Name: Test enzymatyczny in vitro do pomiaru hamowania transkrypcji przez korole galu(III) i H3 5,10,15-tris(pentafluorofenylo)korole (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Poznaj metodę oceny hamowania transkrypcji RNA przez pochodne koroli in vitro przy użyciu elektroforezy żelowej i spektroskopii UV-Vis. Protokół umożliwia badanie potencjalnych związków przeciwnowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Serdecznie dziękujemy dr Cindy N. Chiu za pomoc w elektroforezie żelowej, oraz Andy'emu Zhou i Michaelowi Grodickowi za hojne przekazanie DNA i enzymu restrykcyjnego. Wyrażamy wdzięczność profesorowi J. Heathowi i profesorowi D. Proberowi za hojny dostęp do sprzętu i materiałów. Dziękujemy dr Karn Sorasaenee za pomocne sugestie. Dziękujemy Mary H. Tang za stworzenie ilustracji wykorzystanej w schematycznym przeglądzie w filmie. Finansowanie zostało zapewnione przez Johnson & Johnson i USC Y86786.

UWAGA: Podczas pracy z RNA utrzymuj czyste środowisko pracy, aby uniknąć zanieczyszczenia przez enzymy DNazy i RNazy, które degradują DNA i RNA. Upewnij się, że końcówki i probówki do pipet są wolne od DNaz i RNaz. Pomocne jest również przetarcie powierzchni laboratoryjnych i sprzętu, takiego jak pipety, uchwyty na probówki itp., roztworem odkażającym.
1. Transkrypcja RNA z leczeniem korrolą
<ol>
	<li>Przygotować związki korolowe i inhibitorowe w stosunku molowym 0,01:1 [kompleks]:[DNA]. 
	UWAGA: W naszym przypadku stosunek wynosił 4,3 kompleksu fmol: 0,43 pmol DNA, gdzie użytą matrycą DNA był wektor apET-28c z genem ligA z E. coli pod kontrolą promotora T7. Inne DNA z promotorem T7 są również ważnymi kandydatami do przeprowadzenia testu transkrypcji.
	<ol>
		<li>Rozpuścić aktynomycynę D, tryptolid, tpfc i Ga(tpfc) w dimetylosulfotlenku (DMSO) w czystych, oddzielnych pojemnikach. Uzyskać końcowe stężenie stosunku molowego 0,01:1 [kompleksu]:[DNA] przy użyciu seryjnych rozcieńczeń wodą wolną od nukleaz.
		<ol>
			<li>Rozpuścić 1 mg aktynomycyny D w 1,8 ml DMSO. Podamy 10 μl do oddzielnego pojemnika i rozcieńczyć do 1 ml wodą wolną od nukleaz w celu uzyskania rozcieńczenia 1:100. Podwielokrotność 1 μl rozcieńczenia do oddzielnego pojemnika i rozcieńczyć do 1 ml wodą wolną od nukleaz w celu uzyskania rozcieńczenia 1:1 000. 
			UWAGA: Stężenie końcowego roztworu aktynomycyny D wynosi 4,3 fmol.</li>
			<li>Rozpuścić 1 mg tryptolidu w 0,64 ml DMSO. Podamy 1 μl do oddzielnego pojemnika i rozcieńczyć do 1 ml wodą wolną od nukleaz w celu uzyskania rozcieńczenia 1:1 000. Podamy 1 μl rozcieńczenia do oddzielnego pojemnika i rozcieńczyć do 1 ml wodą wolną od nukleaz w celu uzyskania drugiego rozcieńczenia 1:1 000. 
			UWAGA: Stężenie końcowego roztworu tryptolidu wynosi 4,3 fmol.</li>
			<li>Rozpuścić 1 mg tpfc w 2,9 ml DMSO. Podamy 10 μl do oddzielnego pojemnika i rozcieńczyć do 1 ml wodą wolną od nukleaz w celu uzyskania rozcieńczenia 1:100. Podwielokrotność 1 μl rozcieńczenia do oddzielnego pojemnika i rozcieńczyć do 1 ml wodą wolną od nukleaz w celu uzyskania rozcieńczenia 1:1 000. 
			UWAGA: Stężenie końcowego roztworu tpfc wynosi 4,3 fmol.</li>
			<li>Rozpuścić 1 mg Ga(tpfc) w 2,6 ml DMSO. Podamy 10 μl do oddzielnego pojemnika i rozcieńczyć do 1 ml wodą wolną od nukleaz w celu uzyskania rozcieńczenia 1:100. Podwielokrotność 1 μl rozcieńczenia do oddzielnego pojemnika i rozcieńczyć do 1 ml wodą wolną od nukleaz w celu uzyskania rozcieńczenia 1:1 000. 
			UWAGA: Stężenie końcowego roztworu Ga(tpfc) wynosi 4,3 fmol. 
			UWAGA: Te korole i inhibitory nie są rozpuszczalne w wodzie i muszą być wstępnie rozpuszczone w DMSO. Niewielkie ilości DMSO (poniżej 1%) nie wywołują cytotoksyczności w komórkach (dane niepublikowane).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przed rozpoczęciem reakcji transkrypcyjnej należy samodzielnie przygotować niezbędne odczynniki lub zakupić je od komercyjnego dostawcy.
	<ol>
		<li>Rozmrozić na lodzie wszystkie zamrożone odczynniki (wykaz zamrożonych odczynników znajduje się w Tabeli 1).</li>
		<li>Odczekaj czas mieszania się 10-krotnego buforu reakcyjnego i roztworów 4 rybonukleotydów (ATP, CTP, GTP i UTP), aż całkowicie rozpuszczą się w roztworze.</li>
		<li>Krótko odwirować wszystkie odczynniki, aby zapobiec utracie materiału na krawędzi probówki. Po rozmrożeniu przechowuj rybonukleotydy na lodzie, utrzymując 10-krotny bufor reakcyjny w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Połączyć odczynniki do reakcji transkrypcyjnej w RT (wykaz odczynników znajduje się w Tabeli 2). 
		UWAGA: Spermidyna w 10-krotnym buforze reakcyjnym może współstrącić matrycę DNA, jeśli reakcja jest montowana na lodzie, a nie w RT.</li>
		<li>Dokładnie wymieszaj, delikatnie przesuwając probówkę lub pipetując mieszaninę w górę i w dół. Po wymieszaniu należy krótko odwirować, aby zebrać mieszaninę reakcyjną na dnie probówki.</li>
		<li>Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 37 °C, w sumie przez 2-4 godz. 
		UWAGA: Niezbędne czasy reakcji będą się różnić w zależności od wielkości i sekwencji matrycy DNA. Ten krok może wymagać optymalizacji pod kątem określonych sekwencji. Krótsze matryce mogą wymagać dłuższych czasów reakcji w celu uzyskania wysokiej wydajności całkowitego RNA.</li>
		<li>Po każdej godzinie usuwać 4 μl porcji z każdej reakcji i przechowywać w temperaturze -20 °C. Modyfikować w razie potrzeby dla żądanych punktów czasowych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Kolumna wirowania RNA
<ol>
	<li>Po reakcji transkrypcji należy oczyścić RNA za pomocą kolumn chromatograficznych kompatybilnych z mikrowirówkami. 
	UWAGA: Użycie kolumn wirowych RNA do oczyszczania RNA o więcej niż 20 zasadach powoduje ponad 80% odzysku. 44 
	UWAGA: Chromatografia kolumnowa jest powszechną i wygodną metodą oczyszczania RNA. Istnieją również inne metody oczyszczania, takie jak wytrącanie chlorku litu, ekstrakcja fenol:chloroform, wytrącanie izopropanolu, a także inne dostępne na rynku zestawy.
	<ol>
		<li>Równomiernie zawiesić matrycę Sephadex w buforze kolumny, energicznie odwracając kolumnę trzy lub więcej razy. W tym celu należy gwałtownie przesunąć kolumnę.</li>
		<li>Zdejmij górną zaślepkę z kolumny. W czapce będzie trochę szczątkowej matrycy Sephadex; Jeśli nasadka jest wypełniona matrycą, załóż nasadkę na kolumnę i powtarzaj poprzedni krok, aż większość matrycy znajdzie się w kolumnie.</li>
		<li>Oderwij dolną końcówkę kolumny. 
		UWAGA: Z kolumny może wydostawać się pewna ilość płynu.</li>
		<li>Spakuj kolumnę.
		<ol>
			<li>Umieścić kolumnę w sterylnej (bez RNaz i DNaz) probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
			<li>Odwirować probówkę w wirówce stołowej o stężeniu 1 000 x g przez 1 min.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wyrzucić z kolumny 1,5 ml probówkę mikrowirówkową z eluowanym buforem.</li>
		<li>Natychmiast umieścić kolumnę w nowej sterylnej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i odpipetować próbkę do środka łoża kolumny. Użyj 20-50 μl próbki, aby uniknąć przeciążenia kolumny.</li>
		<li>Odwirować probówkę w wirówce stołowej o stężeniu 1 000 x g przez 1 min. 
		UWAGA: Eluent jest oczyszczoną próbką RNA.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Elektroforeza w żelu agarozowym (1% żelu agarozowego) 42
UWAGA: Bromek etydyny fluoryzuje po związaniu z DNA i RNA, dlatego te biomolekuły mogą być wizualizowane za pomocą światła UV, inkubując je z roztworem bromku etydyny o stężeniu 0,5 μg/ml.
<ol>
	<li>Przygotować 1000-krotny roztwór podstawowy bromku etydyny (0,5 mg/ml), rozpuszczając 5 mg bromku etydyny w 10 ml wody.</li>
	<li>Przygotuj bufor do biegania Tris Acetate EDTA (TAE) do elektroforezy żelowej. Aby uzyskać 50-krotny bufor TAE, połącz 2,0 M octan trisu z 0,05 M kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) i dostosuj pH do 8,5.</li>
	<li>Przygotuj 1% (wagowo/objętościowo) żel agarozowy, rozpuszczając 10 g UltraPure Agarozy w 1 l buforze 1x TAE i topiąc agarozę za pomocą konwencjonalnej kuchenki mikrofalowej. Po ostygnięciu do 50 °C dodać 1 ml 1000-krotnego bromku etydyny do 1% roztworu żelu agarozowego, wymieszać delikatnie obracając lub odwracając w zamkniętym pojemniku, następnie wlać roztwór agarozy do odlewu żelu i pozostawić żel do zestalenia się w temperaturze RT. 
	UWAGA: Bromek etydyny jest substancją mutagenną i potencjalnie rakotwórczą. Ostrożnie nosić rękawice i obchodzić się z roztworami. Aby uzyskać informacje na temat prawidłowych procedur obchodzenia się z bromkiem etydyny, zobacz: <a href="http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667">http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667</a>.</li>
	<li>Po zestaleniu się żelu umieść ustawiony żel w zbiorniku do elektroforezy. Dodaj wystarczającą ilość buforu TAE, aby przykryć żel, aż studzienki zostaną zanurzone. Sprawdzić, czy poziom bufora TAE znajduje się około 1 mm powyżej poziomu żelu. Usuń grzebień żelowy. 
	UWAGA: Wyjęcie grzebienia po zanurzeniu studzienek zapobiega uwięzieniu kieszeni powietrznych w studzienkach.</li>
	<li>Przygotuj próbki RNA. Połączyć 1 μl każdej podwielokrotności oczyszczonej próbki z 1 μl żelowego buforu ładującego (lub z 1 μl 10-krotnego buforu ładującego i rozcieńczyć do 10 μl wodą wolną od nukleaz) i dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół za pomocą mikropipety. 
	UWAGA: 10x bufor ładujący zawiera 20% Ficoll 400, 0,1 M Na2EDTA, pH 8,0, 1,0% SDS, 0,25% błękitu bromofenolowego. Do bufora ładującego można również dodać 0,25% cyjanolu ksylenowego, ponieważ działa on ~50% szybciej niż błękit bromofenolowy i może być przydatny do monitorowania bardzo długich przebiegów. 42 Rozdział 42</li>
	<li>Załaduj żel do każdej próbki, ostrożnie pipetując roztwór na dno każdej studzienki. Należy uważać, aby nie pozostawić żadnych pęcherzyków powietrza ani nie mieszać próbek między studzienkami. 
	UWAGA: Drabinka RNA może być również użyta do określenia rozmiaru transkryptu.</li>
	<li>Podłącz przewody tak, aby DNA migrowało do żelu w kierunku dodatniego odprowadzenia. Ustaw napięcie na żądany poziom, zwykle od 1 do 10 V/cm żelu. Uruchom żel tak długo, jak jest to wystarczające do znacznego oddzielenia fragmentów RNA, wykorzystując migrację barwników do monitorowania postępu separacji. 
	UWAGA: Żel o wymiarach 23 cm x 25 cm przy napięciu 250 V zajmie około 1 godziny, natomiast żel o wymiarach 8 cm x 8 cm przy napięciu 150 V zajmie około 20 minut. Mniejsze fragmenty RNA mają lepszą rozdzielczość, gdy są uruchamiane przy wyższych napięciach.</li>
	<li>Wyłącz zasilanie, gdy barwnik z bufora ładującego przemieści się na odległość uznaną za wystarczającą do oddzielenia fragmentów RNA.</li>
	<li>Wyobraź sobie RNA w świetle UV, ponieważ bromek etydyny będzie fluoryzował.</li>
	<li>Zrób zdjęcie obrazu i porównaj intensywność fluorescencji oczyszczonego RNA z każdego stanu.</li>
</ol>
4. Kwantyfikacja RNA za pomocą spektroskopii UV-Vis
<ol>
	<li>Umieść 2 μl H2O na urządzeniu NanoDrop 2000 lub podobnym urządzeniu i zmierz ślepą próbę.</li>
	<li>Następnie umieścić 2 μl każdej próbki RNA, po oczyszczeniu, na spektrofotometrze i zmierzyć UV-Vis w zakresie długości fal od 200 nm do 800 nm. 
	UWAGA: Odczyt A260 wynoszący 1,0 odpowiada około 40 μg/ml RNA, a czysty RNA ma stosunek A260/A280 równy 2,1. Rozdział 45</li>
	<li>W przypadku, gdy absorbancja jest wyższa niż 1 Średnica Zewnętrzna, należy rozcieńczyć próbki w wodzie wolnej od nukleaz, aby uzyskać Średnicę Zewnętrzną mniejszą niż 1.</li>
	<li>Użyj oprogramowania do tworzenia wykresów, aby wykreślić różne próbki i porównać średnicę zewnętrzną przy 260 nm.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Test ten pokazuje, że dodanie Ga (tpfc) hamuje transkrypcję RNA w sposób porównywalny do znanych kompleksów przeciwnowotworowych wiążących DNA: aktynomycyny D i tryptolidu. Zachowanie cytotoksyczne Ga(tpfc) (IG50 = 58,1-154,7 μM) może wynikać z jego właściwości hamujących. Ponieważ w tpfc nie zaobserwowano zahamowania transkrypcji, cytotoksyczność tpfc nie jest spowodowana hamowaniem transkrypcji RNA, ale jest spowodowana innymi sposobami, które nie zostały jeszcze zbadane.
W cztere...

Chemioterapia często obejmuje leki cytotoksyczne o szerokim spektrum działania z niepożądanymi skutkami ubocznymi i ograniczonym celowaniem, jednak wraz z lepszym zrozumieniem biologii raka, istnieje coraz większe zapotrzebowanie na środki przeciwnowotworowe o wyższej skuteczności zwalczania raka i mniejszej liczbie skutków ubocznych. 1 Ludzkie komórki nowotworowe często stają się zależne od pojedynczego aktywowanego lub nadmiernie eksprymowanego onkogenu w celu przeżycia. 2 Tak więc wiele leków przeciwnowotworowych jest ocenianych pod kątem ich zdolności do hamowania transkrypcji RNA. Terapie, które blokują ekspresję tych transformujących się genów, są skuteczne w eliminowaniu komórek rakowych i prowadzą do śmierci komórek. 3 Transformowane komórki są bardziej wrażliwe na zakłócenia w transkrypcji RNA niż odpowiadające im normalne komórki. 4 Oczekuje się, że leki przeciwnowotworowe, które hamują transkrypcję, będą selektywnie hamować ekspresję onkogenów, które są niezbędne do przeżycia komórki rakowej. 5 W związku z tym hamowanie transkrypcji RNA jest użytecznym sposobem identyfikacji potencjalnych kandydatów na leki przeciwnowotworowe i dowiedzenia się więcej o ich mechanizmie działania. Protokół ten pokazuje, że Ga (tpfc) hamuje transkrypcję RNA w tym samym rzędzie, co leki chemioterapeutyczne Actinomycin D i tryptolid; Podobnych porównań można dokonać przy użyciu tego protokołu z innymi kandydatami na leki przeciwnowotworowe. Aktynomycyna D jest inhibitorem transkrypcji RNA powszechnie stosowanym w leczeniu ciążowego raka trofoblastycznego, raka jąder, guza Wilma, rabdomyosacomy i mięsaka Ewinga6. Aktynomycyna D jest stosowana w terapii nowotworów od prawie pięćdziesięciu lat, odkąd została po raz pierwszy zatwierdzona przez FDA w 1964 roku.Tryptolid jest selektywnym inhibitorem transkrypcji, który był badany in vitro i w różnych modelach zwierzęcych zawierających nowotwór przez 30 lat. 7
Amfifilowa makrocykliczna natura koroli daje znaczące przewagi nad innymi klasami leków, takimi jak małe cząsteczki czy leki biologiczne. 8-14 Charakter makrocykliczny pozwala na przepuszczalność komórkową, która jest większa niż oczekiwano dla tak dużych cząsteczek i są one wystarczająco duże, aby oddziaływać z powierzchniami makromolekularnymi, takimi jak powierzchnie białek. 8 Wiadomo, że korole tworzą ścisłe kompleksy niekowalencyjne z biomolekułami i lekami. 10 Oprócz nieodłącznej cytotoksyczności struktury korroli, wykazaliśmy, że sulfonowany korol działa jako cząsteczka nośnikowa dla środków chemioterapeutycznych, w szczególności leku antracyklinowego interkalującego DNA, doksorubicyny. Gdy sulfonowaną korelację podawano jednocześnie z doksorubicyną, zaobserwowano 3-krotne zwiększenie IC50 doksorubicyny dla komórek DU-145. 9 Struktura koroli jest stabilna i ma nieodłączne właściwości absorbancji i fluorescencji, które po funkcjonalizacji ulegają unikalnym przesunięciom absorbancji, które można wykorzystać do charakteryzacji. 10 Funkcjonalizacja rusztowania z natury nie wpływa na właściwości fotofizyczne korolu9-15, ale, jak widać w przypadku sulfonowanego korolu, selektywna modyfikacja szkieletu korolu może znacząco zmienić jego właściwości biologiczne. 16 Wcześniej oceniliśmy sześć metalokoroli przeciwko siedmiu ludzkim liniom komórek rakowych. Wyniki wskazują, że toksyczność w stosunku do ludzkich komórek nowotworowych zależy od specyficznego jonu metalu, a także od substytucji grup funkcyjnych. Na przykład sulfonowane korole galu doświadczyły wysokiego wychwytu komórkowego i selektywnie przenikały do jądra komórek raka prostaty z przerzutami do mózgu (DU-145); ta sama korole, choć nie przenika do jądra innych linii komórkowych, wykazuje większą cytotoksyczność dla komórek raka piersi (MDA-MB-231), czerniaka (SK-MEL-28) i jajnika (OVCAR-3) niż dla raka prostaty. 9
Wstępne testy komórkowe wskazują, że te związki są obiecujące jako przeciwnowotworowe środki terapeutyczne, co zasługuje na dalsze badania nad mechanizmem działania. Hamowanie transkrypcji obserwuje się w przypadku niektórych kompleksów metaloorganicznych17-27 i staraliśmy się zbadać ten proces jako możliwy mechanizm cytotoksycznego zachowania rodziny korrole. Ten test transkrypcji zapewnia prostą, niedrogą i łatwą metodę oceny hamowania transkrypcji, która doprowadzi do bardziej szczegółowych informacji na temat wpływu tych cząsteczek na żywe komórki.
Tutaj testowane jest hamowanie transkrypcji 5,10,15-(tris)pentafluorofenylcorolu (Ga(tpfc)) i jego wolnego analogu 5,10,15-(tris)pentafluorofenylcorrole (tpfc) (Rysunek 1). W przeciwieństwie do niektórych kompleksów metali przejściowych, gal(III) jest nieaktywny redoks i dlatego nie bierze bezpośredniego udziału w procesie redoks szlaków metabolicznych opartych na redoks. 28 Niezależnie od tego, gal(III) wykazuje właściwości cytotoksyczne i był badany pod kątem terapeutycznym. Gal jest drugim po platynie najbardziej obiecującym metalem w terapiach przeciwnowotworowych i przeszedł wiele badań i badań; Sole azotanu i chlorku galu zostały ocenione w badaniach klinicznych przeciwko wątrobiakowi, chłoniakowi, rakom pęcherza moczowego i innym chorobom. 29-34 Gal(III) jest zatem idealny do badań koroli przeciwnowotworowych. Wstępne dane pokazują, że Ga(tpfc) i tpfc mają niski IG50, stężenie leku niezbędne do zahamowania 50% maksymalnej proliferacji komórek, z różnymi liniami komórek rakowych (patrz ryc. 2); Potwierdza to zasadność dalszych eksperymentów na tych dwóch związkach w celu określenia ich właściwości hamujących. Porównujemy te związki z popularnymi lekami przeciwnowotworowymi aktynomycyną D i tryptolidem. Aktynomycyna D interkaluje DNA, hamuje wydłużanie RNA i indukuje apoptozę w określonej linii komórkowej przy stężeniach pikomolarnych. 6,35-37 Wykazano, że tryptolid hamuje wzrost guza; wiąże się z ludzką XPB/ERCC3, podjednostką czynnika transkrypcyjnego TFIIH, prowadząc do zahamowania aktywności polimerazy II RNA. 6-7,38-40
Chociaż powszechnie wiadomo, że korole wykazują właściwości cytotoksyczne, istnieje niewiele informacji na temat różnych mechanizmów wynikających z funkcjonalizacji. Hamowanie transkrypcji RNA przez korole zapewniłoby lepszy wgląd w ich interakcje z biomakrocząsteczkami. Inne kompleksy, o których wiadomo, że wiążą się z DNA, takie jak kompleksy dirhodu(II,II), kompleksy chromu(III), kompleksy polipirydylu rutenu(II), kompleksy rodu(III) i różne inne, poddano testom transkrypcji RNA,18-27 co pozwoliło na lepsze zrozumienie ich interakcji z biomakrocząsteczkami. Ten łatwy i szeroko dostępny eksperyment jest również dobrym testem wstępnym do oceny właściwości cytotoksycznych danej cząsteczki i określenia, czy zasługuje ona na dalsze badania biologiczne. Test transkrypcji RNA pozwala również na wiele modyfikacji, takich jak zmiana ilości użytego związku lub enzymów; różnicowanie okresu inkubacji, czasu reakcji i punktów czasowych pobierania próbek; oraz różnicowanie długości i sekwencji matrycy DNA, wśród innych zmiennych będących przedmiotem zainteresowania, co potencjalnie dostarcza dużej ilości danych. Ten test transkrypcji jest również łatwo dostępny w postaci niedrogich zestawów ze wszystkimi niezbędnymi składnikami reakcji, chociaż komponenty można kupić i przygotować indywidualnie. W tych eksperymentach używamy dostępnego na rynku zestawu, o którym wiadomo, że ma wysoką wydajność. Rozdział 41
Aby ocenić hamowanie transkrypcji, używamy dwóch metod: elektroforezy w żelu agarozowym i spektroskopii UV-Vis. Elektroforeza w żelu agarozowym jest prostą i skuteczną metodą separacji, identyfikacji i oczyszczania fragmentów DNA i RNA o wielkości od 0,5 do 25 kb. 42 Spektroskopia UV-Vis może być stosowana do określania stężenia i czystości RNA. Rozdział 43

<table><tbody><tr><td>Actinomycin D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1410</td><td>Przechowywać w temperaturze 2-8 & deg; C, chronić przed światłem</td></tr><tr><td>Triptolide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3652</td><td>Przechowywać w temperaturze 2-8 stopni; C, chronić przed lekkimi</td></tr><tr><td>nukleazami wolnymi od H2O&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>AM9938</td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript T7 Zestaw do transkrypcji</td><td>Life Technologies</td><td>AM1334</td><td>Sklep pod adresem &ndash; 20 &stopni; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637</td><td>UWAGA: Aby uzyskać informacje na temat prawidłowych procedur obchodzenia się z bromkiem etydyny, zobacz: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667</td></tr><tr><td>Octan trisu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6025</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agaroza</td><td>Life Technologies</td><td>16500-100</td><td></td></tr><tr><td>mini kolumny RNA Quick Spin</td> Roche <td>Life Science</td><td>11814427001</td><td>Sklep w 2-8 stopniach; C , nie zamrażaj</td></tr><tr><td>1 kb Drabina DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>N3232S</td><td>Przechowuj pod adresem &ndash; 20 &stopni; C&nbsp;</td></tr></tbody></table>

test enzymatyczny in vitro do pomiaru hamowania transkrypcji przez korole galu(iii) i h3 5,10,15-tris(pentafluorofenylo)korole

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

Chemioterapia często obejmuje środki cytotoksyczne o szerokim spektrum działania z wieloma skutkami ubocznymi i ograniczonym celowaniem. Korole to klasa makrocykli tetrapiroliowych, które wykazują zróżnicowane właściwości cytostatyczne i cytotoksyczne w określonych liniach komórkowych, w zależności od tożsamości chelatowanego metalu i grup funkcyjnych. Unikalne zachowanie funkcjonalizowanych koroli w stosunku do określonych linii komórkowych wprowadza możliwość celowanej chemioterapii.
Wiele leków przeciwnowotworowych jest ocenianych na podstawie ich zdolności do hamowania transkrypcji RNA. Poniżej przedstawiamy krok po kroku protokół transkrypcji RNA w obecności znanych i potencjalnych inhibitorów. Ocena produktów RNA reakcji transkrypcji za pomocą elektroforezy żelowej i spektroskopii UV-Vis dostarcza informacji na temat właściwości hamujących potencjalnych kandydatów na leki przeciwnowotworowe, a dzięki modyfikacjom testu – na temat ich mechanizmu działania.
Niewiele wiadomo o molekularnym mechanizmie działania cytotoksyczności koroli. W tym eksperymencie rozważamy dwa związki koroli: 5,10,15-(tris)pentafluorofenylkorol (Ga(tpfc)) i analog wolnej zasady 5,10,15-(tris)pentafluorofenylkorol (tpfc). Do zbadania właściwości hamujących koroli użyto testu transkrypcji RNA. Przygotowano pięć reakcji transkrypcyjnych: DNA traktowane aktynomycyną D, tryptolidem, Ga(tpfc), tpfc w stosunku [kompleks]:[zasada matrycy DNA] odpowiednio 0,01 oraz nieleczona kontrola.
Reakcje transkrypcyjne zostały przeanalizowane po 4 godzinach za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym i spektroskopii UV-Vis. Istnieje wyraźne hamowanie przez Ga(tpfc), aktynomycynę D i tryptolid.
Ten test transkrypcji RNA może być zmodyfikowany, aby dostarczyć więcej szczegółów mechanistycznych, poprzez zmianę stężeń kompleksu przeciwnowotworowego, DNA lub enzymu polimerazy, lub poprzez inkubację DNA lub polimerazy z kompleksami przed transkrypcją RNA; te modyfikacje różnicowałyby między mechanizmem hamowania obejmującym DNA a enzymem. Dodanie kompleksu po transkrypcji RNA można wykorzystać do sprawdzenia, czy kompleksy degradują lub hydrolizują RNA. Test ten może być również wykorzystany do badania dodatkowych kandydatów na leki przeciwnowotworowe.

Jakościowa ocena transkrypcji RNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym
Elektroforeza w żelu agarozowym jest wykorzystywana do obrazowania przepisanego RNA. Bromek etydyny fluorescuje po związaniu (λem = 605 nm, λex = 210 nm, 285 nm)46 , co umożliwia obrazowanie RNA. Ciemniejsze prążki w żelu odpowiadają wyższym stężeniom RNA. Jeśli aktynomycyna D, triptolid lub którykolwiek z kompleksów korrolu hamuje transkrypcję RNA, produkcja RNA jest o...

Gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorofenylcorol i jego wolnozasadowy analog wykazują niską cytotoksyczność komórek mikromolowych. W tym artykule opisano reakcję transkrypcji RNA, obrazowanie RNA za pomocą żelu barwionego bromkiem etydyny oraz ilościowe oznaczanie RNA za pomocą spektroskopii UV-Vis, w celu oceny hamowania transkrypcji przez korole i demonstruje prostą metodę oceny właściwości kandydatów przeciwnowotworowych.

Test enzymatyczny in vitro do pomiaru hamowania transkrypcji przez korole galu(III) i H3 5,10,15-tris(pentafluorofenylo)korole

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest określenie, czy potencjalne związki przeciwnowotworowe hamują transkrypcję kwasu rybonukleinowego (RNA). Realizuje się to poprzez przygotowanie reakcji transkrypcji RNA z dodatkiem potencjalnych inhibitorów; w niniejszym doświadczeniu badana jest inhibicja transkrypcji RNA przez związki CHO wykazujące zróżnicowane właściwości cytotoksyczne, a następnie porównuje się je ze znanymi inhibitorami. Po dokładnym wymieszaniu składników, probówki z reakcją są inkubowane w temperaturze 37 °C, a w wybranych punktach czasowych pobiera się odpowiednie alikwoty.Następnie do oceny względnego hamowania wykorzystuje się elektroforezę w żelu, ponieważ bromek irydu fluorescencyjnie wiąże się z RNA, a ciemniejsze prążki w żelu odpowiadają wyższym stężeniom RNA. Aby ilościowo określić stopień zahamowania transkrypcji, przeprowadza się spektroskopię w ultrafiolecie, świetle widzialnym lub spektroskopię UV-Vis. Ostatecznie materiał wideo ten demonstruje prostą metodę oceny właściwości kandydatów na leki przeciwnowotworowe.Poprzez ocenę inhibicji transkrypcji przez koralowce, potencjalne leki przeciwnowotworowe powinny być badane pod kątem ich zdolności do hamowani

an-vitro-enzymatic-assay-to-measure-transcription-inhibition-gallium

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

In Vitro enzymatyczne badanie do pomiaru hamowania transkrypcji przez gal(III) oraz H3 5,10,15-tris(pentafluorofenylo)korole

Niniejsza metoda opisuje wysokowydajną syntezę in vitro zarówno zmodyfikowanego (z czapeczką), jak i niezmodyfikowanego (bez czapeczki) mRNA z liniowego plazmidu zawierającego gen lucyferazy Gaussia (GLuc). RNA zostaje poddane oczyszczaniu, a następnie część mRNA bez czapeczki zostaje enzymatycznie zmodyfikowana z wykorzystaniem enzymu czapeczkującego wirusa Vaccinia. W ostatnim kroku mRNA jest transfekowane do komórek HeLa, a następnie analizowana jest aktywność lucyferazy w supernatantach...

Transkrypcja in vitro i capping mRNA lucyferazy Gaussia z następującą transfekcją komórek HeLa

Ten protokół opisuje eksperymentalną procedurę szybkiej budowy sztucznych czynników transkrypcyjnych (ATF) z pokrewnymi reporterami GFP oraz ilościowe określenie zdolności ATF do stymulowania ekspresji GFP za pomocą cytometrii przepływowej.

Szybka synteza i badania przesiewowe chemicznie aktywowanych czynników transkrypcyjnych za pomocą reporterów opartych na GFP

Homeostaza wapniowa retikulum endoplazmatycznego jest zaburzona w różnych patologiach.  Reporter wydzielanego białka monitorującego wapń ER (SERCaMP) może być używany do wykrywania zakłóceń w magazynie wapnia ER.   Protokół ten opisuje zastosowanie Gaussia lucyferazy SERCaMP do badania homeostazy wapnia ER in vitro i in vivo.

Monitorowanie homeostazy wapniowej retikulum endoplazmatycznego za pomocą lucyferazy Gaussia SERCaMP

W tej pracy zapewniamy eksperymentalny przepływ pracy, w jaki sposób aktywne wzmacniacze mogą być identyfikowane i eksperymentalnie weryfikowane.

Przewidywanie i walidacja elementów regulatorowych genów aktywowanych podczas różnicowania embrionalnych komórek macierzystych indukowanego kwasem retinowym

W tym manuskrypcie opisujemy protokół do funkcjonalnego badania transkrypcji i hamującej aktywności środków przeciwbakteryjnych ukierunkowanych na bakteryjną transkrypcję.

In vitro Testy transkrypcji i ich zastosowanie w odkrywaniu leków

Istnieje zapotrzebowanie, aby testy przedkliniczne nowej klasy leków "sierocych" zwanych farmakologicznymi białkami opiekuńczymi były powtarzalne, szybkie i skuteczne. Opracowaliśmy prosty, wysoce ustandaryzowany i wszechstronny test oparty na hodowli komórkowych do badań przesiewowych dla kwalifikujących się pacjentów, a także nowatorskie farmakologiczne leki opiekuńcze.

In vitro Pomiar enzymów w celu zbadania farmakologicznej reakcji białka opiekuńczego w chorobie Fabry'ego i Pompego

Tutaj opisujemy standardowy protokół wykrywania aktywności β-galaktozydazy we wczesnych zarodkach całych myszy oraz metodę sekcji parafiny i przeciwbarwienia. Jest to łatwa i szybka procedura monitorowania ekspresji genów podczas rozwoju, która może być również stosowana do skrawków tkanek, narządów lub hodowanych komórek.

Śledzenie ekspresji genów poprzez wykrywanie aktywności β-galaktozydazy w całych zarodkach myszy

Regulacja środowiska chromatyny jest niezbędnym procesem niezbędnym do prawidłowej ekspresji genów. W tym miejscu opisujemy metodę kontrolowania ekspresji genów poprzez rekrutację maszynerii modyfikującej chromatynę w sposób specyficzny dla genu i odwracalny.

Tłumienie transkrypcji genów poprzez przekierowywanie maszynerii komórkowej za pomocą chemicznych modyfikatorów epigenetycznych

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) jest potężnym narzędziem do zrozumienia molekularnych mechanizmów regulacji genów. Metoda ta wiąże się jednak z trudnościami w uzyskaniu powtarzalnej fragmentacji chromatyny przez mechaniczne ścinanie. W tym miejscu przedstawiamy ulepszony protokół testu ChIP z wykorzystaniem trawienia enzymatycznego.

Test immunoprecypitacji chromatyny z wykorzystaniem nukleaz mikrokokowych w komórkach ssaków

Ten protokół wykorzystuje opartą na sondzie reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (PCR), test sulforodaminy B (SRB), klonowanie 3' nietranslowanych regionów (3' UTR) oraz test lucyferazy w celu weryfikacji docelowych genów interesującego miRNA i zrozumienia funkcji miRNA.

Protokół in vitro do oceny poziomów, funkcji i powiązanych genów docelowych w komórkach nowotworowych

Metylotransferazy DNA są potencjalnymi celami leków przeciwnowotworowych. W tym miejscu przedstawiono protokół oceny małych cząsteczek pod kątem hamowania metylotransferazy DNA. Test ten wykorzystuje endonukleazę do sprzężenia metylacji DNA z generowaniem fluorescencji i pozwala na monitorowanie aktywności enzymu w czasie rzeczywistym.

Ciągły test metylacji DNA sprzężony z endonukleazą oparty na fluorescencji w celu wykrycia inhibitorów metylotransferazy DNA

Poznaj metodę oceny hamowania transkrypcji RNA przez pochodne koroli in vitro przy użyciu elektroforezy żelowej i spektroskopii UV-Vis. Protokół umożliwia badanie potencjalnych związków przeciwnowotworowych.

Test enzymatyczny in vitro do pomiaru hamowania transkrypcji przez korole galu(III) i H₃ 5,10,15-tris(pentafluorofenylo)korole

Przeglądaj więcej filmów