Name: Analiza porównawcza ekspresji białek rekombinowanych w różnych biofabrykach: bakteriach, komórkach owadów i systemach roślinnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Poznaj metody ekspresji białek rekombinowanych w bakteriach, komórkach owadów i systemach roślinnych. To porównanie pokazuje zalety i ograniczenia każdej platformy produkcyjnej w biotechnologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez akcję COST 'Molecular pharming: Plants as a production platform for high-value proteins' FA0804. Autorzy dziękują dr. Anatolijowi Giritchowi i prof. Yuri Glebie za udostępnienie wektorów MagnICON do celów badawczych.

<ol><li>Hampe, C. S., Hammerle, L. P., Falorni, A., Robertson, J., Lernmark, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutagenesis+of+K396R+of+the+65+kDa+glutamic+acid+decarboxylase+active+site+obliterates+enzyme+activity+but+not+antibody+binding%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutagenesis of K396R of the 65 kDa glutamic acid decarboxylase active site obliterates enzyme activity but not antibody binding.</a> FEBS Lett. 488 (3), 185-189 (2001).</li>
<li>Avesani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+human+GAD65+accumulates+to+high+levels+in+transgenic+tobacco+plants+when+expressed+as+an+enzymatically+inactive+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Recombinant human GAD65 accumulates to high levels in transgenic tobacco plants when expressed as an enzymatically inactive mutant.</a> Plant Biotechnol. J. 9 (8), 862-872 (2010).</li>
<li>Sambrook, J., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+laboratory+manual.+Second+Edition%22">Molecular Cloning: A laboratory manual. Second Edition</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (1989).</li>
<li>Avesani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+different+biofactories+for+the+production+of+a+major+diabetes+autoantigen%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of different biofactories for the production of a major diabetes autoantigen.</a> Transgenic Res. 23, 281-291 (2014).</li>
<li>Marillonnet, S., Giritch, A., Gils, M., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+planta+engineering+of+viral+RNA+replicons%3A+efficient+assembly+by+recombination+of+DNA+modules+delivered+by+Agrobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+%28USA%29%22%5BJournal%5D)">In planta engineering of viral RNA replicons: efficient assembly by recombination of DNA modules delivered by Agrobacterium.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. (USA). 101 (18), 6852-6857 (2004).</li>
<li>Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors+for+the+expression+of+proteins+in+plants%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Viral vectors for the expression of proteins in plants).</a> Curr. Opin. Biotechnol. 18, 134-141 (2007).</li>
<li>Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one+pot%2C+one+step%2C+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PLoS One. 3 (11), (2008).</li>
<li>Xu, R., Li, Q. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol%3A+streamline+cloning+of+genes+into+binary+vectors+in+Agrobacterium+via+the+Gateway+TOPO+vector+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Protocol: streamline cloning of genes into binary vectors in Agrobacterium via the Gateway TOPO vector system.</a> Plant Methods. 4 (4), 1-7 (2008).</li>
<li>Fairbanks, G., Steck, T. L., Wallach, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+analysis+of+the+major+polypeptides+of+the+human+erythrocyte+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane.</a> Biochemistry. 10 (13), 2606-2617 (1971).</li>
<li>Falorni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioimmunoassay+detects+the+frequent+occurrence+of+autoantibodies+to+the+Mr+65%2C000+isoform+of+glutamic+acid+decarboxylase+in+Japanese+insulin-dependent+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Radioimmunoassay detects the frequent occurrence of autoantibodies to the Mr 65,000 isoform of glutamic acid decarboxylase in Japanese insulin-dependent diabetes.</a> Autoimmunity. 19, 113-125 (1994).</li>
<li>Hunt, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+gene+to+protein%3A+a+review+of+new+and+enabling+technologies+for+multi-parallel+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">From gene to protein: a review of new and enabling technologies for multi-parallel protein expression.</a> Protein Expr. Purif. 40 (1), 1-22 (2005).</li>
<li>Arzola, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+co-expression+of+post-transcriptional+silencing+suppressor+for+increased+in+planta+expression+of+a+recombinant+anthrax+receptor+fusion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Transient co-expression of post-transcriptional silencing suppressor for increased in planta expression of a recombinant anthrax receptor fusion protein.</a> Int. J. Mol. Sci. 12 (8), 4975-4990 (2011).</li>
<li>Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+recombinant+protein+production+in+different+biofactories%3A+the+green+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Res.+Int%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: the green perspective.</a> Biomed. Res. Int. 2014, 136419(2014).</li>
<li>Avesani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+in+planta+expression+of+the+human+islet+autoantigen+glutamic+acid+decarboxylase+%28GAD65%29%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65).</a> Transgenic Res. 12 (2), 203-212 (2003).</li>
<li>Leuzinger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+agroinfiltration+of+Plants+for+high-level+transient+expression+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Efficient agroinfiltration of Plants for high-level transient expression of recombinant proteins.</a> J Vis Exp. (77), (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie zachodzi konflikt interesów w związku z publikacją niniejszej pracy.

W tym badaniu porównano trzy różne platformy ekspresji rekombinowanego białka ludzkiego: komórki bakteryjne, komórki bakulowirusa/owadów i rośliny. Platforma oparta na roślinach była dalej badana, wykorzystując trzy szeroko stosowane technologie ekspresji (tj. transjenty - oparte na MagnICON i pK7WG2 - oraz stabilne). Białko docelowe wybrane do tego eksperymentu, hGAD65mut, było wcześniej eksprymowane w różnych układach13, a jego produkcja i funkcjonalność są łatwo wykrywalne i mierzalne14....

Rekombinowane białka są komercyjnie masowo produkowane w heterologicznych systemach ekspresyjnych za pomocą nowych narzędzi biotechnologicznych. Kluczowe czynniki, które należy wziąć pod uwagę przy wyborze heterologicznego systemu ekspresji, to: jakość białka, funkcjonalność, szybkość procesu, wydajność i koszt.
W dziedzinie białek rekombinowanych, rynek farmaceutyków szybko się rozwija i w związku z tym większość produkowanych obecnie biofarmaceutyków jest rekombinowana. Białka mogą ulegać ekspresji w kulturach komórkowych bakterii, drożdży, pleśni, ssaków, roślin i owadów, a także w systemach roślinnych (poprzez stabilną lub przejściową transformację) i transgenicznych zwierząt; Każdy system ekspresji ma swoje nieodłączne zalety i ograniczenia, a dla każdego docelowego białka rekombinowanego należy dokładnie ocenić optymalny system produkcji.
Platformy oparte na roślinach stają się ważną alternatywą dla tradycyjnych systemów opartych na fermentorach dla bezpiecznej i opłacalnej produkcji białek rekombinowanych. Chociaż koszty dalszego przetwarzania są porównywalne z kosztami komórek drobnoustrojów i ssaków, kluczowymi zaletami są niższe inwestycje początkowe wymagane do komercyjnej produkcji roślin, oraz potencjalna ekonomia skali, zapewniana przez uprawę na dużych obszarach.
Oceniliśmy rośliny jako bioreaktory do ekspresji izoformy 65 kDa ludzkiej dekarboksylazy kwasu glutaminowego (hGAD65), jednego z głównych autoantygenów w autoimmunologicznej cukrzycy typu 1 (T1D). hGAD65 jest powszechnie stosowany jako marker, zarówno do klasyfikacji, jak i monitorowania postępu choroby, a jego rola w zapobieganiu cukrzycy typu 1 jest obecnie badana w badaniach klinicznych. Jeśli te próby zakończą się sukcesem, globalne zapotrzebowanie na rekombinowany hGAD65 dramatycznie wzrośnie.
Tutaj skupiamy się na ekspresji enzymatycznie nieaktywnego odpowiednika hGAD65, hGAD65mut, mutanta powstałego przez podstawienie reszty lizyny, która wiąże kofaktor PLP (fosforan pirydoksalu-5') resztą argininy (K396R)1. 
hGAD65mut zachowuje swoją immunogenność i w komórkach roślin i owadów akumuluje się do dziesięciu razy wyżej niż hGAD65, jego odpowiednik typu dzikiego. Postawiono hipotezę, że aktywność enzymatyczna hGAD65 zakłóca metabolizm komórek roślinnych do tego stopnia, że hamuje własną syntezę, podczas gdy hGAD65mut, enzymatycznie nieaktywna forma, może być akumulowany w komórkach roślinnych do wyższych poziomów.
Dla ekspresji hGAD65mut, tutaj zbadano użycie różnych technologii, szeroko stosowanych w biotechnologii roślin, i porównano je z tradycyjnymi platformami ekspresji (Escherichia coli i Baculovirus/oparte na komórkach owadów).
W tej pracy, platformy rekombinacyjne opracowane do ekspresji hGAD65mut, obejmujące systemy tradycyjne i oparte na roślinach, zostały poddane przeglądowi i porównane na podstawie szybkości procesu i wydajności, a także jakości i funkcjonalności produktu końcowego.

<table><tbody><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Sigma</td><td>Y1333</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Formedium</td><td>TRP03</td><td></td></tr><tr><td>Agar Klasa bakteriologiczna</td><td>Applichem</td><td>A0949</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 II SFM medium</td><td>Gibco</td><td>10902-088</td><td></td></tr><tr><td>Grace' s Pożywka dla owadów, nieuzupełniona</td><td>Gibco</td><td>11595-030</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Cellfectin II</td><td>Invitrogen</td><td>10362-100</td><td></td></tr><tr><td>MS pożywka zawierająca witaminy</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0222</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0809</td><td></td></tr><tr><td>Agar roślinny</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>P1001</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina sodowa</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>A0104</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>siarczan gentamycyny</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>G0124</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>ganciclovir</td><td>Invitrogen</td><td>I2562-023</td><td></td></tr><tr><td>Karbenicylina disodowa</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>C0109</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>siarczan kanamycyny</td><td>Sigma</td><td>K4000</td><td>Toksyczna</td></tr><tr><td>ryfampicyna</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>R0146</td><td>Toksyczny i ndash; 25 mg/ml zapas w DMSO</td></tr><tr><td>Siarczan streptomycyny</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0148</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>dichlorowodorek spektynomycyny</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0188</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (izopropil-&beta;-D-1-tiogalattopiranozyd)</td><td>Sigma</td><td>I5502</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>hydrat MES</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Biochemiczny</td><td>436994U</td><td></td></tr><tr><td>Acetosyringone</td><td>Sigma</td><td>D134406</td><td>Toksyczny &ndash; 0,1 M zapas w</td></tr><tr><td>strzykawce DMSO (1 ml)</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fluka</td><td>63136</td><td></td></tr><tr><td>BAP (6-benzyloaminopuryna)</td><td>Sigma</td><td>B3408</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>NAA (kwas naftalenooctowy)</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>N0903</td><td>Drażniący</td></tr><tr><td>Cefotaksym,</td><td>Mylan Generics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>Dostosuj pH za pomocą 1 N HCl, aby uzyskać bufor Tris-HCl</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>1 M zapas</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>PMSF (fluorek fenylometanosulfonylu)</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>, toksyczny</td></tr><tr><td>mocznik</td><td>Sigma</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P5927</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>DTT (Dithiothreitol)</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td>Toxic &ndash; 1 M zapas, przechowywać w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>C1374</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>koktajl inhibitorów proteazy roślinnej</td><td>Sigma</td><td>P9599</td><td>Nie zamrażaj/nie rozmrażaj zbyt wiele razy</td></tr><tr><td>SDS (dodecylosiarczan sodu)</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td>Łatwopalny, toksyczny, &ndash; 10% zapasu</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Blue R-250</td><td>Sigma</td><td>B7920</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma</td><td>24137</td><td>Łatwopalny</td></tr><tr><td>kwas octowy</td><td>Sigma</td><td>27221</td><td></td></tr><tr><td>dekarboksylaza kwasu antyglutaminowego 65/67</td><td>Sigma</td><td>G5163</td><td>Nie zamrażaj/nie rozmrażaj zbyt wiele razy</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-królicze sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP)</td><td>Sigma</td><td>A6154</td><td>Nie zamrażaj/nie rozmrażaj zbyt wiele razy</td></tr><tr><td>Życie komórek Sf9</td><td> Technologie</td><td>11496</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Kompetentny E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2530H</td><td></td></tr><tr><td>Białko A Sepharoza</td><td>Sigma</td><td>P2545</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do hodowli komórkowych</td><td>Zestaw do</td><td></td> testów radioimmunologicznych Sigma CLS3516 <td></td></tr><tr><td></td><td>Techno Genetics</td><td>12650805</td><td>Materiał radioaktywny</td></tr></tbody></table>

analiza porównawcza ekspresji białek rekombinowanych w różnych biofabrykach: bakteriach, komórkach owadów i systemach roślinnych

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

Systemy oparte na roślinach są uważane za cenną platformę do produkcji białek rekombinowanych, ze względu na ich dobrze udokumentowany potencjał do elastycznej, taniej produkcji wysokiej jakości, bioaktywnych produktów.
W tym badaniu porównaliśmy ekspresję docelowego ludzkiego białka rekombinowanego w tradycyjnych hodowlach komórkowych (bakteryjnych i owadzich) opartych na fermentorach z roślinnymi systemami ekspresji, zarówno przejściowymi, jak i stabilnymi.
Dla każdej platformy opisaliśmy ustawienie, optymalizację i długość procesu produkcyjnego, jakość produktu końcowego i wydajność, a także oceniliśmy tymczasowe koszty produkcji, specyficzne dla wybranego docelowego białka rekombinowanego.
Ogólnie rzecz biorąc, nasze wyniki wskazują, że bakterie nie nadają się do produkcji docelowego białka ze względu na jego nagromadzenie w nierozpuszczalnych ciałach inkluzyjnych. Z drugiej strony, systemy roślinne są wszechstronnymi platformami, które pozwalają na produkcję wybranego białka przy niższych kosztach niż system Bakulowirus/komórka owada. W szczególności stabilne linie transgeniczne charakteryzowały się najwyższą wydajnością produktu końcowego, a rośliny dokonujące ekspresji przejściowej najszybszym rozwojem procesu. Jednak nie wszystkie białka rekombinowane mogą czerpać korzyści z systemów roślinnych, ale najlepsza platforma produkcyjna powinna być określona empirycznie z podejściem indywidualnym dla każdego przypadku, jak opisano tutaj.

W niniejszym materiale opisano schemat eksperymentalny dla heterologicznej ekspresji docelowego białka rekombinowanego w różnych systemach produkcyjnych. Pierwszym etapem było przygotowanie poszczególnych platform poprzez ustalenie optymalnych warunków ekspresji białka docelowego w każdym z systemów.
Ekspresja białka docelowego, hGAD65mut, została indukowana w trzech powtórzeniach kultur E. coli. Po 3 hr ekspresji w 37 °C komórki bakteryjne zebrano poprzez wirowanie i poddano lizie za...

W tym badaniu porównano ekspresję docelowego ludzkiego białka rekombinowanego na różnych platformach produkcyjnych. Skupiliśmy się na tradycyjnych kulturach fermentorowych i roślinach, opisując konfigurację każdego systemu i podkreślając, na podstawie zgłoszonych wyników, nieodłączne ograniczenia i zalety każdej platformy.

Analiza porównawcza ekspresji białek rekombinowanych w różnych biofabrykach: bakteriach, komórkach owadów i systemach roślinnych

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

a-comparative-analysis-recombinant-protein-expression-different

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza porównawcza ekspresji białka rekombinowanego w różnych biofaktoriach: bakterie, komórki owadów i systemy roślinne

W erze genomiki post-humanistycznej dostępność białek rekombinowanych w natywnych konformacjach jest kluczowa dla badań i rozwoju w obszarze strukturalnym, funkcjonalnym oraz terapeutycznym. W niniejszej pracy opisujemy system ekspresji białek w skali testowej i przemysłowej z wykorzystaniem ludzkich komórek embrionalnej nerki 293T, który może być stosowany do produkcji różnorodnych białek rekombinowanych.

Wygodna i uniwersalna platforma ekspresyjna do produkcji białek wydzielanych z komórek ludzkich

Rośliny oferują nowatorski system do produkcji białek farmaceutycznych na skalę komercyjną, który jest bardziej skalowalny, opłacalny i bezpieczny niż obecne paradygmaty ekspresji. W tym badaniu przedstawiamy proste i wygodne, a jednocześnie skalowalne podejście do wprowadzenia genu docelowego zawierającego Agrobacterium tumefaciens do roślin w celu przejściowej ekspresji białka.

Efektywna agroinfiltracja roślin w celu uzyskania przejściowej ekspresji białek rekombinowanych na wysokim poziomie

Rozwój biotynylowalnych białek fuzyjnych ma wiele potencjalnych zastosowań w różnych dziedzinach badań. Inżynieria białek rekombinowanych to prosta procedura, która jest opłacalna, zapewniając wysoką wydajność niestandardowych białek.

Ekspresja, izolacja i oczyszczanie rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych białek biotynylowanych do regeneracji tkanki nerwowej

Ekspresja białek rekombinowanych przez systemy ssaków staje się atrakcyjną metodą wytwarzania kompleksów białkowych dla biologii strukturalnej. W tym artykule przedstawiamy prosty, ale bardzo wydajny system ekspresji wykorzystujący hodowane w zawiesinie komórki ssaków do oczyszczania kompleksów białkowych do badań strukturalnych.

Ekspresja białek rekombinowanych w biologii strukturalnej w komórkach zawiesinowych HEK 293F: nowatorskie i dostępne podejście

Współekspresja białek jest potężną alternatywą dla rekonstytucji in vitro kompleksów białkowych i jest pomocna w przeprowadzaniu testów biochemicznych i genetycznych in vivo. W tym artykule informujemy o wykorzystaniu koekspresji białek w Escherichia coli do uzyskania kompleksów białkowych i dostrojenia częstotliwości mutacji komórek.

Wieloaspektowe korzyści płynące z koekspresji białek w Escherichia coli

Laboratoryjna produkcja białek eukariotycznych z odpowiednią modyfikacją potranslacyjną stanowi istotną barierę. Oto solidny protokół z szybkim ustanowieniem i przekształceniem w ekspresję białek przy użyciu systemu ekspresji ssaków. System ten wspomaga selektywne znakowanie aminokwasów, selektywne znakowanie białek i małocząsteczkowych modulatorów składu glikanów.

Wysoka ekspresja rekombinowanych białek ludzkich z przejściową transfekcją komórek HEK293 w zawiesinie

Nielityczne systemy ekspresji komórek owadów są niedostatecznie wykorzystywane do produkcji, transportu/lokalizacji komórkowej i analizy funkcjonalnej białek rekombinowanych. W tym miejscu opisujemy metody generowania wektorów ekspresyjnych i późniejszej przejściowej ekspresji białek w dostępnych na rynku liniach komórkowych lepidoptera. Przedstawiono również kolokalizację akwaporyn Bemisia tabaci z subkomórkowymi białkami markerowymi fluorescencyjnymi.

Przejściowa ekspresja i lokalizacja komórkowa rekombinowanych białek w hodowanych komórkach owadów

Ten manuskrypt opisuje ogólne podejście do projektowania dostosowanych do potrzeb pożywek do uprawy mikrobiologicznej. Jest to możliwe dzięki iteracyjnemu procesowi pracy, łączącemu eksperymentalny projekt oparty na Krigingu i technologię mikrobioreaktorów w celu uzyskania wystarczającej przepustowości uprawy, która jest wspierana przez robotykę laboratoryjną w celu zwiększenia niezawodności i szybkości przygotowywania pożywek do pracy z cieczami.

Ogólny protokół optymalizacji produkcji białek heterologicznych przy użyciu technologii zautomatyzowanych mikrobioreaktorów

Ten protokół opisuje system ekspresji białek wywołany szokiem cieplnym (system komórkowy pDHsp/V5-His/sf9), który może być używany zarówno do ekspresji obcych białek, jak i oceny antyapoptotycznej aktywności potencjalnych obcych białek i ich skróconych aminokwasów w komórkach owadów.

Przejściowa ekspresja obcych genów w komórkach owadów (sf9) do testu funkcjonalnego białka

Tutaj prezentujemy protokoły wykorzystania systemu ekspresji białek komórek owadów i bakulowirusa do produkcji dużych ilości białek wydzielanych przez rośliny do krystalizacji białek. Wektor ekspresyjny bakulowirusa został zmodyfikowany za pomocą GP67 lub peptydu sygnałowego hemoliny owadów w celu ekspresji wydzielania białek roślinnych w komórkach owadów.

Modyfikowanie wektorów ekspresyjnych bakulowirusa w celu wytwarzania wydzielanych białek roślinnych w komórkach owadów

System wektorów ekspresyjnych bakulowirusa (BEVS) to solidna platforma do badania ekspresji i produkcji białkowych metylotransferaz argininowych (PRMT) do wykorzystania w badaniach biochemicznych, biofizycznych i strukturalnych. Miligramowe ilości materiału mogą być produkowane dla większości PRMT i innych białek będących przedmiotem zainteresowania, wymagających eukariotycznej platformy ekspresyjnej.

Produkcja rekombinowanych białek PRMT przy użyciu systemu wektorów ekspresyjnych bakulowirusa

Poznaj metody ekspresji białek rekombinowanych w bakteriach, komórkach owadów i systemach roślinnych. To porównanie pokazuje zalety i ograniczenia każdej platformy produkcyjnej w biotechnologii.

Analiza porównawcza ekspresji białek rekombinowanych w różnych biofabrykach: bakteriach, komórkach owadów i systemach roślinnych (Wideo) | JoVE Journal

Analiza porównawcza ekspresji białek rekombinowanych w różnych biofabrykach: bakteriach, komórkach owadów i systemach roślinnych

Przeglądaj więcej filmów