Name: Wdrożenie patch clampu i mikroskopii fluorescencyjnej na żywo w celu monitorowania właściwości funkcjonalnych świeżo wyizolowanego nabłonka PKD (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Poznaj metodę patch clamp i mikroskopię fluorescencyjną do badania aktywności kanałów jonowych oraz stężenia wapnia w nabłonku cyst z nerek gryzoni. Technika ta pozwala analizować fizjologię nabłonka w chorobie policystycznej nerki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Glenowi Slocumowi (Medical College of Wisconsin) i Colleen A. Lavin (Nikon Instruments Inc.) za doskonałą pomoc techniczną przy eksperymentach mikroskopowych. Badanie to było wspierane przez National Institutes of Health granty R01 HL108880 (dla AS), R01 DK095029 (dla OPo) i K99 HL116603 (dla TSP), National Kidney Foundation IG1724 (dla TSP), American Heart Association 13GRNT16220002 (dla OPo) oraz stypendium badawcze Ben J. Lipps z American Society of Nephrology (dla DVI).

Procedury eksperymentalne opisane poniżej zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Medical College of Wisconsin oraz University of Texas Health Science Center w Houston i były zgodne z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Rysunek 1 przedstawia główne etapy procedury izolacji i przetwarzania tkanek. Krótko mówiąc, nerki szczurów PCK lub SD są używane do ręcznej izolacji monowarstw nabłonkowych przewodów zbiorczych ze zdrowych, niewybieranych kanalików lub torbieli. Tutaj badaliśmy nerki szczurów PCK w wieku 4-16 tygodni10,13.
1. Izolacja torbieli nerek i kanalików łączących (CNT)/Odcinków przewodów zbiorczych (CD)
<ol>
	<li>Znieczulić zwierzę doświadczalne izofluranem (5% indukcji, 1,5 do 2,5% konserwacji)/medycznym stopniem O2 lub inną zatwierdzoną metodą. Zwierzęta muszą być stale monitorowane w celu zapewnienia odpowiedniego poziomu znieczulenia. Stabilna częstość oddechów i reakcja na uszczypnięcie palca u nogi służą do potwierdzenia prawidłowego znieczulenia.</li>
	<li>Wykonaj laparotomię i przepłucz nerki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) przez aortę brzuszną17.
	<ol>
		<li>Przygotuj cewnik z rurką polietylenową (PE50) i podłącz go do pompy strzykawkowej wypełnionej PBS. Przetnij skórę i ścianę brzucha wzdłuż kresy białej, a następnie wykonaj poprzeczne nacięcie brzucha w poprzek brzucha z boku na bok i przesuń narządy jamy brzusznej za pomocą wacików, aby uzyskać dostęp do aorty zstępującej z rozgałęzionymi tętnicami krezkowymi i trzewnymi. Podczas dalszych zabiegów należy zwilżyć narządy wewnętrzne ciepłą solą fizjologiczną, aby zapobiec ich wysuszeniu.</li>
		<li>Umieść jedną ligaturę (#1) wokół tętnic krezkowych i trzewnych, a drugą ligaturę (#2) wokół aorty pod przeponą (nie wiąż). Delikatnie oddziel a. brzuszek poprzez wypreparowanie otaczających go tkanek łącznych cienkimi kleszczami i umieść dwie ligatury ~ 3 mm poniżej lewej tętnicy nerkowej (#3) i powyżej rozwidlenia tętnic biodrowych (#4).</li>
		<li>Zawiąż ligaturę #4 i przymocuj zacisk naczynia wokół aorty między lewą tętnicą nerkową a ligaturą #3. Wykonaj nacięcie między zaciskiem a ligaturą #4, aby cewnikować aortę, użyj ligatury #3, aby mocno zamocować cewnik</li>.
		<li>Zwolnij zacisk i upewnij się, że puls krwi jest widoczny w cewniku, aby zapewnić prawidłową instalację. Rozpocznij perfuzję z szybkością 6 ml/min, zawiąż ligatury #1 i #2 i przetnij lewą żyłę nerkową. Kontynuuj płukanie przez 1-2 minuty, aż narządy zostaną całkowicie zblanszowane.</li>
		<li>Przeciąć nerkowe naczynia krwionośne, cewkę moczową i otaczającą tkankę łączną i tłuszczową nożyczkami, aby pobrać nerki. Następnie wykonaj krótkie rozdarcie w torebce nerkowej i obierz nerki, aby je zdecapsulować. Umieść nerki w lodowatym PBS. Eutanazję potwierdza się za pomocą torakotomii.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj 5 x 5 mm nakrywkowe wióry szklane pokryte poli-L-lizyną. Wytnij szklankę nakrywkową ołówkiem diamentowym i umieść około 20 μl 0,01% sterylnego, przefiltrowanego roztworu poli-L-lizyny na każdym chipsie szklanym. Przygotuj sól fizjologiczną i dwie pary kleszczy zegarmistrzowskich do sekcji.</li>
	<li>Pokrój nerki żyletką wzdłuż płaszczyzny czołowej na plastry o grubości ~1-2 mm. Umieść jeden z plastrów pod mikroskopem stereoskopowym. Izolację tkanek należy wykonać w lodowatej soli fizjologicznej.</li>
	<li>Zlokalizuj torbiele pod mikroskopem stereoskopowym jako okrągłe jamy (ryc. 2A); ich ściany często zawierają wyraźną sieć rozpiętych naczyń krwionośnych. Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką wypreparuj wewnętrzną warstwę nabłonkową torbieli tak cienką, jak to możliwe, aby uzyskać obszar jednowarstwowy. Przymocuj go do szklanego wióra pokrytego poli-L-lizyną. Lepka powierzchnia poli-L-lizyny pozwala badaczowi na mocne ułożenie wewnętrznej warstwy torbieli na szkle. Odsłoń torbiel wierzchołkową stroną do góry, aby zapewnić dostęp do pipet (Rysunek 2B).</li>
	<li>Do izolacji nierozszerzonych segmentów CNT/CCD18-21. należy użyć centralnych wycinków nerki szczura PCK lub SD zawierających brodawkę
	UWAGA: Tkanki brodawkowate są trwalsze niż kora, a przytrzymując brodawkowate pasma rurkowe kleszczami i rozrywając wzdłuż osi promieniowej, plasterek można rozciąć na cienkie sektory. Poszczególne kanaliki są widoczne i można je wyciągnąć w celu umieszczenia na kawałkach szkła nakrywkowego.</li>
	<li>Zidentyfikuj segmenty CNT/CCD za pomocą rozwidleń, wyższej przezroczystości niż kanaliki proksymalne i dużych, wyraźnie widocznych komórek (Figura 2C). Umieść szklany chip nakrywkowy z dołączonymi kanalikami pod mikroskopem wyposażonym w mikromanipulatory odpowiednie do napędzania mikropipet. Za pomocą ostrych mikropipet rozciąć kanaliki i przymocować ich krawędzie do szkła, aby umożliwić dostęp do powierzchni wierzchołkowej (rysunek 2D).</li>
</ol>
2. Elektrofizjologia jednokanałowego zacisku krosowego
<ol>
	<li>Napełnij komorę zaciskową roztworem do kąpieli i przenieś szklany wiór nakrywkowy z izolowanymi tkankami do komory. Upewnij się, że mikropipety z zaciskiem krosowym mają rezystancję 7-10 MΩ, aby zapewnić wiarygodne pomiary na ogniwie (podłączone do ogniwa).</li>
	<li>W przypadku pomiarów podłączonych do ogniw ustaw współczynnik wzmocnienia wzmacniacza na 20x i dolnoprzepustowy prądy o częstotliwości 300 Hz za pomocą ośmiobiegunowego filtra Bessela. Do monitorowania kanałów ENaC należy użyć roztworu do kąpieli w mM: 150 NaCl, 1 CaCl2, 2 MgCl2, 10 HEPES (pH 7,4); pipeta: 140 LiCl, 2 MgCl2 i 10 HEPES (pH 7,4).</li>
	<li>Przeprowadź konwencjonalny eksperyment z zaciskiem krosowym w trybie podłączonym do ogniwa10. Wybierz komórkę w monowarstwie nabłonka i zbliż pipetę do błony wierzchołkowej. Uformuj uszczelnienie o wysokiej wytrzymałości między pipetą a błoną komórkową, stosując delikatne odsysanie. Po uformowaniu uszczelki gigaOhm o wysokiej rezystancji, należy uruchomić protokół bez przerw przy potencjale zatrzymania w celu monitorowania aktywności kanału będącego przedmiotem zainteresowania.</li>
	<li>Przechowuj jednokanałowe dane prądowe z uszczelek gigaOhm bez przerw do późniejszej analizy. Analizuj zdarzenia kanału za pomocą pakietu oprogramowania zwykle dostarczanego z konfiguracjami patch-clamp18. Oblicz aktywność kanału jako NPo, gdzie N odnosi się do liczby aktywnych kanałów w łacie, a Po jest średnim prawdopodobieństwem otwarcia kanałów. 
	UWAGA: Używaj izolowanych torbieli lub kanalików w eksperymentach z zaciskiem przez nie więcej niż 30 minut.</li>
</ol>
3. Ratiometryczne pomiary epifluorescencji wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia w komórkach nabłonka
<ol>
	<li>Użyj 5 mM Fura-2AM rozpuszczonego w DMSO. Podwielokrotny roztwór podstawowy rozlać na pojedyncze stożkowe probówki o pojemności 500 μl (około 10 μl). Chronić przed światłem i przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C do sześciu miesięcy.</li>
	<li>Inkubować izolowane cysty i rozszczepione kanaliki przez 30-40 minut w PSS (w mM: 145 NaCl, 4,5 KCl, 2 MgCl2, 2 CaCl2 i 10 HEPES przy pH 7,35) zawierających 5 μM barwnika Fura-2 AM i 0,05% kwasu pluronowego, aby pomóc w dyspersji estrów acetoksymetylowych. W tym celu umieść chusteczki w 3,5 cm naczyniu zawierającym koktajl ładujący, chroń przed światłem i inkubuj na wolnym wytrząsarce w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zmień pożywkę zawierającą Fura-2 AM, aby oczyścić PSS po inkubacji i umieść tkankę pod mikroskopem w celu dalszego wykonywania obrazowania epifluorescencyjnego.</li>
	<li>Włącz kamerę CCD i stabilne źródło światła (system monochromatorowy) wyposażone w koło filtrów (każda pozycja filtra może być powiązana z własnym poziomem tłumienia, wybieranym za każdym razem, gdy filtr jest wywoływany).</li>
	<li>Znajdź tkankę w jasnym polu. Przełącz się na wykrywanie sygnału fluorescencji i dostosuj intensywność źródła światła za pomocą filtrów o neutralnej gęstości i mocy lampy, aby uniknąć nasycenia sygnału.</li>
	<li>Monitorować fluorescencję Fura-2 AM w próbce tkanki z wzbudzeniem ratiometrycznym przy 340/380 nm z częstotliwością 0,125 Hz lub wyższą. Użyj obiektywu 40×/NA 1.3 lub podobnego, aby uzyskać obraz w odpowiedniej rozdzielczości.</li>
	<li>W celu przetwarzania obrazu i obliczeń zaimportuj sekwencję obrazów. Upewnij się, że kanały zostały podzielone i użyj trybu skali szarości hyperstack. Wybierz kilka obszarów zainteresowania (pojedyncze komórki torbieli lub wybrane obszary tkanki torbielowatej) i oblicz wartości intensywności dla każdego kanału (340 i 380 nm) w preferowanym oprogramowaniu do analizy danych; Odejmij wartości intensywności tła od każdego punktu danych.</li>
	<li>Dla każdego punktu czasowego oblicz stosunek intensywności kanałów Fura-2 AM 340 do 380. Wykreślić zmiany punktu punktowego/liniowego w czasie stanu nieustalonego Ca2+ dla każdego regionu i obliczyć wartości średniej/SE.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisaliśmy tutaj zastosowania konwencjonalnej techniki patch-clamp i epifluorescencyjnego obrazowania wapnia do monowarstw nabłonka torbielowatego pochodzących z mysiego modelu genetycznego ARPKD. Protokół składa się z trzech etapów, z których największą uwagę należy zwrócić na izolację torbieli (krok 1.5 sekcji protokołów) oraz na badania elektrofizjologiczne. Te kluczowe procedury wymagają intensywnego szkolenia i cierpliwości, a czytelnik nie powinien być od razu sfrustrowany.
Przede wszyst...

Kanały jonowe odgrywają znaczącą rolę w wielu funkcjach fizjologicznych, w tym we wzroście i różnicowaniu komórek. Autosomalna dominująca i recesywna wielotorbielowatość nerek (odpowiednio ADPKD i ARPKD) to zaburzenia genetyczne charakteryzujące się rozwojem torbieli wypełnionych płynem nerkowym pochodzących z komórek nabłonka kanalików. ADPKD jest spowodowany mutacjami genów PKD1 lub PKD2 kodujących polisystyny 1 i 2, białka błonowe biorące udział w regulacji proliferacji i różnicowania komórek. PKD2 sam w sobie lub jako kompleks z PKD1 funkcjonuje również jako przepuszczalny dla Ca2+ kanał kationowy1. Mutacje genu PKHD1 kodującego fibrocystynę (białko podobne do receptora związanego z rzęskami, biorące udział w tuburogenezie i/lub utrzymaniu polarności nabłonka) są genetycznym impulsem ARPKD2. Wzrost torbieli jest złożonym zjawiskiem, któremu towarzyszy zaburzona proliferacja3,4, angiogeneza5, odróżnicowanie i utrata polarności komórek kanalików6-8.
Wadliwe wchłanianie zwrotne i zwiększone wydzielanie w nabłonku torbielowatym przyczyniają się do gromadzenia płynu w świetle i rozszerzania torbieli9,10. Upośledzona sygnalizacja zależna od przepływu [Ca2 +] i została również powiązana z cystogenezą podczas PKD11-15.
Tutaj opisujemy metodę odpowiednią do pomiarów jednokanałowych i wewnątrzkomórkowych poziomów Ca2+ w torbielowatych nabłonkach izolowanych od szczurów PCK. Metoda ta została przez nas z powodzeniem zastosowana do scharakteryzowania aktywności nabłonkowego kanału Na+ (ENaC)10 i procesów zależnych od [Ca2+]i, indukowanych przez przepuszczalny dla Ca2+ TRPV4 i purynergiczną kaskadę sygnalizacyjną13.
W tych badaniach użyliśmy szczurów PCK, modelu ARPKD spowodowanego spontaniczną mutacją w genie PKHD1. Szczep PCK został pierwotnie pozyskany od szczurów Sprague-Dawley (SD)16, dlatego szczury SD są używane jako odpowiednia kontrola do porównania ze szczepem PCK. W rezultacie, zarówno segmenty nefronu szczura SD, jak i nieposzerzone kanały zbiorcze wyizolowane od tych samych szczurów PCK mogą służyć jako dwie różne grupy porównawcze do eksperymentów na nabłonku torbielowatym.

<table><tbody><tr><td>Fura-2 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F-14185</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-8</td><td>AAT Bioquest</td><td>21091</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Kwas pluronowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-68&nbsp;</td><td>rozwiązanie</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Boekel Scientific</td><td>260350</td><td></td></tr><tr><td>Źródło światła</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>Lambda XL</td><td>ze zintegrowanym sterownikiem migawki/koła filtrów</td></tr><tr><td>Filtry o neutralnej gęstości</td><td>Nikon</td><td></td><td>ND4, ND8</td></tr><tr><td>Obiektyw</td><td>Nikon</td><td>SFluo&nbsp;</td><td>40/1.3 DIC WD 0.22&nbsp; &nbsp; olej</td></tr><tr><td>Aparat</td><td>fotograficzny Andor Technologies</td><td>Zyla sCMOS</td><td></td></tr><tr><td>Nikon&nbsp; mikroskop (odwrócony)</td><td>Nikon</td><td>Nikon Eclipse TE2000-S</td><td></td></tr><tr><td>Szkło osłonowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>6661B52</td><td></td></tr><tr><td>Ołówek diamentowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>22268912</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji obrazu</td><td>Nikon</td><td>Nikon NIS-Elements&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td><td>Wtyczka ImageJ</td><td>http://imagej.nih.gov/</td> <td>ND Utility umożliwia importowanie obrazów w natywnym formacie Nikon Instruments .nd2</td></tr><tr><td>Komora nagrywająca/perfuzyjna</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz Patch Clamp</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>System</td> akwizycji danych MultiClamp 700B <td></td></tr><tr><td></td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Digidata 1440A</td><td>Axon Digidata&reg; Systemowy</td></tr><tr><td>filtr dolnoprzepustowy</td><td>Warner Instruments</td><td>LPF-8</td><td>8-biegunowe</td></tr><tr><td>kapilary ze szkła borokrzemianowego</td> Bessel <td>World Precision Instruments</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>P-97</td><td>Ściągacz do mikropipet typu płomieniowego / brązowego</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>Japonia</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td> <td>z napędemSutter Instrument Co</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>Stół do izolacji mikrowibracji</td><td>TMC</td><td></td><td>wyposażony w klatkę Faradaya</td></tr><tr><td>Wielokanałowy system perfuzji zaworów</td><td>AutoMake Scientific</td><td>Valve Bank II</td><td></td></tr><tr><td>Komora nagrywająca/perfuzyjna</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr> Software <tr><td></td><td>Urządzenia molekularne</td><td>pClamp 10 . 2</td><td></td></tr><tr><td>Stół chirurgiczny z kontrolowaną temperaturą&nbsp;</td><td>Rdzeń</td><td></td> MCW <td>dla gryzoni</td></tr><tr><td>Lornetkowy stereomikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>System perfuzyjny oparty na pompie strzykawkowej</td><td>Aparat</td><td></td><td></td>Harvarda</tr><tr><td>rurki polietylenowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PE50</td><td></td></tr><tr><td>Znieczulenie izofluoranowe</td><td><a href="http://www.vetequip.com/">http://www.vetequip.com/</a></td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>Inne odczynniki podstawowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wdrożenie patch clampu i mikroskopii fluorescencyjnej na żywo w celu monitorowania właściwości funkcjonalnych świeżo wyizolowanego nabłonka pkd

Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium

Inicjacja i ekspansja torbieli podczas wielotorbielowatości nerek to złożony proces charakteryzujący się nieprawidłowościami w proliferacji komórek kanalików, gromadzeniu płynu świetlnego i tworzeniu macierzy zewnątrzkomórkowej. Aktywność kanałów jonowych i wewnątrzkomórkowa sygnalizacja wapniowa są kluczowymi parametrami fizjologicznymi, które determinują funkcje nabłonka kanalików. Opracowaliśmy metodę odpowiednią do obserwacji aktywności kanałów jonowych w czasie rzeczywistym za pomocą techniki patch-clamp i rejestracji wewnątrzkomórkowego poziomu Ca2+ w monowarstwach nabłonka świeżo wyizolowanych z torbieli nerek. Szczury PCK, model genetyczny autosomalnej recesywnej wielotorbielowatości nerek (ARPKD), wykorzystano do analizy ex vivo kanałów jonowych i przepływu wapnia. Opisano tutaj szczegółową procedurę krok po kroku mającą na celu wyizolowanie torbielowatych monowarstw i nierozszerzonych kanalików od szczurów PCK lub normalnych Sprague Dawley (SD) oraz monitorowanie aktywności pojedynczego kanału i wewnątrzkomórkowej dynamiki Ca2 +. Metoda ta nie wymaga przetwarzania enzymatycznego i umożliwia analizę w natywnym otoczeniu świeżo wyizolowanej monowarstwy nabłonka. Co więcej, technika ta jest bardzo wrażliwa na wewnątrzkomórkowe zmiany wapnia i generuje obrazy o wysokiej rozdzielczości do precyzyjnych pomiarów. Wreszcie, wyizolowany nabłonek torbielowaty może być dalej wykorzystywany do barwienia przeciwciałami lub barwnikami, przygotowania kultur pierwotnych i oczyszczania do różnych testów biochemicznych.

Potencjalny udział ENaC w cystogenezie został wykazany w kilku badaniach, w których zaobserwowano zaburzenia sygnalizacji czynnika wzrostu naskórka (EGF) w progresji PKD22-25 oraz nieprawidłowy reabsorpcję sodu w modelach mysich i hodowlach tkankowych ARPKD26-28. Na przykład Veizis et al. wykazali, że w komórkach CD z nieortologicznego modelu mysiego BPK w ARPKD zmniejszona jest zależna od amiloridu absorpcja Na+29. Niedawno udowodniliśmy, że upośledzona reabsorpcja so...

Kanały jonowe wyrażane w nabłonku kanalików nerkowych odgrywają znaczącą rolę w patologii wielotorbielowatości nerek. W tym miejscu opisujemy protokoły eksperymentalne stosowane do przeprowadzania analizy patch-clamp i wewnątrzkomórkowych pomiarów poziomu wapnia w nabłonku torbielowatym świeżo wyizolowanym z nerek gryzoni.

Wdrożenie patch clampu i mikroskopii fluorescencyjnej na żywo w celu monitorowania właściwości funkcjonalnych świeżo wyizolowanego nabłonka PKD

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest rejestracja aktywności pojedynczych kanałów oraz pomiar zmian wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia w monowarstwach cystycznie przekształconych, świeżo izolowanych z modeli gryzoni z wielotorbielowatością nerek. Jest to realizowane poprzez wstępne przepłukanie nerek PCK rec przez aortę brzuszną w celu usunięcia krwi z tkanek nerkowych. Drugim krokiem jest izolacja nabłonkowej monowarstwy torbieli.Następnie wyizolowaną warstwę jednowarstwową można wykorzystać do konwencjonalnych pomiarów metodą patch clamp w celu badania kanałów jonowych w błonach apikalnych komórek nabłonkowych. Wyizolowana tkanka może służyć również do wprowadzania barwników wapniowych w celu ilościowego oznaczenia zmian wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia w komórkach nabłonkowych.Parametry te, zmierzone w naturalnym środowisku torbieli, można porównać ze zdrowymi kanalikami w celu zbadania procesu agenezy torbieli. Główną zaletą tej techniki jest możliwość badania aktywności kanałów chi oraz przepływu wapnia w torbielach nerkowych. Analiza ta dostarcza danych fizjologicznie istotnych, uzyskanych ze świeżo wyizolowanych tkanek.Dzięki temu podejściu możemy monitorować aktywność pojedynczych kanałów w świeżo wyizolowanych nabłonkach. Jest to unikalna metoda, ponieważ pozwala na precyzyjną charakteryzykę zachowania kanałów żelaza z wykorzystaniem różnych modyfikacji techniki patch-clamp. Jesteśmy w stanie przetestować odpowiedź kanałów na różne leki w tkankach torbielowatych oraz zdrowych.Świeżo wyizolowana monowarstwa cyst może być wykorzystana do obrazowania wewnątrzkomórkowego wapnia. Technika ta umożliwia przesiewy farmakologiczne oraz badania funkcjonalne homeostazy wewnątrzkomórkowego wapnia w komórkach cyst, co stanowi istotny sposób odkrywania nowych metod leczenia w zapobieganiu wielotorbielkowatości nerek. Procedura usuwania krwi przedstawi podejście chirurgiczne stosowane w celu oczyszczenia nerek z krwi.W pierwszej kolejności przedstawione zostaną procedury izolacji nerek i torbieli. Należy rozpocząć tę procedurę od wykonania laparotomii i przepłukania nerek roztworem PBS poprzez aortę brzuszną u znieczulonego szczura. W tym celu należy podłączyć cewnik z rurki polietylenowej do pompy strzykawkowej wypełnionej roztworem PBS.Naciąć skórę oraz ścianę brzucha wzdłuż linii pośrodkowej brzucha i odsunąć narządy jamy brzusznej za pomocą patyczków bawełnianych, aby uzyskać dostęp do aorty zstępującej z odchodzącymi tętnicami krezkowymi i trzewnymi. Następnie założyć pierwszą ligaturę wokół tętnic krezkowych i trzewnych, a drugą ligaturę wokół aorty pod przeponą.Delikatnie odseparuj aortalny ADOS za pomocą tępego rozdzielania tkanek łącznych wokół niego przy użyciu pęsety. Następnie umieść trzecią ligaturę około 3 mm poniżej lewej tętnicy nerkowej, a czwartą ligaturę powyżej rozgałęzienia tętnic biodrowych. Zawiąż czwartą ligaturę i załóż zacisk naczyniowy na aortę między lewą tętnicą nerkową a trzecią ligaturą.Wykonaj nacięcie pomiędzy kleszczykami a czwartą ligaturą w celu cewnikowania aorty. Następnie użyj trzeciej ligatury, aby stabilnie przymocować cewnik. Teraz zdejmij kleszczyki.Upewnij się, że w cewniku widoczne jest tętno krwi, aby potwierdzić prawidłową instalację. Następnie rozpocznij perfuzję i zawiąż pierwszą oraz drugą ligaturę. Po tym szybko przetnij lewą żyłę nerkową, aby zmniejszyć ciśnienie.Kontynuuj płukanie przez jedną do dwóch minut, aż organy całkowicie zbledną. Następnie przetnij naczynia krwionośne nerek, cewkę moczową oraz otaczające tkanki łączną i tłuszczową. Aby wyciąć nerki, wykonaj niewielkie nacięcie w torebce nerkowej i odwarstw nerki, aby je wyizolować.Następnie umieść nerki w lodowatym PBS. Dalej przygotuj szkiełka nakrywne o wymiarach 5 by 5 milimetrów oraz 25 by 25 milimetrów, pokryte poli-L-lizyną.Przetnij nerki żyletką wzdłuż płaszczyzny czołowej na plastry o grubości od jednego do dwóch milimetrów. Następnie umieść jeden z plastrów pod mikroskopem stereoskopowym. Za pomocą pęsety z cienkimi końcówkami zlokalizuj torbiele, które wyglądają jak okrągłe jamki.Przeprowadź dyssekcję wewnętrznej warstwy nabłonkowej torbieli tak, aby była ona jak najcieńsza, w celu uzyskania obszaru jednowarstwowego. Następnie przymocuj ją do szklanego podłoża pokrytego polilizyną, eksponując stronę apikalną torbieli. Aby umożliwić dostęp pipetom do przeprowadzenia badań elektrofizjologicznych, napełnij komorę patch-clamp roztworem kąpielowym. Następnie przenieś szklane podłoże z wyizolowanymi tkankami do komory.Wybierz komórkę w warstwie nabłonkowej i zbliż pipetę patch do typowej błony. Następnie przeprowadź konwencjonalny eksperyment patch clamp w konfiguracji cell-attached. W tej procedurze umieść izolowane cysty i rozszczepione cewki w szalce o średnicy trzech i pół centymetra zawierającej PSS, dodając 5 µM flu, 8 HD oraz 0,05% kwasu onowego, aby pomóc w dyspersji acet do met lesterów.Następnie chronić próbkę przed światłem i inkubować na wolnoobrotowym wytrząsarce w temperaturze pokojowej przez 30 do 40 minut. Po inkubacji wypłukać medium inkubacyjne czystym PSS. Następnie umieścić tkankę pod mikroskopem konfokalnym w celu przeprowadzenia obrazowania fluorescencyjnego.Uruchom oprogramowanie do akwizycji konfokalnej. Następnie włącz laser argonowy z wzbudzeniem 488 nanometrów i ustaw emisję na 520 z zakresem 25 nanometrów. Następnie zlokalizuj tkankę w polu jasnym.Monitoruj fluorescencję fluo-4 w próbce tkanki z częstotliwością 0,25 Hz lub wyższą. Zastosuj TP lub inne modulatory farmakologiczne w celu wywołania wzrostu wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia. Przedstawiono tutaj reprezentatywne zapisy prądowe dla aktywności epiteliatnego kanału sodowego, mierzonej w patchach przytwierdzonych do komórek (cell-attached) świeżo izolowanych torbieli od 16-tygodniowych szczurów PCK po 12-tygodniowej kuracji benzoilem oraz wodą pitną.Linie przerywane wskazują odpowiedni stan aktualny, gdzie C i op n oznaczają odpowiednio stany zamknięty i otwarty. Wykres ten podsumowuje obserwowaną aktywność nabłonkowego kanału sodowego, w której benzoil, selektywny inhibitor nabłonkowego kanału sodowego, znacząco zmniejszył aktywność nabłonkowego kanału sodowego. Ten film przedstawia cystyczną monowarstwę obciążoną flu oh eight H przed i po zastosowaniu 10 µM ATP. Wzrost intensywności zielonego sygnału fluorescencji jest widoczny, gdy wewnątrzkomórkowe stężenie wapnia wzrasta w odpowiedzi na ATP. Wykres ten podsumowuje wpływ ATP na poziom wapnia w komórce.W monowarstwie komórek szczurów PCK zastosowanie TP powoduje szybki wzrost wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia, który powraca do poziomu podstawowego w ciągu dwóch lub trzech minut. Technika ta oferuje wyjątkową możliwość monitorowania zmian w przepływie wapnia i aktywności kanałów żelazowych w torbielowatych nerkach. Poza charakterystyką aktywności komórkowego kanału sodowego i napływu wapnia u szczurów PCK, podejście to może być wykorzystane do analizy innych kanałów żelazowych w wielu modelach AR oraz A-D-P-K-D.

implementing-patch-clamp-live-fluorescence-microscopy-to-monitor

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawimy sposób badania wpływu pojedynczej mutacji punktowej na funkcję kanału jonowego.

Mutageneza i analiza funkcjonalna kanałów jonowych heterologicznie eksprymowanych w komórkach ssaków

W tym filmie demonstrujemy wizualizację translokacji PKC w żywych komórkach z wykorzystaniem PKC znakowanych fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo translokacji PKC w komórkach Sf9 oraz w neuronach sensorycznych Aplysia

Ten film przedstawia metodę jednoczesnego obrazowania i rejestrowania aktywności elektrycznej z transgenicznych wycinków mózgu, które zawierają specyficzne dla neuronów białka fluorescencyjne. Procedura polega na utrzymywaniu wycinka mózgu w komorze perfuzyjnej z napowietrzonym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym, użyciu źródła światła do wzbudzenia komórek znakowanych fluorescencyjnie oraz rejestrowaniu sygnałów elektrycznych za pomocą wielokanałowej sondy i zacisku krosowego.

Jednoczesne optyczne i elektrofizjologiczne monitorowanie komórek neuronalnych w wycinkach mózgu

W tym filmie, embrionalne hodowle komórek nerkowych wyrażające zależne od światła białka kanału jonowego połączone fluorescencyjnym reporterem demonstrują wpływ światła na ruch jonów. Zacisk krosowy na całe komórki służy do monitorowania ruchu jonów.

Zapis elektrofizjologii optogenetycznej komórek z kanałami jonowymi zależnymi od światła

Tutaj opisano procedurę uzyskiwania długich odcinków zapisu prądu z jednego kanału jonowego za pomocą techniki patch-clamp dołączonej do komórki. Metoda ta pozwala na obserwację w czasie rzeczywistym wzorca konformacji kanałów otwórz-zamknij, które leżą u podstaw sygnału biologicznego. Dane te informują o właściwościach kanałów w niezakłóconych błonach biologicznych.

Jednokanałowe nagrywanie z zaciskiem krosowym dołączonym do komórki

Zmiany w wewnątrzkomórkowym poziomie wapnia w podocytach są jednym z najważniejszych sposobów kontrolowania funkcji filtracji kłębuszków nerkowych. W tym miejscu wyjaśniamy podejście o wysokiej przepustowości, które umożliwia wykrywanie obchodzenia się z wapniem w czasie rzeczywistym i aktywności pojedynczych kanałów jonowych w podocytach świeżo wyizolowanych kłębuszków nerkowych.

Analiza jednokanałowa i obrazowanie wapnia w podocytach świeżo wyizolowanych kłębuszków nerkowych

Opisano metodę stymulacji aktywności elektrycznej kultur komórkowych in vitro za pomocą światła widzialnego, opartą na użyciu organicznych polimerów półprzewodnikowych.

Optyczna kontrola aktywności elektrycznej żywych komórek za pomocą sprzężonych polimerów

Ten artykuł opisuje, jak selektywność jonowa rodopsyny kanałowej jest określana za pomocą elektrofizjologicznych zapisów całokomórkowych z użyciem komórek HEK293. W tym miejscu przedstawiono eksperymentalną procedurę badania selektywności chlorkowej selektywnej dla anionów rodopsyny kanałowej. Procedura ta może być jednak przenoszona na inne rodopsyny kanałowe o wyraźnej selektywności.

Zapisy całokomórkowe patch-clamp do elektrofizjologicznego oznaczania selektywności jonowej w rodopsynach kanałowych

Prezentujemy protokół, który łączy izolację komórek i zapis z użyciem całego patch-clampu komórkowego w celu zmierzenia właściwości elektrycznych pierwotnych zdysocjowanych komórek nabłonkowych z najądrzy ogona szczura. Protokół ten pozwala na badanie właściwości funkcjonalnych pierwotnych komórek nabłonka najądrza w celu dalszego wyjaśnienia fizjologicznej roli najądrza.

Nagrania całokomórkowe patch-clamp izolowanych pierwotnych komórek nabłonka z najądrza

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzać automatyczne eksperymenty z zaciskami krosowymi sterowanymi obrazem przy użyciu niedawno opracowanego systemu dla standardowego sprzętu do elektrofizjologii in vitro.

Zastosowanie zautomatyzowanego zacisku krosowego sterowanego obrazem do badania neuronów w wycinkach mózgu

Celem tego protokołu jest wyizolowanie nienaruszonych obszarów rozrusznika miednicy nerkowej myszy za pomocą sekcji wibratomowej. Skrawki te można następnie wykorzystać do obrazowania Ca2 + in situ w celu wyjaśnienia przejściowych właściwości Ca2 + komórek rozrusznika serca i innych komórek śródmiąższowych w warstwach wibratomu.

Izolowanie i obrazowanie żywych, nienaruszonych obszarów rozrusznika serca miednicy nerkowej myszy poprzez wycięcie wibratomem

Poznaj metodę patch clamp i mikroskopię fluorescencyjną do badania aktywności kanałów jonowych oraz stężenia wapnia w nabłonku cyst z nerek gryzoni. Technika ta pozwala analizować fizjologię nabłonka w chorobie policystycznej nerki.

Wdrożenie patch clampu i mikroskopii fluorescencyjnej na żywo w celu monitorowania właściwości funkcjonalnych świeżo wyizolowanego nabłonka PKD (Wideo) | JoVE Journal

Wdrożenie patch clampu i mikroskopii fluorescencyjnej na żywo w celu monitorowania właściwości funkcjonalnych świeżo wyizolowanego nabłonka PKD

Przeglądaj więcej filmów