Bezpośrednia indukcja ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych krwi obwodowej

Ogólnym celem tej procedury jest bezpośrednia indukcja nerwowych komórek macierzystych z komórek krwi. Osiąga się to poprzez wzbogacenie CD 34-dodatnich hematopoetycznych komórek progenitorowych z krwi. Drugim krokiem jest transfekcja komórek CD 34 wirusem sendi zawierającym czynniki transkrypcyjne.

Następnie nerwowe komórki macierzyste są pozyskiwane przy użyciu selektywnej pożywki. Ostatnim krokiem jest różnicowanie indukowanych nerwowych komórek macierzystych w neurony, astroglej i oligodendrocyty. Ostatecznie mikroskopia immunofluorescencyjna służy do scharakteryzowania powstałych komórek.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak czas trwania neuronów bezpośrednio z fibroblastów, a także generowanie IPS, jest to, że metoda ta omija żmudny proces generowania i obliczania IPS, ale nadal zapewnia dużą ilość komórek neuronalnych, które mogą się odnosić, różnicować do neuronów. Po raz pierwszy wpadłem na pomysł tej metody, gdy zauważyłem, że dołączone transfekowane komórki CT 34 w rzeczywistości wykazują bardzo podobieństwo do pierwotnych hodowanych komórek neuroprogennych, co pokazuje, że procedura będzie była wykonana przez Marines, technika z mojego życia. Po wyizolowaniu komórek CD 34 z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej zgodnie z instrukcjami zawartymi w protokole tekstowym, rozpocznij proces hodowli komórek CD 34 za pomocą Resus, zawieszając komórki CD 34 w pożywce CD 34, a następnie zasiewaj komórki na 24-dołkowej płytce trzy razy od 10 do piątej komórki na studzienkę w jednym mililitrze pożywki.

Po inkubacji przez 24 godziny w inkubatorze do hodowli tkankowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla, zbierz pływające komórki i odwiruj zawiesinę komórkową w temperaturze 110 razy G w temperaturze pokojowej. Następnie odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w świeżej pożywce konserwacyjnej CD 34. Zobacz nową 24-dołkową płytkę w jednym razy od 10 do piątej komórki na studzienkę w jednym mililitrze pożywki, inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla przez dodatkowe pięć dni, wymieniając połowę pożywki co drugi dzień.

Poprzez ostrożne zasysanie górnej połowy supernatantu, podczas gdy komórki CD 34 znajdują się na dnie studzienek, jak pokazano tutaj w piątym dniu. Po posianiu zebrać komórki CD 34 i odwirować komórki w temperaturze 170 razy G przez 10 minut w temperaturze pokojowej, wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić komórki jak poprzednio i wysiać świeżą 24-dołkową płytkę raz po 10 do piątej komórki na studzienkę w jednym mililitrze pożywki. Następnie rozmrozić zestaw do przeprogramowania cyto tune IPS Sendi.

Najpierw zanurzając dna rurek w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 sekund, a następnie całkowicie rozmrozić w temperaturze pokojowej. Krótko odwirować probówki i umieścić je na lodzie. Przygotować mieszaninę wirusów Sendai, mieszając zalecaną objętość każdego wirusa wymienioną w świadectwie analizy dla odpowiedniej partii.

Zalecana jest wielokrotność infekcji wynosząca 15. Dodaj mieszaninę wirusa Sendai do każdej studzienki komórek CD 34. Następnie wymieszaj dołki, delikatnie potrząsając talerzem.

Po 24 godzinach inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla. Obserwuj wydajność transdukcji. Zauważ, że agregaty komórkowe i sfery, takie jak te pokazane tutaj, są wskaźnikami udanej transdukcji.

Następnie inkubuj komórki w inkubatorze do hodowli tkankowych przez pięć do siedmiu dni, aż pojawią się przyłączone komórki i osiągną 30 do 50% zbieżności, jak pokazano tutaj, co drugi dzień. Zmień połowę podłoża, ostrożnie przenosząc górną połowę podłoża do innego dołka. Jeśli kule komórkowe zostaną przeniesione do nowego, dobrze dodaj równą ilość świeżego podłoża.

Sprawdź płynność komórek za pomocą odwróconego mikroskopu. Gdy komórki są w 30 do 50% zlewne, odessać supernatant i rezerwę, a następnie dodać jeden mililitr neuronalnej pożywki progenitorowej do każdej studzienki, aby utworzyć płytkę zapasową za pomocą kulek w wirówce supernatantu, supernatantu rezerwowego o stężeniu 170 razy G przez 10 minut. Następnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad na płytce z pożywką progenitorową układu nerwowego na 24-dołkowej płytce pokrytej matryżelem.

Tak jak poprzednio, zmieniaj pożywkę w każdej płytce komórek co drugi dzień, aż komórki osiągną 60 do 80% zbieżności. Zwykle po tygodniu. Gdy komórki osiągną wymaganą konfluencję, odessać supernatant i dodać do każdej z nich jeden mililitr pożywki z nerwowych komórek macierzystych.

Następnie oddzielić komórki za pomocą skrobaka do komórek, a następnie bardzo delikatnie pipetować. Następnie przenieś komórki z jednego dołka z 24-dołkową płytką do jednego dołka z sześcioma dołkami. Talerz studni.

Dodaj kolejny mililitr pożywki do studzienki i po powtórzeniu procedury dla wszystkich studzienek, umieść sześciodołkową płytkę w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zmieniaj pełną objętość pożywki co drugi dzień, aż komórki osiągną 60% konfluencji, po czym dysocjuj i reflicytuj komórki w stosunku jeden do trzech, jak właśnie pokazano, aby zamrozić część niezróżnicowanych nerwowych komórek macierzystych. Najpierw przygotuj pożywkę do zamrażania komórek macierzystych, dodając 20% tlenku dimetylosulfa lub DMSO do pożywki z nerwowych komórek macierzystych i umieść na lodzie.

Następnie rozdziel komórki na płytce sześciodołkowej. Za pomocą skrobaka do komórek i delikatnego pipetowania. Zarezerwować podwielokrotność zawiesiny do zliczenia komórek, a następnie odwirować komórki w temperaturze 170 razy G przez 10 minut w temperaturze pokojowej, podczas gdy komórki się obracają, policzyć komórki w podwielokrotności zawiesiny za pomocą hemometru, cytometru lub automatycznego licznika komórek i obliczyć objętość pożywki wymaganą do uzyskania stężenia komórek jeden razy 10 do sześciu komórek na mililitr.

Po zakończeniu wirowania wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad w pożywce z nerwowymi komórkami macierzystymi w ilości od 10 do sześciu komórek na mililitr. Następnie dodaj równą objętość pożywki zamrażającej, pipetę pięć razy 10 do piątych komórek w objętości jednego mililitra do fiolki kriogenicznej i zamroź komórki w pojemniku do zamrażania zgodnie z instrukcjami producenta. Kiedy nerwowe komórki macierzyste w sześciodołkowej płytce osiągną 80% konfluencji, odłącz je za pomocą gumowego policjanta, a następnie rozdziel przez delikatne pipetowanie.

Zawiesinę komórkową umieścić w sterylnej probówce. Policz komórki za pomocą hemometru, cytometru lub automatycznego licznika komórek i dostosuj stężenie zawiesiny komórkowej do jednego razy 10 do piątej komórki na mililitr za pomocą pożywki z nerwowymi komórkami macierzystymi. Następnie odpipetować jeden mililitr zawiesiny komórek na poli D lizynę i pokryte laminatem szkiełko nakrywkowe w jednym dołku na płytce 24-dołkowej po powtórzeniu procedury dla żądanej liczby dołków.

Inkubować jak poprzednio przez 24 godziny. Po upływie czasu inkubacji odessać pożywkę i zastąpić różnicowaniem neuronalnym. Pożywkę inkubować przez dwa tygodnie w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, zmieniając podłoże dwa razy w tygodniu po dwóch tygodniach.

Neuronalne komórki macierzyste powinny być w pełni zróżnicowane, jak pokazano tutaj, i gotowe do dalszych zastosowań, takich jak barwienie immunofluorescencyjne. Pierwsze dwa obrazy pokazują, że nerwowe komórki macierzyste wyrażają się w gnieździe i SOX dwa. Podczas gdy trzeci obraz pokazuje, że OCT cztery nie jest wyrażone, DPI jest używane jako znacznik jądrowy, a pasek skali reprezentuje 200 mikronów.

Po zastosowaniu protokołu różnicowania opisanego w filmie, zróżnicowane neurony wyrażają marker neuronalny beta trzy tubulinę. Ludzkie nerwowe komórki macierzyste mogą być również różnicowane w komórki glejowe. Po różnicowaniu w astrocyty komórki wyrażają marker astrocytarny GFAP.

Wreszcie, na tym obrazie, komórki zostały zróżnicowane w oligodendrocyty i wyrażają marker oligodendrocytów. O cztery. Po opanowaniu wytwarzania indukowanych ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwi obwodowej można przeprowadzić w ciągu około trzech tygodni.

Jeśli zostanie wykonane prawidłowo, neuro komórki macierzyste mogą być dalej różnicowanymi neuronami i niejasnymi metodami ze względu na długie i skomplikowane procesy generowania IPS i mogą być łatwą opcją generowania kultur neuronalnych specyficznych dla pacjenta po jego rozwoju. Technika ta umożliwia naukowcom z dziedziny neurobiologii zbadanie modelowania indywidualnych kultur komórkowych dla różnych zaburzeń neurologicznych, które mogą lepiej reprezentować różnice genetyczne w określonych zaburzeniach, zwłaszcza w przypadku indywidualnych próbek pacjentów.