Name: System kohodowli guzów mózgu/organotypowych plastrów do badania mikrośrodowiska guza i celowanych terapii lekowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Poznaj metodę hodowli pierwotnych ludzkich komórek guza mózgu w plastrach mózgu myszy. Technika ta umożliwia badanie mikrośrodowiska guza oraz testowanie nowych terapii lekowych w warunkach zbliżonych do fizjologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez granty z NIH (P01CA142536 do RAS, T32CA009361 do DPY) oraz fundacji Pediatric Low Grade Astrocytoma.

<ol><li>Heddleston, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+stem+cell+maintenance%3A+the+role+of+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Glioma stem cell maintenance: the role of the microenvironment.</a> Curr Pharm Des. 17 (23), 2386-2401 (2013).</li>
<li>Sasai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shh+pathway+activity+is+down-regulated+in+cultured+medulloblastoma+cells%3A+implications+for+preclinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Shh pathway activity is down-regulated in cultured medulloblastoma cells: implications for preclinical studies.</a> Cancer Res. 66 (8), 4215-4222 (2006).</li>
<li>Louis, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2007+WHO+classification+of+tumours+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">The 2007 WHO classification of tumours of the central nervous system.</a> Acta Neuropathol. 114 (2), 97-109 (2007).</li>
<li>Duffau, H., Capelle, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+brain+locations+of+low-grade+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Preferential brain locations of low-grade gliomas.</a> Cancer. 100 (12), 2622-2626 (2004).</li>
<li>Chourmouzi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manifestations+of+pilocytic+astrocytoma%3A+a+pictorial+review%5BTitle%5D)+AND+%22Insights+Imaging%22%5BJournal%5D)">Manifestations of pilocytic astrocytoma: a pictorial review.</a> Insights Imaging. 5 (3), 387-402 (2014).</li>
<li>Buonamici, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfering+with+resistance+to+smoothened+antagonists+by+inhibition+of+the+PI3K+pathway+in+medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Interfering with resistance to smoothened antagonists by inhibition of the PI3K pathway in medulloblastoma.</a> Sci Transl Med. 2 (51), 51ra70(2010).</li>
<li>Choi, Y., Borghesani, P. R., Chan, J. A., Segal, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+from+a+mitogenic+niche+promotes+cell-cycle+exit%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Migration from a mitogenic niche promotes cell-cycle exit.</a> J Neurosci. 25 (45), 10437-10445 (2005).</li>
<li>Chan, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteoglycan+interactions+with+Sonic+Hedgehog+specify+mitogenic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Proteoglycan interactions with Sonic Hedgehog specify mitogenic responses.</a> Nat Neurosci. 12 (4), 409-417 (2009).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li>
<li>Kenny, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+high+throughput+screening+using+a+primary+human+three-+dimensional+organotypic+culture+predicts+in+vivo+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Quantitative high throughput screening using a primary human three- dimensional organotypic culture predicts in vivo efficacy.</a> Nat Commun. 6, 6220(2015).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+inhibitor+and+feeder+cells+induce+the+conditional+reprogramming+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells.</a> Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).</li>
</ol>

Żaden z autorów nie ma sprzecznych interesów ani sprzecznych interesów.

Protokół ten opisuje, w jaki sposób komórki guza mózgu mogą być znakowane fluorescencyjnie i powlekane na strzałkowym odcinku mózgu myszy P6, a następnie monitorowane przez tydzień w hodowli. Ten test wspólnej hodowli guza mózgu / organotypowego plastra może być wykorzystany do określenia wpływu regionalnego mikrośrodowiska na liczbę komórek nowotworowych, a także może być stosowany jako system do pomiaru skuteczności nowych terapii lekowych na wzrost guza u człowieka. W poprzednich badaniach stosowano podobną strategię ...

Ostatnie badania nad rakiem poczyniły znaczne postępy w identyfikacji mutacji genetycznych, zmian molekularnych i możliwych metod leczenia różnych nowotworów mózgu. Pomimo tego postępu, guzy mózgu pozostają jedną z głównych przyczyn śmiertelności związanej z rakiem u dorosłych i dzieci. Czynniki ograniczające w badaniach nad nowotworami mózgu obejmują ograniczoną dostępność pierwotnych próbek pacjentów i linii komórkowych oraz trudności w replikacji unikalnego i niejednorodnego mikrośrodowiska mózgu w dostępnych systemach eksperymentalnych. W przypadku wielu guzów mózgu warunki wymagane do utrzymania komórek nowotworowych w czasie nie są jeszcze znane. Nawet w przypadku guzów mózgu, które mogą być hodowane w zawiesinie komórkowej jako neurosfery, warunki hodowli mogą wpływać na komórki nowotworowe1,2. Rzeczywiście, dodanie podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów lub naskórkowego czynnika wzrostu w celu pobudzenia proliferacji i zahamowania różnicowania może zmienić ekspresję genów1. Inne metody wzrostu komórek nowotworowych, takie jak propagacja guza u myszy za pomocą ortotopowego lub podskórnego ksenoprzeszczepu komórek nowotworowych, są cennymi testami, ale są ograniczone przez takie czynniki, jak czas rozwoju guza (szczególnie w przypadku guzów o niskim stopniu złośliwości), koszt i liczba komórek nowotworowych, które można wstrzyknąć i zbadać. W związku z tym obecne metody hodowli ludzkich komórek guza mózgu są niewystarczające do utrzymania niektórych typów nowotworów i często zapewniają sztuczne środowisko, które nie naśladuje ściśle środowisk nowotworowych in vivo.
Różne typy guzów mózgu u dzieci rosną w wysoce wyspecjalizowanych miejscach w mózgu[3, 4] i prawdopodobnie odzwierciedla to różne wymagania mikrośrodowiskowe dla wzrostu guza[5]. Protokół ten opisuje nowy system, w którym komórki, które są trudne do namnażania w normalnych warunkach hodowli, mogą być hodowane w organotypowym mikrośrodowisku mózgu, które naśladuje warunki wzrostu guza in vivo. W tym teście ilościowym znakowane fluorescencyjnie komórki guza mózgu są umieszczane na organotypowych wycinkach mózgu młodocianych myszy i monitorowane w czasie. Test ten może być wykorzystany do zbadania wpływu mikrośrodowiska na wzrost guza oraz do testowania nowych terapii lekowych w klinicznie istotnym mikrośrodowisku mózgu.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td></td><td></td>17504044</tr><tr><td>Glukoza</td><td>Invitrogen</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Pennicylina Streptomycyna</td><td>Technologie życia</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Technologie życia</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Technologie życia</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Technologie życia</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Życie Technologie</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A- Medium minus czerwień fenolowa</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td></td><td></td>12349015</tr> Wkładki do kultur plastrowych <tr>agarozy <td>Promega V2111</td><td></td>o<td>niskiej temperaturze topnienia</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Milipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>laminin</td><td>Invitrogen</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>Cm-DiI&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>V22888</td><td></td></tr><tr><td>EDU (Etykietowanie i wykrywanie)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>c10337</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosfery&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>F-21010</td><td></td></tr><tr><td>Wibratom&nbsp;</td>Mikroskop konfokalny <td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Oprogramowanie Nikon Eclipse Ni C2si</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Okulary nakrywkowe 5 mm&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>64-0700 (CS-5R)</td><td></td></tr></tbody></table>

system kohodowli guzów mózgu/organotypowych plastrów do badania mikrośrodowiska guza i celowanych terapii lekowych

A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies

Guzy mózgu są główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności związanej z rakiem. Opracowanie nowych metod leczenia tych nowotworów jest trudne, ponieważ wiele z tych nowotworów nie jest łatwo hodowanych w standardowych warunkach hodowli. Hodowle neurosfery w warunkach wolnych od surowicy i ksenoprzeszczepy ortotopowe poszerzyły zakres guzów, które można utrzymać. Jednak wiele rodzajów guzów mózgu pozostaje trudnych do rozmnażania lub badania. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku guzów mózgu u dzieci, takich jak gwiaździaki pilocytarne i rdzeniaki. Protokół ten opisuje system, który pozwala na hodowlę pierwotnych guzów mózgu u ludzi. Ten test ilościowy może być wykorzystany do zbadania wpływu mikrośrodowiska na wzrost guza oraz do testowania nowych terapii lekowych. Protokół ten opisuje system, w którym znakowane fluorescencyjnie komórki guza mózgu są hodowane na organotypowym wycinku mózgu młodej myszy. Odpowiedź komórek nowotworowych na leczenie farmakologiczne można badać w tym teście, analizując zmiany liczby komórek na wycinku w czasie. Ponadto system ten może zajmować się naturą mikrośrodowiska, które normalnie sprzyja rozwojowi guzów mózgu. Ten test współhodowli organotypowych plastrów guza mózgu zapewnia korzystny system testowania nowych leków na ludzkich komórkach nowotworowych w mikrośrodowisku mózgu.

Ta sekcja obrazuje typ wyników, których można się spodziewać po wykorzystaniu kokultury guza mózgu i organotypowych przekrojów do badania preferencji w obrębie regionalnego mikrośrodowiska oraz do testowania nowych terapii. Wykazujemy, że test został zaprojektowany tak, aby odtworzyć mikrośrodowisko dla guzów mózgu, ponieważ organizacja tkanki i stan proliferacyjny przekroju zostają zachowane (Rysunek 3). Wykazujemy również, że wzrost liczby komórek nowotworowych na przekroju w czasie może wynikać części...

Wiele typów ludzkich guzów mózgu jest zlokalizowanych w określonych regionach mózgu i są trudne do wyhodowania w kulturze. Protokół ten odnosi się do roli mikrośrodowiska guza i bada nowe terapie lekowe poprzez analizę fluorescencyjnych pierwotnych komórek guza mózgu rosnących w organotypowym wycinku mózgu myszy.

System kohodowli guzów mózgu/organotypowych plastrów do badania mikrośrodowiska guza i celowanych terapii lekowych

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these ...

Ogólnym celem tej procedury jest hodowla fluorescencyjnych pierwotnych ludzkich komórek guza mózgu w kokulturze z cienkim skrawkiem mózgu mysiego, aby zbadać wpływ mikrośrodowiska mózgu na wzrost komórek nowotworowych oraz przetestować potencjalne nowe metody leczenia farmakologicznego. Metoda ta może pomóc w zbadaniu kluczowych kwestii w dziedzinie biologii raka, takich jak obszary mózgu wspierające wzrost guza, a potencjalnie także przyczyny rozwoju guzów mózgu w konkretnych obszarach. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wykorzystania jej jako systemu do testowania nowych terapii lekowych na ludzkich komórkach guza mózgu, które nie rosną w standardowych warunkach hodowli komórkowej.Aby rozpocząć tę procedurę, chwyć mysz w szóstym dniu po urodzeniu za nos i wykonaj dwa symetryczne nacięcia od tylnej części czaszki w kierunku oczodołów. Trzymaj końcówkę nożyczek jak najbliżej czaszki, aby uniknąć uszkodzenia tkanek. Następnie wykonaj trzecie nacięcie prostopadle do pierwszego i drugiego nacięcia.Następnie delikatnie usuń czaszkę za pomocą małych nożyczek sprężynowych. Przetnij pozostałą część czaszki wzdłuż linii środkowej. Następnie zdejmij czaszkę, aby odsłonić opłaty węcho

a-brain-tumororganotypic-slice-co-culture-system-for-studying-tumor

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film pokazuje rozwój systemu kokultury 3D. Wycinki mózgu myszy umieszcza się na błonie, a znakowane fluorescencyjnie ludzkie komórki guza mózgu mogą na niej rosnąć. Gdy system jest gotowy, jest barwiony do obrazowania.

Ustalenie guza mózgu w organotypowym modelu kokultury warstw

Wideo pokazuje tworzenie i utrzymywanie organtypowych kultur warstwowych z tkanki glejaka. Wyizolowaną tkankę osadza się w matrycy agarozowej, a cienkie skrawki uzyskuje się za pomocą wibratomu. Sekcje te są następnie umieszczane na przepuszczalnych wkładkach membranowych w mikropłytce i hodowane w pożywce do hodowli warstwowej w celu długotrwałej konserwacji.

Generowanie i utrzymywanie kultur plastrów z ludzkiej tkanki glejaka wielopostaciowego

Organotypowa kokultura wycinków mózgu z komórkami rakowymi umożliwia wizualizację zmian morfologicznych za pomocą fluorescencji, jak również mikroskopii w jasnym polu (wideo) podczas procesu inwazji komórek rakowych w tkance mózgowej. Ten modelowy system pozwala również na podejście oparte na wymianie i uzupełnianiu komórek oraz oferuje szeroką gamę manipulacji i analiz.

System kokultury z organotypowym wycinkiem mózgu i sferoidą 3D komórek rakowych

Obecne modele ex vivo glejaka (GBM) nie są zoptymalizowane pod kątem fizjologicznie istotnych badań nad inwazją nowotworów u ludzi. W tym miejscu przedstawiamy protokół generowania i utrzymywania organotypowych kultur warstwowych ze świeżej tkanki ludzkiej GBM. Przedstawiono opis technik mikroskopii poklatkowej i ilościowej analizy migracji komórek.

Organotypowy model hodowli warstwowej glejaka ludzkiego do badania migracji komórek nowotworowych i specyficznych dla pacjenta skutków leków przeciwinwazyjnych

Organotypowe kultury plastrów hipokampa (OHSC) reprezentują model in vitro, który bardzo dobrze symuluje sytuację in vivo. W tym miejscu opisujemy ulepszony protokół krojenia oparty na wibratomie w celu uzyskania wysokiej jakości plastrów do wykorzystania w ocenie potencjału neuroprotekcyjnego nowych substancji lub biologicznego zachowania komórek nowotworowych.

Organotypowe kultury warstwowe hipokampa jako model do badania neuroprotekcji i inwazyjności komórek nowotworowych

Udostępniamy metodę generowania, hodowli i systematycznej analizy wycinków organotypowych pochodzących z mysich guzów płuc. Opisujemy również, jak zoptymalizować grubość plastra i jak dobrać stężenia leków do leczenia plastrów guza.

Ustalenie i analiza eksplantatów plastrów guza jako warunek wstępny do badań diagnostycznych

Wprowadzamy protokół do mierzenia reakcji na lek w czasie rzeczywistym w organotypowych wycinkach tkanki nowotworowej. Przedstawiona tutaj strategia eksperymentalna stanowi platformę do przeprowadzania średnio-wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków na wycinkach tkanek pochodzących z nowotworów klinicznych lub mysich w warunkach ex vivo.

Pomiar reakcji na lek w czasie rzeczywistym w organotypowych wycinkach tkanki nowotworowej

Ten protokół opisuje przygotowanie organotypowych kultur plastrowych (OTSC). Technika ta ułatwia hodowlę ex vivo nienaruszonej tkanki wielokomórkowej. OTSC mogą być natychmiast użyte do zbadania ich odpowiedniej odpowiedzi na leki w środowisku wielokomórkowym.

Organotypowe kultury warstwowe jako przedkliniczne modele mikrośrodowiska guza w pierwotnym raku trzustki i przerzutach

Wprowadzamy protokół do pomiaru w czasie rzeczywistym reakcji komórek przerzutowych raka piersi do mózgu na leki i promieniowanie w organotypowym modelu wycinka mózgu. Metody te zapewniają test ilościowy w celu zbadania efektów terapeutycznych różnych metod leczenia przerzutów raka piersi do mózgu w sposób ex vivo w obrębie interfejsu mikrośrodowiska mózgu.

Model wycinka mózgu ex vivo do badania i celowania we wzrost guza z przerzutami do mózgu raka piersi

Opisujemy protokół produkcji, hodowli i wizualizacji ludzkich nowotworów, które dały przerzuty na powierzchnie otrzewnej. Wycięte próbki guza są cięte za pomocą wibratomu i hodowane na przepuszczalnych wkładkach w celu zwiększenia natlenienia i żywotności, a następnie obrazowanie i dalsze analizy przy użyciu mikroskopii konfokalnej i cytometrii przepływowej.

Hodowla i obrazowanie organotypowych wycinków guza rzekomego śluzaka otrzewnej ex vivo z wyciętych próbek guza ludzkiego

Tutaj przedstawiamy kompleksowy protokół generowania i wykorzystywania laboratoryjnie zaprojektowanych organoidów glejaka (LEGO) do badania zależności genotyp-fenotyp i badania potencjalnych leków do leczenia glejaka.

Laboratoryjnie zmodyfikowana hodowla organoidów glejaka wielopostaciowego i badania przesiewowe leków

Poznaj metodę hodowli pierwotnych ludzkich komórek guza mózgu w plastrach mózgu myszy. Technika ta umożliwia badanie mikrośrodowiska guza oraz testowanie nowych terapii lekowych w warunkach zbliżonych do fizjologicznych.

System kohodowli guzów mózgu/organotypowych plastrów do badania mikrośrodowiska guza i celowanych terapii lekowych

Przeglądaj więcej filmów