Name: Biokoniugacja i radiosynteza 89przeciwciał znakowanych Zr-DFO (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Poznaj metodę biokoniugacji i radiosyntezy przeciwciał znakowanych izotopem cyrkonu-89 z użyciem chelatora DFO do obrazowania PET w modelu nowotworowym myszy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują prof. Thomasowi Reinerowi, dr. Jacobowi Houghtonowi i dr. Serge'owi Lyaschenko za pomocne rozmowy.

Wszystkie opisane eksperymenty na zwierzętach in vivo zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonym protokołem i zgodnie z etycznymi wytycznymi Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Koniugacja DFO-NCS z J591
<ol>
	<li>W probówce do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml przygotować roztwór J591 o stężeniu 2-5 mg/ml w 1 ml 1x roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (pH 7,4) lub 0,5 M buforu HEPES (pH 7,4).</li>
	<li>DFO-NCS rozpuścić w suchym DMSO w stężeniu między 5-10 mM (3,8-7,6 mg/ml). Roztworu należy dokładnie poddać sonicjacji lub wirowi, aby ułatwić całkowite rozpuszczenie.</li>
	<li>Dostosować pH roztworu J591 do 8,8-9,0, dodając małe porcje (< 10 μl) 0,1 M Na2CO3 .</li>
	<li>Gdy roztwór przeciwciała osiągnie prawidłowe pH, dodać objętość roztworu DFO-NCS odpowiadającą 3-4-krotnemu nadmiarowi molowemu dwufunkcyjnego chelatora.
	<ol>
		<li>Na przykład dodać 4-5 μl 10 mM (7,6 mg/ml) roztworu DFO-NCS (40,4 nmol DFO-NCS) do 1 ml roztworu przeciwciała J591 o stężeniu 2 mg/ml (13,3 nmol J591). Ilość DMSO w końcowej wodnej mieszaninie reakcyjnej nie powinna przekraczać 2% v/v.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować reakcję przez 30 minut w temperaturze 37 °C na mieszającym bloku grzewczym przy 350 obr./min.</li>
	<li>Po 1 godzinie w temperaturze 37 °C oczyścić otrzymany immunokoniugat za pomocą wstępnie zapakowanej jednorazowej kolumny odsalającej wykluczającej rozmiar z odcięciem masy cząsteczkowej 50 000 przy użyciu 0,5 M buforu HEPES (pH 7,4) jako eluentu. Na tym etapie otrzymamy 2 ml roztworu gotowego konstruktu J591-DFO.</li>
	<li>Zmierzyć stężenie konstruktu J591-DFO na spektrofotometrze UV-Vis.</li>
	<li>Jeśli pożądane jest wyższe stężenie konstruktu, należy stężyć roztwór J591-DFO za pomocą odśrodkowej jednostki filtrującej z odcięciem 50 000 mas cząsteczkowych.</li>
	<li>Roztwór gotowego immunokoniugatu J591-DFO przechowywać w temperaturze -20 °C w ciemności. 
	UWAGA: Jest to dopuszczalny punkt zatrzymania procedury.</li>
</ol>
2. Radioznakowanie J591-DFO za pomocą 89Zr
UWAGA: Ten etap protokołu obejmuje obsługę i manipulację radioaktywnością. Przed wykonaniem tych kroków lub wykonaniem jakiejkolwiek innej pracy z promieniotwórczością badacze powinni skonsultować się z Departamentem Bezpieczeństwa Radiologicznego swojej instytucji macierzystej. Należy podjąć wszelkie możliwe kroki w celu zminimalizowania narażenia na promieniowanie jonizujące.  
UWAGA: W interesie prawidłowego prowadzenia notatek radiochemicznych, ilość radioaktywności w próbce powinna być mierzona za pomocą kalibratora dawki i rejestrowana przed i po krokach 2.2-2.13 w poniższym protokole. Pomoże to w dokładnym określeniu wydajności radiochemicznej i określonych działań.
<ol>
	<li>Przygotować roztwór 0,5-2,0 mg J591-DFO w 200 μl 0,5 M buforu HEPES o pH 7,5.</li>
	<li>Odpipetować objętość roztworu podstawowego 89Zr4+ (zwykle dostarczanego w 1,0 M kwasie szczawiowym) odpowiadającą 1,0-6,0 mCi (37-222 MBq) do probówki do mikrowirówki z tworzywa sztucznego o pojemności 2 ml. Dostosować objętość tego roztworu do całkowitej objętości 300 μl, używając 1,0 M kwasu szczawiowego.</li>
	<li>Doprowadzić pH roztworu 89Zr4+ do 6,8-7,5 za pomocą 1,0 M Na2CO3. Rozpocząć od dodania 250 μl 1,0 M Na2CO3 do roztworu 89Zr4+, a następnie dodać mniejsze (< 10 μl) podwielokrotności zasady, aby osiągnąć pożądane pH.</li>
	<li>Dodaj żądaną ilość roztworu 89Zr4+ o dostosowanym pH do roztworu J591-DFO przygotowanego w kroku 2.1.</li>
	<li>Sprawdzić pH mieszaniny reakcyjnej znakowanej radioizotopem, aby upewnić się, że mieści się ona w pożądanym zakresie 6,8-7,5.</li>
	<li>Inkubować reakcję znakowania promieniotwórczego przez 60 minut w temperaturze pokojowej na mieszającym bloku grzewczym z prędkością 350 obr./min.</li>
	<li>Po 60 minutach inkubacji zmierzyć wydajność znakowania radioaktywnego reakcji za pomocą radio-TLC.
	<ol>
		<li>W tym celu umieścić 1 μCi mieszaniny reakcyjnej znakowanej radioizotopem na nasączonym krzemionką pasku TLC. Pozostawić podwielokrotność do wyschnięcia, uruchomić TLC przy użyciu eluentu o stężeniu 50 mM DTPA (pH 5,5) i przeanalizować pasek TLC za pomocą skanera radiowego TLC. Rozdział 89Zr4+ związany z konstruktem J591-DFO pojawi się w punkcie początkowym (Rf < 0,1), podczas gdy wolne kationy 89Zr4+ będą schelatowane przez DTPA i będą eluować z frontem rozpuszczalnika (RF > 0,9).</li>
		<li>Obliczyć wydajność reakcji znakowania promieniotwórczego, całkując radiochromatogram, dzieląc obszar pod krzywą od Rf 0,0-0,1 przez całkowity obszar pod krzywą i mnożąc przez 100.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jeżeli wydajność znakowania promieniotwórczego jest wystarczająca (zazwyczaj teoretyczna aktywność właściwa >2 mCi/mg), należy wygasić reakcję 5 μl 50 mM DTPA, pH 5,5.</li>
	<li>Oczyść otrzymany immunokoniugat za pomocą wstępnie zapakowanej jednorazowej kolumny odsalającej wykluczającej rozmiar z odcięciem masy cząsteczkowej 50 000 przy użyciu eluentu 0,9% sterylnego soli fizjologicznej z 5 mg/ml kwasu gentyzynowego lub 0,25 M octanu sodu (pH 5,5) z 5 mg / ml kwasu gentyzynowego. Na tym etapie otrzymamy 2 ml roztworu gotowego radioimmunokoniugatu 89Zr-DFO-J591.</li>
	<li>Po oczyszczeniu sprawdzić czystość radiochemiczną 89Zr-DFO-J591 za pomocą radio-TLC, jak opisano w kroku 2.7.</li>
	<li>Obliczyć całkowitą wydajność znakowania radioaktywnego reakcji, dzieląc ilość aktywności początkowo dodanej do roztworu przeciwciała przez ilość radioaktywności wyizolowanej za pomocą oczyszczonego radioimmunokoniugatu 89Zr-DFO-J591.</li>
	<li>Obliczyć końcową aktywność specyficzną, dzieląc ilość aktywności wyizolowanej z oczyszczonym radioimmunokoniugatem 89Zr-DFO-J591 przez początkową masę DFO-J591 w reakcji znakowania promieniotwórczego.</li>
	<li>Jeśli pożądane jest wyższe stężenie, należy stężyć roztwór 89Zr-DFO-J591 za pomocą odśrodkowej jednostki filtrującej z granicą masy cząsteczkowej 50 000 
	UWAGA: Kwas gentyzynowy stosowany w końcowym etapie oczyszczania jest środkiem radioochronnym stosowanym w celu zminimalizowania degradacji przeciwciała w wyniku radiolizy. 46 Chociaż możliwe jest przechowywanie radioimmunokoniugatu 89Zr-DFO-J591 przez okres do 48 godzin w temperaturze 4 °C, nie jest to zalecane. Jeżeli radioimmunokoniugat ma być przechowywany, należy użyć 0,25 M octanu sodu (pH 5,5) z 5 mg/ml kwasu gentyzynowego jako buforu do przechowywania, aby zminimalizować ryzyko radiolizy za pośrednictwem podchlorynu. Rozdział 47</li>
</ol>
3. Obrazowanie PET in vivo za pomocą 89Zr-DFO-J591
UWAGA: Podobnie jak w Sekcji 2 Protokołu, ten etap protokołu obejmuje postępowanie i manipulację radioaktywnością. Przed wykonaniem tych czynności badacze powinni skonsultować się z Departamentem Bezpieczeństwa Radiologicznego swojej instytucji macierzystej. Należy podjąć wszelkie możliwe kroki w celu zminimalizowania narażenia na promieniowanie jonizujące.
<ol>
	<li>U samców nagich myszy atymicznych należy wszczepić podskórnie 5 x 106 komórek raka prostaty LNCaP i pozwolić im urosnąć do ksenoprzeszczepu 100-150 mm3 (3-4 tygodnie po inokulacji). Rozdział 44</li>
	<li>Rozcieńczyć 89Zr-DFO-J591 radioimmunokoniugatu do stężenia 1,0 mCi/ml w 0,9% sterylnym roztworze soli fizjologicznej.</li>
	<li>Wstrzyknąć 200 μl roztworu 89Zr-DFO-J591 (200 μCi; 7,4 MBq) do bocznej żyły ogonowej myszy z ksenoprzeszczepem. Rozdział 48</li>
	<li>W pożądanym punkcie czasowym obrazowania (np. 12, 24, 48, 72, 96 lub 120 godzin po wstrzyknięciu) znieczulij mysz 2% mieszaniną izofluranu i tlenu gazowego.</li>
	<li>Umieść mysz na łóżku skanera PET dla małych zwierząt i utrzymuj znieczulenie podczas skanowania za pomocą 1% mieszaniny izofluranu i tlenu gazowego. Przed umieszczeniem zwierzęcia na łóżku skanera należy sprawdzić znieczulenie metodą szczypania palców u nóg i nałożyć maść okulistyczną na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Rozdział 49</li>
	<li>Pozyskaj dane PET dla myszy za pomocą skanowania statycznego z co najmniej 40 milionami zbiegów zdarzeń przy użyciu okna energetycznego 350-700 keV i okna czasowego koincydencji wynoszącego 6 nsec. 50</li> Rozdział
	<li>Po zakończeniu akwizycji obrazu nie pozostawiaj myszy bez opieki i nie umieszczaj jej w klatce z innymi myszami, dopóki nie odzyska przytomności.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Chociaż budowa, znakowanie radioaktywne i obrazowanie 89radioimmunokoniugatów z wykrywaniem Zr-DFO jest na ogół dość prostą procedurą, ważne jest, aby pamiętać o kilku kluczowych kwestiach na każdym etapie procesu. Na przykład, być może najbardziej prawdopodobnym powodem do niepokoju na etapie koniugacji procedury jest agregacja przeciwciała podczas reakcji koniugacji. Problem ten jest najczęściej wynikiem złego wymieszania reakcji koniugacji po dodaniu roztworu podstawowego DFO-NCS. 22 W takim przy...

Ze względu na ich niezwykłą wrażliwość, powinowactwo i selektywność, przeciwciała od dawna uważane są za obiecujące wektory dostarczania radioizotopów do komórek nowotworowych. Jednak ich zastosowanie w obrazowaniu pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) było utrudnione ze względu na brak odpowiedniego radioizotopu emitującego pozytony do ich znakowania. 1-3 Jednym z najważniejszych czynników branych pod uwagę przy projektowaniu radioimmunokoniugatów jest dopasowanie okresu półtrwania fizycznego rozpadu radioizotopu do farmakokinetyki in vivo przeciwciała. Mówiąc dokładniej, przeciwciała często mają stosunkowo długie, wielodniowe biologiczne okresy półtrwania i dlatego muszą być znakowane radioizotopami o porównywalnych fizycznych okresach półtrwania. W przypadku zastosowań obrazowania PET przeciwciała tradycyjnie znakowano radioizotopem za pomocą 64Cu (t1/2 = 12,7 h), 86Y (t1/2 = 14,7 h) lub 124I (t1/2 = 4,18 d). 4,5 Jednak każdy z tych izotopów promieniotwórczych ma istotne ograniczenia, które ograniczają ich przydatność do obrazowania klinicznego. Podczas gdy radioimmunokoniugaty znakowane 86Y i 64Cu okazały się obiecujące w badaniach przedklinicznych, oba izotopy mają fizyczne okresy półtrwania, które są zbyt krótkie, aby były skuteczne w obrazowaniu u ludzi. 124 RozdziałI, w przeciwieństwie do tego, mam prawie idealny fizyczny okres półtrwania do obrazowania z przeciwciałami, ale jest drogi i ma nieoptymalną charakterystykę rozpadu, co prowadzi do obrazów klinicznych o stosunkowo niskiej rozdzielczości. Co więcej, 124radioimmunokoniugaty znakowane izotopem I mogą być poddawane dehalogenacji in vivo, procesowi, który może obniżyć stosunek aktywności guza do tła. 6,7
Dążenie do znalezienia radioizotopu emitującego pozytony, który zastąpi 64Cu, 86Y i 124I w radioimmunokoniugatach, napędzało niedawny wzrost badań nad przeciwciałami znakowanymi 89Zr. 8-12 Powód pojawienia się 89Zr jest prosty: radiometal posiada prawie idealne właściwości chemiczne i fizyczne do stosowania w diagnostycznych radioimmunokoniugatach PET. 13 89Zr jest wytwarzany w reakcji 89Y(p,n)89Zr na cyklotronie przy użyciu komercyjnie dostępnego i w 100% naturalnie występującego celu 89Y. 14,15 Radiometal ma wydajność pozytonów na poziomie 23%, rozpada się z okresem połowicznego rozpadu wynoszącym 78,4 godziny i emituje pozytony o stosunkowo niskiej energii 395,5 keV (ryc. 1). 13,16,17 Należy zauważyć, że 89Zr emituje również promieniowanie γ o wysokiej energii, 909 keV z 99% wydajnością. Chociaż emisja ta nie zakłóca energetycznie emitowanych fotonów o natężeniu 511 keV, wymaga dodatkowego rozważenia w odniesieniu do transportu, obsługi i dozymetrii. Pomimo tego zastrzeżenia, te cechy rozpadu ostatecznie oznaczają, że 89Zr ma nie tylko korzystniejszy okres półtrwania do obrazowania przeciwciałami niż 86Y i 64Cu, ale może również wytwarzać obrazy o wyższej rozdzielczości niż 124I, które emitują pozytony o wyższych energiach 687 i 975 keV, a także pewną liczbę fotonów o energiach w zakresie 100-150 keV od fotonów utworzonych przez pozytony 511 keV. 13 Co więcej, 89Zr jest również bezpieczniejszy w obsłudze, tańszy w produkcji i skuteczniej rezydualizuje się w nowotworach niż jego odpowiednik z jodem promieniotwórczym. 18,19 Jednym z potencjalnych ograniczeń 89Zr jest to, że nie ma on izotopologii terapeutycznej, np. 86Y (PET) vs. 90Y (terapia). Wyklucza to konstruowanie identycznych chemicznie, zastępczych środków obrazowania, które mogą być wykorzystywane jako zwiady dozymetryczne dla swoich terapeutycznych odpowiedników. To powiedziawszy, badania sugerują, że 89przeciwciał znakowanych Zr ma potencjał jako substytuty obrazowania dla 90immunokoniugatów znakowanych Y i 177Lu. 20,21
Z chemicznego punktu widzenia, jako metal grupy IV, 89Zr występuje jako kation +4 w roztworze wodnym. Jon Zr4+ jest silnie naładowany, stosunkowo duży (efektywny promień jonowy = 0,84 A) i może być sklasyfikowany jako "twardy" kation. W związku z tym preferuje ligandy zawierające do ośmiu twardych, anionowych donorów tlenu. Z pewnością najpowszechniejszym chelatorem stosowanym w 89radioimmunokoniugatach znakowanych Zr jest desferrioksamina (DFO), pochodzący z sideroforu, acykliczny chelator zawierający trzy grupy hydroksamatomowe. Ligand stabilnie koordynuje kation Zr4+ szybko i czysto w RT przy biologicznie odpowiednich poziomach pH, a powstały kompleks Zr-DFO pozostaje stabilny przez wiele dni w soli fizjologicznej, surowicy krwi i krwi pełnej. 22 Badania obliczeniowe silnie sugerują, że DFO tworzy kompleks heksawspółrzędnych z Zr4+, w którym metalowe centrum jest skoordynowane z trzema neutralnymi i trzema anionowymi donorami tlenu liganda, a także dwoma egzogennymi ligandami wodnymi (ryc. 2). 23,24 Zachowanie in vivo radioimmunokoniugatów wykorzystujących rusztowanie koniugacyjne 89Zr-DFO było na ogół doskonałe. Jednak w niektórych przypadkach obrazowanie i badania ostrej biodystrybucji wykazały podwyższony poziom aktywności w kościach myszy, którym wstrzyknięto przeciwciała znakowane 89Zr, dane sugerujące, że osteofilny kation 89Zr4 + jest uwalniany z chelatora in vivo, a następnie mineralizuje się w kości. 25 W ostatnim czasie w literaturze ukazało się wiele badań nad rozwojem nowych chelatorów 89Zr4+, w szczególności ligandów z ośmioma donorami tlenu. 24,26,27 Niemniej jednak, w chwili obecnej, DFO jest najczęściej stosowanym chelatorem w 89radioimmunokoniugatach znakowanych Zr. Do przyłączenia DFO do przeciwciał zastosowano wiele różnych strategii biokoniugacji, w tym bioortogonalną chemię kliknięć, reakcję reaktywnych tiolowo-reaktywnych konstruktów DFO z cysteinami w przeciwciałie oraz reakcję aktywowanych konstruktów DFO zawierających estry z lizynami w przeciwciałie. 4,28-30 Z pewnością najpowszechniejszą strategią jest jednak użycie pochodnej DFO ZAWIERAJĄCEJ IZOTIOCYJANIANY, DFO-NCS (rysunek 2). 22 Ten dostępny na rynku dwufunkcyjny chelator solidnie i niezawodnie tworzy stabilne, kowalencyjne wiązania tiomocznikowe z lizynami przeciwciała (ryc. 3).
W ciągu ostatnich kilku lat, w literaturze opisano szeroką gamę 89radioimmunokoniugatów znakowanych Zr-DFO. Badania przedkliniczne były szczególnie obfite, obejmujące przeciwciała od bardziej znanego cetuksymabu, bewacyzumabu i trastuzumabu po bardziej ezoteryczne przeciwciała, takie jak TRC105 ukierunkowane na CD105 i 5A10 skierowane przeciwko fPSA. 30-36 Ostatnio w literaturze pojawiła się niewielka liczba wczesnych badań klinicznych z użyciem 89przeciwciał znakowanych Zr-DFO. W szczególności grupy w Holandii opublikowały badania, w których stosowano 89Zr-DFO-cmAb U36, 89Zr-DFO-ibritumomab tiuxetan i 89Zr-DFO-trastuzumab. 21,32,37 Ponadto obecnie prowadzony jest szereg innych badań klinicznych z wykorzystaniem radioimmunokoniugatów znakowanych 89Zr, w tym badania w Memorial Sloan Kettering Cancer Center z użyciem ukierunkowanego na PSMA 89Zr-DFO-J591 do obrazowania raka prostaty i ukierunkowanego na HER2 89Zr-DFO-trastuzumabu do obrazowania raka piersi. 23,30 Ponadto, podczas gdy przeciwciała znakowane radioaktywnie pozostają najpowszechniejszymi radiofarmaceutykami znakowanymi 89Zr, radiometal jest również coraz częściej stosowany w innych wektorach, w tym peptydach, białkach i nanomateriałach. 38-43 Rozdział 38-43
Modułowość tej metodologii etykietowania 89Zr-DFO jest ogromnym atutem. Repertuar przeciwciał ukierunkowanych na biomarkery stale się poszerza, a zainteresowanie wykonywaniem obrazowania PET in vivo przy użyciu tych konstruktów rośnie w szybkim tempie. W związku z tym uważamy, że opracowanie bardziej ustandaryzowanych praktyk i protokołów może przynieść korzyści tej dziedzinie. Doskonały pisemny protokół eksperymentalny dla koniugacji DFO-NCS i znakowania radioaktywnego 89Zr został już opublikowany przez Vosjana i wsp.22 Uważamy, że wizualna demonstracja zapewniona przez te prace może jeszcze bardziej pomóc badaczom, którzy dopiero zaczynają przygodę z tymi technikami. W omawianym protokole specyficzny dla prostaty antygen błonowy ukierunkowany na przeciwciało J591 zostanie wykorzystany jako system modelowy do zilustrowania (1) biokoniugacji dwufunkcyjnego chelatora DFO-izotiocyjanianu z przeciwciałem, (2) radiosyntezy i oczyszczania radioimmunokoniugatu 89Zr-DFO-mAb oraz (3) obrazowania PET in vivo z radioimmunokoniugatem 89Zr-DFO-mAb w mysim modelu raka. Księga 23,44,45

<table><tbody><tr><td>p-SCN-Bn-DFO</td><td>Makrocykle</td><td>B-705</td><td>Przechowywać w temperaturze -80 &deg; C</td></tr><tr><td>[89Zr]Zr-szczawian</td><td>Różne, w tym Perkin-Elmer</td><td></td><td>Uwaga: Materiał radioaktywny</td></tr><tr><td>Kolumny odsalające PD-10</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01&nbsp;</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Filtry odśrodkowe Amicon Ultra-4 EMD</td><td>Millipore</td><td>UFC805024</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Papier RadioTLC impregnowany żelem krzemionkowym</td><td>Agilent Technologies</td><td>SGI0001</td><td>Pokrój w paski o szerokości 0,5 cm</td></tr></tbody></table>

biokoniugacja i radiosynteza 89przeciwciał znakowanych zr-dfo

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

Wyjątkowe powinowactwo, specyficzność i selektywność przeciwciał czynią je niezwykle atrakcyjnymi wektorami dla radiofarmaceutyków PET ukierunkowanych na nowotwory. Ze względu na ich wielodniowy biologiczny okres półtrwania, przeciwciała muszą być znakowane radionuklidami emitującymi pozytony o stosunkowo długim okresie półtrwania rozpadu fizycznego. Tradycyjnie, izotopy emitujące pozytony 124I (t1/2 = 4,18 d), 86Y (t1/2 = 14,7 h) i 64Cu (t1/2 = 12,7 h) były używane do znakowania przeciwciał do obrazowania PET. Ostatnio jednak w tej dziedzinie nastąpił dramatyczny wzrost wykorzystania promieniometalu 89Zr emitującego pozytony w środkach do obrazowania PET opartych na przeciwciałach. Rozdział 89Zr jest prawie idealnym radioizotopem do obrazowania PET z immunokoniugatami, ponieważ posiada fizyczny okres półtrwania (t1/2 = 78,4 h), który jest zgodny z farmakokinetyką przeciwciał in vivo i emituje pozyton o stosunkowo niskiej energii, który daje obrazy o wysokiej rozdzielczości. Co więcej, przeciwciała można bezpośrednio znakować za pomocą 89Zr przy użyciu chelatora desferrioksaminy pochodzącego z sideroforu (DFO). W tym protokole specyficzny dla prostaty antygen błonowy ukierunkowany na przeciwciało J591 zostanie wykorzystany jako system modelowy do zilustrowania (1) biokoniugacji dwufunkcyjnego chelatora DFO-izotiocyjanianu z przeciwciałem, (2) radiosyntezy i oczyszczania radioimmunokoniugatu 89Zr-DFO-mAb oraz (3) obrazowania PET in vivo z radioimmunokoniugatem 89Zr-DFO-mAb w mysim modelu raka.

Pierwszy krok w tym protokole, czyli koniugacja DFO-NCS z przeciwciałem, jest zazwyczaj bardzo skuteczny i niezawodny. Zazwyczaj oczyszczony immunokoniugat modyfikowany chelatorem można uzyskać z wydajnością &gt; 90%, a zastosowanie 3 ekwiwalentów molowych DFO-NCS w początkowej reakcji koniugacji pozwoli uzyskać stopień znakowania chelatorem wynoszący około 1,0-1,5 DFO/mAb. Kroki znakowania radioizotopem 89Zr oraz oczyszczania procedury są równie proste. Przy stężeniach opisanych w powyższym protokole, wydajno...

Ze względu na swój wielodniowy okres półtrwania radioaktywnego i korzystne właściwości rozpadu, emitujący pozytony radiometal 89Zr doskonale nadaje się do stosowania w radiofarmaceutykach opartych na przeciwciałach do obrazowania PET. W tym protokole opisana zostanie biokoniugacja, radiosynteza i przedkliniczne zastosowanie przeciwciał znakowanych 89Zr.

Biokoniugacja i radiosynteza 89przeciwciał znakowanych Zr-DFO

The exceptional affinity, specificity, and selectivity of antibodies make them extraordinarily attractive vectors for tumor-targeted PET ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest synteza radioimmunokonjugatu znakowanego cyrkonem 89 i DFO oraz ocena jego wydajności in vivo. Jest to realizowane poprzez najpierw przyłączenie chelatora deferoksaminy do przeciwciała. Drugim krokiem jest radiowe znakowanie konjugatu przeciwciała z DFO cyrkonem 89.Następnie radioimmunokonjugat jest oczyszczany za pomocą chromatografii wykluczania żelowego. Ostatnim krokiem jest wykonanie obrazowania pozytonowej tomografii emisyjnej, czyli PET, u małych zwierząt w mysim modelu raka. Ostatecznie obrazowanie PET służy do uzyskania obrazów rozkładu in vivo radioimmunokonjugatu znakowanego cyrkonem 89.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ regulacja pH roztworu szczawianu cyrkonu 89 może być nieco problematyczna. Przedstawię tę procedurę wspólnie z Dalią Abdi, technikiem w naszym laboratorium. Najpierw przygotuj roztwór J 5 91 o stężeniu od 2 do 5 mg/mL w 1 mL 0,5 M buforu HEPES w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 mL, rozpuść D-F-O-N-C-S w suchym DMSO w stężeniu od 5 do 10 mM, a następnie poddaj roztwór działaniu sonikatora i wirówki w celu zapewnienia całkowitego rozpuszczenia.Następnie dost

the-bioconjugation-and-radiosynthesis-of-89zr-dfo-labeled-antibodies

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Biokoniugacja i radiosynteza 89Zr-DFO-oznaczonych przeciwciał

Ten film opisuje technikę precelowanej radioimmunoterapii lub PRIT, w której do leczenia nowotworów podaje się immunokoniugaty, a następnie radioligandy. Ta radioimmunoterapia zmniejsza dawki promieniowania do zdrowych tkanek i wykorzystuje radionuklidy o bardzo krótkim okresie półtrwania, niezgodne z wektorami opartymi na przeciwciałach.

Radioimmunoterapia pretargetowana: metoda celowanego dostarczania terapeutycznych radionuklidów do nowotworów

Ten film demonstruje technikę wykorzystującą radioimmunokoniugat do obrazowania in vivo guza na modelu mysim. Po wstrzyknięciu radioimmunokoniugatu przeciwciała koniugatu wiążą się ze specyficznym antygenem błonowym na komórkach nowotworowych. Radioznacznik koniugatu emituje pozytony, które oddziałują z sąsiednimi elektronami w celu wytworzenia energii, która jest wykrywana przez skaner pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) w celu stworzenia obrazu guza.

Technika obrazowania PET in vivo do wykrywania guzów w modelu mysim przy użyciu przeciwciał znakowanych radioaktywnie

Bioortogonalna cykloaddycja Dielsa-Aldera została wykorzystana do stworzenia skutecznej i modułowej, pretargetowanej strategii obrazowania PET dla raka. W niniejszym protokole etapy tej metodologii są opisane w kontekście systemu modelowego wykorzystującego przeciwciało ukierunkowane na raka jelita grubego huA33 i radioligand znakowany 64Cu.

Wykorzystanie bioortogonalnej cykloaddycji Dielsa-Aldera z odwróconym zapotrzebowaniem elektronów do wstępnie ukierunkowanego obrazowania PET

Opisano szczegółową procedurę syntezy azydku znakowanego 125I oraz znakowania radioaktywnego nanocząstek złota o wielkości 13 nm sprzężonych z grupą dibenzocyklooktynu (DBCO) przy użyciu reakcji kliknięcia bez miedzi.

Zoptymalizowany protokół skutecznego znakowania radioaktywnego nanocząstek złota przy użyciu azydkowej grupy protetycznej znakowanej 125I

Tutaj opisujemy protokół znakowania radioaktywnego i testowania in vivo pochodnych chelatu tetrazyny tridentate 99mTc(I) do wstępnego celowania i chemii bioortogonalnej.

Przygotowanie i ocena chelatów trójzębnych znakowanych 99 mTc do wstępnego celowania przy użyciu chemii bioortogonalnej

Peptydy pochodzenia wirusowego sprzężone z koniugatami przeciwciał (AC) to podejście, które nabiera rozpędu ze względu na potencjał dostarczania ładunków molekularnych ze zwiększoną akumulacją komórek nowotworowych. Wykorzystując powszechne metody oceny koniugacji peptydów, akumulacji wewnątrzkomórkowej AC i ładunku oraz celowania w guz, protokół ten pomaga naukowcom w kluczowych początkowych fazach rozwoju.

Wstępna ocena koniugatów przeciwciał zmodyfikowanych peptydami pochodzącymi z wirusów w celu zwiększenia akumulacji komórkowej i poprawy celowania w guz

Ten protokół opisuje syntezę i charakterystykę przeciwciała modyfikowanego trans-cyklooctenem (TCO) oraz 177znakowanego Lu radioligandu tetrazyny (Tz) do radioterapii pretargetowanej (PRIT). Ponadto szczegółowo opisano zastosowanie tych dwóch konstruktów w badaniach biodystrybucji in vivo i terapii podłużnej w mysim modelu raka jelita grubego.

Precelowana radioimmunoterapia oparta na odwróconej reakcji Dielsa-Aldera na odwrócone zapotrzebowanie elektronowe

W tym protokole opiszemy syntezę PODS, odczynnika na bazie fenyoksadiazolylu metylosulfonu do selektywnego przyłączania ładunków do tioli biomolekuł, szczególnie przeciwciał. Ponadto opiszemy syntezę i charakterystykę dwufunkcyjnego chelatora nośnego POD oraz jego koniugację z modelowym przeciwciałem.

Synteza i biokoniugacja odczynników tiolowo-reaktywnych do tworzenia immunokoniugatów modyfikowanych selektywnie

Tutaj opisana jest metoda określania powinowactwa (KD) przeciwciał znakowanych radioaktywnie do unieruchomionych antygenów. KD jest stałą dysocjacji równowagi, którą można wyznaczyć na podstawie eksperymentu wiązania nasycenia, mierząc całkowite, specyficzne i niespecyficzne wiązanie przeciwciała znakowanego radioaktywnie w różnych stężeniach z jego antygenem.

Określanie powinowactwa wiązania (KD) przeciwciał znakowanych radioaktywnie do unieruchomionych antygenów

Przedstawiono tutaj protokół znakowania radioizotopowego komórek za pomocą radioizotopu pozytonowej tomografii emisyjnej (PET), 89Zr (t1/2 78.4 h), przy użyciu gotowego do użycia syntonu radioznakującego, [89Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([89Zr]Zr-DBN). Znakowanie radioizotopowane komórek za pomocą [89Zr]Zr-DBN umożliwia nieinwazyjne śledzenie i obrazowanie podanych komórek znakowanych radioaktywnie w organizmie za pomocą PET przez okres do 7 dni po podaniu.

Obrazowanie transportu komórek za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej: metoda znakowania radioaktywnego komórek

Ta praca opisuje zautomatyzowaną produkcję do 1,7 GBq [68Ga]Ga-FAPI-46 na syntezatorze iPHASE MultiSyn do obrazowania PET białka aktywującego fibroblasty.

Zautomatyzowana radiosynteza [68Ga]Ga-FAPI-46 do rutynowego stosowania klinicznego

Poznaj metodę biokoniugacji i radiosyntezy przeciwciał znakowanych izotopem cyrkonu-89 z użyciem chelatora DFO do obrazowania PET w modelu nowotworowym myszy.

Biokoniugacja i radiosynteza ⁸⁹przeciwciał znakowanych Zr-DFO

Przeglądaj więcej filmów