Name: Kompletna i zaktualizowana metoda polikultury wrotka do hodowli danio pręgowanego po raz pierwszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Poznaj metodę polikultury wrotka do hodowli larw danio pręgowanego, która zwiększa przeżywalność i przyspiesza wzrost. Technika ta znacząco redukuje zasoby potrzebne do badań rozwojowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Opieka i wykorzystanie ryb wygenerowanych dla reprezentatywnych wyników opisanych w tym protokole zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi określonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Szpitalu Dziecięcym w Bostonie, protokół # 14-05-2673R.

1. Kultura wrotka
<ol>
	<li>Podstawowe elementy systemu hodowli wykorzystującego 100-litrowe naczynie hodowlane
	<ol>
		<li>Zbierz wszystkie składniki do konfiguracji kultury wrotka . Zestaw do hodowli wrotków składa się z naczynia hodowlanego (CV) do hodowli wrotków; podobny zbiornik do konserwacji wrotków paszowych (naczynie do hodowli paszowych, FCV); okrągłodenny słoik wylęgowy (zbiornik paszowy, FR) do przechowywania mieszanki paszowej dla alg (AFM); dopływ powietrza (AS) do napowietrzania CV, FCV i FR; pompa perystaltyczna z zegarem dozującym (PMT) do sterowania dostarczaniem glonów do CV i FCV; oraz filtr cząstek stałych (FPF), który znajduje się wewnątrz CV. 
		UWAGA: Pełna lista materiałów eksploatacyjnych i komponentów znajduje się w Wykazie materiałów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>konfiguracja
	<ol>
		<li>Podnieś CV i FCV na stojaku lub stole, aby kultury można było łatwo zebrać przez odpływ wpasowany do pojemnika zbiorczego (rysunek 1). Użyj elastycznego przewodu doprowadzającego powietrze, aby połączyć AS z długością sztywnego przewodu w każdym naczyniu hodowlanym. Upewnij się, że rurka jest wystarczająco długa, aby dostarczyć powietrze do dolnej części CV lub FCV.</li>
		<li>Użyj przewodu pneumatycznego o małej przepustowości, aby podłączyć AS do długości sztywnej rurki, która rozciąga się do dolnej części FR, która zawiera AFM. Zamontuj zawór w każdym przewodzie powietrznym, aby regulować przepływ powietrza. Podłącz FR do PMT za pomocą rurki doprowadzającej zasilanie i poprowadź rurkę z PMT do otworu wywierconego z boku CV/FCV, w pobliżu góry. Rysunek 1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>startup
	<ol>
		<li>Napełnij naczynie hodowlane do 90% dostępnej objętości wodą z odwróconej osmozy (RO). Jeśli RO nie jest dostępna, użyj czystej, odchlorowanej wody miejskiej; Należy jednak przeprowadzić ocenę ryzyka bioasekuracji w celu zapewnienia, że w wodzie źródłowej nie występują żadne organizmy potencjalnie chorobotwórcze. UWAGA: Taka analiza może być wykonana przez dowolne wykwalifikowane laboratorium badające wodę.</li>
		<li>Dozuj wodę z naczynia hodowlanego z solą akwariową, aby osiągnąć zasolenie 15 g/l. Ustaw przepływ powietrza do naczynia tak, aby utrzymywało "toczące się wrzenie", a następnie powoli dodawaj odmierzoną ilość soli do naczynia hodowlanego, aż zostanie całkowicie rozpuszczona przez napowietrzanie. Kontynuuj napowietrzanie wody przez >1 godzinę, aby upewnić się, że jest w pełni natleniona.</li>
		<li>Przygotuj mieszankę paszową dla alg. Do 3 l czystej, odchlorowanej świeżej (0 ppm) wody dodać 100 gNaHCO3 i 100 g neutralizatora amoniaku (hydroksymetylosulfonianu sodu). Ten ostatni odczynnik zapewnia dodatkową korzyść w postaci neutralizacji pozostałości chloru z wody z kranu lub pozostałości wybielacza z odkażania sprzętu do hodowli. Bardzo ważne jest, aby upewnić się, że związki te są całkowicie rozpuszczone. Następnie dodać 1 L koncentratu z alg (biomasa sucha masa ~15%). Dodać mieszaninę paszową do FR i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Dodać kulturę starterową 5 - 10 milionów wrotków Brachionus plicatilis do CV zawierającej napowietrzoną wodę o zasoleniu 15 g/l. Jeżeli wrotki zostały schłodzone podczas transportu lub przechowywania, powinny być stopniowo (przez 30 minut lub dłużej) przyzwyczajane do temperatury wody w naczyniu hodowlanym (25–27 °C).</li>
		<li>Włącz PMT i rozpocznij pompowanie paszy z glonów do naczynia do hodowli wrotków. Korzystając z funkcji timera PMT, ustaw szybkość dostarczania mieszanki paszowej dla glonów tak, aby ~1.6 ml mieszanki paszowej dla glonów było dostarczane na milion wrotków w kulturze dziennie. Karmić małymi porcjami w regularnych odstępach czasu w ciągu 24 godzin; Im częstsze karmienie, tym lepiej.</li>
		<li>Skalibruj szybkość tłoczenia pompy, ręcznie włączając PMT na określony czas (np. 1 min) i zbierz glony, które pompuje w tym czasie, do cylindra z podziałką lub zlewki. Na przykład, jeśli PMT dozuje 5 ml glonów w ciągu 1 minuty, to dawka wyniesie 5 ml glonów / min.</li>
		<li>Oblicz wymaganą dzienną dawkę karmienia, mnożąc liczbę obecnych wrotków w milionach przez 1,6 ml. Na przykład kultura wrotków o wielkości populacji 100 milionów wrotków wymagałaby ~160 ml paszy dziennie (100 x 1,6 ml).</li>
		<li>Ustaw PMT tak, aby dozować całkowite dzienne zapotrzebowanie na paszę w regularnych odstępach czasu przez okres 24 godzin. Na przykład, podawanie całkowitej dziennej ilości paszy wynoszącej 160 ml może być podawane w porcjach raz na 3 godziny przez okres 24 godzin przy użyciu zestawu PMT z pompką dozującą 5 ml/min przez 4 minuty, 8 razy dziennie (5 ml/min x 4 min = 20 ml x 8 karmień = 160 ml).</li>
		<li>Pozwól kulturze rosnąć, aż wygeneruje wymaganą populację, zwykle przez 48 - 72 godziny, przed zbiorem. Po 24 godzinach od uruchomienia wlej filtry cząstek stałych z nici dentystycznej do naczynia hodowlanego i rozpocznij normalną konserwację.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konserwacja 
	UWAGA: Kultura działa w sposób ciągły i wymaga rutynowej konserwacji, która najlepiej powinna być wykonywana o tej samej porze każdego dnia, w następującej kolejności.
	<ol>
		<li>Napełnij FCV do 90% dostępnej objętości czystą, odchlorowaną słodką wodą z dozowanymi solami akwariowymi o stężeniu 10 g/l. Upewnij się, że woda jest dobrze wymieszana i że cała sól jest całkowicie rozpuszczona. Ustaw przepływ powietrza do naczynia tak, aby utrzymywało "toczące się wrzenie". Zmierzyć zasolenie za pomocą refraktometru i upewnić się, że zasolenie wynosi 10 g/l. Kluczowe znaczenie ma osiągnięcie tego celu i nieprzekraczanie go.</li>
		<li>Pobrać próbki wrotków w CV: Upewnij się, że kultura jest dobrze wymieszana, a następnie pobrać 3 próbki po 2-3 ml każda, używając pipety do przenoszenia lub autopipetora, z różnych części kultury. Połączyć te próbki w probówce lub fiolce o odpowiedniej wielkości (np. 10 ml).</li>
		<li>Przenieść 1 - 2 ml połączonej próbki na szalkę Petriego, tak aby można ją było uwidocznić pod mikroskopem preparacyjnym. Sprawdź jakość kultury (zachowanie wrotków podczas pływania, obecność oderwanych jaj, zanieczyszczające pierwotniaki).</li>
		<li>Unieruchomić wrotki w pozostałej połączonej próbce, dodając do próbki 100 μl 50% roztworu jodu Lugolsa. W ciągu kilku sekund po dodaniu płynu Lugola obserwuj, jak wrotki przestają pływać. Teraz łatwo policz wrotki . 
		UWAGA: Zamiast płynów Lugola można użyć etanolu, rozcieńczonego wybielacza lub octu. Ocet (2 krople/10 ml) ma tę zaletę, że nie jest niebezpieczny, nie traci siły podczas przechowywania, jak mogą to zrobić roztwory wybielacza i jodu, i nie powoduje skurczów wrotków, dzięki czemu korona rzęsek i "stopa" pozostają przedłużone, a zwierzęta wyglądają bardziej naturalnie.</li>
		<li>Upewnij się, że próbka jest dobrze wymieszana (unieruchomione wrotki szybko osiadają), a następnie szybko weź podpróbkę o objętości ~2 ml do plastikowej pipety i dozuj 1 ml do szkiełka do liczenia Sedgewick-Rafter (20 x 50 kwadratów 1 mm) (Rysunek 2). Za pomocą mikroskopu preparacyjnego lub złożonego policz nienaruszone wrotki i całkowitą liczbę jaj przyczepionych do tych wrotków (ryc. 2). Policz tyle powierzchni szkiełka, ile potrzeba, aby policzyć ~100 wrotków. Oblicz liczbę wrotków na ml i zapisz to w arkuszu kalkulacyjnym lub dzienniku.</li>
		<li>Zbierz ~30% objętości wrotków w CV: Wyjmij dopływ powietrza i filtr nici dentystycznej, powoli otwórz zawór w dolnej części CV i pozwól, aby woda spłynęła do kolektora planktonu z sitkiem o oczkach 53 μm. Zbierz wodę wypływającą z dna kolektora po przefiltrowaniu do wiadra lub odpływu. Używaj delikatnego lub umiarkowanego przepływu, aby uniknąć uszkodzenia wrotków. Nie pozwól, aby wrotki wyschły na ekranie.</li>
		<li>Ze względu na spójność zaleca się ustalanie FCV przy standardowej liczbie wrotków każdego dnia. Dlatego, w oparciu o znaną gęstość wrotka CV i objętość zbioru, należy dostosować całkowitą objętość FCV, aby uzyskać stałą gęstość końcową (np. 1 500 wrotków/ml). Dodać zebrane wrotki do FCV: Delikatnie przenieś wrotki z sita zbiorczego za pomocą butelki do mycia wypełnionej czystą słoną wodą (10 - 15 g/l). Odwróć sitko nad FCV i umyj wrotki w FCV delikatnym strumieniem słonej wody. Uruchom PMT, aby dostarczyć paszę (~1,57 ml na milion wrotków dziennie) do FCV.</li>
		<li>Wyszoruj całe wnętrze CV czystą, miękką nylonową szczotką lub padem do szorowania.</li>
		<li>Przygotuj nową mieszankę 15 g/l wody, dodając odpowiednią ilość soli do odmierzonej ilości czystej wody RO w wiadrze o pojemności 5 galonów, aby zastąpić objętość wody utraconej podczas zbiorów. Dodaj sól do wody w wiadrze i energicznie mieszaj, aż całkowicie się rozpuści, a następnie dodaj do CV.</li>
		<li>Używając sprayu wysokociśnieniowego w zlewie, wypłucz filtr nici dentystycznej, aż będzie wolny od zanieczyszczeń, a następnie włóż go z powrotem do CV.</li>
		<li>Dostosuj dawki paszy dla glonów dostarczanych do układu sercowo-naczyniowego, zmieniając czas trwania każdego dawkowania, zgodnie z dzienną liczbą wrotków/ml. Skorzystaj z obliczeń podanych w kroku 1.3.8 powyżej, aby określić odpowiednią ilość paszy, która ma być dostarczona.</li>
		<li>Około 24 godziny później powtórz proces. Rozpocząć od zebrania wrotków pozostałych w FCV (które nie były potrzebne w poprzednim dniu) w taki sam sposób, jak opisano powyżej (kroki 1.4.2 - 1.4.10). Zagęścić je w 2 litrach świeżej, czystej odchlorowanej wody (5 g/l soli). Mogą one być przechowywane w temperaturze 4 °C jako zapasowe źródło lub wykorzystywane do karmienia ryb w późniejszych stadiach, poza tym, co opisano w niniejszym protokole. 
		UWAGA: Protokół ten pozwala na do 2-3 dni zmniejszonej konserwacji kultur (przy normalnym karmieniu automatycznym), ponieważ wrotki w CV mogą tolerować pominięcie zbiorów bez poważnych konsekwencji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Polikultura
<ol>
	<li>Instalacji
	<ol>
		<li>Zebrać zarodki danio pręgowanego z tarła, przelewając zarodki z tarła przez sitko do herbaty, a następnie delikatnie spłukując sterylną wodą dla ryb (lub innym niezanieczyszczonym źródłem odpowiednio kondycjonowanego roztworu; np. pożywka dla zarodków, E3 itp.) z butelki do mycia na szalki Petriego.</li>
		<li>Inkubować zarodki w temperaturze 25-28 °C na szalkach Petriego w gęstości 40-50 zarodków na szalce przez 5 dni.</li>
		<li>Fazę polikultury należy rozpocząć w 5 dniu po zapłodnieniu lub gdy więcej niż 90% wyklutych larw aktywnie pływa w słupie wody.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>szczepienie
	<ol>
		<li>Dodać 500 ml kultury wrotka bezpośrednio z FCV do zbiornika szkółkarskiego o pojemności 3,5 l; włączenie wody do hodowli wrotków zapewnia paszę dla glonów, która utrzymuje zawartość składników odżywczych wrotków podczas polikultury.</li>
		<li>Delikatnie wlej larwy z jednej szalki Petriego do zbiornika szkółkarskiego. Upewnij się, że w naczyniu nie pozostały żadne larwy.</li>
		<li>Dodać do zbiornika 500 ml czystej, kondycjonowanej wody dla ryb z systemu recyrkulacji lub dedykowanego źródła wody, aby osiągnąć końcową objętość 1 l i końcowe zasolenie 5 g/l. 
		UWAGA: To zasolenie ma kluczowe znaczenie, ponieważ zasolenie >7 g/l będzie miało negatywny wpływ, jeśli zasolenie wyniesie 7 g/l, a przeżywalność wrotka będzie miało negatywny wpływ, jeśli zasolenie <2 g/l.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Faza polikultury 
	UWAGA: Faza polikultury powinna trwać do 4 dni po inokulacji (łącznie 5 dni, co odpowiada 5-9 dniom po zapłodnieniu).
	<ol>
		<li>W tym okresie należy obserwować zbiornik polikulturowy co najmniej raz dziennie, aby upewnić się, że wrotki i ryby są obecne i rosną. Upewnij się, że wrotki są widoczne w całym słupie wody. Upewnij się, że ryby są również widoczne w słupie wody, pływając wśród wrotków.</li>
		<li>Rozpocznij normalny przepływ wody przez zbiornik. Umieść sitko lub przegrodę nad otworem spustowym, aby upewnić się, że larwy nie są wypłukiwane ze zbiornika. 
		UWAGA: Pod koniec tej fazy ryba będzie wystarczająco duża, aby spożywać większe zdobycze, takie jak nauplia artemii lub przetworzone produkty paszowe w zakresie wielkości 75 - 125 μm. 
		UWAGA: Dynamikę populacji wrotka w reprezentatywnym zbiorniku polikulturowym zmierzono poprzez pobieranie próbek/liczenie wrotków ze zbiornika w taki sam sposób, jak opisano w krokach 1.4.2 - 1.4.5. Odbywało się to raz dziennie od początku fazy polikultury aż do jej zakończenia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ribas, L., Piferrer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+%28Danio+rerio%29+as+a+model+organism%2C+with+emphasis+on+applications+for+finfish+aquaculture+research%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Aquaculture%22%5BJournal%5D)">The zebrafish (Danio rerio) as a model organism, with emphasis on applications for finfish aquaculture research.</a> Reviews in Aquaculture. 6, 209-240 (2014).</li>
<li>Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+understanding+tissue+regenerative+capacity+and+mechanisms+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals.</a> Nature reviews. Genetics. 11, 710-722 (2010).</li>
<li>Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+genetics+TIG%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends in genetics TIG. 29, 611-620 (2013).</li>
<li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hooked%21+modeling+human+disease+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Hooked! modeling human disease in zebrafish.</a> Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).</li>
<li>Selderslaghs, I. W. T., Blust, R., Witters, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feasibility+study+of+the+zebrafish+assay+as+an+alternative+method+to+screen+for+developmental+toxicity+and+embryotoxicity+using+a+training+set+of+27+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Feasibility study of the zebrafish assay as an alternative method to screen for developmental toxicity and embryotoxicity using a training set of 27 compounds.</a> Reproductive Toxicology. 33 (2), 142-154 (2012).</li>
<li>Lawrence, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+husbandry+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture%22%5BJournal%5D)">The husbandry of zebrafish (Danio rerio): A review.</a> Aquaculture. 269, 1-20 (2007).</li>
<li>Harper, C., Lawrence, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarper%2C+C+%22The+Laboratory+Zebrafish+%28Laboratory+Animal+Pocket+Reference%29%22">The Laboratory Zebrafish (Laboratory Animal Pocket Reference)</a>. , CRC Press. (2010).</li>
<li>Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNusslein-Volhard%2C+C+%22Zebrafish%2C+A+Practical+Approach%22">Zebrafish, A Practical Approach</a>. , Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book.+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish%22">The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish</a>. , University of Oregon Press. (2007).</li>
<li>Carvalho, P., Arau, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rearing+zebrafish+%28Danio+rerio%29+larvae+without+live+food%3A+evaluation+of+a+commercial%2C+a+practical+and+a+purified+starter+diet+on+larval+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture+Research%22%5BJournal%5D)">Rearing zebrafish (Danio rerio) larvae without live food: evaluation of a commercial, a practical and a purified starter diet on larval performance.</a> Aquaculture Research. 37, 1107-1111 (2006).</li>
<li>Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+behaviour+and+ecology+of+the+zebrafish%2C+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Rev+Camb+Philos+Soc%22%5BJournal%5D)">The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio.</a> Biol Rev Camb Philos Soc. 83 (1), 13-34 (2008).</li>
<li>Best, J., Adatto, I., Cockington, J., James, A., Lawrence, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+rearing+first-feeding+larval+zebrafish%3A+polyculture+with+Type+L+saltwater+rotifers+%28Brachionus+plicatilis%29%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A novel method for rearing first-feeding larval zebrafish: polyculture with Type L saltwater rotifers (Brachionus plicatilis).</a> Zebrafish. 7 (3), 289-295 (2010).</li>
<li>Lawrence, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+zebrafish+husbandry+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Advances in zebrafish husbandry and management.</a> Methods in Cell Biology. 104, 429-451 (2011).</li>
<li>Lawrence, C., Sanders, E., Henry, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+culturing+saltwater+rotifers+%28Brachionus+plicatilis%29+for+rearing+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Methods for culturing saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) for rearing larval zebrafish.</a> Zebrafish. 9, 140-146 (2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Biology+and+Culture+of+Channel+Catfish%22">Biology and Culture of Channel Catfish</a>. Tucker, C. S., Hargreaves, J. A. 34, 634-657 (2004).</li>
</ol>

E.C. Henry jest zatrudniony przez Reed Mariculture, Inc., firmę dostarczającą wrotki, koncentraty alg i inne materiały na rynki akwakultury i ryb.

Pomyślne wdrożenie metody polikultury wrotka do karmienia wczesnych larw danio pręgowanego wymaga skutecznych protokołów dla dwóch zadań: ustanowienia i utrzymania systemu ciągłej hodowli wrotków w celu karmienia ryb oraz hodowli larw danio pręgowanego jako pierwsze karmione wraz z wrotkami w tym samym zbiorniku.
Konfiguracja systemu ciągłej produkcji wrotków morskich dla laboratoriów danio pręgowanego, po raz pierwszy opisana przez Lawrence'a i współautorów14 , została zmodyfikowan...

Danio rerio) jest wybitnym zwierzęciem laboratoryjnym, wykorzystywanym w coraz większej liczbie dyscyplin naukowych, w tym między innymi w genetyce rozwojowej, toksykologii, zachowaniu, akwakulturze, biologii regeneracyjnej i modelowaniu wielu ludzkich zaburzeń 1-5. Chociaż gatunek ten jest stosunkowo łatwy do utrzymania w laboratorium, istnieje szereg wyzwań związanych z zarządzaniem jego hodowlą6. Najbardziej widocznym z nich jest hodowla larw, szczególnie gdy ryby po raz pierwszy zaczynają żerować po napompowaniu pęcherza gazowego7. W normalnych, kontrolowanych warunkach to zdarzenie rozwojowe występuje po ~5 dniach od zapłodnienia (dpf), przy czym następujące po sobie 3-5 dni wzrostu są szczególnie krytyczne7. Główną trudnością techniczną na tym etapie jest odpowiednie zaspokojenie potrzeb żywieniowych pierwszych żerujących larw - elementy paszy muszą być odpowiednio zwymiarowane, strawne, atrakcyjne i dostępne niemal w sposób ciągły, bez tworzenia nadmiernych odpadów w zbiornikach hodowlanych. Historycznie rzecz biorąc, osiągano to zazwyczaj poprzez dostarczanie rybom w zbiornikach wielu małych ilości paszy, wraz z rutynową wymianą wody8,9. Chociaż metody te są do pewnego stopnia skuteczne, są nieefektywne, wymagają dużych nakładów pracy i zwracają tylko zmienne i ograniczone wskaźniki wzrostu iprzeżycia10.
W naturze, larwy danio pręgowanego przypuszczalnie żywią się obfitym małym zooplanktonem obecnym w słupie wody11. Z tego powodu protokoły larwikultury, które obejmują żywe pasze, takie jak pantofelek, wrotki i artemia, są zazwyczaj najbardziej wydajne7. W 2010 roku Best i współautorzy wykazali, że możliwe jest hodowanie larw danio pręgowanego w statycznej, słonawej wodzie wraz z wrotkami słonowodnymi przez pierwsze 5 dni egzogennegożerowania12. To podejście, które wykorzystuje naturalną wysoką produktywność kultur wrotków, aby zapewnić obfitą, wysoce pożywną zdobycz bez zanieczyszczania wody, daje bardzo wysokie wskaźniki wzrostu i przeżywalności larw przy niskim nakładzie pracy12,13. W ostatnich latach coraz więcej laboratoriów na całym świecie przyjęło różne wersje tego protokołu, a wiele z nich obecnie hoduje wrotki w sposób ciągły, aby wspierać systemy szkółkarskie14.
W ciągu ostatnich kilku lat, metody zarówno polikultury rotyferów/danio pręgowanych, jak i produkcji wrotków, zostały udoskonalone i ulepszone, aby stały się bardziej ustandaryzowane i łatwo skalowalne. Ten artykuł zawiera instrukcje krok po kroku dotyczące: 1) ciągłej i solidnej produkcji wrotków oraz 2) ustanowienia systemu polikultury wrotka/danio pręgowanego stosowanego do wspierania silnego wzrostu ryb przez pierwsze 5 dni żywienia egzogennego.

<table><tbody><tr><td>Rotifer Culture Infrastructure</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 L Naczynie hodowlane</td><td>Aquaneering</td><td>Niestandardowe</td><td>naczynie do hodowli z poliwęglanu, ze stożkowym dnem, z zaworem spustowym</td></tr><tr><td>Zestaw wiader do hodowli o pojemności 5 galonów</td><td>Zestaw startowy CCS</td><td>Reed Mariculture</td><td>Naczynie hodowlane o małej objętości dla małych obiektów</td></tr><tr><td>Sztywne przezroczyste rurki 1/2" OD, 36"</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>16025</td><td>Sztywna przezroczysta rurka do dostarczania powietrza</td></tr><tr><td>Rura siatkowa</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>RT444X</td><td>Wspornik rurki siatkowej do filtra nici</td></tr><tr><td>dentystycznej Nić</td> dentystyczna <td>Trzcina Mariculture</td><td>Nić dentystyczna 12" x 42"</td><td>Pułap cząstek stałych</td></tr><tr><td>Perystaltyczna pompa czasowa dozująca, 5 GPD</td><td>Grainger</td><td>38M003&nbsp;</td><td>Pompa dozująca z timerem do dozowania paszy do wrotków</td></tr><tr><td>Perystaltyczna pompa czasowa dozująca, 1-100 ml / h (do hodowli na mniejszą skalę)</td><td>Coral Vue</td><td>SKU: IC-LQD-DSR</td><td>Pompa dozująca z timerem do dozowania paszy do wrotków</td></tr><tr><td>Rurki silikonowe&nbsp;</td><td>Cole Parmer</td><td></td><td>Rurka do dostarczania glonów do naczynia z wrotkiem</td></tr><tr><td>Sztywna przezroczysta rurka "OD", 36"</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>16025</td><td>Sztywna przezroczysta rurka do dostarczania powietrza do pasty z glonów</td></tr><tr><td>Sztywna przezroczysta rurka OD, 36"</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>16025</td><td>Sztywne przezroczyste rurki do dostarczania glonów</td></tr><tr><td>Wrotki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Live Rotifers Brachionus plicatilis Typ L</td><td>Mariculture trzciny</td><td>Typ L 5 milionów</td><td>Hodowla wrotków do uruchomienia systemu</td></tr><tr><td>Rotifer Feed</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydroksymetylosulfonian sodu</td><td>Mariculture</td><td>ClorAm-X&reg; Wanna 1lb</td><td>Reduktor amoniaku do mieszanki paszowej dla alg</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25533B</td><td>bufor pH do mieszanki paszowej dla alg</td></tr><tr><td>Koncentrat mikroalg</td><td>Trzcina Mariculture</td><td>Rotigrow Plus&reg; 1 litrowy worek</td><td>Zoptymalizowana pod względem odżywczym karma dla wrotka</td></tr><tr><td>RG Complete</td><td>Reed Mariculture</td><td>RG Kompletna butelka o pojemności 6 uncji Uniwersalna karma</td> na <td>bazie mikroalg do hodowli na małą skalę</td></tr><tr><td>Przygotowanie wody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Reef Crystals Reef Salt</td><td>That Fish Place</td><td>198210</td><td>Sól do produkcji wody hodowlanej (UWAGA: ta pozycja jest tylko przykładem; można stosować wszelkie preparaty soli wolne od zanieczyszczeń).&nbsp;</td></tr><tr><td>Refraktometr</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>SR6</td><td>mierzący zasolenie</td></tr><tr><td>Sprzęt do hodowli wrotków</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plankton Kolektory o średnicy 12", 53 mikrony</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>BBPC20</td><td>Sito siatkowe do zbierania wrotków</td></tr><tr><td>Podkładki do szorowania</td><td>Pentair Ekosystemy wodne</td><td>SCR-58</td><td>Podkładka do szorowania do czyszczenia wnętrza naczyń hodowlanych</td></tr><tr><td>Wiadro ze szczotką</td><td></td><td></td><td></td>do szorowania</tr><tr><td></td><td>Grainger Dostawa&nbsp;</td><td>43Y530</td><td>Wiadro z podziałką do mieszania wody hodowlanej</td></tr><tr><td>Słoik wylęgowy</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>J30</td><td>Przechowywanie mieszanki paszowej z alg</td></tr><tr><td>Lugol' s Roztwór, rozcieńczony</td><td>Fisher Scientific</td><td>S99481</td><td>Środek stosowany do unieruchamiania żywych wrotków do liczenia</td></tr><tr><td>planktonu Sedgewick-Rafter z siatką&nbsp;</td><td>Pentair Aquatic Eco-Systems</td><td>M415</td><td>Wrotki liczące</td></tr><tr><td>Miscelleneous</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sitko do herbaty</td><td>Kitchenworks</td><td>971972</td><td>Służy do zbierania zarodków danio pręgowanego po tarle</td></tr></tbody></table>

kompletna i zaktualizowana "metoda polikultury wrotka" do hodowli danio pręgowanego po raz pierwszy

The Complete and Updated "Rotifer Polyculture Method" for Rearing First Feeding Zebrafish

Danio pręgowany (Danio rerio) jest organizmem modelowym o rosnącym znaczeniu w wielu dziedzinach nauki. Jednym z najbardziej wymagających aspektów technicznych hodowli tego gatunku w laboratorium jest hodowla larw pierwszego karmienia do stadium młodocianego o wysokich wskaźnikach wzrostu i przeżywalności. Główne wyzwanie związane z zarządzaniem w tym okresie rozwojowym koncentruje się na dostarczaniu rybom wysoce odżywczych składników paszy niemal w sposób ciągły bez uszczerbku dla jakości wody. Ponieważ larwy danio pręgowanego są dobrze przystosowane do żerowania na małym zooplanktonie w słupie wody, żywe zdobycze, takie jak wrotki brachionidy, artemia i pantofelek, są powszechnie uznawane za paszę z wyboru, przynajmniej do czasu, gdy ryby osiągną stadium młodociane i będą w stanie efektywnie żywić się przetworzoną dietą. Protokół ten opisuje metodę, za pomocą której nowo wyklute larwy danio pręgowanego są hodowane razem z żywymi wrotkami morskimi (Brachionus plicatilis) w tym samym systemie. To podejście oparte na polikulturze zapewnia rybom "na żądanie", bogate w składniki odżywcze źródło żywego pokarmu bez wytwarzania odpadów chemicznych na poziomach, które w przeciwnym razie ograniczałyby wydajność. Co ważne, ponieważ system wykorzystuje zarówno naturalną, wysoką produktywność wrotków, jak i preferencje behawioralne ryb, nakład pracy związany z konserwacją jest niewielki. Poniższy protokół szczegółowo opisuje zaktualizowaną procedurę krok po kroku, która obejmuje produkcję wrotków (skalowalną do dowolnego pożądanego poziomu) do stosowania w polikulturze larw danio pręgowanego i wrotków, która promuje maksymalną wydajność w ciągu pierwszych 5 dni egzogennego karmienia.

Opisany tutaj system ciągłej hodowli wrotków jest dynamiczny i naturalne jest, że liczebność wrotków ulega niewielkim wahaniom w czasie, jeśli występują różnice w dziennych dawkach pokarmu i tempie zbiorów. Populację wrotków w jednej z aktywnych kultur w placówkach akwakultury w Boston Children's Hospital, utrzymywaną w opisany wyżej sposób, monitorowano przez 30 dni (Rysunek 3). Średnia gęstość hodowli w tym okresie wynosiła 932 rotifers/mL, przy maksymalnej wartości 1,3...

Larwy danio pręgowanego są przystosowane do żywienia się zooplanktonem. Możliwe jest wykorzystanie tej naturalnej cechy w laboratorium, hodując najpierw ryby karmione razem w tym samym systemie z żywymi wrotkami słonowodnymi. Ta strategia "polikultury" sprzyja wysokiemu wzrostowi i przetrwaniu przy minimalnym nakładzie pracy i zakłóceniach dla larw.

Kompletna i zaktualizowana "metoda polikultury wrotka" do hodowli danio pręgowanego po raz pierwszy

The zebrafish (Danio rerio) is a model organism of increasing importance in many fields of science.  One of the most demanding technical aspects of ...

Ogólnym celem metody polikultury wrotka jest wykorzystanie naturalnej produktywności i cech biologicznych wrotków słonowodnych w celu stworzenia środowiska sprzyjającego szybkiemu wzrostowi i maksymalnej przeżywalności larw danio pręgowanego po raz pierwszy. Główną zaletą tej techniki jest to, że radykalnie zmniejsza ilość czasu i przestrzeni potrzebnej do pomyślnego wyhodowania dużej liczby larw danio pręgowanego do wykorzystania w eksperymentach badawczych. Rozpocznij konserwację kultur wrotka, napełniając naczynie hodowlane lub FCV do 90 procent pojemności czystą, odchlorowaną słodką wodą z dozownikiem 10 gramów na litr soli akwariowych.Upewnij się, że woda jest dokładnie wymieszana i że cała sól jest całkowicie rozpuszczona. Następnie ustaw przepływ powietrza do naczynia tak, aby utrzymywało wrzenie. Zmierz zasolenie cieczy za pomocą refraktometru.Następnie należy pobrać próbki wrotków w naczyniu hodowlanym lub CV. Upewnij się, że kultura jest dobrze wymieszana. Następnie zbierz trzy dwu- lub trzymililitrowe próbki za pomocą pipety transferowej z różnych części kultury i połącz próbki w probówce. Przenieść od jednego do dwóch mililitrów połączonej próbki na szalkę Petriego.Wizualizuj próbkę pod mikroskopem preparacyjnym i sprawdź jakość hodowli. Dodaj 100 mikrolitrów 50-procentowego roztworu jodu Lugola do próbki, aby unieruchomić wrotki i policzyć je. Natychmiast pobrać dwumililitrową podpróbkę za pomocą plastikowej pipety i dozować jeden mililitr do szkiełka do liczenia krokwi Sedgewick.Za pomocą mikroskopu preparacyjnego policz tyle powierzchni szkiełka, ile potrzeba, aby policzyć do 100 nienaruszonych wrotków i całkowitą liczbę jaj przyczepionych do wrotków. Następnie oblicz liczbę wrotków na mililitr do późniejszego wykorzystania. Rozpocznij zbiory, wyjmując dopływ powietrza i filtr nici dentystycznej.Powoli otwórz zawór w dolnej części CV i pozwól, aby woda delikatnie spłynęła do kolektora planktonu z siatką o oczkach 53 mikronów. Zbierz wodę wypływającą z dna kolektora po przefiltrowaniu do wiadra lub spuszczeniu. Następnie napełnij butelkę 10 do 15 gramami na litr czystej słonej wody.Odwróć sitko nad FCV i umyj wrotki w FCV delikatnym strumieniem słonej wody. Uruchom programowalny timer dozowania lub PMT, aby dostarczyć paszę do FCV. Następnie wyszoruj całe wnętrze CV czystym padem do szorowania.Utwórz nową mieszankę 15 gramów na litr w wiadrze o pojemności pięciu galonów, aby zastąpić objętość wody utraconej podczas zbiorów. Energicznie mieszaj roztwór, aż mieszanina całkowicie się rozpuści. Następnie dodaj roztwór do CV. Następnie przepłucz filtr nici dentystycznej sprayem pod wysokim ciśnieniem.Gdy filtr nici dentystycznej jest wolny od zanieczyszczeń, należy go umieścić z powrotem w CV.Dostosuj dawki podawania glonów dostarczanych do CV, zmieniając czas trwania każdego dozowania. Po 24 godzinach powtórz proces, rozpoczynając zbiór wrotków pozostających w FCV. Skoncentruj wrotki w dwóch litrach świeżej, czystej, odchlorowanej wody z pięcioma gramami soli na litr.Mogą one być przechowywane w temperaturze czterech stopni Celsjusza jako zapas lub wykorzystywane do karmienia ryb w późniejszych stadiach poza tym, co opisano w tym protokole. Zbierz zarodki danio pręgowanego z tarła, przelewając zarodki z tarła przez sitko do herbaty. A następnie delikatnie spłukując sterylną wodą rybną z butelki do mycia na szalki Petriego.Po zebraniu wszystkich zarodków należy je wysiadywać. Rozpocznij fazę polikultury, gdy ponad 90 procent wyklutych larw aktywnie pływa w słupie wody. Dodaj 500 mililitrów kultury wrotka bezpośrednio z FCV do 3,5-litrowego zbiornika szkółkarskiego.Następnie delikatnie wlej larwy z jednej szalki Petriego do zbiornika szkółkarskiego. Upewnij się, że w naczyniu nie pozostały żadne larwy. Dodaj 500 mililitrów czystej, kondycjonowanej wody dla ryb z dedykowanego źródła wody do zbiornika do końcowej objętości jednego litra i 5 gramów na litr końcowego zasolenia.Obserwuj zbiornik polikulturowy co najmniej raz dziennie, aby upewnić się, że wrotki i ryby są obecne i rosną. Sprawdź, czy wrotki są widoczne w całym słupie wody. Upewnij się, że ryby są również widoczne w słupie wody i że pływają wśród wrotków.Bardzo ważne jest, aby codziennie oceniać stan każdego zbiornika, aby upewnić się, że żyją i pływają z wrotkami dostępnymi dla wszystkich larw ryb. Po upewnieniu się, że wrotki i ryby rosną, rozpocznij normalny przepływ wody przez zbiornik. Na koniec umieść sitko nad otworem spustowym, aby upewnić się, że larwy nie zostaną wypłukane ze zbiornika.Typowa wydajność hodowli wrotków była monitorowana przez okres 30 dni i uzyskała średnią gęstość hodowli 932 wrotki na mililitr. I maksymalnie 1 330 wrotków na mililitr. Populacja wrotka w zbiorniku polikulturowym z danio pręgowanym ma średnią gęstość wrotka wynoszącą 589,4 wrotka na mililitr.Minimalna wartość 481 wrotków na mililitr jest 10 razy lepsza niż wcześniej opublikowane prace. Danio pręgowany wykazywał stały wzrost każdego dnia przez okres pięciu dni od średniej całkowitej długości 3,9 milimetra do 5,4 milimetra. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak hodować wrotki do użytku w systemie polikultury, który został opracowany w celu spełnienia wymagań żywieniowych danio pręgowanego karmionego po raz pierwszy.

the-complete-updated-rotifer-polyculture-method-for-rearing-first

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejszy protokół opisuje regularną konserwację i pielęgnację w celu utrzymania optymalnych warunków chowu danio pręgowanych. Film przedstawia procedurę konserwacji systemu, bieżącego utrzymania, karmienia, rozrodu oraz hodowli larw danio pręgowanych.

Regularna pielęgnacja i konserwacja laboratorium rybek danio (Danio rerio): wprowadzenie

Obiekt dla danio pręgowanego nadający się do hodowli i badań in vivo jest zbudowany w łatwy i niedrogi sposób. Konserwacja jest minimalna. To miejsce jest idealne do angażowania studentów i niezależnych badań.

Budowa niedrogiego i łatwego w budowie obiektu do połowu danio pręgowanego

Trwałe zwłóknienie z odkładaniem się nadmiernej ilości białek macierzy zewnątrzkomórkowej prowadzi do marskości wątroby. Nadużywanie alkoholu jest jedną z głównych przyczyn ciężkich chorób wątroby. Stworzyliśmy model zwłóknienia wątroby danio pręgowanego indukowanego etanolem, aby zbadać mechanizmy i strategie promowania regeneracji hepatocytów po uszkodzeniu wywołanym alkoholem.

Opracowanie modelu zwłóknienia wątroby indukowanego etanolem u danio pręgowanego w celu zbadania regeneracji hepatocytów za pośrednictwem komórek progenitorowych

Danio pręgowany był ostatnio używany jako system modelowy in vivo do badania czasu replikacji DNA podczas rozwoju. Poniżej znajdują się szczegółowe protokoły wykorzystania zarodków danio pręgowanego do profilowania czasu replikacji. Protokół ten można łatwo dostosować do badania czasu replikacji u mutantów, poszczególnych typów komórek, modeli chorób i innych gatunków.

Profilowanie czasu replikacji DNA przy użyciu danio pręgowanego jako systemu modelowego in vivo

Przedstawiamy skuteczny i łatwy w użyciu protokół do przygotowania pierwotnych hodowli komórkowych zarodków danio pręgowanego do transfekcji i obrazowania żywych komórek, a także protokół do przygotowania pierwotnych komórek z mózgu dorosłego danio pręgowanego.

Hodowla i transfekcja komórek pierwotnych danio pręgowanego

Celem tego protokołu jest zmierzenie czasu przejścia fluorescencyjnie znakowanego pokarmu przez jelita larw danio pręgowanego w sposób wysokoprzepustowy.

Wysokoprzepustowy pomiar czasu pasażu jelitowego przy użyciu larw danio pręgowanego

Ta praca opisuje protokół dla modułowego systemu transgenezy Tol2, metody klonowania opartej na bramie, służącej do tworzenia i wstrzykiwania transgenicznych konstruktów do embrionów zebranego.

System Danio pręgowanego Tol2: modułowe i elastyczne podejście do transgenezy oparte na bramce

Ten protokół przedstawia podstawowe kroki do uzyskania wolnych od zarazków (GF) zarodków ryb i utrzymania ich od larw do stadium młodocianego, w tym pobieranie próbek i wykrywanie ich sterylnego statusu. Zastosowanie modeli GF w przypadku infekcji jest ważne dla zrozumienia roli drobnoustrojów w zdrowiu gospodarza.

Generowanie, utrzymanie i identyfikacja wolnych od zarazków modeli danio pręgowanego od larw do stadiów młodocianych

Przedstawiamy tutaj nowy, łatwy w budowie i nisko kosztowy protokół dotyczący obiegowego hodowania rybki labiryntowej.

System do hodowania ryb cebra z recyrkulacją wody

Badanie najwcześniejszych zdarzeń progresji komórek przednowotworowych i interakcji wrodzonych komórek odpornościowych jest kluczowe dla zrozumienia i leczenia raka. W tym miejscu opisujemy metodę warunkowego wywoływania przemian komórek nabłonkowych i późniejszego obrazowania na żywo interakcji wrodzonych komórek odpornościowych z komórkami skóry wyrażającymi HRASG12V u larw danio pręgowanego.

Obrazowanie na żywo interakcji między komórkami immunologicznymi i przednowotworowymi przy użyciu indukowalnego systemu ekspresji Gal4/UAS w skórze larw danio pręgowanego

Poznaj metodę polikultury wrotka do hodowli larw danio pręgowanego, która zwiększa przeżywalność i przyspiesza wzrost. Technika ta znacząco redukuje zasoby potrzebne do badań rozwojowych.

Kompletna i zaktualizowana "metoda polikultury wrotka" do hodowli danio pręgowanego po raz pierwszy

Przeglądaj więcej filmów