Name: Wykorzystanie bioortogonalnej cykloaddycji Dielsa-Aldera z odwróconym zapotrzebowaniem elektronów do wstępnie ukierunkowanego obrazowania PET (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-03T15:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Poznaj bioortogonalną cykloaddycję Dielsa-Aldera z odwróconym zapotrzebowaniem elektronów do wstępnie ukierunkowanego obrazowania PET nowotworów. Metoda wykorzystuje przeciwciało skierowane przeciwko rakowi jelita grubego i radioligand z 64Cu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Prof. Ralphowi Weisslederowi, Dr. Patowi Zanzonico i Dr. NagaVaraKishore Pillarsetty za pomocne rozmowy oraz NIH za fundusze (BMZ: 1K99CA178205-01A1)

OŚWIADCZENIE ETYCZNE: Wszystkie opisane eksperymenty na zwierzętach in vivo zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonym protokołem i zgodnie z etycznymi wytycznymi Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Synteza Tz-Bn-NOTA
<ol>
	<li>W małym naczyniu reakcyjnym rozpuścić 7 mg NH 2-Bn-NOTA (1,25 x 10-2 mmol) w 600 μl buforuNaHCO3 (0,1 M, pH 8,1). Sprawdź pH roztworu. W razie potrzeby dostosować pH roztworu do 8,1 przy użyciu małych porcji 0,1 M Na2CO3 .</li>
	<li>Dodać roztwór NH 2-Bn-NOTA do 0,5 mg Tz-NHS (1,25 x 10-3 mmol) w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml. 
	nuta: Tz-NHS można zważyć na sucho lub dodać z roztworu podstawowego suchego DMF lub DMSO (< 50 μl).</li>
	<li>Pozostawić otrzymany roztwór reakcyjny do reakcji przez 30 minut w temperaturze pokojowej z łagodnym mieszaniem.</li>
	<li>Po 30 minutach oczyścić produkt za pomocą chromatografii HPLCC18 z odwróconymi fazami w celu usunięcia nieprzereagowanego NH 2-Bn-NOTA. NH 2-Bn-NOTA może być monitorowany na długości fali 254 nm, podczas gdy Tz-NHS i Tz-Bn-NOTA najlepiej monitorować na długości fali 525 nm. 
	nuta: Czasy retencji są oczywiście w dużym stopniu zależne od konfiguracji sprzętu HPLC w każdym laboratorium (pompy, kolumny, rurki itp.). Jednakże, dla przykładu, jeśli gradient 0:100 MeCN/H2O (oba z 0,1% TFA) do 100:0 MeCN/H2O przez 25 minut i używana jest analityczna kolumna C18 4,6 x 250 mm, czasy retencji Tz-Bn-NOTA, Tz-NHS i NH 2-Bn-NOTA wyniosą około 15 minut, 16,5 minut, i 10 minut, odpowiednio. Produkt może być oczyszczony z innych składników reakcji w jednym cyklu lub wielu przebiegach przy użyciu półpreparatywnej lub preparatywnej kolumny C18 HPLC. 1H-NMR, analityczna HPLC i ESI-MS to metody, które można wykorzystać do weryfikacji czystości gotowego prekursora Tz-Bn-NOTA. 11</li>
	<li>Zebrać eluent HPLC zamrozić za pomocą ciekłego azotu.</li>
	<li>Owiń zamrożoną probówkę zbiorczą w nieprzezroczystą folię aluminiową.</li>
	<li>Umieścić zamrożoną probówkę zbiorczą w naczyniu liofilizującym O/N w celu usunięcia ruchomej fazy HPLC.</li>
	<li>Oczyszczony produkt (jasnoróżowe ciało stałe) należy przechowywać w ciemności w temperaturze -80 °C. 
	nuta: Jest to akceptowalny punkt zatrzymania procedury. Gotowy prekursor Tz-Bn-NOTA jest stabilny przez co najmniej 1 rok w tych warunkach.</li>
</ol>
2. Przygotowanie immunokoniugatu huA33-TCO
<ol>
	<li>W probówce do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml przygotować roztwór TCO-NHS o stężeniu 1 mg/ml (2,7 mM) w suchym DMF.</li>
	<li>W probówce do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml przygotować roztwór huA33 o stężeniu 2 mg/ml (13,3 μM) w 1 ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, pH 7,4 (0,01 M PO43-, 0,154 M NaCl).</li>
	<li>Stosując małe podwielokrotności (< 5 μl) 0,1 M Na2CO3 dostosować pH roztworu przeciwciała do 8,8-9,0. Do monitorowania pH należy używać papieru do pomiaru pH lub pH-metru z mikroelektrodą i uważać, aby pH nie wzrosło powyżej pH 9,0.</li>
	<li>Gdy roztwór przeciwciała osiągnie prawidłowe pH, dodaj objętość roztworu TCO-NHS odpowiadającą 8 molowym odpowiednikom aktywowanego estru. Na przykład dodać 7,9 μl roztworu TCO-NHS o stężeniu 1 mg/ml (1,07 x 10-7 mol TCO-NHS) do 1 ml roztworu przeciwciał huA33 o stężeniu 2 mg/ml (1,33 x 10-8 mol huA33). Nie przekraczać 5% objętości DMF w roztworze.</li>
	<li>Delikatnie wymieszaj roztwór, kilkakrotnie odwracając probówkę mikrowirówki.</li>
	<li>Owiń probówkę mikrowirówki w nieprzezroczystą folię aluminiową.</li>
	<li>Pozostawić roztwór do inkubacji przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z łagodnym mieszaniem.</li>
	<li>Po 1 godzinie w temperaturze pokojowej należy oczyścić otrzymany immunokoniugat za pomocą wstępnie zapakowanej kolumny odsalającej wykluczającej jednorazowy rozmiar. Najpierw przepłucz kolumnę wykluczającą rozmiar zgodnie z opisem dostawcy, aby usunąć wszelkie konserwanty obecne na kolumnie podczas przechowywania. Następnie dodać mieszaninę reakcyjną do kolumny wykluczającej rozmiar, przepłukać kolumnę 1,5 ml 0,9% sterylnego roztworu soli fizjologicznej, a następnie zebrać produkt, używając 2 ml 0,9% sterylnego soli fizjologicznej jako eluentu. 
	UWAGA: Na tym etapie otrzymasz kompletny huA33-TCO w postaci 2 ml roztworu.</li>
	<li>Zmierz stężenie wynikowego huA33-TCO na spektrofotometrze UV-Vis.</li>
	<li>Jeśli pożądane jest wyższe stężenie, stęż roztwór huA33-TCO za pomocą odśrodkowej jednostki filtrującej z odcięciem 50 000 mas cząsteczkowych. 
	UWAGA: Ważne jest, aby pamiętać, że podczas gdy huA33 i wiele innych dobrze znanych przeciwciał (np. bewacyzumab, trastuzumab, cetuksymab i J591) są bardzo tolerancyjne na koncentrację, agregacja i wytrącanie mogą wystąpić po stężeniu w innych przypadkach. Badacze próbujący przeprowadzić tę procedurę z nowym przeciwciałem powinni zaufać literaturze lub własnej wiedzy na temat danego przeciwciała w odniesieniu do tego, czy należy stężać przeciwciało, czy nie.</li>
	<li>Gotowy immunokoniugat huA33-TCO należy przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności. 
	UWAGA: Jest to dopuszczalny punkt zatrzymania procedury. Gotowy koniugat mAb-TCO powinien być stabilny przez co najmniej 3 miesiące w tych warunkach przechowywania.</li>
</ol>
3. 64Cu Radioznakowanie Tz-Bn-NOTA
UWAGA: Ten etap protokołu obejmuje obsługę i manipulację radioaktywnością. Przed wykonaniem tych kroków – lub wykonaniem jakichkolwiek innych prac związanych z radioaktywnością – naukowcy powinni skonsultować się z Departamentem Bezpieczeństwa Radiologicznego swojej instytucji macierzystej. Podejmij wszelkie możliwe kroki, aby zminimalizować narażenie na promieniowanie jonizujące.
<ol>
	<li>W probówce do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml przygotować roztwór Tz-Bn-NOTA o stężeniu 0,5 mg/ml (723 μM).</li>
	<li>Do probówki do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml dodać 10 μl roztworu Tz-Bn-NOTA (5 μg) do 400 μl 0,2 M buforu NH4OAc o pH 5,5. </li>
	<li>W celu prawidłowego prowadzenia notatek radiochemicznych, należy zmierzyć i zapisać ilość promieniotwórczości w próbce za pomocą kalibratora dawki przed i po wykonaniu kolejnych etapów poniższego protokołu (ppkt 3.4-3.8). Pomoże to w dokładnym określeniu wydajności radiochemicznej.</li>
	<li>Dodać 2 000 μCi (74 MBq) 64Cu do roztworu Tz-Bn-NOTA. 
	UWAGA: Zazwyczaj [64Cu]CuCl2 jest dostarczany w małej objętości (< 30 μl) 0,1 N HCl, a zatem do reakcji znakowania radioaktywnego potrzebne są tylko małe objętości (< 10 μl) tego roztworu podstawowego. Jeśli potrzebne są większe objętości [64Cu]CuCl2 zapasu, reakcja znakowania radioaktywnego jest tolerancyjna na zwiększenie całkowitej objętości reakcji. Należy jednak dokładnie monitorować pH roztworu reakcyjnego znakowanego radioizotopem, aby upewnić się, że nie spadnie ono poniżej pH 4,0.</li>
	<li>Pozostawić roztwór do inkubacji przez 10 minut w temperaturze pokojowej z łagodnym mieszaniem.</li>
	<li>Po 10 minutach inkubacji oczyścić produkt za pomocą chromatografii HPLCC18 z odwróconymi fazami. Czasy retencji są oczywiście w dużym stopniu zależne od konfiguracji sprzętu HPLC w każdym laboratorium (pompy, kolumny, rurki itp.). Jednak, aby przedstawić przykład, jeśli stosuje się gradient od 5:95 MeCN/H2O (oba z 0,1% TFA) do 95:5 MeCN/H2O w ciągu 15 minut, czas retencji 64Cu-Tz-Bn-NOTA powinien wynosić około 9,8 minuty, podczas gdy wolny, nieskompleksowany 64Cu będzie eluował się z czołem rozpuszczalnika po około 2-4 minutach.</li>
	<li>Za pomocą wyparki obrotowej usunąć eluent HPLC.</li>
	<li>Ponownie rozpuścić produkt 64Cu-Tz-Bn-NOTA w 0,9% sterylnej soli fizjologicznej. 
	UWAGA: Biorąc pod uwagę fizyczny okres półtrwania wynoszący 12,7 godziny wynoszący 64Cu, nie jest to akceptowalny punkt zatrzymania procedury. Przeprowadzić syntezę 64Cu-Tz-Bn-NOTA bezpośrednio przed wstrzyknięciem radioligandu i natychmiast postępować zgodnie z krokiem 3.7 zgodnie z krokiem 4.5.</li>
</ol>
4. Obrazowanie PET in vivo 
UWAGA: Podobnie jak w Sekcji 3 Protokołu, ten etap protokołu obejmuje obsługę i manipulację radioaktywnością. Przed wykonaniem tych czynności badacze powinni skonsultować się z Departamentem Bezpieczeństwa Radiologicznego swojej instytucji macierzystej. Podejmij wszelkie możliwe kroki, aby zminimalizować narażenie na promieniowanie jonizujące.
<ol>
	<li>U samicy atymicznej nagiej myszy należy wszczepić podskórnie 1 x 106 komórek raka jelita grubego SW1222 i pozwolić im wyrosnąć w ksenoprzeszczep o średnicy 100-150 mm3 (9-12 dni po zaszczepieniu). 11</li>
	<li>Rozcieńczyć podwielokrotność roztworu huA33-TCO z sekcji 2 protokołu do stężenia 0,5 mg/ml w 0,9% sterylnym roztworze soli fizjologicznej.</li>
	<li>Wstrzyknąć 200 μl roztworu huA33-TCO (100 μg) do żyły ogonowej myszy zawierającej ksenoprzeszczep.</li>
	<li>Odczekaj 24 godziny na akumulację huA33-TCO w guzie myszy.</li>
	<li>Rozcieńczyć radioligand 64Cu-Tz-Bn-NOTA do stężenia 1,5 mCi/ml w 0,9% sterylnym roztworze soli fizjologicznej.</li>
	<li>Wstrzyknąć 200 μl roztworu radioliganda 64Cu-Tz-Bn-NOTA (300 μCi; 11,1 MBq; 1,6 nmol 64Cu-Tz-Bn-NOTA, zakładając aktywność właściwą 6,7 MBq/nmol) do żyły ogonowej myszy z ksenograftem.</li>
	<li>W pożądanym punkcie czasowym obrazowania (np. 2, 6, 12 lub 24 godziny po wstrzyknięciu) znieczulij mysz 2% mieszaniną izofluranu i tlenu.</li>
	<li>Umieść mysz na łóżku skanera PET dla małych zwierząt. Utrzymuj znieczulenie podczas skanowania za pomocą 1% mieszaniny izofluranu i tlenu. Przed umieszczeniem zwierzęcia na łóżku skanera sprawdź znieczulenie metodą szczypania palców u nóg i nałóż maść weterynaryjną na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.</li>
	<li>Pozyskaj dane PET dla myszy za pomocą skanowania statycznego z co najmniej 20 milionami zbiegających się zdarzeń przy użyciu okna energetycznego 350-700 keV i okna czasowego koincydencji wynoszącego 6 nsec. Po zakończeniu akwizycji obrazu nie pozostawiaj myszy bez opieki i nie umieszczaj jej w klatce z innymi myszami, dopóki nie odzyska przytomności.</li>
</ol>

<ol><li>Wu, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+and+antimatter%3A+The+resurgence+of+immuno-PET%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET.</a> Journal of Nuclear Medicine. 50, 2-5 (2009).</li>
<li>Zeglis, B. M., Lewis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+the+construction+of+radiometallated+bioconjugates+for+positron+emission+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Dalton+Transactions%22%5BJournal%5D)">A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography.</a> Dalton Transactions. 40, 6168-6195 (2011).</li>
<li>Hollander, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bispecific+antibodies+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Bispecific antibodies for cancer therapy.</a> Immunotherapy. 1, 211-222 (2009).</li>
<li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+pretargeting+in+mice+using+99mTc-labeled+morpholino%2C+a+DNA+analog%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor pretargeting in mice using 99mTc-labeled morpholino, a DNA analog.</a> Journal of Nuclear Medicine. 43, 384-391 (2002).</li>
<li>Boerman, O. C., van Schaijk, F. G., Oyen, W. J. G., Corstens, F. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretargeted+radioimmunotherapy+of+cancer%3A+Progress+step+by+step%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pretargeted radioimmunotherapy of cancer: Progress step by step.</a> Journal of Nuclear Medicine. 44, 400-411 (2003).</li>
<li>Goldenberg, D. M., Sharkey, R. M., Paganelli, G., Barbet, J., Chatal, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+pretargeting+advances+cancer+radioimmunodetection+and+radioimmunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Antibody pretargeting advances cancer radioimmunodetection and radioimmunotherapy.</a> Journal of Clinical Oncology. 24, 823-834 (2006).</li>
<li>Sharkey, R. M., Chang, C. H., Rossi, E. A., McBride, W. J., Goldenberg, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretargeting%3A+taking+an+alternate+route+for+localizing+radionuclides%5BTitle%5D)+AND+%22Tumor+Biology%22%5BJournal%5D)">Pretargeting: taking an alternate route for localizing radionuclides.</a> Tumor Biology. 33, 591-600 (2012).</li>
<li>Sharkey, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+delivery+of+radionuclides+for+imaging+and+therapy+of+cancer+using+pretargeting+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Improving the delivery of radionuclides for imaging and therapy of cancer using pretargeting methods.</a> Clinical Cancer Research. 11, 7109-7121 (2005).</li>
<li>Schultz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tetravalent+single-chain+antibody-streptavidin+fusion+protein+for+pretargeted+lymphoma+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A tetravalent single-chain antibody-streptavidin fusion protein for pretargeted lymphoma therapy.</a> Cancer Research. 60, 6663-6669 (2000).</li>
<li>Lewis, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+evaluation+of+pretargeted+64Cu+for+tumor+imaging+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo evaluation of pretargeted 64Cu for tumor imaging and therapy.</a> Journal of Nuclear Medicine. 44, 1284-1292 (2003).</li>
<li>Zeglis, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pretargeted+PET+imaging+strategy+based+on+bioorthgonal+Diels-Alder+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">A pretargeted PET imaging strategy based on bioorthgonal Diels-Alder click chemistry.</a> Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013).</li>
<li>Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazine+ligation%3A+fast+bioconjugation+based+on+inverse+electron+demand+Diels-Alder+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Tetrazine ligation: fast bioconjugation based on inverse electron demand Diels-Alder reactivity.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 13518-13519 (2008).</li>
<li>Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Hatin, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+sensitive+pretargeted+labeling+of+cancer+cells+through+a+tetrazine%2Ftrans-cyclooctene+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie-International+Edition%22%5BJournal%5D)">Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition.</a> Angewandte Chemie-International Edition. 48, 7013-7016 (2009).</li>
<li>Devaraj, N. K., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+applications+of+tetrazine+cycloadditions%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Biomedical applications of tetrazine cycloadditions.</a> Accounts of Chemical Research. 44, 816-827 (2011).</li>
<li>Devaraj, N. K., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazine-based+cycloadditions%3A+application+to+pretargeted+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tetrazine-based cycloadditions: application to pretargeted live cell imaging.</a> Bioconjugate Chemistry. 19, 2297-2299 (2008).</li>
<li>Keliher, E. J., Reiner, T., Turetsky, A., Hilderbrand, S., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yielding%2C+two-step+18F+labeling+strategy+for+18F-PARP1+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem%22%5BJournal%5D)">High-yielding, two-step 18F labeling strategy for 18F-PARP1 inhibitors.</a> ChemMedChem. 6, 424-427 (2011).</li>
<li>Reiner, T., Earley, S., Turetsky, A., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+small-molecule+ligands+for+PARP1+imaging+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal small-molecule ligands for PARP1 imaging in living cells.</a> ChemBioChem. 11, 2375-2377 (2010).</li>
<li>Reiner, T., Keliher, E. J., Earley, S., Marinelli, B., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+in+vivo+imaging+of+a+18F-labeled+PARP1+inhibitor+using+a+chemically+orthogonal+scavenger-assisted+high-performance+method%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Synthesis and in vivo imaging of a 18F-labeled PARP1 inhibitor using a chemically orthogonal scavenger-assisted high-performance method.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50, 1922-1925 (2011).</li>
<li>Taylor, M. T., Blackman, M., Dmitrenko, O., Fox, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+synthesis+of+highly+reactive+dienophiles+for+the+tetrazine-trans-cyclooctene+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Design and synthesis of highly reactive dienophiles for the tetrazine-trans-cyclooctene ligation.</a> Journal of the American Chemical Society. 133, 9646-9649 (2011).</li>
<li>Selvaraj, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazine-trans-cyclooctene+ligation+for+the+rapid+construction+of+integrin+alpha%28v%29beta%283%29+targeted+PET+tracer+based+on+a+cyclic+RGD+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+and+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Tetrazine-trans-cyclooctene ligation for the rapid construction of integrin alpha(v)beta(3) targeted PET tracer based on a cyclic RGD peptide.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 21 (3), 5011-5014 (2011).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+18F+labeling+of+cysteine-containing+peptides+and+proteins+using+tetrazine-trans-cyclooctene+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Efficient 18F labeling of cysteine-containing peptides and proteins using tetrazine-trans-cyclooctene ligation.</a> Molecular Imaging. 12, 121-128 (2013).</li>
<li>Han, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+bioorthogonal+and+highly+efficient+conjugation+method+for+quantum+dots+using+tetrazine-norbornene+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Development of a bioorthogonal and highly efficient conjugation method for quantum dots using tetrazine-norbornene cycloaddition.</a> Journal of the American Chemical Society. 132, 7838-7839 (2010).</li>
<li>Zeglis, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+strategy+for+the+construction+of+radiometalated+antibodies+for+positron+emission+tomography+based+on+inverse+electron+demand+Diels-Alder+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Modular strategy for the construction of radiometalated antibodies for positron emission tomography based on inverse electron demand Diels-Alder click chemistry.</a> Bioconjugate Chemistry. 22, 2048-2059 (2011).</li>
<li>Zeng, D., Zeglis, B. M., Lewis, J. S., Anderson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growing+impact+of+bioorthogonal+click+chemistry+on+the+development+of+radiopharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">The growing impact of bioorthogonal click chemistry on the development of radiopharmaceuticals.</a> Journal of Nuclear Medicine. 54, 829-832 (2013).</li>
<li>Reiner, T., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inverse+electron+demand+Diels-Alder+reaction+in+radiochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Labeled+Compounds+and+Radiopharmaceuticals%22%5BJournal%5D)">The inverse electron demand Diels-Alder reaction in radiochemistry.</a> Journal of Labeled Compounds and Radiopharmaceuticals. 57, 285-290 (2014).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazine-trans-cyclooctene+ligation+for+the+rapid+construction+of+18-F+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Tetrazine-trans-cyclooctene ligation for the rapid construction of 18-F labeled probes.</a> Chemical Communications. 46, 8043-8045 (2010).</li>
<li>Karver, M. R., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+evaluation+of+a+series+of+1%2C2%2C4%2C5-tetrazines+for+bioorthogonal+conjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis and evaluation of a series of 1,2,4,5-tetrazines for bioorthogonal conjugation.</a> Bioconjugate Chemistry. 22, 2263-2270 (2011).</li>
<li>Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+chemistry%3A+fishing+for+selectivity+in+a+sea+of+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal chemistry: fishing for selectivity in a sea of functionality.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48, 6973-6998 (2009).</li>
<li>Bosch, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+strained+alkynes+for+Cu-free+click+reaction+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nuclear+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of strained alkynes for Cu-free click reaction in live mice.</a> Nuclear Medicine and Biology. 40, 415-423 (2013).</li>
<li>Rossin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+chemisry+for+pretargeted+tumor+imaging+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">In vivo chemisry for pretargeted tumor imaging in live mice.</a> Angewandte Chemie International Edition. 49, 3375-3378 (2010).</li>
<li>Ackerman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A33+antigen+displays+persistent+surface+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+and+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">A33 antigen displays persistent surface expression.</a> Cancer Immunology and Immunotherapy. 57, 1017-1027 (2008).</li>
<li>Carrasquillo, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((124I-huA33+antibody+PET+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">124I-huA33 antibody PET of colorectal cancer.</a> Journal of Nuclear Medicine. 52, 1173-1180 (2011).</li>
<li>Sakamoto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+I+radioimmunolocalization+trial+of+humanized+monoclonal+antibody+huA33+in+patients+with+gastric+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">A phase I radioimmunolocalization trial of humanized monoclonal antibody huA33 in patients with gastric carcinoma.</a> Cancer Science. 97, 1248-1254 (2006).</li>
<li>Rossin, R., Lappchen, R., vanden Bosch, S. M., LaForest, R., Robillard, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diels-Alder+reaction+for+tumor+pretargeting%3A+In+vivo+chemistry+can+boost+tumor+radiation+dose+compared+with+directly+labeled+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Diels-Alder reaction for tumor pretargeting: In vivo chemistry can boost tumor radiation dose compared with directly labeled antibody.</a> Journal of Nuclear Medicine. 54, 1989-1995 (2013).</li>
<li>Rossin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+reactive+trans-cyclooctene+tags+with+improved+stability+for+Diels-Alder+chemistry+in+living+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Highly reactive trans-cyclooctene tags with improved stability for Diels-Alder chemistry in living systems.</a> Bioconjugate Chemistry. 34, 1210-1217 (2014).</li>
<li>Emmetiere, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((18F-labeled-bioorthogonal+liposomes+for+in+vivo+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">18F-labeled-bioorthogonal liposomes for in vivo targeting.</a> Bioconjugate Chemistry. 24, 1784-1789 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Główną zaletą tej wstępnie ukierunkowanej strategii obrazowania PET jest to, że jest ona w stanie nakreślić guzy za pomocą kontrastu obrazu między celem a tłem przy zaledwie ułamku dawki promieniowania tła wytwarzanej przez bezpośrednio znakowane przeciwciała. Na przykład w opisanym tutaj systemie obrazowania raka jelita grubego wykorzystano dane z eksperymentów z ostrą biodystrybucją do wykonania obliczeń dozymetrycznych dla strategii pretargetowania opartej na 64Cu wraz z bezpośrednio znakowanymi 64</su...

W ciągu ostatnich trzydziestu lat, pozytonowa tomografia emisyjna (PET) stała się niezastąpionym narzędziem klinicznym w diagnostyce i leczeniu raka. Przeciwciała od dawna uważane są za obiecujące wektory dostarczania izotopów promieniotwórczych emitujących pozytony do nowotworów ze względu na ich wyjątkowe powinowactwo i swoistość wobec biomarkerów nowotworowych. 1,2 Jednak stosunkowo powolna farmakokinetyka przeciwciał in vivo wymaga stosowania izotopów promieniotwórczych o wielodniowym fizycznym okresie półtrwania. Ta kombinacja może powodować wysokie dawki promieniowania do narządów niedocelowych pacjentów, co jest ważnym powikłaniem, które ma szczególne znaczenie kliniczne, ponieważ radioimmunokoniugaty są wstrzykiwane dożylnie, a zatem – w przeciwieństwie do częściowej tomografii komputerowej ciała – skutkują pochłonięciem dawek w każdej części ciała, niezależnie od badanych tkanek.
Aby ominąć ten problem, wiele wysiłku poświęcono na rozwój strategii obrazowania PET, które rozdzielają radioizotop i grupę docelową, wykorzystując w ten sposób korzystne właściwości przeciwciał, jednocześnie omijając ich wewnętrzne ograniczenia farmakokinetyczne. Strategie te – najczęściej nazywane celowaniem wstępnym lub celowaniem wieloetapowym – zazwyczaj obejmują cztery etapy: (1) podanie przeciwciała zdolnego do wiązania zarówno antygenu, jak i radioligandu; (2) akumulacja przeciwciał w tkance docelowej i ich usunięcie z krwi; (3) podawanie małocząsteczkowego radioligandu; oraz (4) ligację in vivo radioligandu z przeciwciałem, po której następuje szybki klirens nadmiaru radioligandu. 3-8 W niektórych przypadkach między etapami 2 i 3 wstrzykuje się dodatkowy środek czyszczący w celu przyspieszenia wydalania przeciwciał, które jeszcze nie związały guza i pozostają we krwi. 5
Ogólnie rzecz biorąc, dwa rodzaje strategii pretargetowania są najbardziej rozpowszechnione w literaturze. Chociaż oba okazały się skuteczne w modelach przedklinicznych, mają również kluczowe ograniczenia, które utrudniają ich zastosowanie kliniczne. Pierwsza strategia opiera się na wysokim powinowactwie między przeciwciałami sprzężonymi ze streptawidyną a radioznakami modyfikowanymi biotyną; Jednak immunogenność przeciwciał zmodyfikowanych streptawidyną okazała się niepokojącym problemem w odniesieniu do translacji. 5,6,9,10 Druga strategia, w przeciwieństwie do tego, wykorzystuje bispecyficzne przeciwciała, które zostały genetycznie zmodyfikowane w celu wiązania zarówno antygenu biomarkera raka, jak i drobnocząsteczkowego haptenu znakowanego radioaktywnie. 3,11-14 Chociaż ta ostatnia ścieżka jest z pewnością twórcza, jej szerokie zastosowanie jest ograniczone przez złożoność, koszty i brak modułowości systemu.
Ostatnio opracowaliśmy i opublikowaliśmy wstępnie ukierunkowaną metodologię obrazowania PET opartą na reakcji cykloaddycji Dielsa-Aldera (IEDDA) z odwrotnym zapotrzebowaniem elektronów między transcyklooctenem (TCO) a tetrazyną (Tz; Rysunek 1). 11 Podczas gdy sama reakcja jest znana od dziesięcioleci, chemia IEDDA przeżywa w ostatnich latach renesans jako technika biokoniugacji chemii klikanej, co ilustrują fascynujące prace grup Ralpha Weissledera, Josepha Foxa i Petera Conti. 12-15 Cykloaddycja IEDDA została zastosowana w szerokim zakresie zastosowań, w tym w obrazowaniu fluorescencyjnym za pomocą peptydów, przeciwciał i nanocząstek, a także w obrazowaniu jądrowym zarówno za pomocą radiohalogenów, jak i radiometali. 16-26 Podwiązanie jest wysokowydajne, czyste, szybkie (k1 > 30 000 M-1 sec-1), selektywne i – co najważniejsze – bioortogonalne. 27 I chociaż wiele rodzajów chemii kliknięć – w tym katalizowane Cu cykloaddycje azydkowo-alkilonowe, cykloaddycje azydkowo-alkinowe promowane szczepem i ligacje Staudingera – są również bioortogonalne, to unikalne połączenie kinetyki szybkiej reakcji i bioortogonalności sprawia, że chemia IEDDA tak dobrze nadaje się do zastosowań pretargetowania w całych organizmach. 28,29 Idąc tym tropem, ważne jest, aby zauważyć, że niedawny raport z naszych laboratoriów nie był pierwszym, w którym zastosowano chemię IEDDA do pretargetingu: pierwsze doniesienie o obrazowaniu pretargetowanym za pomocą IEDDA powstało z pracy Rossina i wsp. i zawierało metodologię SPECT wykorzystującą tetrazynę znakowaną intopem 111. Rozdział 30
Jak omówiliśmy powyżej, metodologia pretargetingu składa się z czterech dość prostych kroków (Rysunek 2). W omawianym protokole opisana zostanie wstępnie ukierunkowana strategia obrazowania PET raka jelita grubego, która wykorzystuje radioligand tetrazynowy znakowany 64Cu-NOTA i zmodyfikowany TCO koniugat przeciwciała huA33. Jednak ostatecznie modułowość tej metodologii jest jedną z jej największych zalet, ponieważ ugrupowanie transcyklooktenu może być dołączone do dowolnego przeciwciała nieinternalizującego, a tetrazyna może być przyłączona do szerokiej gamy radioaktywnych reporterów.

<table><tbody><tr><td>Tetrazine NHS Ester</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>764701</td><td>Sklep w temperaturze -80 stopni; C</td></tr><tr><td>Trans-cyklookten NHS Ester</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>764523</td><td>Przechowywać w temperaturze -80 & deg; C</td></tr><tr><td>p-NH2-Bn-NOTA</td><td>Makrocykle</td><td>B-601</td><td>Przechowywać w temperaturze -80 &deg; Z</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie bioortogonalnej cykloaddycji dielsa-aldera z odwróconym zapotrzebowaniem elektronów do wstępnie ukierunkowanego obrazowania pet

Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging

Ze względu na swoje wyjątkowe powinowactwo i specyficzność, przeciwciała stały się niezwykle obiecującymi wektorami do dostarczania radioizotopów do komórek nowotworowych do obrazowania PET. Jednak konieczność znakowania przeciwciał radionuklidami o długim fizycznym okresie półtrwania często skutkuje wysokimi dawkami promieniowania tła w tkankach niebędących przedmiotem zwalczania. Aby obejść ten problem, zastosowaliśmy wstępnie ukierunkowaną strategię obrazowania PET opartą na reakcji cykloaddycji Dielsa-Aldera z odwrotnym zapotrzebowaniem elektronów. Metodologia ta oddziela przeciwciało od radioaktywności, a tym samym wykorzystuje pozytywne cechy przeciwciał, unikając jednocześnie ich wad farmakokinetycznych. System składa się z czterech etapów: (1) wstrzyknięcia koniugatu mAb-trans-cyklooctenu (TCO); (2) okres lokalizacji, w którym przeciwciało gromadzi się w guzie i usuwa się z krwi; (3) wstrzyknięcie znakowanej radioizotopowo tetrazyny; oraz (4) podwiązanie składników metodą click in vivo, po którym następuje usunięcie nadmiaru radioligandu. W przykładzie przedstawionym w niniejszej pracy, radioligand tetrazynowy znakowany 64Cu-NOTA i humanizowane przeciwciało sprzężone z trans-cyklooktenem (huA33) zostały z powodzeniem wykorzystane do nakreślenia guzów raka jelita grubego SW1222 o wysokim kontraście guza do tła. Co więcej, metodologia celowania wstępnego pozwala uzyskać wysokiej jakości obrazy przy zaledwie ułamku dawki promieniowania do tkanki niedocelowej utworzonej przez radioimmunokoniugaty bezpośrednio znakowane 64Cu lub 89Zr. Ostatecznie modułowość tego protokołu jest jedną z jego największych zalet, ponieważ ugrupowanie transcyklooctenu może być dołączone do dowolnego przeciwciała nieinternalizującego, a tetrazyna może być przyłączona do szerokiej gamy izotopów promieniotwórczych.

Pierwsze trzy etapy eksperymentu — synteza Tz-Bn-NOTA, konjugacja TCO z huA33 oraz radiomarkowanie konstruktu Tz-Bn-NOTA (Rysunki 3 i 4) — są wysoce niezawodne. W opisanym powyżej przypadku konstrukt Tz-Bn-NOTA został zsyntezowany z wysoką wydajnością i czystością. Przeciwciało huA33 zostało zmodyfikowane z uzyskaniem 4,2 ± 0,6 TCO/mAb, a Tz-Bn-NOTA został radiomarkowany 64Cu, co pozwoliło uzyskać oczyszczony radioligand o czystości radiochemicznej &gt;99%, wydajności skorygow...

Bioortogonalna cykloaddycja Dielsa-Aldera została wykorzystana do stworzenia skutecznej i modułowej, pretargetowanej strategii obrazowania PET dla raka. W niniejszym protokole etapy tej metodologii są opisane w kontekście systemu modelowego wykorzystującego przeciwciało ukierunkowane na raka jelita grubego huA33 i radioligand znakowany 64Cu.

Wykorzystanie bioortogonalnej cykloaddycji Dielsa-Aldera z odwróconym zapotrzebowaniem elektronów do wstępnie ukierunkowanego obrazowania PET

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest wstępne znakowanie tkanki nowotworowej za pomocą reakcji bioortogonalnej pomiędzy Tet INE a trans-cyklooktynem w celu obrazowania PET. Jest to realizowane poprzez wstrzyknięcie myszy z nowotworem przeciwciała znakowanego trans-cyklooktynem, po czym następuje okres oczekiwania, podczas którego przeciwciało powoli gromadzi się w guzie i jest usuwane z krwi. Następnie temu samemu zwierzęciu wstrzykuje się radioligand tetrazynowy.Radioligand łączy się w reakcji typu click z przeciwciałem znakowanym TCO w obrębie guza, a dzięki temu, że jest to mała cząsteczka, szybko usuwa się z krwi. Uzyskane obrazowanie PET małych zwierząt wykazuje wyraźne odgraniczenie guza przy wysokim kontraście i wysokich stosunkach aktywności guza do tła. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak obrazowanie PET z bezpośrednio znakowanymi przeciwciałami, jest uzyskanie obrazów o wysokim kontraście przy zaledwie ułamku dawki promieniowania podawanej pacjentowi.Zastosowania tej techniki obejmują terapię, ponieważ metody wstępnego celowania (pre-targeting) pozwalają dostarczyć bardzo wysokie dawki promieniowania do guzów, podczas gdy dawki dostarczane do zdrowych organów i tkanek pozostają bardzo niskie. Będę demonstrować tę technikę wraz z Catherine Kazą, technikiem w naszym laboratorium. Reakcję syntezy rozpoczynamy od rozpuszczenia 7 mg NH₂-BN-Notta w 600 µL 0,1 M wodorowęglanu sodu o pH 8,1.Sprawdź pH i w razie potrzeby użyj małych alikwotów 0,1 molarnego węglanu sodu, aby dostosować pH do wartości 8,1. Następnie dodaj ten roztwór do 0,5 miligrama TZ NHS w probówce do mikrocentryfugi. Pozostaw odczynnik do inkubacji przez pół godziny w temperaturze pokojowej przy łagodnym mieszaniu.Zapasy TZ NHS można rozpuścić w DMF lub DMSO po pół godzinie. Produkt należy oczyścić za pomocą HPLC w odwróconej fazie C 18, aby usunąć niereaktywne NH two BN notta, które będą widoczne przy 254 nanometrach. TZ NHS i TZ BN Notta najlepiej monitorować przy 525 nanometrach.Czas retencji próbki będzie różnić się w zależności od sprzętu, jednak przy zastosowaniu gradientu acetonitrylanu i wody od 0 do 100 i ponownie do 0 w ciągu 25 minut oraz analitycznej kolumny C 18 o wymiarach 4,6 by 250 milimetrów, czasy retencji dla trzech związków wyniosą odpowiednio 16,5, 15 i 10 minut. Zamrozić zebraną frakcję HPLC w ciekłym azocie, a następnie owinąć probówkę nieprzezroczystą folią aluminiową. Następnie umieścić zamrożoną probówkę w naczyniu do liofilizacji i pozostawić w liofilizatorze przez noc.Aby usunąć fazę ruchomą HPLC w celu weryfikacji czystości otrzymanego prekursora TZ bn no top, należy zastosować analityczną spektroskopię protonowego NMR, HPLC i/lub spektrometrię mas ESI. Reakcję rozpoczyna się od przygotowania 2,7 milimolowego roztworu T-C-O-N-H-S w DMF w probówce do mikrowirówki, a w drugiej probówce do mikrowirówki należy przygotować roztwór HUA 33 o stężeniu dwóch miligramów na mililitr w 1 ml PBS o pH 7,4.Następnie, dodając niewielkie ilości 0,1 M węglanu sodu, dostosuj pH roztworu do wartości między 8,8 a 9,0, nie przekraczając tej górnej granicy. Następnie dodaj objętość T-C-O-N-H-S odpowiadającą ośmiu ekwiwalentom molowym aktywnego estru. Delikatnie wymieszaj roztwór, kilkakrotnie odwracając naczynie, a następnie owiń je folią.Następnie inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez około godzinę przy łagodnym mieszaniu. Po godzinie, użyć gotowej jednorazowej kolumny do odsalania metodą wykluczania treściowego, aby oczyścić immunokoniugat z mieszaniny reakcyjnej. Nanieść 1 mL mieszaniny reakcyjnej na kolumnę, a następnie dodać 1,5 mL 0,9% sterylnego roztworu soli fizjologicznej.Następnie eluj produkt humanizowany HUA 33 TCO dwiema mililitrami 0,9% soli fizjologicznej. Zmierz stężenie produktu za pomocą spektrometru UV-Vis. Jeśli stężenie jest niższe od pożądanego, zagęść produkt przy użyciu wirówki z filtrem o masie cząsteczkowej 50 000 Da.Zacznij od przygotowania roztworu TZ BN notta o stężeniu 0,5 mg/ml w probówce do mikrocentrifugi. Do drugiej probówki do mikrocentrifugi dodaj 10 µL przygotowanego roztworu TZ BN Notta do 400 µL 0,2 M buforu octanu amonu o pH 5,5. Pamiętaj o pomiarze i zapisaniu poziomu radioaktywności próbki przed i po każdym z kolejnych etapów.Jest to niezbędne do dokładnego obliczenia wydajności radiochemicznej i prowadzenia dokumentacji. Teraz dodaj 2000 micro curies miedzi 64 do roztworu TZ BN Notta. Inkubuj tę mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 10 minut przy lekkim mieszaniu.Aby oczyścić produkt, należy zastosować HPLC w fazie odwróconej na kolumnie C 18, rozcieńczając produkty za pomocą gradientu acetonitrylanu i wody od 5% do 95% w ciągu 15 minut z dodatkiem 0,1% TFA. Radioetykietowany tz, BN nota zostanie wymyty w 9,8 minucie, podczas gdy wolny miedź 64 zostanie wymyty wraz z frontem rozpuszczalnika w czasie od dwóch do czterech minut. Po odparowaniu eluentu HPLC za pomocą rotacyjnego odparowacza, należy rozpuścić radioetykietowany produkt w 0,9% sterylnym roztworze soli fizjologicznej, a następnie przystąpić do użycia produktu tak szybko, jak to możliwe. Procedura ta rozpoczyna się od rozcieńczenia alikwotu przygotowanego roztworu HEA 33 TCO do stężenia 0,5 mg/ml w 0,9% sterylnym roztworze soli fizjologicznej.Następnie wstrzyknij 200 µL roztworu do żyły ogonowej myszy z ksenoprzeszczepem. Pozostaw zhumanizowany a 33 TCO w obiegu, aby mógł nagromadzić się w guzie przez 24 godziny. Po 24 godzinach przygotuj znakowany miedzią 64 TZ BN Notta w stężeniu 1,5 mCi/mL w 0,9% jałowej soli fizjologicznej.Następnie, w wyznaczonym czasie, podaj 200 µL przygotowanego roztworu radioligandu myszy poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej. Zpodaj myszy znieczulenie i umieść ją na stole skanera PET dla małych zwierząt. Znieczulenie należy podtrzymać za pomocą maski nosowej, a stan znieczulenia potwierdzić poprzez test szczypania w palec.Aby zapobiec wysychaniu, należy nałożyć cienką warstwę maści okulistycznej. Następnie należy pozyskać dane zwierzęcia, wykonując skan statyczny z 60 milionami zdarzeń koincydentnych w zakresie od 350 do 700 keV, przy czasie koincydencji wynoszącym sześć nanosekund. Po obrazowaniu należy odczekać, aż mysz odzyska przytomność, przed powrotem do klatki, potencjalnie z innymi myszami. Myszy nago-tymiczne z wszczepionym rakiem jelita grubego SW 1222 wykazującym ekspresję antygenu 33.Ksenoprzeszczepy zbadano zgodnie z opisanym protokołem. Zarówno eksperymenty z biodystrybucją ostrą, jak i obrazowanie PET wykazują, że strategia pretargetowania pozwala na wyodrębnienie ksenoprzeszczepu raka jelita grubego z doskonałym kontrastem obrazu i wysokimi stosunkami aktywności guza do tła. W ciągu kilku godzin radioligand jest usuwany z organizmu wraz z kałem, a stosunki aktywności guza do tła stają się bardzo wysokie.Niektóre zmienne w tym podejściu do wstępnego celowania wymagały optymalizacji, podobnie jak w przypadku każdej strategii obrazowania. Podanie 300 µg koniugatu przeciwciała z TCO zamiast 100 µg spowodowało zwiększenie widocznej radioaktywności w sercu myszy, podobnie jak skrócenie odstępu czasowego z 24 do 12 godzin. W obu przypadkach reakcja click nadal zachodziła w obrębie guza, co wyraźnie ilustruje wychwyt tumoralny w wczesnych punktach czasowych.Jednakże reakcja typu „click” wyraźnie zachodzi również we krwi, co jest niepożądane. Podczas próby zastosowania tej procedury należy osiągnąć precyzyjną równowagę wszystkich zmiennych pretargetowania. Bardzo ważne jest, aby zoptymalizować masę immunokonjugatu TCO, jak również odstęp czasowy między iniekcjami.Należy pamiętać, że praca z substancjami promieniotwórczymi może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas eksperymentu należy zachować środki ostrożności, takie jak stosowanie odpowiednich środków ochrony indywidualnej (PPE) oraz zapewnienie stałego ekranowania promieniowania.

harnessing-bioorthogonal-inverse-electron-demand-diels-alder

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Wykorzystanie bioortogonalnej odwrotnej reakcji Dielsa-Aldera do przeznaczonego wstępnie PET imagingu

Ten film opisuje technikę precelowanej radioimmunoterapii lub PRIT, w której do leczenia nowotworów podaje się immunokoniugaty, a następnie radioligandy. Ta radioimmunoterapia zmniejsza dawki promieniowania do zdrowych tkanek i wykorzystuje radionuklidy o bardzo krótkim okresie półtrwania, niezgodne z wektorami opartymi na przeciwciałach.

Radioimmunoterapia pretargetowana: metoda celowanego dostarczania terapeutycznych radionuklidów do nowotworów

Prezentujemy metodę szybkiego, odwracalnego unieruchamiania małych cząsteczek i funkcjonalizowanych zespołów nanocząstek do badań powierzchniowego rezonansu plazmonów (SPR), wykorzystując sekwencyjną bioortogonalną chemię cykloaddycji na chipie i wychwytywanie przeciwciała-antygen.

Mikroprzepływowa reakcja wychwytywania-cykloaddycji w układzie scalonym w celu odwracalnego unieruchomienia małych cząsteczek lub struktur wieloskładnikowych do zastosowań w biosensorach

Ze względu na swój wielodniowy okres półtrwania radioaktywnego i korzystne właściwości rozpadu, emitujący pozytony radiometal 89Zr doskonale nadaje się do stosowania w radiofarmaceutykach opartych na przeciwciałach do obrazowania PET. W tym protokole opisana zostanie biokoniugacja, radiosynteza i przedkliniczne zastosowanie przeciwciał znakowanych 89Zr.

Biokoniugacja i radiosynteza 89przeciwciał znakowanych Zr-DFO

Opisano szczegółową procedurę syntezy azydku znakowanego 125I oraz znakowania radioaktywnego nanocząstek złota o wielkości 13 nm sprzężonych z grupą dibenzocyklooktynu (DBCO) przy użyciu reakcji kliknięcia bez miedzi.

Zoptymalizowany protokół skutecznego znakowania radioaktywnego nanocząstek złota przy użyciu azydkowej grupy protetycznej znakowanej 125I

Tutaj opisujemy protokół znakowania radioaktywnego i testowania in vivo pochodnych chelatu tetrazyny tridentate 99mTc(I) do wstępnego celowania i chemii bioortogonalnej.

Przygotowanie i ocena chelatów trójzębnych znakowanych 99 mTc do wstępnego celowania przy użyciu chemii bioortogonalnej

Demonstrujemy półautomatyczną syntezę radiochemiczną [18F]3F4AP i procedury kontroli jakości.

Zautomatyzowana synteza radiochemiczna [18F]3F4AP: nowy znacznik PET do obrazowania chorób demielinizacyjnych

Przedstawiono łatwy test fluorescencyjny w celu oceny skuteczności par syntetazy amino-acyl-tRNA/tRNA zawierających niekanoniczne aminokwasy (ncAA) do białek ulegających ekspresji w komórkach ssaków. Opisano zastosowanie ncAA do badania receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), w tym fotosieciowanie miejsc wiązania i bioortogonalne znakowanie GPCR na żywych komórkach.

Optymalizacja genetycznego włączenia sond chemicznych do GPCR w celu mapowania fotosieciowania i chemii bioortogonalnej w żywych komórkach ssaków

Miejsca obrazowania pozytonowej tomografii emisyjnej (PET), które biorą udział w wielu wczesnych badaniach klinicznych, wymagają solidnych i wszechstronnych możliwości produkcji radioznaczników. Na przykładzie radioznacznika [18F] Klofarabiny ilustrujemy, jak zautomatyzować syntezę radioznacznika za pomocą elastycznego radiosyntezatora opartego na kasecie i zwalidować syntezę do użytku klinicznego.

Automatyzacja protokołu syntezy radioznacznika metodą pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) do produkcji klinicznej

Ten protokół opisuje syntezę i charakterystykę przeciwciała modyfikowanego trans-cyklooctenem (TCO) oraz 177znakowanego Lu radioligandu tetrazyny (Tz) do radioterapii pretargetowanej (PRIT). Ponadto szczegółowo opisano zastosowanie tych dwóch konstruktów w badaniach biodystrybucji in vivo i terapii podłużnej w mysim modelu raka jelita grubego.

Precelowana radioimmunoterapia oparta na odwróconej reakcji Dielsa-Aldera na odwrócone zapotrzebowanie elektronowe

Prezentujemy protokół do bezpośredniej wizualizacji aktywności metabolicznej w komórkach regulowanych przez aminokwasy za pomocą mikroskopii stymulowanego rozpraszania Ramana (DO-SRS) z tlenkiem deuteru (ciężka wodaD2O), która jest zintegrowana z mikroskopią fluorescencyjną wzbudzenia dwufotonowego (2PEF).

Bioortogonalne obrazowanie chemiczne metabolizmu komórkowego regulowanego przez aminokwasy aromatyczne

Ten protokół przedstawia szczegółową procedurę przygotowania czterech radioznaczników węgla-11 za pomocą "metody pętlowej" [11C]metylacji. Opisujemy procedurę syntezy [11C]ER-176, z danymi dla trzech dodatkowych radioznaczników: [11C]MRB, [11C]mHED i [11C]PiB. Metoda pętlowa zapewnia wydajną syntezę ze zwiększoną wydajnością radiochemiczną w porównaniu z tradycyjną metylacją naczynia reakcyjnego [11C].

Zwiększenie wydajności i wydajności znakowania radioligandów węgla-11 w badaniach klinicznych z wykorzystaniem metody pętli

Poznaj bioortogonalną cykloaddycję Dielsa-Aldera z odwróconym zapotrzebowaniem elektronów do wstępnie ukierunkowanego obrazowania PET nowotworów. Metoda wykorzystuje przeciwciało skierowane przeciwko rakowi jelita grubego i radioligand z 64Cu.

Wykorzystanie bioortogonalnej cykloaddycji Dielsa-Aldera z odwróconym zapotrzebowaniem elektronów do wstępnie ukierunkowanego obrazowania PET (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie bioortogonalnej cykloaddycji Dielsa-Aldera z odwróconym zapotrzebowaniem elektronów do wstępnie ukierunkowanego obrazowania PET

Przeglądaj więcej filmów