Name: Izolacja i wzbogacenie ludzkich komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej w celu zwiększenia osteogenezy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Poznaj metodę izolacji ludzkich komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej o zwiększonym potencjale osteogenicznym przy użyciu cytometrii przepływowej. Technika ta wspiera rozwój medycyny regeneracyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez grant National Institutes of Health Research R01-DE021683-01 oraz grant National Institutes of Health Research R01-DE019434 dla M.T.L.; Stypendium badawcze Howard Hughes Medical Institute dla M.T.C. D.C.W. było wspierane przez A.C.S Franklin Martin Faculty Research Fellowship, The Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine oraz Stanford University Child Health Research Institute Faculty Scholar Award.

UWAGA: Wszystkie próbki pacjentów zostały pobrane za świadomą zgodą, a protokoły eksperymentalne zostały przejrzane i zatwierdzone przez Institutional Review Board Uniwersytetu Stanforda (Protokoły #2188 i #9999).
1. Izolacja komórek i hodowla:
<ol>
	<li>Pozyskanie ludzkiej podskórnej tkanki tłuszczowej od zdrowych pacjentek poddawanych planowej lipoaspiracji brzucha, boku i/lub uda w znieczuleniu miejscowym/ogólnym. Upewnij się, że uzyskano zgodę Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej (IRB) na protokół izolacji ASC z tkanek ludzkich i przestrzegaj instytucjonalnych środków ostrożności podczas pracy z takimi materiałami.</li>
	<li>Aby uzyskać SVF z lipoaspirowanej tkanki tłuszczowej, należy najpierw trzykrotnie przemyć lipoaspirat równymi objętościami 1x sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Ostrożnie zassać i wyrzucić dolną warstwę wodną.</li>
	<li>Przygotuj bufor do trawienia kolagenazy: 0,075% kolagenazy typu I w zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS). Przygotuj bufor FACS: 2% FBS, 1% P188 i 1% Pen-Strep w PBS. Przefiltruj oba roztwory za pomocą dostępnego na rynku filtra polieterosulfonowego o wielkości porów 0,22 μm o szybkim przepływie.</li>
	<li>Aby strawić przemytą tkankę tłuszczową, dodać równą objętość buforu do wytrawiania kolagenazy i bezpiecznie umieścić naczynie wytrawiające w łaźni wodnej z wytrząsaniem na 60 minut w temperaturze 37 °C (około 180 wstrząsów/min). 
	UWAGA: Najlepiej jest używać naczynia do wytrawiania o większej objętości niż jest to wymagane, ponieważ pozwala to na maksymalne trawienie podczas wytrząsania (tj. 250 ml buforu do trawienia kolagenazy, 250 ml umytej tkanki tłuszczowej w sterylnej kolbie o pojemności 1L).</li>
	<li>Zneutralizować aktywność enzymatyczną, dodając równą objętość buforu FACS i pozostawiając w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Następnie odwirować przy 233 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie odessać i wyrzucić supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu SVF o dużej gęstości.</li>
	<li>Zawiesić osad w 5-10 ml buforu do lizy krwinek czerwonych RT, w zależności od wielkości osadu. Pozostawić roztwór w temperaturze pokojowej przez 5 minut i odwirować przy 233 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad, dodając 5-10 ml tradycyjnej pożywki wzrostowej, w zależności od wielkości osadu (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM]/10% FBS/1% roztwór penicyliny-streptomycyny [pen-strep]).</li>
	<li>Przefiltruj zawiesinę przez nylonowe sitko o średnicy 100 μm, aby usunąć zanieczyszczenia komórkowe.</li>
	<li>Wirować przy 233 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant bez naruszania osadu.</li>
	<li>Zawiesić osad w 5-10 ml tradycyjnej pożywki wzrostowej, w zależności od wielkości osadu.</li>
	<li>Umieścić 2 x 106 komórek w standardowym naczyniu hodowlanym o średnicy 15 cm i założyć kultury pierwotne O/N w temperaturze 37 °C/21%O2, 5% CO2 . Utrzymywać na poziomie sub-konfluentnym, aby zapobiec spontanicznemu różnicowaniu w temperaturze 37 °C/21%O2, 5% CO2 w pożywkach wzrostowych. 
	UWAGA: Gęstość komórek w całkowicie zlewającej się płytce o długości 15 cm wynosi około 4-6 x 106 komórek.</li>
</ol>
2. Barwienie
<ol>
	<li>Hodowla ASC w tradycyjnym podłożu wzrostowym w temperaturze 37 °C/21% O2, 5% CO2 przez 36 godzin przed barwieniem/sortowaniem.</li>
	<li>Usunąć ASC z płytek hodowlanych za pomocą Accutase (zgodnie z protokołem producenta).</li>
	<li>Umyj komórki raz buforem FACS (PBS z 2% FBS i 1% paciorkowcem).</li>
	<li>Wirować przy 233 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant bez naruszania osadu. Ponownie zawiesić komórki w 0,5-1 ml buforu FACS (w zależności od liczby komórek i ilości pożądanego przeciwciała). 
	UWAGA: Objętość zawiesiny komórek, zgodnie z zaleceniami producenta przeciwciał FACS, określa stężenie przeciwciał. Jednak miareczkowanie stężenia przeciwciał przy użyciu stężenia początkowego 1:100 jest zwykle zalecane, jeśli stosuje się przeciwciało po raz pierwszy.</li>
	<li>Policz całkowitą liczbę komórek za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Zarezerwować 100 ul. podwielokrotności w probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml do użycia dla niebarwionej próbki i jednokolorowych próbek kontrolnych (w zależności od liczby użytych przeciwciał fluorescencyjnych).</li>
	<li>Dodać odpowiednie znakowane fluorescencyjnie przeciwciała monoklonalne (w określonych stężeniach, zgodnie z instrukcjami producenta) i inkubować przez 20-30 minut na lodzie, osłonięty przed światłem.
	<ol>
		<li>Aby oznaczyć subpopulację osteogenną: Rozcieńczyć anty-CD90 (APC anty-ludzki CD90 (Thy1)) lub anty-CD105 (FITC anty-ludzki CD105 (endoglin)) w buforze FACS do stężenia 1:50.</li>
		<li>Aby oznaczyć inne populacje komórek (np. komórki krwiotwórcze i śródbłonka): Rozcieńczyć anty-CD45 (Anti-Human CD45 Pacific Blue), anty-CD34 (Anti-Human CD34 APC) i/lub anty-CD31 (Anti-Human CD31 PE) w buforze FACS do stężenia 1:50.</li>
		<li>W przypadku niestosowania przeciwciał sprzężonych bezpośrednio, należy użyć biotynylowanego przeciwciała pierwszorzędowego z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym ze streptawidyną, takim jak streptawidyna PE-Cy7, w rozcieńczeniu 1:100.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po inkubacji przemyć komórki dwukrotnie: napełnić probówki buforem FACS i odwirować przy 233 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, zasysając supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w buforze FACS o pojemności 400-500 μl i przefiltrować próbki przez nylonowe sitko o średnicy 70 μm w celu usunięcia grudek komórek.</li>
	<li>Przenieść oznakowane komórki do probówek FACS z filtrem i przechowywać próbki na lodzie przez cały czas analizy.</li>
</ol>
3. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją
UWAGA: Poniższe kroki wymagają wcześniejszej wiedzy na temat sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) lub pomocy wykwalifikowanego technika.
<ol>
	<li>Korzystając z odpowiedniego oprogramowania FACS, zaprojektuj wykresy analityczne w celu zbadania rozproszenia do przodu (FSC), rozproszenia bocznego (SSC), fikoerytryny (PE)-Texas Red, błękitu pacyficznego, izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC), allofikocyjaniny (APC) i dowolnego innego fluoroforu używanego do znakowania komórek.</li>
	<li>Przed załadowaniem do sortownika komórek należy na krótko zawirować każdą próbkę, aby ponownie zawiesić komórki.</li>
	<li>Rozpocznij od analizy niebarwionej próbki w celu ustawienia bramek dla całej populacji komórek, wykluczenia resztek komórkowych i określenia podstawowej autofluorescencji.</li>
	<li>Dodać jodek propidyny (PI) do niebarwionej próbki i przeanalizować ją w celu wizualizacji populacji żywych komórek w całej populacji komórek. Zbuduj bramę wokół tej populacji.</li>
	<li>Przeanalizuj jednokolorową próbkę kontrolną dla każdego fluorochromu w celu ustawienia kompensacji fluorescencji.</li>
	<li>Przeanalizuj zabarwioną próbkę, aby ustawić położenie bramek do sortowania.</li>
	<li>Dodaj PI do barwionej próbki w celu wybarwienia martwych komórek.</li>
	<li>Sortowanie oznaczonych populacji komórek. Sortować do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml lub probówek stożkowych (15 ml) zawierających pożywkę hodowlaną.</li>
	<li>Ręcznie przerwij sortowanie po uzyskaniu wymaganej liczby komórek.</li>
	<li>Korzystając z FACS, przeprowadź kontrolę czystości, analizując niewielką frakcję (np. 500 komórek) pozyskanej populacji komórek. 
	UWAGA: Ten krok potwierdza czystość posortowanych populacji komórek. Idealnie, czystość powinna być większa niż 90-95%.</li>
	<li>Odwirować komórki w temperaturze 233 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C natychmiast po zakończeniu sortowania i ponownie zawiesić w 1 ml świeżej pożywki zawierającej 10% FBS. 
	UWAGA: Ilość użytego podłoża może zostać zwiększona w zależności od wielkości osadu komórkowego.</li>
	<li>Płytka na płytkach pokrytych żelatyną w celu poprawy żywotności komórek. W zależności od końcowej wydajności komórek, płytka 300 000 komórek na dołek w płytce 6-dołkowej, 100 000 komórek na studzienkę w płytce 12-dołkowej.</li>
</ol>

<ol><li>Narsinh, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+transcriptional+profiling+reveals+heterogeneity+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells.</a> J Clin Invest. 121, 1217-1221 (2011).</li>
<li>Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+large-scale+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microfluidic large-scale integration.</a> Science. 298, 580-584 (2002).</li>
<li>Warren, L., Bryder, D., Weissman, I. L., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+profiling+in+individual+hematopoietic+progenitors+by+digital+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transcription factor profiling in individual hematopoietic progenitors by digital RT-PCR.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17807-17812 (2006).</li>
<li>Warren, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+instability+is+not+a+universal+attribute+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional instability is not a universal attribute of aging.</a> Aging Cell. 6, 775-782 (2007).</li>
<li>Aalami, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+a+mouse+model+of+calvarial+healing%3A+differences+in+regenerative+abilities+of+juveniles+and+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Applications of a mouse model of calvarial healing: differences in regenerative abilities of juveniles and adults.</a> Plast Reconstr Surg. 114, 713-720 (2004).</li>
<li>Levi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD105+protein+depletion+enhances+human+adipose-derived+stromal+cell+osteogenesis+through+reduction+of+transforming+growth+factor+beta1+%28TGF-beta1%29+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">CD105 protein depletion enhances human adipose-derived stromal cell osteogenesis through reduction of transforming growth factor beta1 (TGF-beta1) signaling.</a> The Journal of biological chemistry. 286, 39497-39509 (2011).</li>
<li>Chen, X. D., Qian, H. Y., Neff, L., Satomura, K., Horowitz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thy-1+antigen+expression+by+cells+in+the+osteoblast+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Thy-1 antigen expression by cells in the osteoblast lineage.</a> J Bone Miner Res. 14, 362-375 (1999).</li>
<li>Malladi, P., Xu, Y., Yang, G. P., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+vitamin+D%2C+retinoic+acid%2C+and+dexamethasone+in+mouse+adipose-derived+mesenchymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Functions of vitamin D, retinoic acid, and dexamethasone in mouse adipose-derived mesenchymal cells.</a> Tissue engineering. 12, 2031-2040 (2006).</li>
<li>Levi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depot-specific+variation+in+the+osteogenic+and+adipogenic+potential+of+human+adipose-derived+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+reconstructive+surgery%22%5BJournal%5D)">Depot-specific variation in the osteogenic and adipogenic potential of human adipose-derived stromal cells.</a> Plastic and reconstructive surgery. 126, 822-834 (2010).</li>
<li>James, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen%2Festrogen+receptor+alpha+signaling+in+mouse+posterofrontal+cranial+suture+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Estrogen/estrogen receptor alpha signaling in mouse posterofrontal cranial suture fusion.</a> PloS one. 4, e1720(2009).</li>
<li>Locke, M., Feisst, V., Dunbar, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+human+adipose-derived+stem+cells%3A+separating+promise+from+clinical+need%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: human adipose-derived stem cells: separating promise from clinical need.</a> Stem Cells. 29, 404-411 (2011).</li>
<li>Glotzbach, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Information+Theoretic%2C+Microfluidic-Based+Single+Cell+Analysis+Permits+Identification+of+Subpopulations+among+Putatively+Homogeneous+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An Information Theoretic, Microfluidic-Based Single Cell Analysis Permits Identification of Subpopulations among Putatively Homogeneous Stem Cells.</a> PLoS One. 6, e21211(2011).</li>
<li>Zhu, M., Heydarkhan-Hagvall, S., Hedrick, M., Benhaim, P., Zuk, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+isolation+of+adipose-derived+stem+cells+from+human+lipoaspirates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Manual isolation of adipose-derived stem cells from human lipoaspirates.</a> J. Vis. Exp. , e50585(2013).</li>
<li>Mitchell, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotype+of+human+adipose-derived+cells%3A+temporal+changes+in+stromal-associated+and+stem+cell-associated+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers.</a> Stem Cells. 24, 376-385 (2006).</li>
<li>McMurray, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+surfaces+for+the+long-term+maintenance+of+mesenchymal+stem+cell+phenotype+and+multipotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency.</a> Nat Mater. 10, 637-644 (2011).</li>
<li>Katz, A. J., Tholpady, A., Tholpady, S. S., Shang, H., Ogle, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+and+transcriptional+characterization+of+human+adipose-derived+adherent+stromal+%28hADAS%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Cell surface and transcriptional characterization of human adipose-derived adherent stromal (hADAS) cells.</a> Stem Cells. 23, 412-423 (2005).</li>
<li>McIntosh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunogenicity+of+human+adipose-derived+cells%3A+temporal+changes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">The immunogenicity of human adipose-derived cells: temporal changes in vitro.</a> Stem Cells. 24, 1246-1253 (2006).</li>
<li>Choudhery, M. S., Badowski, M., Muise, A., Pierce, J., Harris, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+age+negatively+impacts+adipose+tissue-derived+mesenchymal+stem+cell+expansion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Donor age negatively impacts adipose tissue-derived mesenchymal stem cell expansion and differentiation.</a> Journal of translational medicine. 12, 8(2014).</li>
<li>Yoshimura, K., Suga, H., Eto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem%2Fprogenitor+cells%3A+roles+in+adipose+tissue+remodeling+and+potential+use+for+soft+tissue+augmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+medicine%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem/progenitor cells: roles in adipose tissue remodeling and potential use for soft tissue augmentation.</a> Regenerative medicine. 4, 265-273 (2009).</li>
<li>Chung, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD90+%28Thy-1%29+Positive+Selection+Enhances+Osteogenic+Capacity+of+Human+Adipose-Derived+Stromal+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">CD90 (Thy-1) Positive Selection Enhances Osteogenic Capacity of Human Adipose-Derived Stromal Cells.</a> Tissue Eng Part A. , (2012).</li>
</ol>

Żaden z autorów nie ma interesu finansowego w żadnym z produktów, urządzeń lub leków wymienionych w tym manuskrypcie. Żaden z autorów nie ma konkurencyjnego interesu finansowego do zgłoszenia.

Obecnie izolacja jednorodnych subpopulacji ASC z SVF ludzkiej tkanki tłuszczowej pozostaje trudnym, choć pożądanym celem. Izolacja proosteogennych subpopulacji ASC jest szczególnie pożądana, ponieważ takie komórki mogą być wykorzystywane do badania powstawania i homeostazy tkanek szkieletowych. Jednak SVF tkanki tłuszczowej wykazuje znaczną niejednorodność pod względem pojemności komórek macierzystych i potencjału różnicowania. 11 Molekularnych podstaw tej niejednorodności nie można zrozumieć na podstawie zbio...

Heterogeniczność populacji komórek macierzystych nie jest jeszcze w pełni zrozumiała i pozostaje główną przeszkodą w rozwoju klinicznie skutecznych zastosowań terapeutycznych opartych na komórkach macierzystych. Jednym z najczęstszych sposobów scharakteryzowania heterogenicznej populacji komórek macierzystych jest zastosowanie metody sortowania komórek, takiej jak sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS), w celu oddzielenia komórek na podstawie ich profili ekspresji markerów powierzchniowych. W miarę jak metody sortowania stają się coraz bardziej złożone, możliwe staje się zidentyfikowanie bardziej wyraźnych funkcjonalnych subpopulacji komórek. Technologie mikroprzepływowe są coraz częściej wykorzystywane do analizy ekspresji genów na poziomie pojedynczej komórki. Multipleksowana ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy (qPCR) w układzie mikroprzepływowym pozwala na skuteczną i niezawodną analizę transkrypcji pojedynczej komórki w wysokiej rozdzielczości. 1-5
W poprzednim badaniu wykorzystującym profilowanie transkrypcyjne pojedynczej komórki 48 genów, zaobserwowano znaczną heterogeniczność transkrypcji wśród ASC. 6 Jednak dystrybucja genów MSX2, BMP-5, BMP-7, ALP, OCN, RUNX2 wykazywała silny związek z klastrem komórek o wysoce osteogennych profilach transkrypcyjnych. Aby wyizolować komórki zgodnie z tym osteogennym profilem ekspresji genów, wzorce ekspresji antygenu powierzchniowego skorelowano z wzorcami transkrypcji, a następnie odkryto, że ekspresja markera powierzchniowego endoglinu (CD105) ściśle koreluje ze zwiększonym potencjałem różnicowania osteogennego ASC. Niezależnie od ekspresji CD105, ekspresja receptora powierzchniowego Thy-1 (CD90), białka błonowego połączonego z glikozylofosfatydyloinozytolem, jak wcześniej wykazano przez Chen i wsp., że jest związane z komórkami osteoprogenitorowymi, była również skorelowana z ekspresją genów osteogennych. 6,7 Odkrycia te dają możliwość prospektywnego wyizolowania subpopulacji w ramach większej heterogenicznej puli ASC o zwiększonej zdolności osteogennej do zastosowań w inżynierii tkanki kostnej opartej na komórkach.

<table><tbody><tr><td>Jednorazowe probówki stożkowe 250 ml</td><td>Corning (Thomas Scientific)</td><td>2602A43</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, wysoka glukoza, Suplement GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Betadine - Antyseptyczny roztwór powidonu/jodu</td><td>Purdue&nbsp;</td><td>PFC-67618015017</td><td></td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanka, 1X</td><td>Cellgro</td><td>21-023-CV</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, certyfikowana, pochodzenie z USA</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza z&nbsp; Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130-5G</td><td></td></tr><tr><td>ACCUTASE Cell Detachment Solution</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>APC Mouse Anti-Human CD90</td><td>BD Pharmingen</td><td>559869</td><td></td></tr><tr><td>FITC Mouse anti-Human CD105 (Endoglin)</td><td>BD Pharmingen</td><td>561443</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD45 eFluor 450 (zamiennik Pacific Blue)&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>48-9459-41</td><td></td></tr><tr><td>Anty-ludzki CD34 APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0349-41</td><td></td></tr><tr><td>Anty-ludzki CD31 (PECAM-1) PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0319-41</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna PE-Cy7</td><td>eBioscience</td><td>25-4317-82</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Instrument Aria II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Oprogramowanie</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i wzbogacenie ludzkich komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej w celu zwiększenia osteogenezy

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

Mezenchymalne komórki zrębowe pochodzące ze szpiku kostnego (BM-MSC) są uważane za złoty standard dla zastosowań inżynierii tkankowej opartej na komórkach macierzystych. Jednak proces, w którym muszą być zbierane, może wiązać się ze znaczną zachorowalnością w miejscu dawczym. W przeciwieństwie do tego, komórki zrębowe pochodzenia tłuszczowego (ASC) są łatwiej dostępne i łatwiejsze do zebrania, co czyni je atrakcyjną alternatywą dla BM-MSC. Podobnie jak BM-MSC, ASC mogą różnicować się w osteogenne komórki rodowe i mogą być wykorzystywane w zastosowaniach inżynierii tkankowej, takich jak wysiew na rusztowaniach w celu stosowania w wadach szkieletu twarzoczaszki. ASC uzyskuje się z frakcji zrębu naczyniowego (SVF) strawionej tkanki tłuszczowej, która jest niejednorodną mieszaniną ASC, komórek śródbłonka naczyniowego i komórek ściennych, komórek mięśni gładkich, perycytów, fibroblastów i komórek krążących. Analiza cytometryczna przepływowa wykazała, że profil znacznika powierzchniowego dla ASC jest podobny do profilu dla BM-MSC. Pomimo kilku opublikowanych doniesień ustalających markery fenotypu ASC, nadal brakuje konsensusu co do profili identyfikujących komórki osteoprogenitorowe w tej niejednorodnej populacji. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wyizolować i wykorzystać subpopulację ASC o zwiększonej zdolności osteogennej do naprawy krytycznych rozmiarów ubytków kalwarii.

Wykorzystanie CD90 jako markera dla komórek o zwiększonym potencjale osteogenicznym pozwala na wyizolowanie silnie wzbogaconych populacji ludzkich ASC (Rysunek 1A, 1B). Komórki ASC barwiono przeciwciałami anty-ludzkimi CD45 sprzężonymi z Pacific Blue, anty-ludzkimi CD105 sprzężonymi z FITC oraz anty-ludzkimi CD90 sprzężonymi z APC. Po sortowaniu poziom czystości wynosił ponad 98%, co potwierdzono w analizie po sortowaniu.
Zdefiniowanie grup komórek na podstawie profilów transk...

Niejednorodność transkrypcyjna w ludzkich komórkach zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej może być zdefiniowana na poziomie pojedynczej komórki za pomocą markerów powierzchni komórki i genów osteogennych. Opisujemy protokół wykorzystujący cytometrię przepływową do izolacji subpopulacji komórek o zwiększonym potencjale osteogennym, który może być wykorzystany do poprawy rekonstrukcji szkieletu twarzoczaszki.

Izolacja i wzbogacenie ludzkich komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej w celu zwiększenia osteogenezy

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie subpopulacji ludzkich komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej o zwiększonym potencjale osteogennym przy użyciu cytometrii wspomaganej przepływem. Ludzkie komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej lub ASC są pobierane z ludzkiego aspiratu lipo i hodowane przez 36 godzin. Komórki są następnie barwione przeciwciałami wybranymi do oznaczania populacji osteogennych, a pożądane populacje są izolowane za pomocą cytometrii wspomaganej przepływem.Ostatecznie barwienie fosfatazą alkaliczną i azaryną ujawnia zwiększony potencjał osteogenny izolowanych komórek. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku medycyny regeneracyjnej i rozwoju nowych terapii translacyjnych, ponieważ opisuje, jak wyizolować subpopulację ASC ze wzmocnioną osteogenezą. Poniższa procedura jest wykonywana przy użyciu ludzkiej podskórnej tkanki tłuszczowej od zdrowych pacjentek, które przeszły planową lipoaspirację brzucha, boku i/lub uda w znieczuleniu miejscowym lub ogólnym.Zacznij od 500 mililitrów do jednego litra tkanki w kanistrze ssącym pobranym bezpośrednio z sali operacyjnej. Natychmiast po zbiorach rozpocznij procedurę zbioru. Zmaksymalizuje to żywotność komórek w celu uzyskania zrębowej frakcji naczyniowej lub SVF z tkanki tłuszczowej aspirowanej lipo Zacznij od dodania sterylnego PBS w stosunku jeden do jednego.Następnie delikatnie potrząśnij kanistrem, aby wymieszać. Po wymieszaniu. Pozostaw roztwór do odstania, aż podzieli się na trzy warstwy.Wierzchnia warstwa oleju jest przezroczysta i żółta. Środkowa warstwa tłuszczu jest lepka, nieprzezroczysta i żółta, a dolna warstwa krwi jest czerwona. Ostrożnie za pomocą serologicznej, pipety, odessać i odrzucić dolną warstwę krwi, odessać górną warstwę oleju.Następnie powtórz to. Umyj dodatkowo dwa razy. Po przygotowaniu buforu do trawienia kolagenazy i buforu faksu, jak opisano w dokumencie towarzyszącym, umieścić je w kapturze razem z buforem do lizy czerwonych krwinek, tak aby mogły ogrzać się do temperatury pokojowej.Następnie umytą tkankę tłuszczową przenieść do dużej kolby i strawić ją w równej objętości buforu do trawienia kolagenazy. Umieścić kolbę w łaźni wodnej z wytrząsaniem na 60 minut. W 37 stopniach Celsjusza.Najlepiej jest używać naczynia do wytrawiania o większej objętości niż jest to wymagane, ponieważ pozwala to na maksymalne trawienie podczas wstrząsania. Na przykład 250 buforu do trawienia kolagenazy i 250 ml umytej tkanki tłuszczowej należy umieścić w sterylnej kolbie o pojemności jednego litra. Po inkubacji zneutralizować aktywność enzymatyczną, dodając równą objętość buforu faksowego i pozostawiając tkankę w temperaturze pokojowej na pięć minut.Następnie przenieś tkankę trawienną do jednorazowej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 250 mililitrów i odwiruj w temperaturze 233 g lub 20 minut w czterech stopniach Celsjusza. Po wirowaniu odessaj supinat i ponownie zawieś pel pel, dodając od pięciu do 10 mililitrów tradycyjnego wzrostu. Średnie, w zależności od wielkości pelletu.Następnie pipetować zawiesinę przez nylonowe sitko o średnicy 100 mikrometrów do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia komórkowe. Po odrzuceniu supernatantu paleta powinna wyglądać tak, jak pokazano. Tutaj, Reese, zawieś podniebienie w 10 mililitrach temperatury pokojowej.Bufor do czerwonej lizy. Pozostaw roztwór w temperaturze pokojowej na pięć minut, a następnie odwiruj go w temperaturze 233 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie wirować w temperaturze 233 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i wyrzucić pestkę, nie naruszając osadu.Następnie Resus zawiesić granulat w pięciu do 10 mililitrach tradycyjnego wzrostu. Średnie, w zależności od wielkości pelletu. Po zliczeniu komórek umieść 2 miliony komórek w 10-centymetrowym standardowym naczyniu hodowlanym i ustaw kultury pierwotne na noc.Utrzymuj komórki SVF na poziomie sub konfluentnym, aby zapobiec spontanicznemu różnicowaniu. 36 godzin po wysiewie podnieś komórki za pomocą Accutane zgodnie z protokołem producenta. Umyć komórki raz buforem faksowym, a następnie odwirować w temperaturze 233 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po zawirowaniu wyrzuć snat, nie naruszając pelletu. Ponownie zawieś komórki w 0,5 do jednego mililitra efektów. Bufor. Policz komórki za pomocą hemocytometru.Przydziel 1,2 miliona komórek do nieposortowanej grupy, która zostanie posiana osobno jako kontrola. W tym eksperymencie przenieś 100 mikrolitrowych kwatów do jednej 1,5-mililitrowej rurki einor. Dla każdej próbki, która ma być poddana analizie, należy przygotować jedną niebarwioną próbkę oraz pojedyncze kontrole barwy dla każdego z przeciwciał, które mają być użyte, i umieścić je na lodzie.Obok oznaczenia subpopulacji osteogennej rozcieńczyć anty CD 90 lub anty CD 1 0 5 w buforze faksu, aby oznaczyć inne populacje komórek, takie jak komórki hematopoetyczne i śródbłonka, rozcieńczyć anty CD 45, anty CD 34 i/lub anty CD 31 w buforze faksu. Po inkubacji przemyć komórki dwukrotnie, napełniając probówki buforem faksowym i odwirować w temperaturze 233 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po spirycie wirowym, snat po drugim płukaniu ponownie zawiesza komórki w 400 do 500 mikrolitrach efektów.Filtruj buforowo próbki przez nylonowe sitko o średnicy 70 mikrometrów do probówki wirówkowej w celu usunięcia grudek komórek. Wykonaj sortowanie komórek aktywowane fluorescencją, jak opisano w dołączonym protokole. Korzystając z wykresów analizy projektu oprogramowania faktograficznego, aby zbadać rozproszenie po stronie rozproszenia do przodu, eryn, izotiocyjanian fluorescencji Texas Red Pacific blue, cały cyjanek i wszelkie inne Fluor four używane do znakowania komórek.Ważne jest, aby upewnić się, że wykresy analizy faktów są rysowane odpowiednio, aby przypadkowo nie wykluczyć pożądanych populacji komórek. Posortuj oznakowane populacje komórek do 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych lub 15-mililitrowych stożkowych probówek zawierających hodowlę. Podłoże ręcznie przerwij sortowanie.Po uzyskaniu wymaganej ilości komórek do tego eksperymentu potrzebne jest około 2 miliony komórek. Następnie, korzystając z faktów, przeprowadź kontrolę czystości, analizując niewielką frakcję około 500 komórek z nabytej populacji komórek. Należy pamiętać, że ten krok potwierdza czystość posortowanych populacji komórek.Idealnie czystość powinna być większa niż 90 do 95% natychmiast po sortowaniu komórek wirówki w temperaturze 233 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie ponownie zawieś komórki w jednym mililitrowym, świeżym podłożu zawierającym 10% płytkę FBS, komórki na płytkach pokrytych żelatyną, aby poprawić żywotność komórek. W zależności od końcowej płytki do produkcji komórek, 300 000 komórek na dołek w płytce sześciodołkowej lub 100 000 komórek na dołek.W 12-dołkowej płytce do izolacji ludzkiej tkanki tłuszczowej docierają komórki zrębu o zwiększonym potencjale osteogennym. ASC wybarwiono sprzężonym anty-ludzkim CD 45 z Pacific Blue, Fitz Sprzężonym anty-ludzkim CD 1 0 5 i A PC sprzężonym anty-ludzkim CD 90 i wyizolowano zgodnie z opisem w tym filmie, jak pokazano tutaj, sortowanie na podstawie wysokiej ekspresji CD 90 lub niskiej ekspresji CD 1 0 5 dało wysoce wzbogacone populacje ludzkich ASC w celu scharakteryzowania potencjału osteogennego dwóch subpopulacji. CD 90 dodatnie CD 1 0 5, niskie i niesortowane ASC hodowano w pożywce do różnicowania osteogennego przez 14 dni, jak widać na tym obrazie.Barwienie fosfatazą alkaliczną, która służy jako wczesny wskaźnik tworzenia kości, było zwiększone w populacji z dodatnim wynikiem hodowli CD 90 w porównaniu z innymi grupami, kwantyfikacja za pomocą oprogramowania do analizy obrazu potwierdziła, że zaobserwowana różnica była znacząca. Podobnie, w dniu 14, barwienie allerowe i czerwone, które służy do wykrywania mineralizacji macierzy zewnątrzkomórkowej i służy jako metryka końcowego różnicowania osteogennego, zostało zwiększone w populacji CD 90 dodatnich w porównaniu z innymi grupami. Kwantyfikacja za pomocą oprogramowania do analizy obrazu również potwierdziła, że zaobserwowana różnica była znacząca.Dane te wskazują, że CD 90 dodatnie ASC są w stanie zmineralizować znacznie większą ilość macierzy zewnątrzkomórkowej niż komórki niesortowane, co sugeruje, że izolowane ASC zachowują zdolność do ulegania różnicowaniu osteogennemu po sortowaniu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować subpopulację ASC o zwiększonym potencjale osteogennym. Podczas pracy z próbkami pobranymi od ludzi, jak opisano w niniejszym protokole, ważne jest, aby zawsze nosić odpowiednią odzież ochronną.

isolation-enrichment-human-adipose-derived-stromal-cells-for-enhanced

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejszy protokół opisuje izolację komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej z aspiratu tłuszczowego oraz stworzenie krytycznego ubytku w kalwaru o rozmiarze 4 mm w celu oceny regeneracji szkieletu.

Naprawa modelu krytycznego ubytku kalwarii z wykorzystaniem stromalnych komórek pochodzących z tkanki tłuszczowej pozyskanych z lipoaspiratu

W 2001 roku naukowcy z UCLA opisali izolację populacji dorosłych komórek macierzystych, określanych jako komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej lub ASC. W tym artykule przedstawiono izolację ASC z lipoaspiratów przy użyciu ręcznego, enzymatycznego protokołu trawienia z użyciem kolagenazy.

Ręczna izolacja komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej z ludzkich lipoaspiratów

Ten protokół opisuje izolację komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej świni (pADSC) z podskórnych tkanek tłuszczowych z badaniem multipotencji. Multipotencjalne pADSC są wykorzystywane do wyznaczania procesów różnicowania adipocytów i badania transdyferencjacji do wielu linii komórkowych mezenchymy mezodermalnej lub dalszych linii ektodermy i endodermy do badań regeneracyjnych.

Izolacja i różnicowanie komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej z podskórnych tkanek tłuszczowych świń

Komórki zrębu pochodzące z tkanki tłuszczowej mogą być przydatne do inżynierii nowej tkanki z własnych komórek pacjenta. Przedstawiamy protokół izolacji subpopulacji ludzkich komórek zrębu pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC) o zwiększonym potencjale osteogennym, a następnie zastosowania komórek w teście gojenia kalwaryjnego in vivo.

Szybka izolacja komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej BMPR-IB+ do zastosowania w modelu gojenia ubytków nazębnych

Przedstawiamy protokół do zbadania biomarkerów ekspresji mRNA komórek pochodzących z okostnej (PDC) indukowanych przez witaminę C (witaminę C) i 1,25-dihydroksywitaminę D [1,25-(OH)2D3]. Ponadto oceniamy zdolność PDC do różnicowania się w osteocyty, chondrocyty i adipocyty.

Izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkiej okostnej pęcherzyków płucnych i wpływ witaminy D na aktywność osteogenną komórek pochodzących z okostnej

Odróżnienie białych i beżowych adipocytów od komórek progenitorowych naczyń tkanki tłuszczowej niesie ze sobą potencjał do metabolicznej poprawy otyłości. Opisujemy protokoły izolacji komórek śródbłonka CD34 + CD31 + z ludzkiego tłuszczu oraz późniejszej ekspansji i różnicowania in vitro do białych i beżowych adipocytów. Omówiono kilka dalszych zastosowań.

Izolacja, ekspansja i indukcja adipogenna komórek śródbłonka CD34+CD31+ z ludzkiej tkanki tłuszczowej i podskórnej

Ten protokół zapewnia bezenzymatyczną metodę izolowania mezenchymalnych komórek macierzystych z próbek abdominoplastyki i lipoaspiratu przy użyciu metody eksplantatu. Brak ostrych enzymów lub etapów wirowania zapewnia klinicznie istotne komórki macierzyste, które można wykorzystać do badań in vitro lub przenieść z powrotem do kliniki.

Bezenzymatyczna metoda izolacji i namnażania ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej

Produkty ksenogeniczne (chemiczne lub pochodzenia zwierzęcego) wprowadzone do etapów przygotowania/manipulacji terapii komórkowej są związane ze zwiększonym ryzykiem reaktywności immunologicznej i transmisji patogennej u pacjentów gospodarza. W tym artykule opisano całkowicie wolną od ksenogenów metodę izolacji i ekspansji in vitro ludzkich komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej.

Izolacja i hodowla ludzkich komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej za pomocą innowacyjnej metody wolnej od ksenogenu w terapii u ludzi

Ten protokół opisuje metodologię izolowania i identyfikacji mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (MSC) od szczurów Sprague Dawley.

Izolacja i identyfikacja mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej szczurów Sprague Dawley

Tkanka tłuszczowa jest doskonałym źródłem mezenchymalnych komórek macierzystych. Tutaj przedstawiamy krok po kroku ekstrakcję, hodowlę i charakterystykę komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC) z tkanki tłuszczowej najądrza szwajcarskich myszy.

Izolacja, ekspansja in vitro i charakterystyka mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej najądrza myszy

Przedstawiamy tutaj standardową metodę efektywnej izolacji komórek macierzystych pochodzących z tłuszczu i adipocytów, charakteryzującą się skróceniem czasu przetwarzania o &gt;90%, wysoką żywotnością komórek oraz szeroką kompatybilnością.

Efektywna izolacja komórek macierzystych i adipocytów pochodzących z tłuszczu z tkanki tłuszczowej wieprzi

Poznaj metodę izolacji ludzkich komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej o zwiększonym potencjale osteogenicznym przy użyciu cytometrii przepływowej. Technika ta wspiera rozwój medycyny regeneracyjnej.

Izolacja i wzbogacenie ludzkich komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej w celu zwiększenia osteogenezy

Przeglądaj więcej filmów