Budowa komórkowych neuroprzekaźników fluorescencyjnych (CNiFER) do optycznej detekcji neuroprzekaźników in vivo

Ogólnym celem tego filmu jest opisanie metodologii budowy i testowania komórkowych neuroprzekaźników fluorescencyjnych (CNiFER), które można wykorzystać do optycznego monitorowania uwalniania określonych neuroprzekaźników in vivo. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w neurobiologii dotyczące czasu i uwalniania neuromodulatorów w mózgu. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją dostosować do dowolnego rodzaju neuroprzekaźnika lub neuromodulatora, który sygnalizuje przez GPCS.

Regionalna demonstracja tej metody jest pomocna. Jest to iniekcja in vivo, a późniejsze obrazowanie CNiFER jest technicznie trudne. Aby rozpocząć tę procedurę, zobacz komórki HEK293, które zawierają detektor wapnia oparty na przodzie i chimeryczne białko g w kolbie T-25.

Następnie hoduj komórki w nawilżonym inkubatorze, w temperaturze 37 stopni Celsjusza, z pięcioprocentowym CO2, aż do około 50% konfluencji. Następnie odessać pożywkę z kolby T-25. Dodać dwa mililitry mieszaniny pożywki z wirusem lenta i inkubować kolbę T-25 w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2.

Następnego dnia zbierz zainfekowane komórki HEK293, dodając jeden mililitr trypsyny. Następnie ponownie zawieś osad komórkowy w pięciu mililitrach pożywki wzrostowej HEK293. Zasiej jeden mililitr komórek w kolbie T-75 do zamrażania i przechowywania oraz 1,5 mililitra komórek w kolbie T-25 do analizy FACS.

W przypadku 10-punktowej krzywej agonisty, w celu przetestowania zakażonych komórek, wysiewaj pierwsze dwa rzędy 96-dołkowej płytki pokrytej fibronektyną ze 100 mikrolitrami zawiesiny komórkowej na studzienkę. Następnie inkubuj komórki HEK293 rosnące w kolbie T-25, kolbie T-75 i 96-dołkowej płytce, aż do około 90% zlewania się w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2 przez jeden do dwóch dni. Przed analizą FACS należy określić funkcjonalną ekspresję GPCR, przygotowując płytkę z lekiem o 10 różnych stężeniach agonistów, które mieszczą się w przewidywanym EC 50.

Przygotuj różne stężenia agonisty za pomocą metody seryjnego rozcieńczania i utwórz szablon, aby śledzić stężenia leku. Następnie ustaw temperaturę czytnika płytek na 37 stopni Celsjusza. Następnie zaprogramuj 96-dołkowy czytnik płytek fluorometrycznych do pomiaru progu i wykonywania transferów roztworu.

Aby zmierzyć próg za pomocą genetycznie kodowanego czujnika wapnia opartego na progach, TNXXL, ustaw długość fali wzbudzenia na 436 plus minus 4,5 nanometra. Następnie ustaw filtry emisji i filtry odcinające dla ECFP i cytrynu. Następnie zaprogramuj czytnik płytek tak, aby mierzył emisje co cztery sekundy, w sumie przez 180 sekund.

Wybierz opcje dla objętości płytki 100 mikroliderów, wysokości pipety 150 mikrolitrów i dostarczania 50 mikrolitrów leku z potrójnej płytki złożonej. Ustaw punkt czasowy podania leku na 30 sekund. Następnie odessać pożywkę z rzędów A i B i dodać 100 mikrolitrów ACSF do 96-dołkowej płytki sniffera, która jest w około 90% zlewna.

Następnie załaduj potrójną płytkę z lekiem i 96-dołkową płytkę sniffer do czytnika płytek. Odczekaj 30 minut, aby zrównoważyć płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przed rozpoczęciem programu. Po uruchomieniu czytnika płytek wyeksportuj wartości czytnika fluorescencji do pliku tekstowego.

Następnie zaimportuj ten plik do wcześniej utworzonego szablonu arkusza kalkulacyjnego, który normalizuje intensywność kwitnienia do linii podstawowych sprzed bodźca, oblicza stosunek progów szczytowych dla każdego stężenia agonisty i generuje krzywą odpowiedzi na dawkę. Przygotuj pipetę iniekcyjną CNiFER, kładąc szklaną kapilarnę na pionowym ściągaczu elektrod. Użyj kleszczy, aby złamać końcówkę elektrody na średnicę około 40 mikrometrów.

Umieść nasączoną ACSF gąbkę na wcześniej uformowanym okienku czaszki znieczulonej myszy o grubości dwóch na trzy milimetry, aby zachować wilgotność podczas przygotowywania komórek do wstrzyknięcia. Następnie zbierz klon CNiFER, który został wyhodowany w kolbie T-75 do około 80% konfluencji. Odessać pożywkę i przemyć komórki sterylnym PBS.

Usunąć PBS i użyć 10 mililitrów ACFS do usunięcia komórek z dna kolby. Następnie trytleruj komórki, aby zdysocjować grudki komórek. Wirować przez dwie minuty w wirówce do hodowli komórkowych.

Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach ACSF. Następnie wirować przez 30 sekund w temperaturze 1400 razy G i usunąć supernatant, pozostawiając osad pokryty ACSF. Następnie należy ponownie napełnić pipetę iniekcyjną olejem mineralnym.

Załaduj pipetę do nanowtryskiwacza. Umieść pięć mikrolitrów zawiesiny komórek CNiFER na pasku plastikowej folii parafinowej w pobliżu preparatu dla myszy. Pobrać komórki CNiFER do wyciągniętej pipety.

Teraz przesuń pipetę do docelowych współrzędnych x i y. Opuść pipety i przebij przygotowaną wcześniej przyrzedzoną czaszkę. Kontynuuj do około 200 do 400 mikrometrów pod powierzchnią czaszki, w warstwach drugiej i trzeciej kory.

Wstrzyknij 4,6 nanolitra komórek CNiFER w najgłębsze miejsce za pomocą nanowtryskiwacza. Zwróć uwagę na ruch na styku oleju i komórki. A następnie poczekaj pięć minut, aż komórki się rozładują.

Wyjmij pipetę na około 100 mikrometrów i wstrzyknij kolejne 4,6 nanolitra komórek CNiFER i ponownie odczekaj pięć minut. Następnie powoli i delikatnie wyjmij pipetę, aby zapobiec cofaniu się CNiFER. W tej procedurze umieść platformę obrazowania z myszą z unieruchomioną głową pod obiektywem 10-krotnego zanurzenia w wodzie w mikroskopie obrazowania dwufotonowego.

Włóż kostkę filtracyjną do obrazowania progów, która ma zwierciadło dichroiczne o długości 505 nanometrów i filtry pasmowoprzepustowe o długości od 460 nanometrów do 500 nanometrów do pomiaru ECFP i od 520 nanometrów do 560 nanometrów do pomiaru cytrynu. Następnie dodaj ACSF do studni, w której znajduje się przerzedzone okno czaszki i opuść 10-krotny obiektyw zanurzenia w wodzie do ACSF. Użyj okularu w połączeniu z lampą rtęciową i kostką filtra GFP, aby zlokalizować CNiFER.

Teraz przełącz się na obiektyw z 40-krotnym zanurzeniem w wodzie. Następnie wybierz odpowiednią ścieżkę światła dla obrazowania dwóch fotonów. Włącz laser impulsowy femtosekundowy bliskiej podczerwieni.

Wybierz długość fali 820 nanometrów i ustawienie mocy od pięciu do 15%Ustaw napięcie pmt jeden i pmt dwa na wartość submaksymalną, zwykle 500-1000 woltów, w zależności od pmt. Następnie ustaw wzmocnienie na jeden dla każdego kanału i wyzeruj pozycję z dla celu. Opuść obiektyw o około 100 do 200 mikrometrów od powierzchni kory mózgowej i rozpocznij skanowanie xy.

Dostosuj moc lasera, wzmocnienie i napięcie pmt dla każdego kanału, aby zoptymalizować stosunek sygnału do szumu fluorescencji CNiFER. Następnie użyj oprogramowania, aby ograniczyć obrazowanie do regionu zawierającego komórki CNiFER, a także regionu tła. Wybierz linię Cowmana, uśredniając dla dwóch, aby uzyskać odpowiedni stosunek sygnału do szumu, i użyj częstotliwości skanowania od 3 do jednego herca przy czterech mikrosekundach na piksel.

Następnie narysuj ROI wokół komórek CNiFER. Otaczając około trzech do czterech komórek na płaszczyznę. Skonfiguruj analizę średniej intensywności zwrotu z inwestycji w czasie rzeczywistym.

Następnie rozpocznij akwizycję, aby monitorować kwitnienie CNiFER w czasie i rozpocznij stymulację elektryczną lub eksperyment behawioralny, jednocześnie monitorując fret. W tym przykładzie odpowiedź progu D2R CNiFER została zmierzona na czytniku płytek z systemem dostarczania roztworu. Ten wykres przedstawia reakcję progową podczas aplikacji dopaminy do D2 CNiFER.

Należy pamiętać, że emisja ECFP maleje, podczas gdy emisja cytrynu wzrasta wraz z dopaminą. A oto wykres odpowiedniego stosunku progów. Poniżej przedstawiono krzywe odpowiedzi na dawkę dla odpowiedzi D2 CNiFER na dopaminę i noradrenalinę.

Ponadto przedstawiono responsywne sterowanie CNiFER, w których brakuje D2R. Ten wykres słupkowy pokazuje odpowiedź współczynnika progów dla innych neuroprzekaźników i modulatorów przy 50 nano molach i jednym mikro trzonie. W tym przypadku elektryczna stymulacja neuronów DA w istocie czarnej wywołuje dużą zmianę w stosunku progów dla D2 CNiFER.

Zwróć uwagę, jak amplituda odpowiedzi wzrasta wraz ze wzrostem intensywności stymulacji elektrycznej. Sprzężenie stymulacji z wstrzyknięciem kokainy wzmacnia odpowiedź CNiFER. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak tworzyć, testować i używać CNiFER do obrazowania in vivo.

Przez cały okres opracowywania CNiFER konieczne jest utrzymanie sterylnej techniki, ponieważ komórki te zostaną ostatecznie wszczepione żywym myszom. Realizacja CNiFER stanowi ważne narzędzie dla badań w dziedzinie neurobiologii do optycznego pomiaru uwalniania dowolnego neuroprzekaźnika lub neuromodulatora, który sygnalizuje przez receptor sprzężony z białkiem G. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.