Name: Bezpośrednia indukcja ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych krwi obwodowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Poznaj metodę bezpośredniej indukcji ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych krwi obwodowej. Technika ta umożliwia różnicowanie w neurony, astrocyty i oligodendrocyty bez konieczności generowania iPSC.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy nie mają konfliktu interesów do ujawnienia.

1. Wzbogacanie hematopoetycznych komórek progenitorowych z dorosłej krwi pełnej
UWAGA: Krwiotwórcze komórki progenitorowe lub komórki CD34+ mogą być oczyszczane z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) pochodzących z różnych źródeł, w tym krwi pępowinowej, materiału leukaferezy i krwi pełnej, przy użyciu metod opartych na wirowaniu w gradionym gradimencie gęstości. Wymieniona tutaj metoda wykorzystuje jako przykład krew pełną.
<ol>
	<li>Izolacja PBMC z krwi pełnej:
	<ol>
		<li>Dodać 4,5 ml pożywki do separacji limfocytów do probówki SepMate, pipetując ją przez centralny otwór wkładki.</li>
		<li>Rozcieńczyć próbkę krwi równą objętością sterylnego DPBS zawierającego 2% surowicy ludzkiej (v/v). Na przykład rozcieńczyć 5 ml próbki 5 ml DPBS + 2% surowicy ludzkiej.</li>
		<li>Dodać rozcieńczoną próbkę, pipetując ją wzdłuż boku probówki. Należy uważać, aby nie przelać próbki bezpośrednio przez centralny otwór.</li>
		<li>Wirować przy 1 200 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć supernatant znajdujący się powyżej warstwy PMBC.</li>
		<li>Zbierz warstwę PBMC (mętną) do nowej probówki.</li>
		<li>Dodać 15 ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco zawierającego 2% surowicy ludzkiej do probówki i wirować przy sile 150 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej przy wyłączonym hamulcu.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 15 ml DPBS zawierającym 2% surowicy ludzkiej. Policz liczbę komórek.</li>
		<li>Wirować przy 690 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć cały supernatant z probówki.</li>
		<li>Zawiesić komórki w 1 x 107 komórek na 15 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco (IMDM) firmy Iscove zawierającego 1% antybiotyków (v/v) i 10% surowicy ludzkiej (v/v).</li>
		<li>Inkubować komórki O/N w temperaturze 37 °C w inkubatorze 5% CO2 przed wyizolowaniem komórek CD34+.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozytywna selekcja komórek CD34+ z PBMC przy użyciu zestawu CD34 MultiSort: 
	UWAGA: Pracuj szybko i używaj wstępnie schłodzonych roztworów, aby schłodzić komórki i zapobiec zamykaniu przeciwciał na powierzchni komórki oraz niespecyficznemu znakowaniu komórek zgodnie z instrukcją zestawu.
	<ol>
		<li>Zebrać wszystkie PMBC w probówce o pojemności 50 ml i policzyć całkowitą liczbę komórek w pożywce.</li>
		<li>Odwirować komórki przy sile 300 x g przez 10 minut. Całkowicie usunąć cały supernatant.</li>
		<li>Zawiesić do 108 komórek na 300 μl w buforze perełkowym (DPBS zawierającym 0,5% ludzkiej surowicy (v/v) i 2 mM EDTA).</li>
		<li>Dodać 100 μl odczynnika blokującego FcR i dodać 100 μl CD34 MultiSortMicroBeads.</li>
		<li>Dobrze wymieszać i inkubować przez 30 minut w lodówce (2 - 8 °C).</li>
		<li>Przemyć komórki, dodając 2 ml buforu perełkowego na10-8 komórek i odwirować przy 300 x g przez 10 minut w suchej temperaturze pokojowej. Całkowicie usunąć supernatant.</li>
		<li>Zawiesić do 108 komórek w 500 μl buforu.</li>
		<li>Umieścić kolumnę MACS LS w polu magnetycznym separatora MACS i przygotować kolumnę, przepłukując ją 3 ml buforu perełkowego.</li>
		<li>Zastosuj zawieszenie komórki na środku kolumny. Przepłyną nieoznakowane komórki, przez które można je zebrać, jeśli jest to preferowane.</li>
		<li>Przemyć kolumnę trzykrotnie 3 ml buforu do kulek.</li>
		<li>Wyjąć kolumnę z separatora i umieścić ją w probówce o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Dodać 5 ml buforu perełkowego do kolumny i natychmiast wypłukać magnetycznie znakowane komórki, wciskając tłok do kolumny.</li>
		<li>Dodać 20 μl odczynnika MultiSort Release na 1 ml zawiesiny komórek. Dobrze wymieszać i inkubować przez 10 minut w lodówce (2 - 8 °C).</li>
		<li>Dodać 1 - 2 ml buforu perełkowego na 107 komórek i odwirować komórki przy 300 x g przez 10 minut w suchej temperaturze miejsca. Całkowicie usunąć supernatant.</li>
		<li>Zawieś komórki w 50 μl buforu kulkowego na 10-7 komórek.</li>
		<li>Dodać 30 μl odczynnika MultiSort Stop na 10-7 komórek i inkubować przez 15 minut w lodówce.</li>
		<li>Dodać 5 ml buforu perełkowego i odwirować komórki przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wyprowadzenie indukowanych nerwowych komórek macierzystych z komórek CD34+
<ol>
	<li>Hodowla komórek CD34 +: 
	UWAGA: Świeżo przygotowane podłoże należy zużyć w ciągu 7 dni, jeśli jest przechowywane w lodówce. Znaczną utratę komórek CD34 można zaobserwować po 24 godzinach, ale znaczna proliferacja komórek powinna być zauważalna, zwłaszcza po 5 dniu. Jeśli liczba komórek stale spada lub nie ma proliferacji, oznacza to albo złą jakość pożywki, albo komórek CD34 i komórki nie powinny być używane do następnego kroku.
	<ol>
		<li>Zawiesić i hodować komórki CD34 + w pożywce podtrzymującej CD34 (pożywka StemSpan SFEM zawierająca ludzką trombopoetynę (TPO, 100 ng / ml), ligand kinazy tyrozynowej 3 podobnej do fms (Flt-3) (100 ng / ml) i czynnik komórek macierzystych (SCF, 100 ng / ml), interleukinę-6 (IL-6, 20 ng / ml) i interleukinę-7 (IL-7, 20 ng / ml)) na płytce 24-dołkowej (do 3 x 105 / dołek w 1 ml pożywki na basenik) w temperaturze 37 °C w inkubatorze 5% CO2 .</li>
		<li>Po 24 godzinach zbierz pływające komórki i odwiruj komórki przy 110 x g w temperaturze pokojowej, aby pozbyć się wszelkich przyczepionych komórek i resztek komórek. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml świeżej pożywki podtrzymującej CD34 i wysiewać nasiona na nowej 24-dołkowej płytce (do 1 x 105/dołek) w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez dodatkowe 5 dni.</li>
		<li>Wymieniaj połowę pożywki co drugi dzień, ostrożnie odsysając górną połowę supernatantu, podczas gdy komórki CD34+ unoszą się na dnie studzienek (ryc. 1A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transfekcja wirusa Sendai:
	<ol>
		<li>W 5 dniu zebrać komórki CD34 i odwirować komórki przy 170 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.</li>
		<li>Zawiesić komórki w świeżej pożywce w proporcjach 1 x 105/dołek na 24-dołkowej płytce w 1 ml pożywki.</li>
		<li>Rozmrozić zestaw do przeprogramowania cytotune-iPS Sendai, zanurzając najpierw dna probówek w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 10 sekund, a następnie całkowicie rozmrozić w temperaturze pokojowej. Krótko odwirować probówki i umieścić je na lodzie. Przygotować mieszaninę wirusów Sendai, mieszając zalecaną objętość każdego wirusa wymienioną w certyfikacie analizy (COA) dla odpowiedniej partii. Zalecany jest MOI 15.</li>
		<li>Dodaj mieszankę wirusa Sendai do każdej studzienki komórek CD34. Wymieszaj dołki, delikatnie potrząsając. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 .</li>
		<li>Obserwuj wydajność transfekcji po 24 godzinach. Zauważ, że agregaty komórek i tworzenie kul są wskaźnikami udanej transfekcji (Rysunek 1B).</li>
		<li>Zmień połowę podłoża, ostrożnie przenosząc górną połowę podłoża do innego dołka. Jeśli w nowej studzience znajdują się kule komórkowe, dodaj taką samą ilość świeżej pożywki.</li>
		<li>Zmieniaj podłoże co drugi dzień, powtarzając krok 2.2.6.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Indukcja nerwowych komórek macierzystych: 
	UWAGA: W zależności od warunków komórkowych, około 5 lub 7 dni po transfekcji, jednowarstwowe komórki przylegające osiągną 30-50% konfluencji (ryc. 1C).
	<ol>
		<li>Usunąć supernatanty zawierające pływające komórki i kulki, a następnie dodać 1 ml neuronalnej pożywki progenitorowej (Dulbecco's Modified Eagle Medium: Mieszanka składników odżywczych F-12 (DMEM/F12), zawierającej 1x suplement N2, 0,1% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 1% (v/v) antybiotyków, 20 ng/ml podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF) i 20 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF)) do przylegających komórek.</li>
		<li>Opcjonalnie należy rozdzielić kulki komórkowe poprzez delikatne pipetowanie i odwirować komórki przy stężeniu 170 x g przez 10 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki progenitorowej układu nerwowego na nowej 24-dołkowej płytce pokrytej matrycą zgodnie z instrukcją jako kopię zapasową.</li>
		<li>Zmieniaj pożywkę co drugi dzień, aż komórki osiągną 60 - 80% zlewania się, zwykle po 1 tygodniu.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i dodać 1 ml pożywki z nerwowych komórek macierzystych (pożywka wolna od surowicy, NSC SFM). Oddziel komórki za pomocą skrobaka do komórek, a następnie bardzo delikatnie pipetuj.</li>
		<li>Usuń komórki i wysiew je wszystkie w jednym dołku na 6-dołkowej płytce. Dodaj kolejny 1 ml pożywki z nerwowych komórek macierzystych, aby uzyskać 2 ml pożywki dla każdej studzienki. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 .</li>
		<li>Zmieniaj podłoże co drugi dzień.</li>
		<li>Gdy komórki osiągną 60% konfluencji, zdysocjuj i ponownie plateruj komórki w stosunku 1:3, wykonując czynności opisane w 2.3.4 i 2.3.6.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamrażanie nerwowych komórek macierzystych:
	<ol>
		<li>Przygotuj pożywkę do zamrażania nerwowych komórek macierzystych, dodając 20% dimetylosulfotlenku (DMSO) do pożywki z nerwowych komórek macierzystych. Utrzymuj zamrażarkę na lodzie.</li>
		<li>Oddzielić komórki na płytce 6-dołkowej za pomocą skrobaka do komórek, a następnie delikatnie pipetować. Policz komórki. Odwirować komórki przy stężeniu 170 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w pożywce z nerwowymi komórkami macierzystymi w proporcjach 1 x 106/ml. Dodać taką samą objętość pożywki do zamrażania do komórek.</li>
		<li>Dodać 1 ml (5 x 10 łącznie5 komórek) komórek w kriowalu. Zamroź komórki za pomocą pojemnika do zamrażania Mr. Froster zgodnie z instrukcją.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Różnicowanie komórek nerwowych
<ol>
	<li>Różnicowanie komórek nerwowych:
	<ol>
		<li>Gdy nerwowe komórki macierzyste osiągną 80% zbieżności, odłącz nerwowe komórki macierzyste za pomocą gumowego policjanta, a następnie rozdziel je przez delikatne pipetowanie.</li>
		<li>Policz komórki i dostosuj stężenie do 1 x 105/ml w pożywce z nerwowych komórek macierzystych.</li>
		<li>W celu różnicowania neuronów umieść komórki na szkiełkach nakrywkowych pokrytych poli-D-lizyną/lamininą na 24-dołkowych płytkach o wymiarach 1 x 105 / dołek. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 .</li>
		<li>Zastąp pożywkę pożywką do różnicowania neuronalnego (DMEM/F12 zawierającą 1x suplement N2, 1x suplement B27, 300 ng/ml cAMP, 0,2 mM witaminy C, 10 ng/ml czynnika neurotroficznego pochodzenia mózgowego (BDNF) i 10 ng/ml czynnika neurotroficznego pochodzącego z komórek glejowych (GDNF)) po 24 godzinach. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze 5% CO2 .</li>
		<li>Zmieniaj pożywkę różnicowania neuronalnego dwa razy w tygodniu przez 2 tygodnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zróżnicowanie astroglejowe:
	<ol>
		<li>Oddziel nerwowe komórki macierzyste przez pipetowanie.</li>
		<li>Policz komórki i dostosuj stężenie komórek do 5 x 104 komórek/ml. Wysiewaj komórki na 24-dołkowych płytkach. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 .</li>
		<li>Zastąp pożywkę DMEM/F12 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i inkubuj komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze 5% CO2 .</li>
		<li>Zmieniaj podłoże dwa razy w tygodniu przez 2 tygodnie. Jeśli komórki osiągną konfluencję przed 2 tygodniami, ponownie pokryj je płytkami, wykonując czynności 3.2.1 i 3.2.2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Różnicowanie oligodendrocytów:
	<ol>
		<li>Oddziel nerwowe komórki macierzyste przez pipetowanie.</li>
		<li>Policz komórki i zasiew 1 x 105 komórek na 24-dołkowych płytkach pokrytych poli-L-ornityną w 1 ml pożywki różnicującej oligodendrocyty składającej się z DMEM / F12 zawierającego suplement N2, 10 ng / ml płytkowego czynnika wzrostu AA (PDGF-AA), 2 ng / ml neurotrofiny-3 (NT-3), 2 ng / ml jeża sonicznego (Shh) i 3 nM trójjodotyroniny (T3). Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 .</li>
		<li>Zmieniaj podłoże dwa razy w tygodniu przez 2 tygodnie.</li>
		<li>Zastąp pożywkę DMEM/F12 suplementem 1xN2 i 3 nM T3 i hoduj komórki przez dodatkowy tydzień w celu produkcji podstawowego białka mieliny (MBP).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Barwienie immunofluorescencyjne
<ol>
	<li>Zastąp pożywkę 4% paraformaldehydem (PFA). Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wyrzuć PFA i przemyj PBS zawierającym 0,1% Triton X-100 (PBS-T) 3 razy po 5 minut za każdym razem.</li>
	<li>Przepuszczalność komórek za pomocą PBS zawierającego 0,5% Triton X-100 przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zablokuj komórki PBS-T zawierającym 4% surowicy koziej przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować komórki z odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi rozcieńczonymi w PBS-T zawierającym 0,1% BSA przez 2 godziny w temperaturze RT lub O/N w chłodni.</li>
	<li>Myj komórki 3 razy PBS-T, za każdym razem 5 minut. Inkubować komórki z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluorochromem, stosując rozcieńczenie 1:400 w PBS-T zawierającym 0,1% BSA przez 1 godzinę na wytrząsarce w ciemności.</li>
	<li>Przemyć komórki PBS-T zawierającym 4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj komórki jeszcze dwa razy PBS-T przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Obserwuj oznaczone komórki za pomocą mikroskopu i zrób zdjęcia (ryc. 3).</li>
</ol>

<ol><li>Azari, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+immature+neuronal+cells+from+neural+stem+cell+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny.</a> PLoS ONE. 6, e20941(2011).</li>
<li>Azari, H., Sharififar, S., Fortin, J. M., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuroblast+assay%3A+an+assay+for+the+generation+and+enrichment+of+neuronal+progenitor+cells+from+differentiating+neural+stem+cell+progeny+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The neuroblast assay: an assay for the generation and enrichment of neuronal progenitor cells from differentiating neural stem cell progeny using flow cytometry.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Zhang, N., An, M. C., Montoro, D., Ellerby, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Human+Huntington%27s+Disease+Cell+Model+from+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoSCurr%22%5BJournal%5D)">Characterization of Human Huntington's Disease Cell Model from Induced Pluripotent Stem Cells.</a> PLoSCurr. 2, RRN1193(2010).</li>
<li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-Specific+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disease-Specific Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Cell. 134 (5), 877-886 (2008).</li>
<li>Song, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+of+patient+specific+iPS+cells+as+a+novel+approach+to+study+the+pathophysiology+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation of patient specific iPS cells as a novel approach to study the pathophysiology of multiple sclerosis.</a> Stem Cell Research. 8 (2), 259-273 (2012).</li>
<li>Vierbuchen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+fibroblasts+to+functional+neurons+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors.</a> Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).</li>
<li>Pfisterer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+human+fibroblasts+to+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 10343-10348 (2011).</li>
<li>Lee, S. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Generation+of+Neurosphere-Like+Cells+from+Human+Dermal+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Direct Generation of Neurosphere-Like Cells from Human Dermal Fibroblasts.</a> PLoS ONE. 6, e21801(2011).</li>
<li>Thier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Conversion+of+Fibroblasts+into+Stably+Expandable+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct Conversion of Fibroblasts into Stably Expandable Neural Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).</li>
<li>Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Südhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+mouse+fibroblasts+to+self-renewing%2C+tripotent+neural+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 2527-2532 (2012).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+neural+stem+cells+from+human+adult+peripheral+CD34%2B+cells+for+an+autologous+model+of+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Derivation of neural stem cells from human adult peripheral CD34+ cells for an autologous model of neuroinflammation.</a> PLoS ONE. 8, e81720(2013).</li>
<li>Jin, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Sendai+virus+provides+a+highly+efficient+gene+transfer+into+human+cord+blood-derived+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Recombinant Sendai virus provides a highly efficient gene transfer into human cord blood-derived hematopoietic stem cells.</a> Gene Ther. 10 (3), 272-277 (2003).</li>
<li>Ban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+transgene-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+%28iPSCs%29+by+temperature-sensitive+Sendai+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 14234-14239 (2011).</li>
<li>Goolsby, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+progenitors+express+neural+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic progenitors express neural genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14926-14931 (2003).</li>
</ol>

Badanie jest finansowane ze środków krajowych NIH.

Podano szczegółowy protokół bezpośredniego generowania nerwowych komórek macierzystych z obwodowych hematopoetycznych komórek progenitorowych.
W porównaniu z komórkami fibroblastów ludzka krew obwodowa jest bardziej dostępna. Korzystając z przedstawionego protokołu, z 10 ml krwi pełnej można wzbogacić więcej niż 1 x10 5 hematopoetycznych komórek progenitorowych lub komórek CD34-dodatnich. Chociaż zanieczyszczeniu płytkami krwi zwykle nie można zapobiec, można je łatwo zmniejszyć, wi...

Hodowle neuronów in vitro były używane jako podstawowe narzędzie do badań nad chorobami neurologicznymi. W takich badaniach najczęściej wykorzystuje się pierwotne hodowle neuronalne zwierząt (głównie gryzoni) 1,2 oraz ludzkie linie komórek nerwowych pochodzące z glejaków lub innych nowotworów. Uznano jednak, że istnieją znaczne różnice między komórkami gryzoni i ludzkimi. Wielu ustaleń opartych na gryzoniach nie można przełożyć na ludzi. Co więcej, wraz z szybkim rozwojem analizy masowych informacji genomicznych oraz stosunkowo łatwą edycją genów i sekwencjonowaniem całego genomu, trend jest coraz bardziej nastawiony na odkrywanie genów podatnych na choroby i określanie ich funkcji i ról w określonych chorobach, co sprawia, że nieliczne ludzkie linie komórek neuronalnych mają tylko ograniczone zastosowanie. Teoretycznie najlepszym wyborem są pierwotne kultury neuronalne człowieka pochodzące z próbek układu nerwowego pacjenta, ale są one niemożliwe do uzyskania; W związku z tym konieczne są alternatywne metody. W ostatnich latach podjęto pewne działania, z których dwa są najbardziej charakterystyczne. Po opracowaniu techniki generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) przy użyciu mysich i ludzkich komórek somatycznych 3,4, komórki nerwowe mogą być od nich dalej różnicowane5-7. Jednak generowanie i charakteryzowanie iPSC wymaga intensywnego nakładu pracy, technik i czasu, czasami nawet zaporowego. Wkrótce potem opracowano inne podejście do bezpośredniej transformacji komórek neuronalnych z komórek somatycznych 8,9. Ponieważ powstałe neurony są nieproliferacyjne, ogranicza to jego zastosowanie w intensywnych badaniach i badaniach przesiewowych leków, które wymagają dużej ilości komórek. Aby skorzystać z obu technik, kilka grup10-12 badało bezpośrednie pochodzenie nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych z komórek somatycznych, co omija żmudny proces generowania i charakteryzowania iPSC, ale nadal zapewnia przyzwoitą liczbę nerwowych komórek macierzystych do późniejszego różnicowania neuronów. Wcześniej wykazaliśmy, że po wprowadzeniu czynników transkrypcyjnych Yamanaka do hematopoetycznych komórek progenitorowych, nerwowe komórki macierzyste mogą być bezpośrednio generowane przy użyciu pożywki selekcyjnej nerwowych komórek progenitorowych13. Tutaj szczegółowo opisujemy tę metodę.

<table><tbody><tr><td>Pożywka do separacji limfocytów</td><td>Lonza</td><td>17-829E</td><td>1x</td></tr><tr><td>SepMate</td><td>Stemcell Technologies</td><td>15415</td><td>15 ml</td></tr><tr><td>Surowica ludzka</td><td>Invitrogen</td><td>34005-100</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyki</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>1%</td></tr><tr><td>CD34 MultiSort Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-056-701</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Cellgro</td><td>46-034-Cl</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>MACS LS kolumna</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM medium</td><td>Stemcell Technologies</td><td>9650</td><td>1x</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Quality Biologicals</td><td>112-035-101</td><td>1x</td></tr><tr><td>TPO</td><td>Peprotech</td><td>300-18</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>Flt-3</td><td>Peprotech</td><td>300-19</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>SCF</td><td>Peprotech</td><td>300-07</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>IL-6</td><td>Peprotech</td><td>200-06</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>IL-7</td><td>Peprotech</td><td>200-07</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>IPS Sendai Zestaw do przeprogramowania</td> Life <td>Technologies</td><td>A1378001</td><td></td></tr><tr><td>Skrobak do komórek</td><td>Sarstedt</td><td>83.183</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki</td> <td>CryoTubePojemnik Thermo</td><td>368632</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty</td><td>Thermo</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12400-024</td><td>1x</td></tr><tr><td>suplement N2</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>1x</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A2934</td><td>0,1% (w/v)</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplement</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>1x</td></tr><tr><td>NSC surowica bez surowicy pożywka</td><td>Life Technologies</td><td>A1050901</td><td>1x</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe powlekane poli-D-lizyną/lamininą</td><td>BD Bioscences</td><td>354087</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma</td><td>A9501</td><td>300 ng/ml</td></tr><tr><td>Witamina C</td><td>Sigma</td><td>A0278</td><td>0,2 mM</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>Poli-L-ornityna</td><td>Sigma</td><td>P4957</td><td>1x</td></tr><tr><td>PDGF-AA</td><td>Peprotech</td><td>100-13A</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>NT-3</td><td>Peprotech</td><td>450-03</td><td>2 ng/ml</td></tr><tr><td>Shh</td><td>Peprotech</td><td>1314-SH/CF</td><td>2 ng/ml</td></tr><tr><td>T3</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td>3 nM</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>4%</td></tr> <tr><td>PBS</td><td>Jakość Biologiczna</td><td>119-069-101</td><td>1x</td></tr><tr><td>Kozia surowica</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td>4%</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Mysi monoklonalny anty-Nestin</td><td>Millipore</td><td>AB5922</td><td>1:1,000 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>anty-SOX2 przeciwciało</td><td>Zastosowane komórki macierzyste</td><td>ASA0120</td><td>Gotowe do użycia</td></tr><tr><td>Mysz anty-&beta; Przeciwciało III-tubuliny</td><td>Promega</td><td>G712A</td> 1<td>:1,000 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało anty-GFAP</td><td>Sigma</td><td>G4546</td><td>1:100 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-O4</td><td>R& Systemy D</td><td>MAB1326</td><td>IgM; 1 ng/ml</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 kozie przeciwciało anty-królicze</td><td>Technologie życia</td><td>A11012</td><td>1:400 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 kozie przeciwciało anty-mysie</td><td>Technologie życia</td><td>A11001</td><td>1:400 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 kozie przeciwciało anty-mysie IgM</td><td>Life techniologies</td><td>A21042</td><td>1:250 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>1 &mu; g/ml</td></tr></tbody></table>

bezpośrednia indukcja ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych krwi obwodowej

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Kultury neuronalne specyficzne dla chorób człowieka są niezbędne do generowania modeli in vitro dla ludzkich chorób neurologicznych. Jednak brak dostępu do pierwotnych kultur neuronalnych dorosłych ludzi rodzi wyjątkowe wyzwania. Ostatnie osiągnięcia w dziedzinie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) zapewniają alternatywne podejście do uzyskiwania kultur nerwowych z fibroblastów skóry za pomocą iPSC specyficznych dla pacjenta, ale proces ten jest pracochłonny, wymaga specjalnej wiedzy specjalistycznej i dużych zasobów oraz może trwać kilka miesięcy. Uniemożliwia to szerokie zastosowanie tej technologii do badania chorób neurologicznych. Aby przezwyciężyć niektóre z tych problemów, opracowaliśmy metodę pozyskiwania nerwowych komórek macierzystych bezpośrednio z ludzkiej dorosłej krwi obwodowej, z pominięciem procesu wyprowadzania iPSC. Hematopoetyczne komórki progenitorowe wzbogacone z ludzkiej dorosłej krwi obwodowej hodowano in vitro i transfekowano wektorami wirusa Sendai zawierającymi czynniki transkrypcyjne Sox2, Oct3/4, Klf4 i c-Myc. Transfekcja powoduje zmiany morfologiczne w komórkach, które są dalej selekcjonowane przy użyciu ludzkiej pożywki progenitorowej zawierającej podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) i czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEGF). Powstałe komórki charakteryzują się ekspresją markerów nerwowych komórek macierzystych, takich jak gniazdyna i SOX2. Te nerwowe komórki macierzyste mogą być dalej różnicowane do neuronów, astrogleju i oligodendrocytów w określonych pożywkach różnicujących. Wykorzystując łatwo dostępne próbki ludzkiej krwi obwodowej, metoda ta może być wykorzystana do uzyskania nerwowych komórek macierzystych w celu dalszego różnicowania się z komórkami nerwowymi w celu modelowania in vitro zaburzeń neurologicznych i może przyczynić się do postępu w badaniach związanych z patogenezą i leczeniem tych chorób.

Jakość komórek CD34 ma krytyczne znaczenie dla sukcesu transdukcji neuralnych komórek macierzystych. Wysokiej jakości komórki CD34 proliferują podczas pierwszych kilku dni hodowli i przyjmują postać nieprzywierających, homogenicznie okrągłych komórek, unoszących się tuż nad dnem naczyń hodowlanych (Rycina 1A). Pomyślna infekcja prowadzi do powstania agregatów komórkowych, które powiększają się w czasie (Rycina 1B), podczas gdy w trakcie hodowli mogą pojawić się niespecyficzne agregaty ko...

Opracowano metodę bezpośredniego pozyskiwania ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych wzbogaconych o komórki krwi obwodowej.

Bezpośrednia indukcja ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych krwi obwodowej

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest bezpośrednia indukcja komórek macierzystych neuronów z komórek krwi. Jest to osiągane poprzez wstępne wzbogacenie populacji CD 34-dodatnich komórek progenitorowych krwiotwórczych z krwi. Drugim krokiem jest transfekcja komórek CD 34 wirusem sendai zawierającym czynniki transkrypcyjne.Następnie, przy użyciu selektywnego pożywki, wyizolowano komórki macierzyste neuronów. Ostatnim etapem jest zróżnicowanie indukowanych komórek macierzystych neuronów w neurony, astroglia oraz oligodendrocyty. Ostatecznie, do charakterystyki otrzymanych komórek wykorzystuje się mikroskopię immunofluorescencyjną.Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak bezpośrednia konwersja neuronów z fibroblastów, a także generowanie iPS, jest fakt, że metoda ta omija żmudny proces generowania i hodowli iPS, a mimo to zapewnia dużą liczbę komórek neuronalnych, które mogą ulegać różnicowaniu w neurony. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy zauważyłem, że przytwierdzone przetransfekowane komórki CD 34 wykazują bardzo podobne cechy do pierwotnych hodowli komórek neurogennych, co potwierdza skuteczność procedury opracowanej we współpracy z technikiem z m

direct-induction-human-neural-stem-cells-from-peripheral-blood

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Bezpośrednie indukowanie ludzkich komórek macierzystych układu nerwowego z obwodowych krwiotwórczych komórek progenitorowych

Opracowaliśmy protokół indukcji neuroblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z zastosowaniem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów neuronalnych oraz typów komórek neuronalnych rozwijającego się OUN w celu regeneracji tkanki nerwowej.

Efektywne wyprowadzanie ludzkich progenitorów neuronalnych i neuronów z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z zastosowaniem indukcji małymi cząsteczkami

W niniejszym materiale przedstawiamy prosty i skuteczny protokół generowania ludzkich iPSC z 3-4 ml krwi obwodowej przy użyciu pojedynczego lentiwirusowego wektora reprogramującego. Reprogramowanie łatwo dostępnych komórek krwi daje nadzieję na przyspieszenie wykorzystania technologii iPSC poprzez udostępnienie jej szerszemu gronu badaczy.

Generowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu wektora lentiwirusowego STEMCCA

Ten film demonstruje przeprogramowanie komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMNC) na indukowane nerwowe komórki macierzyste (iNSC) za pomocą wirusa Sendai. Wirus Sendai jest nieintegrującym się wirusem, który oferuje skuteczny i bezpieczny pojazd do przeprogramowania komórek.

Generowanie indukowanych nerwowych komórek macierzystych (iNSC) z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMNC): procedura oparta na wirusie Sendai w celu przeprogramowania PBMNC na iNSC

Ten film pokazuje bezpośrednie przeprogramowanie genetycznie zmodyfikowanych hematopoetycznych komórek progenitorowych na neuronalne komórki macierzyste. Czynniki transkrypcyjne ulegające ekspresji przez krwiotwórcze komórki progenitorowe wywołują kaskadę zdarzeń molekularnych ułatwiających ich transformację. Dalsze specyficzne pożywki są używane do selekcji i wzrostu indukowanych neuronalnych komórek macierzystych.

Bezpośrednie przeprogramowanie hematopoetycznych komórek progenitorowych w neuronalne komórki macierzyste

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych dostarcza fascynujących perspektyw dla pochodnych autologicznych przeszczepów. Jednak progresja przez stan pluripotencjalny i pracochłonne różnicowanie nadal utrudnia translację kliniczną. Tutaj opisujemy pochodzenie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednią konwersję do indukowanych nerwowych komórek progenitorowych, a następnie różnicowanie w linie nerwowe.

Wyprowadzanie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednia konwersja do ekspandowalnych nerwowych komórek progenitorowych

Ten protokół opisuje efektywną indukcję hemogennego śródbłonka i wielopotencjalnych hematopoetycznych komórek progenitorowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych.

Bezpośrednia indukcja hemogennego śródbłonka i krwi przez nadekspresję czynników transkrypcyjnych w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych

Proponujemy protokół przeprogramowania komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC). Poprzez posiew transdukowanych komórek krwi na płytkach pokrytych matrycą za pomocą wirowania, iPSC są z powodzeniem indukowane z komórek pływających. Technika ta sugeruje prosty i skuteczny protokół przeprogramowania komórek, takich jak PBMC i CBMC.

Indukowane pluripotencjalne wytwarzanie komórek macierzystych z komórek krwi za pomocą wirusa Sendai i wirowania

Ten protokół opisuje szczegółową metodę efektywnego generowania bezintegracyjnych iPSC z ludzkich dorosłych komórek krwi obwodowej. Za pomocą czterech wektorów episomalnych opartych na oriP/EBNA do ekspresji czynników przeprogramowujących, KLF4, MYC, BCL-XL lub OCT4 i SOX2, z 1 ml krwi obwodowej można uzyskać tysiące kolonii iPSC.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych bez integracji z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej przy użyciu wektorów episomalnych

Protokół przedstawia przeprogramowanie komórek jednojądrzastych krwi obwodowej w celu wywołania nerwowych komórek macierzystych przez infekcję wirusem Sendai, różnicowanie iNSC w neurony dopaminergiczne, przeszczepianie prekursorów DA do jednostronnie uszkodzonych modeli mysich choroby Parkinsona oraz ocenę bezpieczeństwa i skuteczności prekursorów DA pochodzących z iNSC w leczeniu PD.

Generowanie indukowanych nerwowych komórek macierzystych z obwodowych komórek jednojądrzastych i różnicowanie w kierunku prekursorów neuronów dopaminergicznych do badań transplantacyjnych

Tutaj prezentujemy protokół precyzyjnego tworzenia hemogennego śródbłonka z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w stanie wolnym od karmów i kseno. Metoda ta będzie miała szerokie zastosowanie w modelowaniu chorób i badaniach przesiewowych pod kątem związków terapeutycznych.

Różnicowanie śródbłonka hemogennego od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w zdefiniowanym stanie wolnym od karmnika i ksenotypu

Tutaj prezentujemy protokół charakterystyki immunofenotypowej i indukowanego cytokinami różnicowania hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych CD34+ pochodzących z krwi pępowinowej do czterech linii szpikowych. Zastosowania tego protokołu obejmują badania nad wpływem mutacji choroby szpikowej lub małych cząsteczek na różnicowanie szpiku komórek CD34+.

Różnicowanie szpikowe ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych CD34+ pochodzących z krwi pępowinowej

Poznaj metodę bezpośredniej indukcji ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych krwi obwodowej. Technika ta umożliwia różnicowanie w neurony, astrocyty i oligodendrocyty bez konieczności generowania iPSC.

Bezpośrednia indukcja ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych krwi obwodowej

Przeglądaj więcej filmów