Name: Organotypowy model kohodowli 3D wspierający proliferację, różnicowanie i ekspresję genów rozwiązłych komórek nabłonka grasicy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Poznaj metodę trójwymiarowej hodowli organotypowej komórek nabłonka rdzenia grasicy, która wspiera proliferację, różnicowanie i ekspresję genów. Technika ta znacznie przewyższa tradycyjne systemy 2D w badaniach immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Niemieckie Centrum Badań nad Rakiem (DKFZ), konsorcjum UE "Tolerage", Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 938) i Landesstiftung Baden-Württemberg.

To badanie zostało zatwierdzone przez komisję etyczną Regierungspräsidium Karlsruhe. Wszystkie zwierzęta były trzymane w określonych warunkach wolnych od patogenów w Niemieckim Centrum Badań nad Rakiem (DKFZ). Do wszystkich eksperymentów hodowlanych wykorzystano młode myszy w wieku od 1 do 7 dni.
1. Izolacja mTEC od grasicy
UWAGA: Następujące etapy trawienia zostały przeprowadzone zgodnie z wcześniejszym opisem1 w sterylnych warunkach z pewnymi modyfikacjami w następujący sposób.
<ol>
	<li>Odetnij głowę szczeniakom myszy i usuń grasicę. Umieść thymi na lodzie na płytce Petriego zawierającej pożywkę RPMI 1640 (zawierającą 5% FCS).</li>
	<li>Pokrój thymi na drobne, małe kawałki i umieść w okrągłej probówce z ~5-30 ml pożywki RPMI i delikatnie mieszaj za pomocą magnesu przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Następnie zdekantować supernatant zawierający głównie tymocyty i trawić pozostałą tkankę sekwencyjnie za pomocą jednej rundy kolagenazy typu IV (0,2 mg/ml i 57 U/ml końcowej koncentracji) przez 15 minut każdy w temperaturze 37 °C, a następnie kolagenazę/dypazę (0,2 mg/ml i 1,2 U/ml stężenie końcowe) przez 25 minut w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej z mieszaniem magnetycznym, aż do całkowitego strawienia thymi. Użyj 1 ml enzymu na dwie do trzech grasicy.</li>
	<li>Mieszaj tkankę raz na 7-10 minut za pomocą pipety Pasteura. Połącz frakcje kolagenazy/dyspazy i przefiltruj przez gazę o grubości 70 μm.</li>
	<li>Wzbogać mTEC za pomocą magnetycznego sortowania komórek (MACS). Przeprowadzić oczyszczanie mTEC przez magnetyczne sortowanie komórek, jak opisano wcześniej11 i pokazano na rysunku 1. 
	UWAGA: Do sortowania magnetycznego mTEC użyliśmy następujących przeciwciał: anty-CD80-PE (16-10A1, stosować w rozcieńczeniu 1:100) i anty-EpCAM-bio (G8.8, stosować w rozcieńczeniu 1:100)12. Niedojrzałe i dojrzałe mTEC wykorzystujące MACS zdefiniowano odpowiednio: CD45- EpCAM+, CD80- i CD45- CD80+.</li>
	<li>Po oczyszczeniu MACS (czystość niedojrzałych mTEC = 83,1 ± 6,3 % i dojrzałych mTEC = 79,23 ± 3,42%), należy wysiać mTEC do kultur organotypowych, jak opisano poniżej (sekcja 2.3).</li>
	<li>Alternatywnie, sortuj mTEC według FACS (przy użyciu dyszy 100 μm) po wyczerpaniu CD45 MACS przy użyciu następujących przeciwciał: anty-CD45-PerCP (30-F11, stosować w rozcieńczeniu 1:100), anty-Ly51-FITC (6C3, stosować w rozcieńczeniu 1:100), anty-EpCAM-Alexa647 (G8.8, stosować w rozcieńczeniu 1:500) i anty-CD80-PE (16-10A1, stosować w rozcieńczeniu 1:100). Wyklucz martwe komórki za pomocą jodku propidyny (1:5 000) (dzień 4). Niedojrzałe i dojrzałe mTEC wykorzystujące FACS zdefiniowano odpowiednio jako: PI- CD45- Ly51-EpCAM+ CD80- i PI- CD45-Ly51- EpCAM+ CD80+.</li>
</ol>
2. 3D Organotypowe kokultury (OTC)
UWAGA: Konstrukcje 3D-dermalne do organotypowej hodowli keratynocytów zostały przygotowane zgodnie z wcześniejszym opisem9,13. Na wszystkich etapach komórki inkubowano w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Leki OTC wykorzystujące mTEC zostały przygotowane z niewielkimi modyfikacjami w następujący sposób.
<ol>
	<li>Przygotowanie ludzkich fibroblastów 
	UWAGA: Ludzkie fibroblasty skóry uzyskano z kultur eksplantatów zdeepidermizowanej skóry właściwej, jak opisano wcześniej9.
	<ol>
		<li>Krótko mówiąc, odetnij paski ludzkiej skóry ( ~ 5 cm długości) i potraktuj termolizyną (0,5 mg / ml w soli fizjologicznej o 10 mM Hepes pH 7,4) O / N w 4 °C.</li>
		<li>Następnie oddziel naskórek od skóry właściwej za pomocą kleszczy.</li>
		<li>Drobno pokrój skórę właściwą na małe kawałki, umieść na 10-centymetrowej płytce Petriego i pozostaw do wyschnięcia na 1-2 godziny pod sterylnym strumieniem powietrza. Regularnie uzupełniaj eksplantaty DMEM zawierającym 20 % FBS.</li>
		<li>Podziel wyrastające fibroblasty po zlewaniu się (zwykle około 3 tygodni) za pomocą 0,1% trypsyny, upewniając się, że eksplantaty nadal przylegają do płytki przez kolejne rundy wzrostu.</li>
		<li>Rozszerz fibroblasty z tych samych eksplantatów do 3 razy w DMEM za pomocą 10% FBS i zakonserwuj jekriokonserwacją 14. Użyj tej samej partii fibroblastów dla każdej serii eksperymentalnej. 
		UWAGA: Fibroblasty nie były napromieniane w celu utworzenia odpowiedników na skórę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie rusztowania
	<ol>
		<li>Pokrój wiskozę, włókninę włóknistą o grubości 0,4-0,6 mm (szczegóły produktu w pomocniczym arkuszu Excel) na dobrze odgraniczone okręgi za pomocą ostrego metalowego dziurkacza o średnicy 11 mm, aby dokładnie pasował do 12 wkładów filtracyjnych. Następnie umieść go w 12-dołkowym wkładzie filtracyjnym (poliestrowa membrana kapilarna o wielkości porów 3 μm) jako rusztowanie. Umieść cały zestaw filtra w sterylnej 12-dołkowej płytce.</li>
		<li>Przygotuj żel fibrynowy za pomocą zestawu kleju fibrynowego do zabiegu chirurgicznego składającego się z kombinacji fibrynogenu i trombiny. Wstępnie rozcieńczyć fibrynogen i trombinę wchodzące w skład zestawu odpowiednio do 8 mg/ml i 10 jednostek/ml. W przypadku pojedynczego dołka na płytce 12-dołkowej należy postępować w następujący sposób.
		<ol>
			<li>Rozcieńczyć 100 μl fibrynogenu (8 mg/ml) 100 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) bez Ca2+ i Mg2+, pH 7,0. Rozcieńczyć 100 μl trombiny (10 jednostek/ml) 100 μl FCS zawierającego 270 000 fibroblastów.</li>
			<li>Dozować 200 μl mieszaniny komórek trombiny zawierającej fibroblasty na rusztowanie, a następnie dodać 200 μl fibrynogenu (mieszanina 1:1), co daje końcowe stężenie fibrynogenu 2 mg/ml i trombiny 2,5 jednostki/ml. Dobrze wymieszać i równomiernie rozprowadzić na całej powierzchni rusztowania za pomocą delikatnego pipetowania (Dzień 1). 
			UWAGA: Po 30 minutach w temperaturze 37 °C utworzy się skrzep otaczający fibroblasty, który całkowicie wypełni wewnętrzne przestrzenie rusztowania i utworzy gładką górną powierzchnię.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Współkultura z mTEC
	<ol>
		<li>W przypadku hodowli wstępnej należy zanurzyć hodowle narządowe w DMEM z 10 % FBS, 50 μg/ml kwasu L-askorbinowego i 1 ng/ml TGF-β1 z wymianą pożywki co drugi dzień przez 4-5 dni.</li>
		<li>W dniu wysiewu mTEC należy zastąpić podłoże pożywką rFAD (1:1 DMEM + DMEM/F12) z 10% FBS, 10-10 M toksyną, 0,4 mg/ml hydrokortyzonem, 50 μg/ml kwasu L-askorbinowego, ligandem RANK (0,1 μg/ml) i 500 jednostkami/ml Aprotyniny, zapobiegając w ten sposób przedwczesnej fibrynolizie przez proteazy serynowe wydzielane przez fibroblasty.</li>
		<li>7-8 godzin później przygotuj kokultury, wysiewając 250 000 mTEC (kompletne mTEC lub podzbiory CD80lo i CD80hi), w objętości 100 μl na studzienkę na rusztowaniu fibroblastów. Policz komórki za pomocą komory Neubauera (dzień 4). 
		UWAGA: Przez cały czas organotypowe kultury grasicy 3D są zanurzone w pożywce, w przeciwieństwie do skórnych OTC, które są transportowane drogą powietrzną.</li>
		<li>Po 24 godzinnej inkubacji należy podać kulturom pożywkę (całkowita wymiana pożywki), jak wspomniano powyżej (krok 2.3.2), obecnie zawierającą zmniejszone ilości aprotyniny, 250 jednostek/ml (dzień 5).</li>
		<li>W celu oceny aktywności proliferacyjnej mTEC należy dodać EdU (6,7 μM/ml, tj. 10 μM/dołek) do OTC na 4 godziny przed zakończeniem hodowli. Wykonaj barwienie kriosekcji OTC zgodnie z opisem w zestawie do obrazowania EdU w połączeniu z współbarwieniem keratyny 14. Określić wskaźniki proliferacyjne mTEC, licząc komórki K14 + EdU + w dwóch sekcjach każdej próbki hodowli lub cytometrii przepływowej (cytometria przepływowa EdU, sekcja 1.7, ale zamiast Ly51-FITC należy użyć CDR1-PB15 w rozcieńczeniu 1:100 i 2.3.6.4).</li>
		<li>Po 4-7 dniach kohodowli zakończ OTC i proces izolacji RNA, kriosekcji lub analizy FACS (dzień 8-11).
		<ol>
			<li>Zakończ hodowle za pomocą kleszczy, oddzielając rusztowanie/odpowiednik skórny od filtra wkładu studziennego.</li>
			<li>W przypadku kriosekcji należy zanurzyć cały OTC w związku OCT i zamrozić w oparach ciekłego azotu przed kriosekcją. Przygotować skrawki OTC o grubości 5-7 μm za pomocą kriostatu i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia. Do immunohistochemii kriogenicznych OTC należy stosować przeciwciała anty-keratynowe 14 (AF64, stosować w rozcieńczeniu 1:1,000) i anty-wimentyny (GP53, stosować w rozcieńczeniu 1:100). Wykonać pośrednie barwienie immunohistochemiczne przy użyciu odpowiednich przeciwciał drugorzędowych.</li>
			<li>W celu izolacji RNA dodać 1 ml roztworu denaturującego (zawierającego fenol i tiocyjanian guanidyny) do nakrętki 2 ml probówki wolnej od RNazy. Pokrój cały OTC na kawałki skalpelem i dodaj do probówki zawierającej roztwór denaturujący. Rozdrobnić mechanicznie OTC za pomocą przyrządu FastPrep dwukrotnie przez 30 sekund z prędkością 6,0, umieścić pomiędzy nimi na lodzie na 2 minuty (po tym czasie próbkę można przechowywać w temperaturze -80 °C). W przypadku zamrożenia w temperaturze -80 °C rozmrozić na lodzie. Odwirować probówki z prędkością 11 500-13 000 obr./min przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do świeżej probówki, inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej i postępować zgodnie z protokołami izolacji RNA, stosując ekstrakcję kwasowym tiocyjanianem guanidyny-fenolem-chloroformem, zgodnie z opisem producenta.</li>
			<li>W celu analizy FACS należy usunąć rusztowanie i oddzielić membranę od żelu fibryna/fibroblast/mTEC. Drobno pokrój żel skalpelem i strawij go w probówce FACS przez ~20 minut lub do całkowitego strawienia za pomocą 2 ml kolagenazy/dypazy w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej z mieszaniem magnetycznym. Mieszać roztwór enzymu pipetą Pasteura raz na 5 minut. Po całkowitym roztrawieniu przefiltrować zawiesinę komórkową przez filtr 70 μm; Wybarwić zawiesinę pojedynczej komórki za pomocą przeciwciał opisanych w ppkt 1.7 i przeanalizować za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promiscuous+gene+expression+in+medullary+thymic+epithelial+cells+mirrors+the+peripheral+self%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self.</a> Nat Immunol. 2, 1032-1039 (2001).</li>
<li>Kyewski, B., Klein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+central+role+for+central+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+immunology%22%5BJournal%5D)">A central role for central tolerance.</a> Annual review of immunology. 24, 571-606 (2006).</li>
<li>Bonfanti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+reprogramming+of+thymic+epithelial+cells+to+skin+multipotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental reprogramming of thymic epithelial cells to skin multipotent stem cells.</a> Nature. 466, 978-982 (2010).</li>
<li>Kont, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Aire+regulates+the+expression+of+tissue-restricted+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Modulation of Aire regulates the expression of tissue-restricted antigens.</a> Molecular Immunology. 45, 25-33 (2008).</li>
<li>Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+architecture+of+the+thymus+is+required+to+maintain+delta-like+expression+necessary+for+inducing+T+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development.</a> J Immunol. 176, 730-734 (2006).</li>
<li>Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+proinsulin-producing+medullary+thymic+epithelial+cell+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones.</a> Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).</li>
<li>White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaggregate+thymus+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Reaggregate thymus cultures.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2008).</li>
<li>Stark, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+homeostasis+in+long-term+scaffold-enforced+skin+equivalents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Investig+Dermatol+Symp+Proc%22%5BJournal%5D)">Epidermal homeostasis in long-term scaffold-enforced skin equivalents.</a> J Investig Dermatol Symp Proc. 11, 93-105 (2006).</li>
<li>Boehnke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+fibroblasts+and+microenvironment+on+epidermal+regeneration+and+tissue+function+in+long-term+skin+equivalents%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Effects of fibroblasts and microenvironment on epidermal regeneration and tissue function in long-term skin equivalents.</a> Eur J Cell Biol. 86, 731-746 (2007).</li>
<li>Pinto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+organotypic+coculture+model+supporting+proliferation+and+differentiation+of+medullary+thymic+epithelial+cells+and+promiscuous+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression.</a> J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).</li>
<li>Gabler, J., Arnold, J., Kyewski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promiscuous+gene+expression+and+the+developmental+dynamics+of+medullary+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Promiscuous gene expression and the developmental dynamics of medullary thymic epithelial cells.</a> Eur J Immunol. 37, 3363-3372 (2007).</li>
<li>Farr, A., Nelson, A., Truex, J., Hosier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+heterogeneity+in+the+murine+thymus%3A+a+cell+surface+glycoprotein+expressed+by+subcapsular+and+medullary+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Epithelial heterogeneity in the murine thymus: a cell surface glycoprotein expressed by subcapsular and medullary epithelium.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 645-653 (1991).</li>
<li>Stark, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Authentic+fibroblast+matrix+in+dermal+equivalents+normalises+epidermal+histogenesis+and+dermoepidermal+junction+in+organotypic+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Authentic fibroblast matrix in dermal equivalents normalises epidermal histogenesis and dermoepidermal junction in organotypic co-culture.</a> Eur J Cell Biol. 83, 631-645 (2004).</li>
<li>Schoop, V. M., Mirancea, N., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+organization+and+differentiation+of+HaCaT+keratinocytes+in+organotypic+coculture+with+human+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Epidermal organization and differentiation of HaCaT keratinocytes in organotypic coculture with human dermal fibroblasts.</a> J Invest Dermatol. 112, 343-353 (1999).</li>
<li>Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+reactive+with+subsets+of+mouse+and+human+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 36, 1511-1517 (1988).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak finansowego lub handlowego konfliktu interesów.

Wraz z RTOC, OTC 3D okazały się znacznie lepsze pod względem różnicowania TEC i utrzymania/indukcji pGE (Tabela 1) w porównaniu z innymi (i) "uproszczonymi kulturami 3D" wykorzystującymi - same fibroblasty bez rusztowania; (ii) systemy 2D wykorzystujące - fibroblasty/komórki zasilające współhodowane z TEC10, (iii) komórki 3T3-J2, w których rozwijają się klony TEC, ale pGE jest tracone, (iv) matrigel lub (v) składniki ECM (dane niepublikowane). PGE był utrzymywany przez okres do 7 dni w OTC 3D,...

Rozwijające się tymocyty stanowią około 98 % grasicy, podczas gdy pozostałe 2% składa się z różnych komórek, które wspólnie tworzą zrąb grasicy (tj. komórki nabłonkowe, komórki dendrytyczne, makrofagi, limfocyty B, fibroblasty, komórki śródbłonka). Zewnętrzne komórki nabłonka korowego (cTEC) zapewniają imigrację komórek pro-T ze szpiku kostnego, indukcję linii komórek T w multipotencjalnych komórkach pre-T i pozytywną selekcję niedojrzałych tymocytów ograniczonych przez MHC. Wewnętrzne komórki nabłonka rdzeniastego grasicy (mTEC) są zaangażowane w indukcję tolerancji tych tymocytów o wysokim powinowactwie TCR do kompleksów autopeptydowych / MHC poprzez indukowanie selekcji negatywnej lub ich odchylenia do linii komórek regulatorowych T. W kontekście indukcji centralnej tolerancji, mTEC są wyjątkowe, ponieważ wyrażają szerokie spektrum własnych antygenów (TRA) z ograniczeniami tkankowymi, odzwierciedlając w ten sposób jaźń obwodową. Zjawisko to nazywa się promiskuityczną ekspresją genów (pGE)1,2.
Większość obecnych badań nad tym fascynującym typem komórek opiera się na izolowanych komórkach ex vivo, ponieważ różne krótkoterminowe systemy hodowli 2D niezmiennie powodowały utratę pGE i kluczowych cząsteczek regulatorowych, takich jak MHC klasy II, FoxN1 i Aire w ciągu pierwszych 2 dni3-6. Nie było jednak jasne, jakich konkretnych elementów i cech nienaruszonej siatki 3D grasicy brakowało w modelach 2D. Posada narządów grasicy (RTOC) była do tej pory jedynym systemem 3D, który umożliwia badanie rozwoju limfocytów T z jednej strony, a biologii komórek zrębu z drugiej strony w nienaruszonym mikrośrodowisku grasicy7. Jednak RTOC mają pewne ograniczenia, tj. zawierają już złożoną mieszaninę komórek, wymagają wprowadzenia komórek zrębu płodu i wytrzymują maksymalny okres hodowli wynoszący od 5 do 10 dni.
Brak redukcjonistycznych systemów hodowli in vitro utrudnił badanie kilku aspektów rozwoju limfocytów T i organogenezy grasicy, nie tylko molekularnej regulacji pGE i jej związku z biologią rozwojową mTEC.
Ze względu na bliskie pokrewieństwo struktury organizacji komórek nabłonkowych skóry i grasicy, zdecydowaliśmy się na system 3D organotypowej hodowli (OTC), który został pierwotnie opracowany w celu naśladowania różnicowania keratynocytów in vitro i stworzenia w ten sposób skórnego odpowiednika. System OTC składa się z obojętnej macierzy rusztowania pokrytej fibroblastami skóry, które są uwięzione w żelu fibrynowym, na który umieszcza siękeratynocyty 8,9. W tym przypadku zastąpiliśmy keratynocyty oczyszczonymi mTEC. Zachowując podstawowe cechy tego modelu, zoptymalizowaliśmy pewne parametry.
W przyjętym modelu OTC mTEC rozprzestrzeniały się, ulegały końcowemu różnicowaniu i zachowywały tożsamość mTEC oraz pGE, naśladując w ten sposób rozwój mTEC in vivo 10. Niniejsza uwaga techniczna zawiera szczegółowy protokół umożliwiający stopniowe ustawianie grasicy bez recepty.

<table><tbody><tr><td>Ciężarne myszy C57BL/6&nbsp;</td><td>Kolumny Charles River WIGA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny MS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>CD45 Mikrogranulki mysie</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-301</td><td></td></tr><tr><td>Mikrogranulki anty-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-801</td><td></td></tr><tr><td>Mikrogranulki streptawidyny</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-101</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM (G8.8 -Alexa 647 i -biotyna)</td><td>Nr ref. 12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało CD80-PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>553769</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało CD45-PerCP</td><td>Przeciwciało Pharmingen</td><td>557235</td><td></td></tr><tr><td>Ly51-FITC Przeciwciało</td><td>BD Pharmingen</td><td>553160</td><td></td></tr><tr><td>CDR1-Pacific Blue</td><td>Ref. 15</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Keratyna 14</td><td>Covance</td><td>PRB-155P</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało wimentyny</td><td>Progen</td><td>GP58</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-sprzężone AffiniPure Goat anty-królicze IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch&nbsp;</td><td>111-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488-sprzężony AffiniPure F(ab')2 Fragment kozy anty-świnka morska IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch&nbsp;</td><td>106-546-003</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało drugorzędowe anty-królicze IgG (H+L), sprzężone sondy molekularne Alexa Fluor 488</td><td>(Invitrogen GmbH)</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do obrazowania Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Zestaw do obrazowania</td><td>Invitrogen</td><td>C10339</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Zestaw do cytometrii przepływowej</td><td>Invitrogen</td><td>C10425</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowe wkłady filtracyjne (thincerts)</td><td>Greiner bio-one</td><td></td><td></td>657631</tr><tr><td>Płytka 12-dołkowa</td><td>Greiner</td><td>665180-01</td><td></td></tr><tr><td>Jettex 2005/45</td><td>ORSA, Giorla Minore, Włochy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen TISSUECOL-Kit Immuno</td><td>Baxter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trombin TISSUECOL-Kit Immuno</td><td>Baxter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Serva</td><td>47302.03</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Lonza</td><td>BE12-719F</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-049&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FBS Gold</td><td>GE Healthcare</td><td>A11-151</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin (Trasylol)</td><td>Bayer</td><td>4032037</td><td></td></tr><tr><td>Toksyna</td><td>Biomol</td><td>G117</td><td></td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Seromed (Biochrom)</td><td>K3520</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy</td><td>Sigma</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&szlig; 1</td><td>Invitrogen</td><td>PHG9214</td><td></td></tr><tr><td>RANKL</td><td>R& Systemy D</td><td>462-TR-010</td><td></td></tr><tr><td>Termolizyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>&nbsp; T-7902</td><td></td></tr><tr><td>OCT Compound</td><td>TissueTek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Trizol (aka. Roztwór denaturujący - Kwaśna ekstrakcja tiocyjanianianem guanidyny-fenolem i chloroformem)</td><td>Invitrogen</td><td>10296028</td><td></td></tr><tr><td>FastPrep FP120</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenaza Typ IV&nbsp;</td><td>CellSystems</td><td>LS004189</td><td>0,2 mg/ml i 57U/ml stężenie końcowe.</td></tr><tr><td>Neutrale Protetease (Dispase)</td><td>CellSystems</td><td>LS002104</td><td>0,2 mg/ml i 1,2U/ml stężenie końcowe.</td></tr><tr><td>DNase I&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11 284 932 001</td><td>25 &mikro; g/ml stężenie końcowe</td></tr></tbody></table>

organotypowy model kohodowli 3d wspierający proliferację, różnicowanie i ekspresję genów rozwiązłych komórek nabłonka grasicy

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

Rozwój wewnątrzgrasiczych limfocytów T wymaga skomplikowanej trójwymiarowej siatki złożonej z różnych komórek zrębu, tj. komórek nie-T. Tymocyty przechodzą przez to rusztowanie w wysoce skoordynowanym porządku czasowym i przestrzennym, sekwencyjnie przechodząc przez obowiązkowe punkty kontrolne, tj. Zaangażowanie linii limfocytów T, a następnie generowanie i selekcję repertuaru receptorów limfocytów T przed ich eksportem na peryferia. Dwa główne typy komórek rezydujących tworzących to rusztowanie to komórki korowe (cTEC) i komórki nabłonka rdzeniastego grasicy (mTEC). Kluczową cechą mTEC jest tak zwana rozwiązła ekspresja licznych antygenów o ograniczonych tkankach. Te ograniczone tkankowo antygeny są prezentowane niedojrzałym tymocytom bezpośrednio lub pośrednio przez mTEC lub komórki dendrytyczne grasicy, co powoduje samotolerancję.
Obecnie brakuje odpowiednich modeli in vitro emulujących ścieżki rozwoju i funkcje cTEC i mTEC. Ten brak odpowiednich modeli eksperymentalnych utrudnił na przykład analizę ekspresji genów rozwiązłości, która jest nadal słabo poznana na poziomie komórkowym i molekularnym. Dostosowaliśmy model 3D organotypowej kokultury do hodowli mTEC izolowanych ex vivo. Model ten został pierwotnie opracowany do hodowli keratynocytów w taki sposób, aby wytworzyć odpowiednik skóry in vitro. Model 3D zachował kluczowe cechy funkcjonalne biologii mTEC: (i) proliferację i końcowe różnicowanie CD80lo, Aire-ujemne do CD80hi, Aire-dodatnie mTEC, (ii) odpowiedź na RANKL oraz (iii) utrzymującą się ekspresję genów FoxN1, Aire i ograniczonych tkankowo w CD80hi mTEC.

Zastosowaliśmy trójwymiarowy organotypowy model współhodowli (3D OTC), który został pierwotnie opracowany do długotrwałej hodowli keratynocytów in vitro9. mTEC wzbogacone metodą MACS (patrz schemat wzbogacania MACS Rycina 1) wysiano na rusztowanie składające się z żelu fibrynowego i uwięzionych fibroblastów. Fibroblasty zapewniają niezbędną macierz zewnątrzkomórkową (ECM) wspierającą mTEC in vitro. mTEC hodowano w OTC przez 4-14 dni w obecności RANKL w kulturach zanurzonych, ...

Badanie rdzeniastych komórek nabłonka grasicy in vitro zakończyło się w dużej mierze niepowodzeniem, ponieważ obecne systemy hodowli 2D nie naśladują scenariusza in vivo. Opisany w niniejszym dokumencie system hodowli 3D - zmodyfikowany model hodowli organotypowej skóry - okazał się doskonały w rekapitulacji proliferacji mTEC, różnicowaniu i utrzymywaniu ekspresji genów rozwiązłości.

Organotypowy model kohodowli 3D wspierający proliferację, różnicowanie i ekspresję genów rozwiązłych komórek nabłonka grasicy

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest hodowla grasicowych komórek nabłonkowych rdzenia, tzw. mTEC, w trójwymiarowej hodowli organotypowej lub systemie OTC. Osiąga się to poprzez umieszczenie włóknistego materiału rusztowującego w wkładce filtrującej z 12 dołkami, a następnie naniesienie świeżo przygotowanego żelu fibrynowego zawierającego ludzkie fibroblasty skóry. Po czterech do pięciu dniach wstępnej hodowli, mTEC są osadzane na rusztowaniu i hodowane w warunkach hodowli zanurzeniowej.Ostatecznie, w celu oceny rozwoju CED Mtech, w kokulturach można przeprowadzić immunohistochemię, izolację RNA oraz analizy faktograficzne. Główną zaletą trójwymiarowych (3D) organotypowych systemów kokultury w porównaniu z istniejącymi dwuwymiarowymi (2D) systemami hodowli jest ich znacznie większa zdolność do odtworzenia różnicowania, proliferacji mtech oraz utrzymania niespecyficznej ekspresji genów. Technikę tę zaprezentuje dziś Iris Martin, technik z naszego laboratorium partnerskiego.Gdy ludzkie fibroblasty skóry osiągną pełną konfluencję, należy przygotować włókna rusztowania poprzez zagotowanie, wysuszenie i wyprasowanie kawałków włóknistego materiału wiskozy o grubości od 0,4 do 0,6 mm. Za pomocą metalowego dziurkacza należy wyciąć z nich krążki o średnicy 11 mm. Wycięty materiał włóknisty należy umieścić pomiędzy dwoma szkiełkami przedmiotowymi, zawinąć szkiełka w folię i poddać autoklawowaniu.Po sterylizacji umieścić wkłady w dołkach sterylnej płytki 12-dołkowej, a następnie każdy rusztowanie do odpowiedniego wkładu. Następnie zmieszać 2,7 × 10⁵ fibroblastów w 100 µL płodowej surowicy bydlęcej z 100 µL świeżo rozcieńczonej trombiny na każde rusztowanie. Nanieść mieszaninę trombiny i fibroblastów na każde z rusztowań, a następnie dodać 200 µL świeżo rozcieńczonego fibrynogenu.Następnie wymieszaj zawiesinę komórek w każdej studience, rozprowadzając roztwór równomiernie po całym rusztowaniu za pomocą delikatnego pipetowania. Na obrazku przedstawiono wzrost ludzkich fibroblastów skóry w żelu fibrynowym w pierwszym i czwartym dniu hodowli. W studience kontrolnej przygotuj żel testowy bez rusztowania, aby monitorować czas oraz tworzenie się skrzepów w tym samym czasie.Oceniać tworzenie skrzepu za pomocą końcówki pipety lub poprzez odwrócenie płytki; po skrzepnięciu fibroblastów zanurzyć kultury organowe w pożywce uzupełnionej o kwas sorbowy i TGF beta one na cztery do pięciu dni. W dniu wysiewania MT E zastąpić tę pożywkę pożywką RFAD zawierającą 500 units per milliliter apointeryny, aby zapobiec przedwczesnej fibrynolizie. Siedem do ośmiu godzin później wysiać 2,5 × 10⁵ MT E zawieszonych w 100 µL RFAD na górną powierzchnię każdego rusztowania i inkubować kokultury przez 24 godziny. Następnego dnia zastąpić pożywkę świeżą pożywką zawierającą 250 units per milliliter apointeryny na kolejne cztery do siedmiu dni hodowli.Aby ocenić rozwój m Texs metodą immunohistochemiczną pod koniec hodowli, należy za pomocą pęsety oddzielić rusztowanie ekwiwalentu skóry od filtra z każdej studni, a następnie włożyć i zatopić OTC w związku OCT. Zamrozić OTC w fazie gazowej nad ciekłym azotem, aby wyizolować O-T-C-R-N-A.Po oddzieleniu tkanki rusztowania od filtrów, należy za pomocą skalpela pociąć OTC na kawałki i przenieść je do probówki wolnej od RNA o pojemności 2 ml zawierającej 1 ml roztworu denaturującego. Używając homogenizatora FastPrep, należy mechanicznie rozbić OTC dwukrotnie przy prędkości 6,0 przez 30 sekund za każdym razem, z dwuminutową przerwą w lodzie pomiędzy cyklami rozbijania. Następnie należy wyizolować RNA metodą ekstrakcji tiocyjanianem guanidyny i fenolo-chloroformem zgodnie z instrukcją producenta.Aby przeanalizować OTC za pomocą cytometrii przepływowej, należy zdjąć membranę i oddzielić rusztowanie od żelu włóknistego mtech z fibroblastami. Następnie należy przeciąć żel skalpelem, tak jak pokazano przed chwilą. Przenieść tkankę do probówki do cytometrii.Dodaj dwa mililitry pasty kolagenazy. Następnie umieść probówkę w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C z mieszaniem magnetycznym przez 20 minut. Mieszaj za pomocą pipety raz na pięć minut, aż tkanka zostanie całkowicie strawiona.Przefiltruj otrzymaną zawiesinę komórkową przez sito o oczkach 70 µm i przeprowadź barwienie komórek przy użyciu odpowiednich przeciwciał, zgodnie z ilustracją. Komórki MTS można zidentyfikować na podstawie ekspresji keratyny 14, co pozwala łatwo odróżnić je od fibroblastów wykazujących pozytywny wynik dla mentonu. Co ciekawe, niedojrzałe i dojrzałe komórki M Tex wykazują różne, lecz wysoce powtarzalne wzorce wzrostu w hodowli.Niedojrzałe komórki M Texs z niską ekspresją CD 80 (CD 80 low), na przykład, zazwyczaj tworzą dwuwarstwy w bliskim kontakcie z fibroblastami. Podczas gdy komórki MTS z wysoką ekspresją CD 80 (CD 80 high) mają tendencję do tworzenia zwartych agregatów komórkowych ograniczonych przez fibroblasty, subpopulacje mtech nie tylko przeżywają, ale namnażają się w zaprezentowanych warunkach 3D OTC, o czym świadczy ich wbudowywanie EDU. Co ciekawe, komórki MT techs z niską ekspresją CD 80 (CD 80 low) proliferują w wyższym tempie w obecności rankl.Podczas gdy w przypadku technik MT z wysoką ekspresją CD 80 sytuacja jest odwrotna, po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat hodowli technik MT z wykorzystaniem trójwymiarowych (3D) organoidów tkanek (OTC). Metoda ta jest znacznie lepsza od systemów hodowli 2D pod kątem różnicowania technik oraz utrzymywania i indukcji PGE, a także stwarza potencjał do badania lub manipulowania wieloma parametrami.

3d-organotypic-co-culture-model-supporting-medullary-thymic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Model 3D współkultury organotypowej wspierającej proliferację komórek nabłonkowych rdzenia tymusu, różnicowanie i rozpuszczalne ekspresję genów

W niniejszym filmie zaprezentowano przygotowanie kultur reaggregatów grasicy traktowanych 2-dGuo.

Reagregacja kultur grasicy

W niniejszym filmie zaprezentowano technikę wycięcia i usunięcia grasicy płodowej, a także przygotowanie kultur ex vivo grasicy traktowanej 2-dGuo. <br...

Przygotowanie hodowli organowych grasicy traktowanych 2-dGuo

Ten film demonstruje protokół generowania funkcjonalnych limfocytów T specyficznych dla antygenu z niedojrzałych limfocytów T pochodzących z iPSC za pomocą trójwymiarowego systemu hodowli grasicy. Jednoczesna hodowla niedojrzałych limfocytów T pochodzących z iPSC z endogennymi płatami grasicy płodowymi myszy zubożonymi w limfocyty spowodowała pomyślne dojrzewanie limfocytów T do utworzenia emigrantów grasicy pochodzących z iPSC CD8αβ + + MHC klasy I + (iTE).

Trójwymiarowy system hodowli grasicy do generowania emigrantów grasicy pochodzących od iPSC

Ten manuskrypt opisuje technikę opartą na miękkiej litografii, polegającą na inżynierii jednolitych układów trójwymiarowych (3D) tkanek nabłonkowych o określonej geometrii otoczonych macierzą zewnątrzkomórkową. Metoda ta jest dostosowana do szerokiej gamy typów komórek i kontekstów eksperymentalnych oraz pozwala na wysokoprzepustowe badania przesiewowe identycznych kontrprób.

Inżynieria trójwymiarowych tkanek nabłonkowych osadzonych w macierzy zewnątrzkomórkowej

Opisujemy przygotowanie wycinków grasicy, które w połączeniu z cytometrią przepływową mogą być użyte do modelowania pozytywnej i negatywnej selekcji rozwijających się limfocytów T. Plastry grasicy można również przystosować do analizy in situ migracji, lokalizacji i sygnalizacji tymocytów za pomocą immunofluorescencji i mikroskopii dwufotonowej.

Przygotowanie i zastosowanie organotypowych kultur grasicy w warstwach

Ten artykuł opisuje nowatorską metodę generowania indukowanych indukowanych pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z komórek macierzystych (iTE) za pomocą trójwymiarowego (3D) systemu hodowli grasicy. iTE to jednorodny podzbiór limfocytów T blisko spokrewniony z naiwnymi limfocytami T ze zdolnością do proliferacji, tworzenia pamięci i supresji guza.

Trójwymiarowy system hodowli grasicy do generowania indukowanych przez mysie pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z antygenu nowotworowego specyficznych dla antygenu macierzystego

Tutaj opisane są cztery metody generowania organoidów jąder z pierwotnych komórek jąder myszy noworodków, tj. macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) oraz środowiska hodowli 2D i 3D wolne od ECM. Techniki te mają wiele zastosowań badawczych i są szczególnie przydatne do badania rozwoju jąder i fizjologii in vitro.

Pozakomórkowe i pozakomórkowe wolne od macierzy komórkowej wytwarzanie mysich organoidów jąder

Ten protokół oferuje szczegółowe instrukcje dotyczące tworzenia mysich organoidów jelita cienkiego, izolowania wrodzonych komórek limfoidalnych typu 1 od mysiej blaszki jelita cienkiego oraz ustanawiania trójwymiarowych (3D) kokultur między oboma typami komórek w celu zbadania dwukierunkowych interakcji między komórkami nabłonka jelitowego a wrodzonymi komórkami limfoidalnymi typu 1.

Współhodowla organoidów nabłonkowych mysiego jelita cienkiego z wrodzonymi komórkami limfoidalnymi

Ten protokół opisuje izolację podwójnie ujemnych tymocytów z grasicy myszy, a następnie transdukcję retrowirusową i kohodowlę w systemie kohodowli linii komórek zrębu szpiku kostnego z ekspresją delta 4 (OP9-DL4) w celu dalszej analizy funkcjonalnej.

Współhodowla i transdukcja mysich tymocytów na komórkach zrębowych z ekspresją 4 podobną do delta w celu badania onkogenów w białaczce z komórek T

Tutaj opisujemy protokół tworzenia ludzkich organoidów grasicy pochodzących z iPSC, hodowanych w hydrożelach fibrynowych 3D, mających na celu wspomaganie dojrzewania komórek nabłonka grasicy (TEC) i przedłużonego utrzymania, a także tymopoezę in vitro.

Tworzenie organoidów grasicy ludzkiej w trójwymiarowych hydrożelach fibrynowych

Aby badać różnicowanie i funkcjonowanie komórek T CD8 in vitro, komórki T CD8 można wyizolować z myszy i długoterminowo współhodować z wcześniej zakażonymi nabłonkami nabłonka pochwy myszy. Tutaj opisujemy ten proces i oceniamy nabycie rezydentnych markerów komórek T pamięci podczas współhodowli.

In vitro Dyferencjacja komórek T CD8 w pamięci rezydentnej za pomocą systemu współhodowli komórek T nabłonkowych

Poznaj metodę trójwymiarowej hodowli organotypowej komórek nabłonka rdzenia grasicy, która wspiera proliferację, różnicowanie i ekspresję genów. Technika ta znacznie przewyższa tradycyjne systemy 2D w badaniach immunologicznych.

Organotypowy model kohodowli 3D wspierający proliferację, różnicowanie i ekspresję genów rozwiązłych komórek nabłonka grasicy

Przeglądaj więcej filmów