, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+investigating+astrocyte-to-neuron+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">New tools for investigating astrocyte-to-neuron communication.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, (2013).</li>
<li>Davila, D., Thibault, K., Fiacco, T. A., Agulhon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+molecular+approaches+to+understanding+astrocyte+function+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Recent molecular approaches to understanding astrocyte function in vivo.</a> Front Cell Neurosci. 7, 272(2013).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. Waltham, MA. (2012).</li>
<li>Perea, G., Yang, A., Boyden, E. S., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+astrocyte+activation+modulates+response+selectivity+of+visual+cortex+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Optogenetic astrocyte activation modulates response selectivity of visual cortex neurons in vivo.</a> Nat Commun. 5, 3262(2014).</li>
<li>Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes%3A+biology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Astrocytes: biology and pathology.</a> Acta Neuropathol. 119, 7-35 (2010).</li>
<li>Eid, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+glutamine+synthetase+in+the+human+epileptogenic+hippocampus%3A+possible+mechanism+for+raised+extracellular+glutamate+in+mesial+temporal+lobe+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Loss of glutamine synthetase in the human epileptogenic hippocampus: possible mechanism for raised extracellular glutamate in mesial temporal lobe epilepsy.</a> Lancet. 363, 28-37 (2004).</li>
<li>Eid, T., Williamson, A., Lee, T. S., Petroff, O. A., de Lanerolle, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+and+astrocytes--key+players+in+human+mesial+temporal+lobe+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Glutamate and astrocytes--key players in human mesial temporal lobe epilepsy.</a> Epilepsia. 49 Suppl 2, 42-52 (2008).</li>
<li>Tong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+Kir4.1+ion+channel+deficits+contribute+to+neuronal+dysfunction+in+Huntington%27s+disease+model+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington's disease model mice.</a> Nat Neurosci. 17, 694-703 (2014).</li>
<li>Ortinski, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+induction+of+astrocytic+gliosis+generates+deficits+in+neuronal+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition.</a> Nat Neurosci. 13, 584-591 (2010).</li>
<li>Zhang, Y., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+heterogeneity%3A+an+underappreciated+topic+in+neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology.</a> Curr Opin Neurobiol. 20, 588-594 (2010).</li>
<li>Reimsnider, S., Manfredsson, F. P., Muzyczka, N., Mandel, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+transgene+expression+after+intrastriatal+pseudotyped+rAAV2%2F1%2C+rAAV2%2F2%2C+rAAV2%2F5%2C+and+rAAV2%2F8+transduction+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Time course of transgene expression after intrastriatal pseudotyped rAAV2/1, rAAV2/2, rAAV2/5, and rAAV2/8 transduction in the rat.</a> Mol Ther. 15, 1504-1511 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisane tutaj metody pozwoliły nam na ekspresję cyto-GCaMP3 w astrocytach prążkowia in vivo do późniejszego obrazowania [Ca2 +] i in situ. Metoda ta ma zalety w porównaniu z myszami transgenicznymi lub knock-in, w tym silną ekspresję docelowego białka, szybkość i elastyczność wdrożenia eksperymentalnego oraz swoistość anatomiczną. Stwierdzono, że ekspresja GCaMP3 przy użyciu AAV2/5 jest specyficzna i solidna. Połączenie promotora GFAP GfaABC1D z AAV serotypu 5 ma kluczow...

Astrocyty to wszechobecne i obfite komórki glejowe mózgu. Powszechnie wiadomo, że astrocyty pełnią istotną rolę wsparcia i homeostazy, w tym buforowanie stężenia K+ w przestrzeni zewnątrzkomórkowej, wychwyt neuroprzekaźników, a także dostarczanie składników odżywczych. Jednak ostatnie badania pokazują, że wyświetlają one również sygnały [Ca2 +], i, które występują spontanicznie i są wzmacniane przez aktywność neuronalną1. Coraz częściej uważa się, że istnienie sygnalizacji astrocytów [Ca2 +] i wyzwala ich komunikację z neuronami i jako takie zostało zinterpretowane jako forma "pobudliwości Ca2+" w astrocytach. Dostępne dane z ostatnich dwóch dekad sugerują istnienie dwóch warunków, w których astrocyty i neurony mogą się komunikować, być może w sposób dwukierunkowy. Po pierwsze, astrocyty często reagują wzrostem [Ca2 +] i, gdy są aktywowane przez neuroprzekaźniki i neuromodulatory uwalniane z neuronów2. Po drugie, [Ca 2 +] wzrost w astrocytach powoduje uwalnianie cząsteczek sygnałowych z astrocytów, które z kolei mogą wpływać na neurony i naczynia krwionośne. Dowody sugerują, że cząsteczki uwalniane z astrocytów prowadzą do zmian w funkcjach synaps, obwodów i ostatecznie w zachowaniu3-5 poprzez sygnalizację astrocytów-neuronów. Jest to jednak nadal szybko rozwijający się obszar badań i argumentowano, że lepsze i bardziej szczegółowe zrozumienie astrocytów [Ca2+]i jest potrzebne do wyjaśnienia niektórych obecnych niewiadomych6.
W poprzednich pracach wykazano, że masowe ładowanie organicznych barwników wskaźnikowych Ca2+ do astrocytów nie wykrywa niezawodnie sygnałów [Ca2+]i w całych astrocytach w hodowli i in situ7-10. Wyniki te zostały omówione przez nas i innych6,11,12. Wyłaniający się obraz jest taki, że sygnały [Ca2 +] i w procesach astrocytów (np. gałęziach i rozgałęzieniach), które są głównymi miejscami interakcji z neuronami i naczyniami krwionośnymi, rzadko były szczegółowo badane. Ostatnio zastosowanie genetycznie kodowanych wskaźników wapnia (GECI), takich jak cytozolowe GCaMP3, GCaMP5G i GCaMP6 oraz wersji na uwięzi błony plazmatycznej (np. Lck-GCaMP3) umożliwiło badanie sygnałów [Ca2 + ]i w małych przedziałach astrocytów, takich jak cienkie procesy, w pobliżu błony plazmatycznej i na całych terytoriach7,8. Jednak GECI mają jedną wadę w stosunku do organicznych barwników wskaźnikowych Ca2 +, a jest nią wymóg, aby metody genetyczne selektywnie dostarczały geny kodujące do astrocytów in vivo przez okres kilku tygodni, aby GECI mogły zostać odpowiednio wyrażone. Ekspresję in vivo zwykle osiąga się przy użyciu myszy transgenicznych, myszy knock-in lub metod dostarczania opartych na wirusach. W niniejszym artykule JoVE przedstawiamy metody i procedury stosowane do dostarczania GECI do astrocytów prążkowia za pomocą wirusów związanych z adenowirusami. Skupiamy się na cyto-GCaMP3 jako przykładzie, ale ta sama podstawowa procedura działa w przypadku każdego innego reportera opartego na GECI lub białku fluorescencyjnym.

<table><tbody><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>Aparat Harvard</td><td>704506</td><td></td></tr><tr><td>Szklane kapilary</td><td>Świat Instrumenty precyzyjne</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Młynek do mikropipet</td><td>Narishige</td><td>EG-40</td><td></td></tr><tr><td>pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3</td><td>Addgene</td><td>44331</td><td>wysłano plazmid do UPenn Vector Core do pakowania wirusów</td></tr> 1 <tr><td>ml strzykawka</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>igła strzykawki</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>wirus AAV2/5 Rdzeń</td><td>wektorowy UPenn</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Sudan czerwony IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>67386</td><td></td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>CVS Apteka</td><td>152355</td><td></td></tr><tr><td>Kriostat</td><td>Leica</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr><tr><td>Instrument stereotaktyczny</td><td>David Kopf Instruments</td><td>900LS</td><td></td></tr><tr><td>High Speed Rotary Micromotor Kit</td><td>FOREDOM</td><td>K.1070</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Santa cruz biotechnology</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>Super Glue</td><td>Krazy&reg; Klej</td><td>KG925</td><td></td></tr><tr><td>Microslicer</td><td>Ted Pella</td><td>DTK-Zero 1</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopy konfokalne</td><td>Olympus</td><td>FV300 i FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Vector</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>kurczak anty-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>mysz anty-s100&beta;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2532</td><td></td></tr><tr><td>mysia anty-NeuN</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>mysia syntetaza antyglutaminowa</td><td>Millipore</td><td>MAB302</td><td></td></tr><tr><td>koza anty-mysza-Alexa546</td><td>Invitrogen</td><td>A11003</td><td></td></tr><tr><td>koza anty-kurczak-Alexa488</td><td>Invitrogen</td><td>A11039</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Szkło osłonowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5J</td><td></td></tr><tr><td>Medium montażowe</td><td>Vector</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie wewnątrzkomórkowych sygnałów ca2+ w astrocytach prążkowia od dorosłych myszy przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników wapnia

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Astrocyty wykazują spontaniczne wewnątrzkomórkowe fluktuacje stężenia Ca2+ ([Ca2+]i) i w kilku ustawieniach reagują na pobudzenie neuronów wzmocnionymi sygnałami [Ca2+]i. Zaproponowano, że astrocyty z kolei regulują neurony i naczynia krwionośne poprzez mechanizmy zależne od wapnia, takie jak uwalnianie cząsteczek sygnałowych. Jednak obrazowanie [Ca2 +] i w całych astrocytach dopiero niedawno stało się możliwe dzięki genetycznie kodowanym wskaźnikom wapnia (GECI), takim jak seria GCaMP. Zastosowanie GECI w astrocytach daje obecnie możliwość szczegółowego badania sygnałów astrocytów [Ca2 +] i w modelowych mikroobwodach, takich jak prążkowie, które jest największym jądrem zwojów podstawy. W niniejszym raporcie opisano szczegółowe metody chirurgiczne ekspresji GECI w astrocytach in vivo oraz podejścia do obrazowania konfokalnego w celu rejestracji sygnałów [Ca2 +] i w astrocytach prążkowia in situ. Zwracamy uwagę na środki ostrożności, niezbędne kontrole i testy w celu ustalenia, czy ekspresja GECI jest selektywna dla astrocytów i oceny oznak jawnej reaktywności astrocytów. Szczegółowo opisujemy również wycinki mózgu i warunki obrazowania, które umożliwiają wiarygodne obrazowanie [Ca2 +] i w astrocytach prążkowia in situ. Zastosowanie tych podejść ujawniło całe terytoria pojedynczych astrocytów prążkowia i spontanicznych sygnałów [Ca2 +] i w ich somatach, gałęziach i rozgałęzieniach. Dalsze stosowanie i rozszerzanie tych podejść w prążkowiu pozwoli na szczegółowe badanie sygnałów astrocytów [Ca2+]i w mikroobwodach prążkowia.

Aby uzyskać specyficzną dla astrocytów ekspresję cyto-GCaMP3 w prążkowiu, zastosowano wirusa towarzyszącego adenowirusom (AAV) serotypu 5 oraz promotor GFAP GfaABC1D (Rycyna 1A), o którym wcześniej wykazano, że indukuje silną ekspresję GCaMP3 i genu reporterowego w astrocytach hipokampa i kory mózgu8,14. Dwa tygodnie po mikroiniekcji wirusa do prążkowia myszy, mysz (~10 tygodni stara) została poddana perfuzji, a następnie wykonano IHC na cienkich przekrojach mózgu, aby ocenić ekspre...

Właściwości i funkcje wewnątrzkomórkowych sygnałów Ca2+ astrocytów w prążkowiu pozostają niew pełni zbadane. Opisujemy metody ekspresji genetycznie kodowanych wskaźników wapnia w astrocytach prążkowia przy użyciu wirusów związanych z adenowirusami serotypu 2/5 (AAV2/5), a także procedury wiarygodnego obrazowania sygnałów Ca2 + w astrocytach prążkowia in situ.

Obrazowanie wewnątrzkomórkowych sygnałów Ca2+ w astrocytach prążkowia od dorosłych myszy przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników wapnia

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

Ogólnym celem tej procedury jest zobrazowanie wewnątrzkomórkowych sygnałów wapniowych w astrocytach pri AAL od dorosłych myszy przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników wapnia, takich jak cyto G CAMP trzy. Osiąga się to poprzez najpierw wstrzyknięcie wirusa do prążkowia myszy. Następnie mysz może dojść do siebie przez dwa do trzech tygodni po operacji.Następnie mysz jest składana w ofierze i przygotowywane są ostre plastry mózgu. Ostatnim krokiem jest wykonanie konfokalnego obrazowania wapniowego wycinków mózgu. Ostatecznie chemia immunohisto jest wykorzystywana do wykazania, że trzeci obóz Cyto G ulega ekspresji tylko w astrocytach, ale nie w neuronach, i że wstrzyknięcie wirusa nie spowodowało jawnej reaktywności astrocytów.Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak transgeniczne lub nochi M, jest to, że umożliwia ona solidną ekspresję białka docelowego oraz szybką i elastyczną implementację eksperymentalną. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie sygnalizacji wapnia jako osteocytów, takie jak jak wiarygodny pomiar sygnałów wapnia jako osteocytów w gałęziach i rozgałęzieniach warstw osteocytów. Przygotuj się do wstrzyknięcia

imaging-intracellular-ca2-signals-striatal-astrocytes-from-adult-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisujemy sposób pomiaru dynamiki wapnia wewnątrzkomórkowego w pobliżu błony oraz w całej objętości komórki w hodowlach astrocytów, wykorzystując mikroskopię całkowitego wewnętrznego odbicia oraz epifluorescencyjną.

Pomiar dynamiki wapnia w pobliżu błony plazmatycznej oraz w całej przestrzeni wewnątrzkomórkowej astrocytów

Opisano metodę wprowadzania barwników wskaźnikowych wapnia do komórek strefy podkomorowej (SVZ) w celu rejestracji aktywności wapniowej. Potnatalna SVZ zawiera gęsto upakowane komórki, w tym komórki progenitorowe neuronów oraz neuroblasty. Zamiast ładowania metodą kąpielową, barwnik wstrzykiwano pod ciśnieniem bezpośrednio do tkanki, co pozwoliło na lepszą dyfuzję barwnika.

Przygotowanie ostrych skrawków strefy podkomorowej do obrazowania wapnia

Źródło: Bannai, H., et al., Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators. J. Vis. Exp. (2019 rok)Film demonstruje obrazowanie fluorescencyjne w celu obserwacji specyficznej dla przedziałów spontanicznej dynamiki wapnia w astrocytach poprzez sekwencyjne monitorowanie wrażliwych na wapń białek zlokalizowanych na błonie plazmatycznej i retikulum endoplazmatycznym.

Spontaniczne obrazowanie wapnia dla dynamiki specyficznej dla przedziałów w astrocytach

Tutaj opisujemy adaptację protokołów używanych do indukowania plastyczności homeostatycznej w neuronach do badania plastyczności receptorów sprzężonych z białkiem G astrocytów. Metoda ta, ostatnio wykorzystana do badania zmian w mGluR grupy astrocytarnej I u młodych myszy, może być stosowana do pomiaru skalowania różnych astrocytarnych GPCR w tkance dorosłych myszy in situ i in vivo oraz do lepszego zrozumienia wrażliwości receptorów astrocytarnych na zmiany aktywności neuronalnej.

Indukowanie plastyczności receptorów astrocytarnych poprzez manipulację szybkością odpalania neuronów

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania sygnalizacji wapniowej w populacjach poszczególnych typów komórek w mysim złączu nerwowo-mięśniowym.

Ex vivo Obrazowanie specyficznej dla komórki sygnalizacji wapniowej w trójdzielnej synapsie przepony myszy

Genetycznie kodowane wskaźniki Ca2+ (GECI) radykalnie zmieniły sposób wykonywania obrazowania in situ Ca2+. Aby zmaksymalizować odzysk danych z takich nagrań, wymagana jest odpowiednia analiza sygnałów Ca2+. Protokoły przedstawione w tym artykule ułatwiają kwantyfikację sygnałów Ca2+ zarejestrowanych in situ przy użyciu mapowania czasoprzestrzennego i analizy opartej na cząstkach.

Zastosowania technik mapowania czasoprzestrzennego i analizy cząstek do ilościowego określania wewnątrzkomórkowej sygnalizacji Ca2+ in situ

Ten proctocol ma na celu dostarczenie metody obrazowania in vitro i in vivo mitochondrialnego Ca2+ w astrocytach i neuronach.

Obrazowanie mitochondrialnego wychwytu Ca2+ w astrocytach i neuronach przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników Ca2+ (GECI)

Obecny protokół opisuje wykonanie dużego (6 x 3 mm2) okna czaszki przy użyciu folii spożywczej, przezroczystego silikonu i szkła nakrywkowego. To okno czaszkowe pozwala na eksperymenty in vivo z obrazowaniem wapnia w szerokim polu i z dwoma fotonami na tej samej myszy.

In vivo (in vivo) Szerokokątne i dwufotonowe obrazowanie wapnia za pomocą myszy przy użyciu dużego okna czaszki

Ten protokół opisuje chirurgiczną ekspozycję zwoju korzenia grzbietowego (DRG), a następnie GCaMP3 (genetycznie kodowany wskaźnik Ca2+; Białko zielonej fluorescencji-białko kalmoduliny-M13 3) Ca2 + obrazowanie zespołów neuronalnych przy użyciu myszy Pirt-GCaMP3 przy jednoczesnym stosowaniu różnych bodźców do ipsilateralnej tylnej łapy.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego

Protokół ten opisuje obrazowanie wapnia in vivo GCaMP nienaruszonych neuronów zwoju trójdzielnego (TG). Opis ten obejmuje chirurgię ekspozycji na TG, obrazowanie neuronów TG za pomocą mikroskopii konfokalnej in vivo , zastosowanie bodźców somatycznych podczas obrazowania mikroskopowego neuronów TG oraz analizę danych obrazowania wapnia GCaMP in vivo .

In vivo (in vivo ) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach nerwu trójdzielnego

Ten protokół dostarcza kompleksowego opisu metody jednoczesnego rejestrowania sygnałów wapniowych z neuronów i astrocytów w wielu obszarach mózgu związanych z pamięcią i demonstruje jej zastosowanie w paradygmacie zachowania uczenia się i pamięci.

Metoda fotometrii światłowodowej dwukolorowej do rejestracji aktywności astrocytów-neuronów w wielu regionach mózgu podczas nauki i zachowań pamięciowych

Poznaj metodę obrazowania sygnałów wapniowych w astrocytach prążkowia myszy przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników wapnia. Technika ta umożliwia badanie dynamiki wapnia w komórkach glejowych in vivo.

Obrazowanie wewnątrzkomórkowych sygnałów Ca2+ w astrocytach prążkowia od dorosłych myszy przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników wapnia (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie wewnątrzkomórkowych sygnałów Ca²⁺ w astrocytach prążkowia od dorosłych myszy przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników wapnia

Przeglądaj więcej filmów