Name: Budowa komórkowych neuroprzekaźników fluorescencyjnych (CNiFER) do optycznej detekcji neuroprzekaźników in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Poznaj metodę budowy komórkowych neuroprzekaźnikowych reporterów fluorescencyjnych CNiFERs z komórek HEK293 do optycznej detekcji neuroprzekaźników in vivo. Technika umożliwia monitorowanie dynamiki neuromodulatorów w mózgu w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy B. Conklinowi (University of California, San Francisco) za dostarczenie cDNA Gqi5 i Gqs5, A. Schweitzerowi za pomoc w elektronice, N. Taylorowi za pomoc w badaniach przesiewowych klonów, Ianowi Glaaserowi i Robertowi Rifkinowi za korektę oraz Olivierowi Griesbeckowi za TN-XXL. Prace te były wspierane przez granty badawcze za pośrednictwem amerykańskiego Narodowego Instytutu ds. Nadużywania Narkotyków (NIDA) (DA029706; DA037170), Narodowy Instytut Obrazowania Biomedycznego i Bioinżynierii (NIBIB) (EB003832), Hoffman-La Roche (88610A) oraz grant szkoleniowy "Neuroscience Related to Drugs of Abuse" za pośrednictwem NIDA (DA007315).

<ol><li>Day, J. C., Kornecook, T. J., Quirion, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+in+vivo.+microdialysis+to+the+study+of+cholinergic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Application of in vivo. microdialysis to the study of cholinergic systems.</a> Methods. 23, 21-39 (2001).</li>
<li>Robinson, D. L., Venton, B. J., Heien, M. L., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+subsecond+dopamine+release+with+fast-scan+cyclic+voltammetry+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Detecting subsecond dopamine release with fast-scan cyclic voltammetry in vivo.</a> Clin Chem. 49, 1763-1773 (2003).</li>
<li>Liang, R., Broussard, G. J., Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Chemical+Neurotransmission+with+Genetically+Encoded+Fluorescent+Sensors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Imaging Chemical Neurotransmission with Genetically Encoded Fluorescent Sensors.</a> ACS Chem Neurosci. , (2015).</li>
<li>Okubo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+extrasynaptic+glutamate+dynamics+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Imaging extrasynaptic glutamate dynamics in the brain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 6526-6531 (2010).</li>
<li>Marvin, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+fluorescent+probe+for+visualizing+glutamate+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission.</a> Nat Methods. 10, 162-170 (2013).</li>
<li>Nguyen, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+biosensor+for+neurotransmitter+release+and+in+situ+receptor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An in vivo biosensor for neurotransmitter release and in situ receptor activity.</a> Nat Neurosci. 13, 127-132 (2010).</li>
<li>Muller, A., Joseph, V., Slesinger, P. A., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+reporters+reveal+in+vivo+dynamics+of+dopamine+and+norepinephrine+release+in+murine+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell-based reporters reveal in vivo dynamics of dopamine and norepinephrine release in murine cortex.</a> Nat Methods. 11, 1245-1252 (2014).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J Vis Exp. , e3998(2012).</li>
<li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Lentivirus production.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Conklin, B. R., Farfel, Z., Lustig, K. D., Julius, D., Bourne, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substitution+of+three+amino+acids+switches+receptor+specificity+of+Gq%CE%B1+to+that+of+Gj%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Substitution of three amino acids switches receptor specificity of Gqα to that of Gjα.</a> Nature. 363, 274-276 (1993).</li>
<li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nat Protoc. 1, 3166-3173 (2006).</li>
<li>Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polished+and+reinforced+thinned-skull+window+for+long-term+imaging+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Drew, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+optical+access+through+a+polished+and+reinforced+thinned+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull.</a> Nat Methods. 7, 981-984 (2010).</li>
<li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+as+a+tool+to+study+blood+flow+and+neurovascular+coupling+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 32, 1277-1309 (2012).</li>
<li>Yamauchi, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+ligand-gated+ion+channel+receptors+with+genetically+encoded+Ca2%2B+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterizing ligand-gated ion channel receptors with genetically encoded Ca2+ sensors.</a> PLoS One. 6, e16519(2011).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat Methods. 2, 932-940 (2005).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
<li>Cui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+activation+of+striatal+direct+and+indirect+pathways+during+action+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Concurrent activation of striatal direct and indirect pathways during action initiation.</a> Nature. 494, 238-242 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Stworzenie CNiFERs zapewnia innowacyjną i unikalną strategię optycznego pomiaru uwalniania neuroprzekaźników w mózgu in vivo. CNiFER idealnie nadają się do pomiaru uwalniania pozasynaptycznego, tj. przewodzenia objętościowego dla neuroprzekaźników. Co ważne, każdy CNiFER posiada właściwości natywnego GPCR, zapewniając fizjologiczny optyczny pomiar zmian poziomu neuroprzekaźników w mózgu. Do tej pory stworzono CNiFER do wykrywania acetylocholiny (M1-CNiFER)6, dopaminy (D2-CNiFER)7 i...

Aby w pełni zrozumieć, jak neurony komunikują się w mózgu, konieczne jest posiadanie metody pomiaru uwalniania neuroprzekaźników in vivo. Istnieje kilka dobrze znanych technik pomiaru neuroprzekaźników in vivo. Jedną z powszechnie stosowanych technik jest mikrodializa, w której kaniulę wprowadza się do mózgu, a niewielką objętość płynu mózgowo-rdzeniowego pobiera się i analizuje za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej i detekcji elektrochemicznej1. Mikrodializa posiada rozdzielczość przestrzenną rzędu kilku średnic sondy, np. ~0,5 mm dla mikrosondy o średnicy 200 μm. Rozdzielczość czasowa tej techniki jest jednak powolna ze względu na interwały próbkowania, które zwykle trwają ~5 minut lub dłużej1. Co więcej, analizy nie są wykonywane w czasie rzeczywistym. Inną techniką jest szybka skaningowa woltamperometria cykliczna (FSCV), która wykorzystuje sondę z włókna węglowego, która jest wprowadzana do mózgu. FSCV charakteryzuje się doskonałą rozdzielczością czasową (subsekunda), wysoką czułością (nanomolowa) i rozdzielczością przestrzenną przy średnicach sondy od 5 do 30 μm. Jednak FSCV jest ograniczony do przetworników, które wytwarzają charakterystyczny profil utleniania i redukcji z napięciem na węglowej sondzie potencjometrycznej2.
Trzecią techniką pomiaru neuroprzekaźników jest bezpośrednio za pomocą genetycznie kodowanych biosensorów neuroprzekaźników (NT)3. Dzięki tej metodzie tworzy się białko fuzyjne, które zawiera domenę wiążącą ligand dla nadajnika sprzężonego z parą fluoroforów4 opartą na rezonansie fluorescencyjnym (FRET) lub permutowanym GFP5. W przeciwieństwie do poprzednich dwóch metod, te bioczujniki są genetycznie kodowane i ulegają ekspresji na powierzchni komórki gospodarza, takiej jak neuron, poprzez produkcję zwierząt transgenicznych lub w ostrym stopniu przy użyciu czynników wirusowych do infekowania komórek. Do tej pory genetycznie kodowane bioczujniki zostały opracowane tylko do wykrywania glutaminianu i GABA3-5. Ograniczeniami w stosowaniu tych technik była niska czułość w zakresie nM oraz niemożność rozszerzenia detekcji na dużą liczbę przekaźników, np. klasycznych neuroprzekaźników, neuropeptydów i neuromodulatorów, które sygnalizują za pośrednictwem receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR). W rzeczywistości w ludzkim genomie znajduje się prawie 800 GPCR.
Aby rozwiązać te problemy, opracowaliśmy innowacyjne narzędzie do optycznego pomiaru uwalniania każdego neuroprzekaźnika, który wysyła sygnał przez GPCR. CNiFER (cell-based neurotransmitter fluorescent engineered reporters) to klonalne komórki HEK293 zaprojektowane do ekspresji specyficznego GPCR, który po stymulacji wyzwala wzrost wewnątrzkomórkowego [Ca2 +], który jest wykrywany przez genetycznie kodowany czujnik Ca2 + oparty na FRET, TN-XXL. W ten sposób CNiFER przekształcają wiązanie receptora neuroprzekaźnika w zmianę fluorescencji, zapewniając bezpośredni i optyczny odczyt w czasie rzeczywistym lokalnej aktywności neuroprzekaźników. Wykorzystując natywny receptor dla danego neuroprzekaźnika, CNiFER zachowują specyficzność chemiczną, powinowactwo i dynamikę czasową endogennie wyrażanych receptorów. Do tej pory stworzyliśmy trzy rodzaje CNiFER, jeden do wykrywania acetylocholiny za pomocą receptora M1, jeden do wykrywania dopaminy za pomocą receptora D2 i jeden do wykrywania noradrenaliny za pomocą receptora α1a6,7. Technologia CNiFER jest łatwo rozbudowywalna i skalowalna, dzięki czemu jest kompatybilna z każdym typem GPCR. W tym artykule JoVE opisujemy i ilustrujemy metodologię projektowania, realizacji i testowania CNiFER in vivo dla dowolnego zastosowania.

<table><tbody><tr><td>pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro&nbsp;</td><td>System Biosciences</td><td>CD510B-1</td><td>Klonowanie: do generowania lentiwirusa</td></tr><tr><td>12 x 75 *BD Falcon High Clarity Polipropylenowa probówka z okrągłym dnem</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td>FACS</td></tr><tr><td>BD 40 um Sitka do komórek Falcona</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td>FACS</td></tr><tr><td>0,05% Trypsyna EDTA&nbsp;</td>Płytka studzienkowa <td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td>FACS</td></tr><tr><td>96, płaska denna, przezroczysta&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3596</td><td>FACS</td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki do hodowli komórkowych&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>CLS3997</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Optilux przezroczysty spód&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3603</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet Flexstation</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>9000-0911</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Chlorek acetylocholiny&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2661</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Noradrenalina&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7256</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Chlorowodorek dopaminy&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1090</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>GABA&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2129</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Histamina&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7125</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Glutaminian &nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49621</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Epinefryna&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4642</td><td></td></tr><tr><td>Somatostatyna Flexstation&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1763</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>5HT&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9523</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>VIP&nbsp;</td><td>Alpha Diagnostics Inc.&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>SP-69627</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Orexin A</td><td>Alpha Diagnostics Inc.&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>12-p-01</td><td>Substancja Flexstation</td></tr><tr><td>P&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6883</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Adenozyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4036</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Melatonina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5250C</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Czytnik i oprogramowanie płytek fluorescencyjnych</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Flexstation 3</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>&nbsp; DMEM (wysoka glukoza) z Glutamax&nbsp; &nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td>Hodowla tkankowa</td></tr><tr><td>&nbsp; Surowica bydlęca płodu</td><td>Life Technologies</td><td>10082-139</td><td>Hodowla tkankowa</td></tr><tr><td>&nbsp; Długopis/paciorkowiec&nbsp; antybiotyki</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Hodowla tkankowa</td></tr><tr><td>&nbsp; Puromycyna&nbsp; &nbsp;</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pr-1</td><td>Hodowla tkankowa</td></tr><tr><td>&nbsp; Fibronektyna&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td>Hodowla tkankowa</td></tr><tr><td>CoolCell LX Bezalkoholowe pudełko do zamrażania komórek o kontrolowanej dawce</td><td>Bioexpress</td><td>D-3508)</td>Klej cyjanoakrylowy <td>do hodowli tkankowych</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Loctite</td><td>Loctite nr 495</td><td>chirurgia i stereotaksja iniekcyjna folia</td></tr><tr><td>parafinowa z tworzywa sztucznego&nbsp;</td><td>VWR</td><td>Parafilm&reg;</td><td>chirurgia i iniekcja stereotaktyczna</td></tr><tr><td>Nanowtryskiwacz</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td><td>chirurgia i iniekcja stereotaktyczna</td></tr><tr><td>Elektrody szklane</td><td>Drummond</td><td>3-000-203G</td><td>chirurgia i iniekcja stereotaktyczna</td></tr><tr><td>wiertarka ręczna</td><td>OSADA</td><td>Exl-M40</td><td>chirurgia i iniekcja stereotaktyczna</td></tr><tr><td>Frezy do wiertarki</td><td>Fine Scientific</td><td>19007-05; 19007-07)</td><td>chirurgia i iniekcja</td></tr> <tr><td>stereotaktycznaKąpiel sterylizująca</td><td>FST</td><td>18000-45, sterylizator gorących kulek</td><td>chirurgia i stereotaktyczny</td></tr><tr><td>wtrysk komora/maska izofluranowa</td> Highland <td>Medical Equipment</td><td>564-0427, HME 109 Stołowa maszyna anestezjologiczna z parownikiem izofluranu, przepływomierzem O2, zaworem gangowym; 564-0852, Komora indukcyjna Chirurgia 16X7X7,5cm</td><td>i iniekcja stereotaktyczna</td></tr><tr><td>Luneta 3D z ramieniem</td><td>Operacja Zeiss</td><td></td><td>i iniekcja stereotaktyczna</td></tr><tr>chirurgia światłem <td></td><td></td><td>światłowodowym</td><td>i iniekcja stereotaktyczna</td></tr><tr><td>Betadine&nbsp;</td><td></td><td></td><td>chirurgia i iniekcja stereotaktyczna</td></tr><tr><td>70 % (v/v) chirurgia alkoholem</td><td></td><td></td> izopropylowym <td>i iniekcja stereotaktyczna Podkładki</td></tr><tr><td>przygotowawcze powidonowo-jodowe</td> Chirurgia <td>dynarex</td><td>1108</td><td>i iniekcja stereotaktyczna</td></tr><tr><td>NaCl 0,9% (wstrzyknięcie, USP, 918610)</td><td></td><td></td><td>chirurgia i iniekcja stereotaktyczna</td></tr><tr><td>CYKLOSPORYNA (INIEKCJA, USP)</td><td></td><td></td><td>chirurgia i stereotaktyczne wstrzyknięcie</td></tr><tr><td>Buprenex (wstrzyknięcie) buprenorfina (0,03 &mu; g za g gryzonia)</td><td>Chirurgia Sigma-Aldricha</td><td></td><td>i iniekcja stereotaktyczna</td></tr><tr><td>Maść okulistyczna&nbsp;</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-235-35</td><td>chirurgia i iniekcja stereotaktyczna Chirurgia</td></tr><tr><td>Surgifoam</td><td>Ethicon</td><td></td><td>i iniekcja stereotaktyczna</td></tr><tr><td>Cement dentystyczny Grip</td><td>Dentsply</td><td>#675571,</td><td>chirurgia 675572 i iniekcja stereotaktyczna</td></tr><tr><td>Instant SuperGlue&nbsp;</td><td>NDindustries</td><td></td><td>chirurgia i iniekcja stereotaktyczna</td></tr><tr><td>Chirurgia LOCTITE 4041</td><td></td><td></td><td>i iniekcja stereotaktyczna</td></tr><tr><td>METABOND</td><td>C& B</td><td></td><td>chirurgia i iniekcja stereotaktyczna</td></tr><tr><td>nr 0 szkło nakrywkowe</td><td>Chirurgia Fishera</td><td></td><td>i stereotaktyczny zastrzyk stereotaktyczny</td></tr><tr><td>rama&nbsp;</td><td>Chirurgia Kopf</td><td></td><td>i wstrzyknięcie stereotaktyczne</td></tr><tr><td>Sonda doodbytnicza i poduszka grzewcza</td><td>FHC</td><td>40-90-8D, regulator temperatury DC, 40-90-2-06, podkładka grzewcza 6,5X9,5 cm40-90-5D-02, termistor doodbytniczy</td><td>Operacja sondy i stereotaktyczny wtrysk</td></tr><tr><td>optyczna płytka stykowa do obrazowania</td><td>Chirurgia Thorlabs</td><td></td><td>i iniekcja stereotaktyczna</td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Fisher</td><td>S55667</td><td>chirurgia i iniekcja stereotaktyczna</td></tr><tr><td>Kwik-Cast (elastomer silikonowy)</td> Chirurgia <td>World Precision Instruments</td><td></td><td>i iniekcja stereotaktyczna</td></tr><tr><td>Szew&nbsp; &nbsp;</td><td>Etyka</td><td>18' ', 1667, 4-0</td><td>chirurgia i stereotaktyczne</td></tr><tr><td>nożyczki</td><td>iniekcyjne Fine Scientific Tools</td><td>91500-09, 15018-10</td><td>chirurgia i stereotaktyczne iniekcje</td></tr><tr><td>Forcepts</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11252-30; #55, 11295-51; Grafe, 11050-10</td><td>chirurgia i wstrzyknięcie stereotaktyczne</td></tr><tr><td>Student Halsted-Mosquito Hemostats</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>91308-12</td><td>chirurgia i wstrzyknięcie stereotaktyczne</td></tr><tr><td>Zestaw kauteryzatora małych naczyń</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>18000-00</td><td>chirurgia i iniekcja stereotaktyczna</td></tr><tr><td>Sterylizatory z gorącymi kulkami</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>18000-45</td><td>chirurgia i iniekcja</td></tr> <tr><td>stereotaktycznaFuterał na instrumenty z matą silikonową</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>20311-21</td><td>chirurgia i iniekcja stereotaktyczna</td></tr><tr><td>Plastikowe pojemniki do sterylizacji z matą silikonową</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>20810-01</td><td>chirurgia i iniekcja stereotaktyczna</td></tr><tr><td>Zakres fluorescencji 2P o stałym stopniu do obrazowania in vivo</td><td>Olympus</td><td>FV1200 MPE</td><td>Obrazowanie in vivo</td></tr><tr><td>Laser</td> <td>wielofotonowySpectraPhysics</td><td>Mai Tai DeepSee</td><td>Obrazowanie in vivo</td></tr><tr><td>Zielony laser</td><td>Olympus</td><td>473 nm Laserowe</td><td>obrazowanie in vivo</td></tr><tr><td>baza translacyjna xy</td><td>Scientifica</td><td>MMBP</td><td>do obrazowania in vivo</td></tr><tr><td>Fret do YFP i CFP</td><td>Olympus do obrazowania in vivo</td><td></td> Obiektywy zanurzeniowe 10x i 40x Olympus <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Stół powietrzny do <td>obrazowania in vivo</td></tr><tr><td></td><td>Obrazowanie in vivo</td> <td>Newport</td><td></td> zbudowane na</tr><tr><td>zamówienie Światłoszczelna klatka</td><td>Thorlab</td><td></td><td>obrazowanie in vivo</td></tr></tbody></table>

budowa komórkowych neuroprzekaźników fluorescencyjnych (cnifer) do optycznej detekcji neuroprzekaźników in vivo

Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo

Komórkowe neuroprzekaźniki fluorescencyjne (CNiFERs) dostarczają neurobiologom nowego narzędzia do optycznego wykrywania uwalniania neuroprzekaźników w mózgu in vivo. Specyficzny CNiFER jest tworzony z ludzkiej embrionalnej komórki nerkowej, która stabilnie wyraża specyficzny receptor sprzężony z białkiem G, który łączy się z białkami Gq / 11 G, oraz detektor Ca2 + oparty na FRET, TN-XXL. Aktywacja receptora prowadzi do wzrostu sygnału FRET. CNiFER mają czułość nM i czasową reakcję wynoszącą sekundy, ponieważ klon CNiFER wykorzystuje natywny receptor dla określonego neuroprzekaźnika, np. D2R dla dopaminy. CNiGFER są bezpośrednio wszczepiane do mózgu, co umożliwia im wykrywanie uwalniania neuroprzekaźników z rozdzielczością przestrzenną mniejszą niż sto μm, co czyni je idealnymi do pomiaru transmisji objętościowej in vivo. CNiGFER mogą być również wykorzystywane do badań przesiewowych innych leków pod kątem potencjalnej reaktywności krzyżowej in vivo. Niedawno rozszerzyliśmy rodzinę CNiGFER o GPCR, które łączą się z białkami Gi/o G. CNiFER są dostępne do wykrywania acetylocholiny (ACh), dopaminy (DA) i noradrenaliny (NE). Biorąc pod uwagę, że każdy GPCR może być użyty do stworzenia nowego CNiFER i że w ludzkim genomie znajduje się około 800 GPCR, opisujemy tutaj ogólną procedurę projektowania, realizacji i testowania dowolnego typu CNiFER.

CNiFER jest pochodną ludzkiej komórki nerki zarodkowej (HEK293), która została zmodyfikowana tak, aby stabilnie ekspresować co najmniej dwa białka: specyficzny receptor sprzężony z białkiem G (GPCR) oraz genetycznie kodowany sensor [Ca2+], TN-XXL. TN-XXL ulega transferowi energii fluorescencji (FRET) pomiędzy cyjanową a żółtą białkami fluorescencyjnymi, odpowiednio eCFP i Citrine, w odpowiedzi na jony Ca2+6,15. Aktywacja receptorów GPCR sprzężonych z endog...

Przedstawiamy protokół do tworzenia komórkowych neuroprzekaźników fluorescencyjnych (CNiFERs) do optycznego wykrywania wolumetrycznego uwalniania neuroprzekaźników.

Budowa komórkowych neuroprzekaźników fluorescencyjnych (CNiFER) do optycznej detekcji neuroprzekaźników in vivo

Cell-based neurotransmitter fluorescent engineered reporters (CNiFERs) provide a new tool for neuroscientists to optically detect the release of ...

Ogólnym celem tego filmu jest opisanie metodologii konstrukcji i testowania komórkowych fluorescencyjnych reporterów neuroprzekaźników, zwanych CNiFERs, które mogą być wykorzystywane do optycznego monitorowania uwalniania specyficznych neuroprzekaźników in vivo. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neuronauki dotyczące czasu i mechanizmu uwalniania neuromodulatorów w mózgu. Główną zaletą tej techniki jest możliwość jej adaptacji do każdego rodzaju neuroprzekaźnika lub neuromodulatora, który przekazuje sygnały poprzez GPCS.Przydatna jest regionalna demonstracja tej metody. Iniekcja in vivo oraz następujące po niej obrazowanie CNiFERów są technicznie wymagające. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować komórki HEK293 zawierające detektor wapnia oparty na FRET i chimeryczne białko G w kolbie T-25.Następnie hoduj komórki w inkubatorze z nawilżaniem, w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2, aż osiągną około 50% konfluencji. Po tym czasie odessij pożywkę z kolby T-25. Dodaj 2 mL mieszaniny pożywki z lentiwirusem i inkubuj kolbę T-25 w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.Następnego dnia zebrać zakażone komórki HEK293, dodając jeden mililitr trypsyny. Następnie zawiesić osad komórkowy w pięciu mililitrach pożywki do hodowli HEK293. Przenieść jeden mililitr komórek do kolby T-75 w celu zamrożenia i przechowywania, a 1,5 mililitra komórek do kolby T-25 do analizy FACS.Aby uzyskać 10-punktową krzywą agonistyczną do badania zakażonych komórek, należy wysiać zawiesinę komórkową w ilości 100 µL na dołek w dwóch pierwszych rzędach płytki 96-dołkowej pokrytej fibronektyną. Następnie inkubować komórki HEK293 hodowane w kolbie T-25, kolbie T-75 oraz na płytce 96-dołkowej w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez jeden do dwóch dni, aż osiągną około 90% konfluencji. Przed analizą FACS należy określić funkcjonalną ekspresję GPCR poprzez przygotowanie płytki z lekiem zawierającej 10 różnych stężeń agonisty, które obejmują przewidywaną wartość EC 50.Przygotować różne stężenia agonisty metodą rozcieńczeń seryjnych i stworzyć szablon w celu monitorowania stężeń leku. Następnie ustawić temperaturę czytnika płytek na 37 °C. W dalszej kolejności zaprogramować fluorometryczny czytnik płytek 96-dołkowych do pomiaru FRET oraz przenoszenia roztworów.Aby zmierzyć FRET przy użyciu genetycznie kodowanego sensora wapnia opartego na FRET, TNXXL, ustaw długość fali wzbudzenia na 436 ± 4,5 nm. Następnie ustaw filtry emisji oraz filtry odcinające dla ECFP i cytryny. W kolejnym kroku zaprogramuj czytnik płytek tak, aby mierzył emisję co cztery sekundy przez łącznie 180 s.Wybierz opcje dla objętości płytki microleader 100 µL, wysokości pipety 150 µL oraz dozowania 50 µL leku z trzykrotnej płytki z związkami. Ustaw punkt czasowy dozowania leku na 30 s. Następnie odessaj medium z rzędów A i B, a do płytki sniffer 96-dołkowej, która osiągnęła około 90% konfluencji, dodaj 100 µL ACSF.Następnie umieść płytkę z trzykrotnym stężeniem leku oraz płytkę sniffer z 96 dołkami w czytniku płytek. Przed uruchomieniem programu odczekaj 30 minut, aby płytki wyrównały temperaturę do 37 °C. Po zakończeniu pomiaru w czytniku płytek wyeksportuj wartości fluorescencji do pliku tekstowego.Następnie zaimportuj ten plik do wcześniej przygotowanego szablonu arkusza kalkulacyjnego, który normalizuje intensywności fluorescencji względem linii bazowych sprzed stymulacji, oblicza szczytowy stosunek FRET dla każdego stężenia agonisty i generuje krzywą zależności dawka-odpowiedź. Przygotuj pipetę do iniekcji CNiFER, umieszczając szklaną kapilarę w pionowym wyciągaczu elektrod. Za pomocą pęsety odłam końcówkę elektrody do średnicy około 40 micrometers.Umieść gąbkę nasączoną ACSF na wcześniej przygotowanym cienkim oknie czaszkowym o wymiarach 2x3 mm u znieczuplonej myszy, aby utrzymać wilgotność podczas przygotowywania komórek do iniekcji. Następnie pobierz klon CNiFER, który był hodowany w kolbie T-75 do około 80% konfluencji. Odessij pożywkę i przemyj komórki sterylnym PBS.Usunąć PBS, a następnie użyć 10 ml ACFS, aby odseparować komórki od dna kolby. Następnie przeprowadzić tryturację komórek w celu rozbicia skupisk komórkowych. Wirować przez dwie minuty w wirówce do hodowli komórkowych.Usunąć nadsącz i zawiesić osad w 100 µL ACSF. Następnie wirować przez 30 sekund przy 1400 ×g i usunąć nadsącz, pozostawiając osad pokryty ACSF. Po tym zabiegu ponownie napełnić pipetę do iniekcji olejem mineralnym.Załaduj pipetę do nanoinkektora. Nanieś 5 µL zawiesiny komórek CNiFER na pasek plastikowej folii parafinowej w pobliżu preparatu mysiego. Pobierz komórki CNiFER do wyciągniętej pipety.Następnie przesuń pipetę do docelowych współrzędnych x i y. Obniż pipety i przebij wcześniej przygotowaną cienką czaszkę. Kontynuuj wprowadzanie do głębokości około 200 do 400 µm poniżej powierzchni czaszki, do drugiej i trzeciej warstwy kory.Za pomocą nano-injektora wstrzyknij 4,6 nanolitra komórek CNiFER w najgłębszym punkcie. Zwróć uwagę na ruch na granicy fazy olejowej i komórkowej. Następnie odczekaj pięć minut, aż komórki zostaną w pełni wydzielone.Wycofaj pipetę o około 100 mikrometrów i wstrzyknij kolejne 4,6 nanolitrów komórek CNiFER, a następnie ponownie odczekaj pięć minut. Po tym czasie powoli i ostrożnie wycofaj pipetę, aby zapobiec cofaniu się komórek CNiFER. W tej procedurze umieść platformę obrazującą z unieruchomioną głową myszy pod obiektywem imersyjnym 10x w mikroskopie dwufotonowym.Włóż kostkę filtracyjną do obrazowania FRET, która posiada lustro dichroiczne 505 nanometrów oraz filtry przepustowe w zakresie od 460 nanometrów do 500 nanometrów do pomiaru ECFP oraz od 520 nanometrów do 560 nanometrów do pomiaru cytryny. Następnie dodaj ACSF do dołka zawierającego cieńsze okno czaszki i zanurz obiektyw imersyjny 10x w ACSF. Użyj okularu wraz z lampą rtęciową i kostką filtracyjną GFP, aby zlokalizować CNiFERy.Teraz przełącz na obiektyw imersyjny z wodą 40x. Następnie wybierz odpowiednią drogę światła do obrazowania dwufotonowego. Włącz femtosekundowy laser impulsowy bliskiej podczerwieni.Wybierz długość fali 820 nanometrów oraz ustawienie mocy od 5% do 15%. Ustaw napięcie pmt one i pmt two na wartość submaksymalną, zazwyczaj 500-1000 voltów, w zależności od pmt. Następnie ustaw wzmocnienie (gain) na jeden dla każdego kanału i wyzeruj pozycję z obiektywu. Obniż obiektyw o około 100 do 200 mikrometrów od powierzchni kory i rozpocznij skanowanie xy.Dostosuj moc lasera, wzmocnienie (gain) oraz napięcie PMT dla każdego kanału, aby zoptymalizować stosunek sygnału do szumu fluorescencji CNiFER. Następnie za pomocą oprogramowania ogranicz obrazowanie do obszaru zawierającego komórki CNiFER oraz do obszaru tła. Wybierz linię skanowania (cowman line) z uśrednianiem do dwóch próbek, aby uzyskać odpowiedni stosunek sygnału do szumu, i zastosuj szybkość skanowania od 3 do 1 Hz przy 4 µs na piksel.Następnie wyznacz ROI wokół komórek CNiFER, obejmując około trzech do czterech komórek na płaszczyznę. Skonfiguruj analizę w czasie rzeczywistym średnich intensywności ROI.Następnie rozpocznij akwizycję, aby monitorować fluorescencję CNiFER w czasie i rozpocznij stymulację elektryczną lub eksperyment behawioralny, monitorując jednocześnie fret. W tym przykładzie odpowiedź fret D2R CNiFER była mierzona za pomocą czytnika płytek z systemem dozowania roztworów. Wykres ten przedstawia odpowiedź fret podczas aplikacji dopaminy do D2 CNiFER.Należy zauważyć, że emisja ECFP maleje, podczas gdy emisja cytryny wzrasta wraz ze wzrostem stężenia dopaminy. Tutaj przedstawiono wykres odpowiadającego temu stosunku FRET. Wyświetlone są tutaj krzywe zależności dawka-odpowiedź dla reakcji D2 CNiFERs na dopaminę oraz norepinefrynę.Dodatkowo przedstawiono responsywne kontrolne CNiFERy pozbawione D2R. Ten wykres słupkowy pokazuje odpowiedź stosunku FRET dla innych neuroprzekaźników i modulatorów w stężeniach 50 nM i 1 µM. W tym przypadku stymulacja elektryczna neuronów DA w istocie czarnej wywołuje znaczną zmianę stosunku FRET dla D2 CNiFERs.Zwróć uwagę, że amplituda odpowiedzi wzrasta wraz ze zwiększaniem intensywności stymulacji elektrycznej. Połączenie stymulacji z iniekcją kokainy nasila odpowiedź CNiFER. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak tworzyć, testować i wykorzystywać CNiFERy do obrazowania in vivo.Podczas tworzenia CNiFER-ów niezbędne jest zachowanie zasad aseptyki, ponieważ komórki te zostaną ostatecznie wszczepione żywym myszom. Opracowanie CNiFER-ów dostarcza badaczom z dziedziny neuronauki istotnego narzędzia do optycznego pomiaru uwalniania dowolnego neuroprzekaźnika lub neuromodulatora, który sygnalizuje poprzez receptor sprzężony z białkiem G. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

construction-cell-based-neurotransmitter-fluorescent-engineered

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W związku z rosnącym zainteresowaniem terapiami komórkami macierzystymi, techniki obrazowania molekularnego są idealne do monitorowania zachowania tych komórek po transplantacji. Geny reporterowe lucyferazy umożliwiły nieinwazyjną, powtarzalną ocenę przeżywalności, lokalizacji i proliferacji komórek in vivo. W niniejszym filmie zaprezentrowano sposób śledzenia proliferacji hESC w żywej myszy.

Obrazowanie genem reporterowym bioluminescencyjnym ludzkich embrionalnych komórek macierzystych in vitro i in vivo

Opracowaliśmy nową technikę kwantyfikacji zmian receptorów nikotynowych acetylocholiny w obrębie regionów podkomórkowych specyficznych podtypów neuronów OUN, aby lepiej zrozumieć mechanizmy uzależnienia od nikotyny, wykorzystując kombinację podejść, w tym znakowanie receptora białkiem fluorescencyjnym metodą knock-in oraz spektralną mikroskopię konfokalną.

Spektralne obrazowanie konfokalne nikotynowych receptorów znakowanych fluorescencyjnie u myszy typu knock-in z przewlekłą podażą nikotyny

Źródło: Lacin, E., et al. Budowa komórkowych neuroprzekaźników fluorescencyjnych (CNiFER) do optycznej detekcji neuroprzekaźników in vivo. J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia technikę obrazowania uwalniania neuroprzekaźników in vivo przy użyciu komórkowych neuroprzekaźników fluorescencyjnych (CNiFER), wyspecjalizowanych komórek reporterowych wstępnie wstrzykniętych do kory myszy. Umieszczona pod mikroskopem dwufotonowym mysz umożliwia wizualizację sygnalizacji wapniowej indukowanej przez...

Obrazowanie uwalniania neuroprzekaźników za pomocą komórkowych neuroprzekaźników fluorescencyjnych

Dzięki małemu, przezroczystemu ciału, dobrze udokumentowanej neuroanatomii i mnóstwu podatnych technik genetycznych i odczynników, C. elegans stanowi idealny organizm modelowy do obrazowania neuronów in vivo przy użyciu stosunkowo prostych, tanich technik. Tutaj opisujemy obrazowanie pojedynczego neuronu u nienaruszonych dorosłych zwierząt przy użyciu genetycznie kodowanych fluorescencyjnych wskaźników wapnia.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów u C. elegans

Tutaj prezentujemy nowatorskie podejście do obrazowania Ca2+ za pomocą bioluminescencyjnego reportera. Podejście to wykorzystuje stopiony konstrukt GFP-aequorin, który wiąże się z Ca2+ i emituje światło, eliminując potrzebę wzbudzenia światła. Co istotne, metoda ta pozwala na długie, ciągłe obrazowanie, dostęp do głębokich struktur mózgu i wysoką rozdzielczość czasową.

In vivo (in vivo) Funkcjonalne obrazowanie mózgu oparte na bioluminescencyjnym wskaźniku wapnia GFP-aequorin

Ta nowo opracowana technologia oparta na fluorescencji umożliwia długoterminowe monitorowanie transkrypcji genów zegara okołodobowego w jądrze nadskrzyżowaniowym (SCN) swobodnie poruszających się myszy w czasie rzeczywistym i w wysokiej rozdzielczości czasowej.

In vivo (in vivo) Monitorowanie ekspresji genu zegara okołodobowego w jądrze nadskrzyżowaniowym myszy za pomocą reporterów fluorescencyjnych

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania sygnalizacji wapniowej w populacjach poszczególnych typów komórek w mysim złączu nerwowo-mięśniowym.

Ex vivo Obrazowanie specyficznej dla komórki sygnalizacji wapniowej w trójdzielnej synapsie przepony myszy

Prezentujemy dwuczęściowy protokół, który łączy fluorescencyjne obrazowanie wapnia z hybrydyzacją in situ, pozwalając eksperymentatorowi skorelować wzorce aktywności wapnia z profilami ekspresji genów na poziomie pojedynczej komórki.

Fluorescencyjne obrazowanie wapnia i późniejsza hybrydyzacja in situ w celu charakterystyki prekursorów neuronalnych u Xenopus laevis

Opisano dwie powiązane metody wizualizacji zdarzeń subkomórkowych wymaganych do transmisji synaptycznej. Protokoły te umożliwiają monitorowanie w czasie rzeczywistym dynamiki napływu presynaptycznego wapnia i fuzji błony pęcherzyków synaptycznych przy użyciu obrazowania żywych komórek neuronów hodowanych in vitro.

Fluorescencyjny pomiar funkcji synaptycznych w czasie rzeczywistym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego

Korzystając z transgenicznych myszy fluorescencyjnych, opisano szczegółowe protokoły do oceny in vivo transportu aksonalnego endosomów sygnałowych i mitochondriów w obrębie aksonów motorycznych i czuciowych nienaruszonego nerwu kulszowego u żywych zwierząt.

Rozszerzenie zestawu narzędzi do obrazowania in vivo transportu aksonalnego

Obecne metody opisują nieratiometryczne podejście do wysokorozdzielczego, subkompartmentowego obrazowania wapnia in vivo u Caenorhabditis elegans przy użyciu łatwo dostępnych genetycznie kodowanych wskaźników wapnia.

Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo

Poznaj metodę budowy komórkowych neuroprzekaźnikowych reporterów fluorescencyjnych CNiFERs z komórek HEK293 do optycznej detekcji neuroprzekaźników in vivo. Technika umożliwia monitorowanie dynamiki neuromodulatorów w mózgu w czasie rzeczywistym.

Budowa komórkowych neuroprzekaźników fluorescencyjnych (CNiFER) do optycznej detekcji neuroprzekaźników in vivo

Przeglądaj więcej filmów