Name: Zubożenie komórek myszy z ludzkich ksenoprzeszczepów nowotworowych znacznie poprawia dalszą analizę komórek docelowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Poznaj metodę izolacji ludzkich komórek nowotworowych z ksenoprzeszczepów myszy przy użyciu sortowania magnetycznego z przeciwciałami anti-mouse. Technika ta eliminuje zanieczyszczenie komórkami myszy, poprawiając jakość analiz ekspresji genów i sekwencjonowania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Jesteśmy wdzięczni Janinie Kuhl, Nadine Chelius, Petrze Kussmann, Lenie Willnow i Dorothee Lenhard za doskonałą pomoc techniczną.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z lokalnymi wytycznymi etycznymi i prawnymi Regierungspräsidium Freiburg Referat 35.
1. Przygotowanie odczynnika
UWAGA: Przed rozpoczęciem eksperymentu przygotuj następujące odczynniki z zestawu dysocjacyjnego:
<ol>
	<li>Aby przygotować enzym H, rozpuścić każdą fiolkę liofilizowanego proszku w 3 ml RPMI 1640, Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) lub zmodyfikowanej pożywki Eagle (DMEM) firmy Dulbecco. Aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania, należy przygotować odpowiednie porcje (np. 200 μl) i przechowywać je w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy.</li>
	<li>Aby przygotować enzym R, rozpuścić fiolkę z liofilizowanym proszkiem w 2,7 ml pożywki RPMI lub DMEM. Aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania, należy przygotować odpowiednie porcje (np. 100 μl) i przechowywać je w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy.</li>
	<li>Aby przygotować enzym A, rozpuścić fiolkę z liofilizowanym proszkiem w 1 ml buforu A dostarczonego z zestawem bez wirowania. Aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania, należy przygotować odpowiednie porcje (np. 25 μl) i przechowywać je w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy. Należy upewnić się, że zawiesina ta została dokładnie wymieszana bezpośrednio przed pobraniem wymaganej objętości reakcji.</li>
	<li>Przygotować 250 ml buforu (1x PBS z 0,5% BSA) do procedury separacji komórek i barwienia przeciwciał. 
	UWAGA: Podczas hodowli komórek po usunięciu komórek myszy przefiltruj wszystkie i roztwory enzymów przez filtr 0,22 μm.</li>
</ol>
2. Protokół dysocjacji guza
UWAGA: W tym badaniu użyto ksenoprzeszczepów niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC), raka nerki i pęcherza moczowego. Guzy zostały wygenerowane przez wszczepienie ksenoprzeszczepów niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC), raka nerki i pęcherza moczowego u 4-6 tygodniowych samic myszy NMRI nu / nu, jak opisano wcześniej13, 
UWAGA: Ponieważ protokół ten jest całkowicie niezależny od typu nowotworu, może być stosowany do każdego rodzaju guza pochodzącego z pacjenta lub linii komórkowej, a także innych rodzajów ludzkich tkanek ksenotransplantowanych bez modyfikacji protokołu.
<ol>
	<li>Przygotować 5 ml mieszanki wytrawiającej na próbkę tkanki (do 1 g) na świeżo, dodając 4,7 ml RPMI 1640 lub DMEM, 200 μl enzymu H, 100 μl enzymu R i 25 μl enzymu A do probówki dysocjacyjnej (probówki C). Upewnij się, że dokładnie wymieszałeś zawiesinę enzymu R przed pobraniem wymaganej objętości.</li>
	<li>Złóż zwierzęta w ofierze przez zwichnięcie szyjki macicy w znieczuleniu. Zdezynfekuj mysz poprzez spryskanie niewielką ilością etanolu 80% v/v.</li>
	<li>Zbierz podskórny guz z boku myszy za pomocą kleszczy i nożyczek w kapturze do hodowli tkankowej. Przeciąć skórę w miejscu guza za pomocą nożyczek, a następnie oddzielić guz od sąsiedniej zdrowej tkanki za pomocą kleszczy i nożyczek. 
	UWAGA: W zależności od celu eksperymentu wykonaj ten i kolejne kroki w warunkach aseptycznych. W tym badaniu wszystkie etapy przeprowadzono w kapturze do hodowli komórkowej w warunkach aseptycznych, aby móc hodować komórki.</li>
	<li>Przygotuj próbkę guza do trawienia, usuwając tłuszcz (ponieważ spowoduje to, że próbka będzie unosić się na wodzie) i obszary martwicze (ponieważ spowoduje to zmniejszenie żywotności), odcinając ją za pomocą kleszczy i skalpela. Tkankę zmielić na kawałki o grubości 2 - 4 mm za pomocą skalpeli i kleszczy.</li>
	<li>Przenieś kawałki tkanki do probówki C zawierającej mieszankę do wytrawiania.</li>
	<li>Zamknij rurkę C i upewnij się, że jest szczelnie zamknięta. Przymocuj go do góry nogami na tulei stołowego dysocjatora tkanek i upewnij się, że kawałki tkanki znajdują się w obszarze wirnika/stojana.</li>
	<li>Wybierz tryb "h_tumor_01", naciskając przycisk "w górę" lub "w dół", aż tryb pojawi się na wyświetlaczu, a następnie naciskając przycisk "start".
	<ol>
		<li>Jeśli korzystasz z funkcji podgrzewania dysocjatora tkanek na stole, pamiętaj również o podłączeniu grzejnika. Następnie uruchom tryb 37C_h_TDK_1 (dla guzów miękkich), 37C_h_TDK_2 (dla średnich guzów) lub 37C_h_TDK_3 (dla guzów twardych), klikając symbol folderu na ekranie dotykowym, aż pojawi się folder "Miltenyi".</li>
		<li>Aby wybrać tryb, klikaj strzałkę w górę lub w dół, aż zostanie podświetlony 37C_h_TDK_2 trybu dysocjacji. Rękawy stacjonarnego dysocjatora tkanek są przedstawione jako pozycje na wyświetlaczu urządzenia. Wybierz pozycje, na których są uruchamiane próbki, klikając je na ekranie dotykowym. Naciśnij "start", aby uruchomić tryb i kontynuuj krok 2.16. 
		UWAGA: W zależności od typu nowotworu odpowiedni może być inny program dysocjacji (patrz krok 2.7.1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obserwuj okno pokazujące "Zakończenie programu" na ekranie. Po zakończeniu programu odłącz rurkę C od stacjonarnego dysocjatora tkankowego.</li>
	<li>Inkubować próbkę przez 30 minut w temperaturze 37 °C w ciągłym obracaniu, np. za pomocą rotatora probówkowego.</li>
	<li>Po inkubacji przymocuj rurkę C do góry nogami na tulei stołowego dysocjatora tkanek. Ponownie upewnij się, że materiał próbki znajduje się w obszarze wirnika/stojana.</li>
	<li>Uruchom program dysocjacji h_tumor_02 (dla guzów miękkich i średnich) lub h_tumor_01 (dla guzów twardych) zgodnie z opisem w kroku 2.7.1.</li>
	<li>Po zakończeniu programu odłącz rurkę C od stacjonarnego dysocjatora tkankowego.</li>
	<li>Inkubować próbkę przez 30 minut w temperaturze 37 °C w ciągłej rotacji.</li>
	<li>Po inkubacji przymocuj rurkę C do góry nogami na tulei laboratoryjnego dysocjatora tkanek. Ponownie upewnij się, że materiał próbki znajduje się w obszarze wirnika/stojana.</li>
	<li>Uruchom program dysocjacji h_tumor_03 (w przypadku guzów miękkich), h_tumor_02 (w przypadku guzów średnich) lub h_tumor_01 (w przypadku guzów twardych) zgodnie z opisem w kroku 2.7.</li>
	<li>Aby pobrać materiał próbki na dno probówki, należy przeprowadzić krótki etap wirowania (przy 100 x g przez 10 sekund).</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki i nałożyć na sitko o wielkości 70 μm nesh umieszczone w probówce o pojemności 50 ml. Umyj sitko komórkowe 20 ml RPMI 1640 lub DMEM.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórek w dawce 300 x g przez 7 min. Całkowicie odessać supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 5 ml buforu w celu zliczenia. Kontynuuj zubożanie komórek myszy przez magnetyczną separację komórek (sekcja 3).</li>
</ol>
3. Zubożenie komórek myszy przez technologię magnetycznej separacji komórek
UWAGA: Objętości do oznaczania magnetycznego podane poniżej dotyczą do 2 x 106 komórek nowotworowych lub 107 komórek ogółem, w tym czerwonych krwinek. W zależności od wielkości guza zostanie uzyskana mniejsza lub wyższa liczba komórek. W przypadku mniejszej liczby komórek należy użyć tych samych woluminów, jak wskazano. W przypadku używania większej liczby komórek należy odpowiednio zwiększyć wszystkie objętości odczynników i objętości całkowite (np. w przypadku komórek nowotworowych 4 x 106 lub 2 x 107 komórek ogółem należy użyć podwójnej objętości wszystkich wskazanych objętości odczynników i objętości całkowitych).
<ol>
	<li>Oznaczyć numer komórki podwielokrotności z zawiesiny komórek w kroku 2.21 za pomocą mikroskopu i odpowiedniej komory do liczenia. 
	UWAGA: W tym momencie zawiesina komórkowa składa się z niejednorodnej mieszaniny ludzkich komórek nowotworowych, a także mysich komórek zrębu i krwi, w tym czerwonych krwinek. Skład komórek silnie zależy od typu guza i regionu do przeszczepu.</li>
	<li>Podczas wykonywania analizy cytometrii przepływowej po usunięciu komórek myszy należy pobrać 100 μl podwielokrotności do odpowiednich probówek do niebarwionego i dwóch jednokolorowych barwień kontrolnych do analizy cytometrii przepływowej. Przechowywać je w lodówce w temperaturze 2 - 8 °C do czasu dalszych etapów barwienia (punkt 4).</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórek w sile 300 x g przez 10 min. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 80 μl buforu na 2 x 106 komórek nowotworowych lub 107 komórek ogółem Dodaj 20 μl odczynnika do znakowania magnetycznego dla komórek myszy.</li>
	<li>Dobrze wymieszać i inkubować przez 15 minut w lodówce (2 - 8 °C). Podczas etykietowania magnetycznego należy przygotować kolumny o dużej skali (kolumny LS) do separacji magnetycznej, umieszczając je w polu magnetycznym odpowiedniego magnesu (patrz Tabela Materiałów i Wyposażenia) zgodnie z protokołem producenta. Przepłukać kolumnę 3 ml buforu.</li>
	<li>Dostosuj objętość próbki do 500 μl za pomocą buforu dla maksymalnie 2 x 106 komórek nowotworowych lub do 107 komórek ogółem. (Do 1 x 107 komórek nowotworowych lub do 5 x 107 całkowitych komórek może być przetwarzanych na jednej kolumnie LS. Podczas pracy z większą liczbą komórek podziel próbkę na wiele kolumn LS).
	<ol>
		<li>Wykonując analizę cytometryczną przepływową, analizę molekularną lub porównując frakcje w kulturach, należy pobrać 50 μl podwielokrotności jako próbkę niesortowaną. Przechowywać w lodówce w temperaturze 2 - 8 °C do czasu dalszej obróbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nałożyć 500 μl zawiesiny komórek na wcześniej przygotowaną kolumnę. Zebrać przepływowe zawierające nieznakowane komórki docelowe, reprezentujące wzbogacone ludzkie komórki nowotworowe. 
	UWAGA: Podczas pracy z większą liczbą komórek do jednej kolumny można nałożyć do 2,5 ml zawiesiny komórek, która została przygotowana zgodnie z krokiem 3.5.</li>
	<li>Przemyć kolumnę 2 x 1 ml buforu. Zbierz komórki, które przechodzą i połącz je z przepływem z kroku 3.6. Wykonać etapy mycia, dodając 1 ml podwielokrotności buforu, gdy tylko zbiornik kolumny będzie pusty. 
	UWAGA: Przepływ zawiera oczyszczone ludzkie komórki nowotworowe.</li>
	<li>Aby również zebrać komórki myszy zatrzymane w kolumnie, wyjmij kolumnę z separatora i umieść ją na odpowiedniej probówce. Odpipetować 3 ml buforu na kolumnę i natychmiast użyć tłoka, aby wypłukać komórki myszy, mocno wciskając go do kolumny.</li>
	<li>Odwirować frakcje i próbki kontrolne w temperaturze 300 x g przez 10 minut. Całkowicie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w buforze, pożywce hodowlanej lub granulce do zamrażania w ciekłym azocie, w zależności od pożądanego dalszego zastosowania.</li>
</ol>
4. Dalsze analizy
<ol>
	<li>Barwienie do analizy metodą cytometrii przepływowej 
	UWAGA: Przed przeprowadzeniem dalszych analiz część komórek uzyskanych w wyniku procedury zubożenia komórek myszy może być analizowana (np. ocena czystości i wydajności) w cytometrii przepływowej.
	<ol>
		<li>W przypadku analiz cytometrycznych przepływowych należy odwirować co najmniej 10 % frakcji ujemnej i dodatniej otrzymanej z procedury magnetycznego rozdzielania komórek (sekcja 3), jak również próbki kontrolne z etapów 3.2 i 3.5 przy 300 x g przez 10 minut.</li>
		<li>Odrzucić supernatant. Zawiesić osad komórkowy próbek kontrolnych barwienia z etapu 3.2 w 90 μl buforu. Zawiesić frakcje otrzymane w procesie magnetycznego rozdzielania komórek w 80 μl buforu.</li>
		<li>Dodać 10 μl mysiego odczynnika blokującego FcR do wszystkich próbek. Dobrze wymieszać i inkubować przez 5 minut w temperaturze 2 - 8 °C w lodówce.</li>
		<li>Dodać 10 μl anty-ludzkiego EpCAM-PE (równa się rozcieńczeniu przeciwciała 1:10) i 25 μl koktajlu anty-mysiego APC (równa się rozcieńczeniu przeciwciała 1:4) do próbek z sekcji 3. Dodać 10 μl anty-ludzkiego EpCAM-PE do jednej próbki kontrolnej koloru (równa się rozcieńczeniu przeciwciała 1:10) i 10 μl anty-ludzkiego EpCAM-APC do drugiej (równa się rozcieńczeniu przeciwciała 1:10). Wymieszać wszystkie próbki i inkubować przez 10 minut w temperaturze 2 - 8 °C w lodówce. 
		UWAGA: EpCAM nie nadaje się jako marker komórek nowotworowych żadnego typu nowotworu. Dla nowotworów wykorzystanych w tym badaniu znana była ekspresja EpCAM.</li>
		<li>Aby przepłukać próbki, dodać po 1 ml buforu i wirować w masie 300 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy do stężenia do analizy metodą cytometrii przepływowej. Aby wykluczyć martwe komórki, dodać jodek propidyny (1 μg/ml).</li>
		<li>Przeprowadzić analizę cytometrii przepływowej przy użyciu odpowiedniego cytometru przepływowego zgodnie z protokołami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowla ludzkich komórek nowotworowych 
	UWAGA: Oprócz cytometrii przepływowej, komórki uzyskane w procesie separacji mogą być hodowane i wykorzystywane do dalszych testów in vitro.
	<ol>
		<li>Zawiesić posortowaną frakcję z sekcji 3 w pożywce do stężenia 5 x 105 komórek/ml. 
		UWAGA: W zależności od rodzaju powłoki guza, odpowiednia gęstość siewu i warunki uprawy mogą się różnić.</li>
		<li>Dodać 500 μl zawiesiny komórkowej do studzienek 24-dołkowej płytki pokrytej 0,1% żelatyną.</li>
		<li>Inkubować komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5%. 
		UWAGA: Optymalne warunki hodowli zależą od zastosowanego typu nowotworu. Dlatego należy zastosować warunki hodowli odpowiednie dla zastosowanego typu nowotworu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie immunofluorescencyjne hodowanych komórek
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwór blokujący, dodając 10% FCS i 0,1% Triton X-100 do 1x PBS.</li>
		<li>Odrzuć pożywkę hodowlaną. Dodaj 500 μl 1x PBS na studzienkę, aby przepłukać komórki. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej (RT), a następnie całkowicie odrzucić 1x PBS.</li>
		<li>Napraw komórki, dodając 300 μl 4% roztworu PFA. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
		<li>Wyrzuć roztwór PFA. Umyj stałe komórki 3 razy, jak wskazano w kroku 4.3.2.</li>
		<li>Przeprowadź przepuszczalność i blokowanie, dodając 300 μl bloku na studzienkę. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
		<li>Odrzuć roztwór blokujący. Umyj komórki, jak wskazano w kroku 4.3.2.</li>
		<li>Dodać do komórek 300 μl przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w roztworze blokującym. Przeciwciało anty-ludzkie EpCAM rozcieńcza się w stosunku 1:40, przeciwciało Vimentin rozcieńcza się w stosunku 1:200. Inkubować przez noc w temperaturze 2 - 8 °C. 
		Uwaga: Stosowane przeciwciała nie są odpowiednie dla żadnego typu nowotworu, ponieważ EpCAM może nie ulegać ekspresji na komórkach nowotworowych i/lub wimentyna jest również wyrażana przez komórki nowotworowe. Upewnij się, że użyte przeciwciała są odpowiednie dla modelu ksenoprzeszczepu.</li>
		<li>Odrzucić roztwór przeciwciał pierwotnych. Umyj komórki 3 razy, jak wskazano w kroku 4.3.2.</li>
		<li>Dodać do komórek 300 μl przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego w roztworze blokującym. Oba przeciwciała, anty-królicze IgG-Alexe594 i anty-mysie IgG-Alexa488 rozcieńcza się w stosunku 1:400. Inkubować przez 1 godzinę w ciemności w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odrzucić drugorzędowy roztwór przeciwciała. Umyj komórki 2 razy, jak wskazano w kroku 4.3.2.</li>
		<li>Dodać 300 μl roztworu DAPI (0,1 μg/ml) do każdego dołka. Inkubować przez 10 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odrzuć roztwór DAPI. Umyj komórki 3 razy, jak wskazano w kroku 4.3.2.</li>
		<li>Dodaj 500 μl 1x PBS do każdej studzienki. Wykonaj mikroskopię fluorescencyjną przy użyciu odpowiedniego mikroskopu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sekwencjonowanie całego egzomu
	<ol>
		<li>W przypadku sekwencjonowania całego eksomu (WES) należy zamrozić granulki z kroku 3.9 w ciekłym azocie. Przechowywać i pobierać próbki w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Po pobraniu komórek należy przeprowadzić wychwyt egzomu i sekwencjonowanie całego egzomu zgodnie z instrukcjami producenta odpowiedniego zestawu (patrz Tabela materiałów i wyposażenia).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Daniel, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primary+xenograft+model+of+small-cell+lung+cancer+reveals+irreversible+changes+in+gene+expression+imposed+by+culture+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A primary xenograft model of small-cell lung cancer reveals irreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro.</a> Cancer Res. 69 (8), 3364-3373 (2009).</li>
<li>Tentler, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+tumour+xenografts+as+models+for+oncology+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development.</a> Nat Rev Clin Oncol. 9 (6), 338-350 (2012).</li>
<li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology%2C+growth%2C+metastasis+and+disease+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nat Med. 17 (11), 1514-1520 (2011).</li>
<li>Siolas, D., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+tumor+xenografts%3A+transforming+clinical+samples+into+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models.</a> Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).</li>
<li>Wong, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted-capture+massively-parallel+sequencing+enables+robust+detection+of+clinically+informative+mutations+from+formalin-fixed+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Targeted-capture massively-parallel sequencing enables robust detection of clinically informative mutations from formalin-fixed tumours.</a> Sci Rep. 3, 3494(2013).</li>
<li>Sausville, E. A., Burger, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+human+tumor+xenografts+to+anticancer+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Contributions of human tumor xenografts to anticancer drug development.</a> Cancer Res. 66 (7), 3351-3354 (2006).</li>
<li>Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+in+vivo+xenograft+tumor+model+for+predicting+chemotherapeutic+drug+response+in+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients.</a> Clin Pharmacol Ther. 85 (2), 217-221 (2009).</li>
<li>Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+from+human+blastocysts%3A+somatic+differentiation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro.</a> Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).</li>
<li>Merk, J., Rolff, J., Becker, M., Leschber, G., Fichtner, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenografts+of+non-small-cell+lung+cancer%3A+a+pre-clinical+model+to+evaluate+adjuvant+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cardiothorac+Surg%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenografts of non-small-cell lung cancer: a pre-clinical model to evaluate adjuvant chemotherapy.</a> Eur J Cardiothorac Surg. 36 (3), 454-459 (2009).</li>
<li>Baiocchi, M., Biffoni, M., Ricci-Vitiani, L., Pilozzi, E., De Maria, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+models+for+cancer+research%3A+human+cancer+stem+cell+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">New models for cancer research: human cancer stem cell xenografts.</a> Curr Opin Pharmacol. 10 (4), 380-384 (2010).</li>
<li>Gires, O., Stoecklein, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+EpCAM+expression+on+circulating+and+disseminating+tumor+cells%3A+causes+and+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Dynamic EpCAM expression on circulating and disseminating tumor cells: causes and consequences.</a> Cell Mol Life Sci. 71 (22), 4393-4402 (2014).</li>
<li>Zhang, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+effect+of+the+gamma-secretase+inhibitor+PF-03084014+and+docetaxel+in+breast+cancer+models%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Synergistic effect of the gamma-secretase inhibitor PF-03084014 and docetaxel in breast cancer models.</a> Stem Cells Transl Med. 2 (3), 233-242 (2013).</li>
<li>Boven, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+II+preclinical+drug+screening+in+human+tumor+xenografts%3A+a+first+European+multicenter+collaborative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Phase II preclinical drug screening in human tumor xenografts: a first European multicenter collaborative study.</a> Cancer Res. 52 (21), 5940-5947 (1992).</li>
<li>Agorku, D., Hardt, O., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAgorku%2C+D+%22Depletion+of+mouse+cells+from+human+tumor+xenografts+significantly+reduces+bias+in+molecular+analysis+and+improves+culture+of+target+cells.+Abstract+95%22">Depletion of mouse cells from human tumor xenografts significantly reduces bias in molecular analysis and improves culture of target cells. Abstract 95</a>. , AACR. (2014).</li>
<li>Agorku, D., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAgorku%2C+D+%22Next-generation+sequencing+of+human+tumor+xenografts+is+significantly+improved+by+prior+depletion+of+mouse+cells.+Abstract+1455%22">Next-generation sequencing of human tumor xenografts is significantly improved by prior depletion of mouse cells. Abstract 1455</a>. , AACR. (2015).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li>
<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).</li>
<li>Koboldt, D. C., Larson, D. E., Wilson, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+VarScan+2+for+Germline+Variant+Calling+and+Somatic+Mutation+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Using VarScan 2 for Germline Variant Calling and Somatic Mutation Detection.</a> Curr Protoc Bioinformatics. 44, (2013).</li>
<li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+viewer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics viewer.</a> Nat Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).</li>
<li>Aloia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sialyl-glycolipid+stage-specific+embryonic+antigen+4+marks+a+subpopulation+of+chemotherapy-resistant+breast+cancer+cells+with+mesenchymal+features%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The sialyl-glycolipid stage-specific embryonic antigen 4 marks a subpopulation of chemotherapy-resistant breast cancer cells with mesenchymal features.</a> Breast Cancer Res. 17 (1), 146(2015).</li>
</ol>

David Agorku, Stefan Tomiuk, Stefan Wild, Silvia Rüberg, Lisa Zatrieb, Andreas Bosio i Olaf Hardt są lub byli pracownikami Miltenyi Biotec GmbH, Niemcy. Kerstin Klingner i Julia Schüler są pracownikami firmy Oncotest GmbH z Niemiec.

Opracowaliśmy szybką i łatwą metodę izolowania nietkniętych ludzkich komórek nowotworowych z ksenoprzeszczepowanej tkanki nowotworowej. Procedura ta opiera się na kompleksowym zubożeniu komórek pochodzenia mysiego poprzez połączenie automatycznej dysocjacji tkanek i magnetycznego sortowania komórek. Oprócz zubożenia wszystkich komórek myszy, znacznie zmniejsza się również ilość martwych komórek i szczątków we frakcji komórek docelowych. Podsumowując, metoda ta znacznie usprawnia dalsze analizy molekularne i hodowlę ludzkich komórek nowotworowych.
W przeciwieństwie do metod alternatywnych, nie ma potrzeby posiadania wiedzy na temat markerów specyficznych dla komórek nowotworowych, dostosowywania się do różnych składów komórek myszy ani ustanawiania algorytmów. Przedstawiona metoda jest niezależna od szczepu myszy i typu nowotworu. W związku z tym unika się błędu systematycznego poprzez izolację ludzkich subpopulacji nowotworów na podstawie pojedynczych markerów specyficznych dla człowieka, które mogą różnić się ekspresją, jak pokazano w przypadku EpCAM11. Co więcej, nie ogranicza się do materiału nowotworowego, ale może być stosowany do każdego rodzaju ksenoprzeszczepionej tkanki, ponieważ celem są komórki myszy, a nie określone ludzkie subpopulacje nowotworowe (dane nie pokazane).
Kompleksowe usuwanie komórek myszy jest ułatwione dzięki celowaniu w epitopy powierzchniowe ulegające ekspresji wyłącznie na komórkach pochodzenia mysiego. Oprócz dobrze ugruntowanej metody dysocjacji guza, przedstawionej w tym badaniu, istnieje wiele procedur wykorzystujących różne rodzaje enzymów. Zachowanie epitopów na powierzchni komórek jest warunkiem wstępnym dla tej nowatorskiej metody, ale także dla dokładnych analiz populacji ludzkich komórek nowotworowych. Dlatego tak ważne jest, aby do trawienia tkanki nowotworowej używane były delikatne enzymy. W związku z tym zubożenie komórek myszy może być stosowane tylko w połączeniu z procedurami trawienia enzymatycznego, które ewidentnie nie wpływają na epitopy ukierunkowane podczas procedury zubożenia komórek myszy. W razie wątpliwości może to zostać zweryfikowane tylko przez odpowiedniego producenta.
Ta metoda działa również w przypadku ludzkich krążących komórek nowotworowych (CTC). Jednakże, ponieważ częstość komórek docelowych wynosi zwykle < 0,1% usunięcie komórek myszy dodatkowo wymaga lizy czerwonych krwinek i nie można oczekiwać czystości większej niż 50%. W takim przypadku zubożenie komórek myszy można zastosować jako wstępne wzbogacenie CTC, a następnie wzbogacenie za pomocą markerów dodatnich (dane nie pokazano).
Usunięcie komórek myszy znacznie poprawia hodowlę ludzkich komórek nowotworowych, zapobiegając przerostowi fibroblastów myszy w hodowli. Ponadto analiza ludzkich ksenoprzeszczepów nowotworowych za pomocą sekwencjonowania nowej generacji jest znacznie ulepszona i ustandaryzowana. Ponieważ efekt ten zaobserwowano, mimo że podczas wzbogacania egzomu przeprowadzono ukierunkowaną selekcję specyficzną dla sekwencji ludzkiej, oczekuje się, że wpływ na sekwencjonowanie całego genomu i całego transkryptomu będzie jeszcze bardziej widoczny.
Co więcej, przedstawiona metoda umożliwia dokładne badania molekularne subpopulacji nowotworowych w obrębie ksenotransplantowanych nowotworów ludzkich. Usunięcie komórek myszy z odpowiedniej próbki w pierwszym etapie, a następnie sortowanie ludzkich komórek nowotworowych w dwóch różnych subpopulacjach umożliwia bezpośrednie porównanie molekularne subpopulacji nowotworu będącej przedmiotem zainteresowania z ludzkimi komórkami nowotworowymi20. Różnicowa ekspresja genów między podtypami komórek nowotworowych może być bardziej wiarygodnie oceniona, ponieważ nie ma na nią wpływu hybrydyzacja krzyżowa cząsteczek pochodzących od myszy.

Guzy lite u ludzi składają się z wielu typów komórek fizjologicznych, jak również nowotworowych. Tworzą niejednorodne tkanki o złożonych strukturach biologicznych. Procesy biologiczne, takie jak powstawanie nowotworów, progresja i reakcje na terapie, nie są jeszcze w pełni poznane. Modele hodowli komórkowych in vitro stanowią użyteczne narzędzie do badania i zrozumienia biologii nowotworów. Mogą one jednak tylko częściowo odzwierciedlać struktury i procesy występujące w tkankach nowotworowych. Wiarygodne i stabilne przedkliniczne modele nowotworów ludzkich są warunkiem wstępnym dla rozwoju leków i terapii przeciwnowotworowych4,6, a także dla zrozumienia biologii guza i interakcji komórek nowotworowych i ich środowiska.
Modele ksenoprzeszczepów ludzkich nowotworów pochodzące z pierwotnych guzów pacjentów wykazują wysokie relacje z tkanką pochodzenia pod względem architektury histologicznej, interakcji ze strukturami mikrośrodowiskowymi, potencjału przerzutowego i reakcji na leki7. Nawet jeśli ksenoprzeszczepy nowotworowe pochodzą z hodowanych komórek lub linii komórkowych, bardziej naśladują guzy pacjenta, dlatego wykazują większą trafność w większości testów w porównaniu z modelami hodowli komórkowych in vitro. Te cechy sprawiają, że są one złotym standardem modeli przedklinicznych4. Ksenotransplantacja komórek ludzkich myszom jest często stosowana nie tylko w badaniach nad komórkami macierzystymi w celu określenia potencjału macierzystego i różnicowania populacji docelowej8.
Wykazano, że ludzkie mikrokrążenie i ludzkie komórki odpornościowe są zastępowane podczas rozmnażania in vivo ludzkich nowotworów2,9. Czynniki takie jak podtyp guza, tempo wzrostu i region przeszczepu mają duży wpływ na globalny poziom infiltracji, a także na skład znalezionych typów komórek myszy. Jednak nawet gdy czynniki te są utrzymywane na stałym poziomie, ilość i skład komórek myszy są bardzo zmienne.
Dalsze analizy ksenoprzeszczepowanych tkanek są często kwestionowane przez komórki pochodzenia mysiego. Pierwotne hodowle ludzkich komórek nowotworowych z ksenoprzeszczepów są często przerastane przez fibroblasty. Oprócz utrudniania wytwarzania linii komórek nowotworowych in vitro, dalsze testy, takie jak badanie cytotoksyczności leków lub farmakokinetyka, są stronnicze, ponieważ w większości przypadków niemożliwa jest korekta in silico na skutki wynikające z zanieczyszczenia komórek myszy. Poza tym, jedyny częściowo wyjaśniony wzajemny oddziaływanie między mysimi fibroblastami a ludzkimi komórkami nowotworowymi ma bezpośredni wpływ na wyniki eksperymentalne badań10. Co więcej, najbardziej nieprzewidywalna zmienność naciekających komórek myszy pogarsza dokładne analizy molekularne. W analizach NGS lub proteomów każdy mierzony sygnał pochodzący od myszy zamiast sygnału ludzkiego guza bezpośrednio zmniejsza czułość sekwencjonowania. Również analizy ekspresji oparte na mikromacierzach są kwestionowane przez mysie kwasy nukleinowe, które mogą krzyżować się z ludzkimi sondami.
Aby obejść przeszkody związane z zanieczyszczeniem komórek myszy w dalszych analizach ludzkich komórek nowotworowych z modeli ksenoprzeszczepów, zaproponowano różne podejścia. W wielu badaniach pożądane komórki docelowe do dalszej analizy są izolowane przy użyciu markerów lub kombinacji markerów wyrażanych wyłącznie na ludzkich komórkach nowotworowych. Jednak brak wiarygodnych markerów do pozytywnej identyfikacji ludzkich komórek nowotworowych często stanowi dużą przeszkodę. Nawet markery o szerokiej ekspresji, takie jak EpCAM w przypadku nowotworów u ludzi, często wykazują wewnętrzne różnice w ekspresji guza11. Zwiększa to ryzyko, że subpopulacje o niskiej ekspresji, np. komórki nowotworowe przeszły przejście z nabłonka do mezenchymalnego, zostaną utracone podczas izolacji. Ponadto bezpośrednie powiązanie agenta selekcyjnego z komórką docelową może mieć wpływ na późniejsze wyniki analizy. Podjęto również próby zubożenia komórek myszy przy użyciu kombinacji przeciwciał specyficznych dla mysich epitopów CD45 i MHC klasy I12. Jednak ta kombinacja znaczników wykrywa tylko podzbiór komórek myszy. Innym podejściem jest usprawnienie analizowania procesów przez oprogramowanie. Niemniej jednak, wszystkie te podejścia albo nie są odpowiednie dla żadnego rodzaju konfiguracji eksperymentalnej, albo dla żadnej jednostki nowotworowej i metody transplantacji.
W tym badaniu prezentujemy nowatorską i szybką metodę kompleksowego usuwania komórek myszy z ksenoprzeszczepowanych tkanek, niezależnie od szczepu myszy i tkanki pochodzenia. W badaniach przesiewowych na wielu narządach i tkankach docelowych do przeszczepu ksenoprzeszczepów (w tym skóry, płuc, mózgu, nerek i mięśni szkieletowych) byliśmy w stanie zidentyfikować kombinację przeciwciał pozwalającą na kompleksowe wykrywanie komórek myszy. Przeciwciała te sprzężono z cząstkami superparamagnetycznymi, miareczkowano i optymalizowano pod kątem zubożenia za pomocą magnetycznego sortowania komórek. Ponieważ stosowane są tylko przeciwciała specyficzne dla myszy, ludzkie komórki docelowe pozostają "nietknięte", a metoda nie ogranicza się do ksenoprzeszczepionej tkanki nowotworowej. Wykazaliśmy, że kompleksowe usunięcie komórek myszy z ksenoprzeszczepowanych próbek nowotworowych standaryzuje i ułatwia hodowle ludzkich komórek nowotworowych. Ponadto wykazaliśmy, że analiza ludzkich ksenoprzeszczepów nowotworowych za pomocą sekwencjonowania nowej generacji jest znacznie ulepszona. Ponieważ efekt ten zaobserwowano, mimo że podczas wzbogacania egzomu przeprowadzono selekcję specyficzną dla sekwencji ludzkiej, oczekuje się, że wpływ na sekwencjonowanie całego genomu i całego transkryptomu będzie jeszcze bardziej widoczny. Podsumowując, usunięcie komórek myszy za pomocą tej nowatorskiej metody ułatwia hodowlę ludzkich komórek nowotworowych i znacznie usprawnia dalsze analizy ksenoprzeszczepów ludzkich nowotworów.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do dysocjacji nowotworów, człowiek</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-929</td><td>zawiera enzymy H, R i A; instrukcję rekonstytucji można znaleźć w karcie katalogowej</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Biowest</td><td>L0501-500</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C-Tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS Octo Disocjator z grzałkami</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-427</td><td></td></tr><tr><td>Filtr siatkowy MACS SmartStrainer (70 & mikro; m)</td> <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-462</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego 100 mm</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>skalpele</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>zestawy do zmniejszania liczby komórek myszy</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-694</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Różne</td><td></td><td>zastosowania 1x PBS do buforu PEB</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3610</td><td>użyj końcowego stężenia 2 mM w buforze PEB</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td>lub użyć 5 mg/L BSA w buforze PEB</td></tr><tr><td>MACS kolumny</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Separator QuadroMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Filtry PreSep (70 &micro; m)</td> <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>MACSmix Tube Rotator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>CD326-FITC, człowiek</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-080-301</td><td>zastosowanie 1:40 do barwienia immunofluorescencyjnego&nbsp;</td></tr>przeciwciało <tr><td>anty-wimentynowe</td><td>abcam</td><td>ab92547</td><td></td></tr><tr><td>kozio-anty-mysie IgG-Alexa488</td><td>Life Technologies</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>kozio-anty-królik IgG-Alexa594</td><td>Life Technologies</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>rozcieńczyć do końcowego stężenia 0,1 i mikro; g/ml w 0,1 M wodorowęglanu sodu&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia wewnętrznego</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-477</td><td>InsideFix z tego zestawu może być używany do etapu utrwalania podczas barwienia immunofluorescencyjnego&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93418</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik blokujący FcR, mysz</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500-100g</td><td></td></tr><tr><td>Nextera Zestaw do szybkiego wychwytywania</td><td>Illumina</td><td>FC-140-1000</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw odczynników MiSeq v3</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3001</td><td></td></tr></tbody></table>

zubożenie komórek myszy z ludzkich ksenoprzeszczepów nowotworowych znacznie poprawia dalszą analizę komórek docelowych

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Wykorzystanie modeli linii komórkowych in vitro do badań nad rakiem było użytecznym narzędziem. Wykazano jednak, że modele te nie naśladują wiarygodnie guzów pacjenta w różnych testach1. Ludzkie ksenoprzeszczepy nowotworowe stanowią złoty standard w odniesieniu do biologii nowotworów, odkrywania leków i badań nad przerzutami 2-4. Ksenoprzeszczepy nowotworowe mogą pochodzić z różnych rodzajów materiałów, takich jak linie komórek nowotworowych, tkanka nowotworowa z pierwotnych guzów pacjenta4 lub guzy przeszczepiane seryjnie. Podczas rozmnażania in vivo ksenografowana tkanka jest infiltrowana i unaczyniana przez komórki pochodzenia mysiego. Wiele czynników, takich jak jednostka nowotworowa, pochodzenie materiału ksenoprzeszczepowego, tempo wzrostu i region przeszczepu, wpływa na skład i ilość komórek myszy obecnych w ksenoprzeszczepach nowotworowych. Jednak nawet gdy czynniki te są utrzymywane na stałym poziomie, stopień zanieczyszczenia komórek myszy jest bardzo zmienny.
Zanieczyszczenie komórek myszy znacząco utrudnia dalsze analizy ksenoprzeszczepów ludzkich nowotworów. Ponieważ fibroblasty myszy wykazują wysoką skuteczność posiewu i tempo proliferacji, mają tendencję do przerastania kultur ludzkich komórek nowotworowych, zwłaszcza wolno proliferujących subpopulacji. DNA, mRNA i składniki białkowe pochodzące z komórek myszy mogą wpływać na dalszą analizę ekspresji genów, sekwencjonowanie nowej generacji, a także analizę proteomu 5. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowaliśmy szybką i łatwą metodę izolowania nietkniętych ludzkich komórek nowotworowych z ksenoprzeszczepowanej tkanki nowotworowej. Procedura ta opiera się na kompleksowym zubożeniu komórek pochodzenia mysiego poprzez połączenie automatycznej dysocjacji tkanek z laboratoryjnym dysocjatorem tkanek i magnetycznym sortowaniem komórek. Tutaj pokazujemy, że ludzkie komórki docelowe można uzyskać o czystości wyższej niż 96% w czasie krótszym niż 20 minut, niezależnie od typu nowotworu.

Zaproponowano różne podejścia w celu identyfikacji lub usuwania komórek mysich z ksenoprzeszczepów guzów ludzkich, na przykład kombinację przeciwciał swoistych dla myszy przeciwko CD45 i MHC klasy I. Jednakże za pomocą tych kombinacji wykrywano jedynie subpopulacje komórek mysich, podczas gdy proponowana kombinacja wykryła komórki mysie wykazujące ekspresję CD45 i MHC klasy I, a także pozostałe komórki mysie znalezione w tkankach docelowych transplantacji (Rysunek 1). Dzięki zastosowaniu tej nowej kombinacji przeciwciał do magnetycznego sortowania komórek, możliwe było wyizolowanie ludzkich komórek nowotworowych niezależnie od typu guza (Rysunek 2).
Komórki otrzymane w wyniku procedury usuwania komórek mysich opartej na magnetycznej separacji komórek mogły być hodowane, co prowadziło do uzyskania czystych kultur ludzkich komórek nowotworowych (Rycina 4). Ponadto, z tej samej próbki można było uzyskać i hodować żywe komórki mysie. Oprócz usuwania komórek mysich, podczas usuwania komórek mysich (MCD) usuwane były również zanieczyszczenia (Rycina 3).
Całkowite usunięcie komórek mysich, jak również usunięcie zanieczyszczeń, prowadzi do poprawy wyników dalszych analiz molekularnych. Wykazano to poprzez porównanie wyników sekwencjonowania całego eksomu (WES) przeprowadzonego na fragmentach guzów w masie oraz na próbkach pozbawionych komórek mysich, pochodzących z trzech różnych modeli ksenoprzeszczepów nowotworowych pochodzenia pacjenta (Ryciny 5–9). Nasze dane wskazują, że usunięcie komórek mysich przed przeprowadzeniem WES w próbkach guzów ksenoprzeszczepionych nie tylko znacząco zwiększa całkowitą liczbę odczytów (Rycina 5) ale także znacznie zmniejsza liczbę odczytów pochodzących od gospodarza zmapowanych do ludzkiego genomu referencyjnego (Rysunek 6B)Ponieważ te błędnie zmapowane odczyty mysie często zakłócają wyznaczanie SNP, zaobserwowaliśmy znaczną redukcję fałszywie przewidzianych SNP po zastosowaniu MCD. (Ryciny 7–8)Wreszcie wykazaliśmy, że usuwanie odczytów pochodzenia mysiego in silico za pomocą metod bioinformatycznych nie może w pełni zastąpić procedury eksperymentalnej, ponieważ w przypadku wszystkich odczytów nie było możliwe jednoznaczne przypisanie do gatunku pochodzenia na podstawie sekwencji. Co więcej, procedura in silico nie była w stanie skorygować poprawionej jakości i towarzyszącego jej wyższego pokrycia odczytów w obrębie in vitro próbki zredukowane (Rysunek 9).
<img alt="Wykresy rozrzutu z cytometrii przepływowej dla tkanek skóry i płuc myszy; CD45/MHCI-PE, Anti-Mouse-APC." src="/files/ftp_upload/54259/54259fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Opracowanie koktajlu przeciwciał rozpoznających wszystkie komórki mysie w wielu narządach14. Przeprowadzono badania przesiewowe w wielu narządach, w tym w skórze, płucach, mózgu, nerkach i mięśniach szkieletowych. Narządy te stanowią główne tkanki docelowe dla ksenotransplantacji. Kombinacje, takie jak te rozpoznające mysie epitopy CD45 i MHC klasy I, były już stosowane w celu eliminacji komórek mysich po ksenotransplantacji. Jednakże kombinacje markerów te rozpoznawały jedynie podzbiór komórek mysich we wszystkich analizowanych tkankach. W poprzednich badaniach przesiewowych zidentyfikowano kombinację pięciu przeciwciał, która umożliwia kompleksowe wykrywanie wszystkich komórek pochodzenia mysiego. Panel ten obejmuje erytrocyty i jest niezależny od tkanki pochodzenia (A, B oraz dane niepokazane). Zmodyfikowano na podstawie14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54259/54259fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat magnetycznej separacji komórek; wyniki cytometrii przepływowej ksenoprzeszczepów nowotworowych; izolacja komórek nowotworowych." src="/files/ftp_upload/54259/54259fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Niezawodna i szybka eliminacja komórek mysich15. Konjugaty kombinacji przeciwciał z superparamagnetycznymi nanocząsteczkami zostały wykorzystane do opracowania zoptymalizowanego protokołu eliminacji komórek mysich z ludzkich ksenoprzeszczepów nowotworowych za pomocą magnetycznego sortowania komórek (magnetycznej separacji komórek) (A). Ten nowy protokół pozwolił na usunięcie &gt; 99% zanieczyszczających komórek mysich w czasie krótszym niż 20 min, niezależnie od typu nowotworu. Frakcje komórek uzyskane w procedurze magnetycznej separacji komórek zostały znakowane koktajlem przeciwciał pan-mouse oraz przeciwciałem specyficznym dla człowieka przeciwko CD326 (EpCAM) (B). Zmodyfikowano na podstawie15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54259/54259fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy rozproszenia cytometrii przepływowej; barwienie CD44, Anti-Mouse-APC pierwotnych komórek w porównaniu z komórkami glejaka." src="/files/ftp_upload/54259/54259fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Izolacja ludzkich komórek glejaka. Do izolacji ludzkich komórek glejaka z mózgu dorosłej myszy zastosowano zestaw Mouse Cell Depletion Kit. Podczas dysocjacji tkanki nerwowej zazwyczaj powstaje duża ilość debrisu. MCDK skutecznie usuwa martwe komórki i debris, co obrazuje wykres zależności wielkości komórek od ich ziarnistości. Dzięki zastosowaniu tego koktajlu koniugatów możliwe było wyeliminowanie &gt; 99% zanieczyszczających komórek mysich oraz &gt; 60% debrisu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54259/54259fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia immunofluorescencyjna frakcji komórkowych; barwienie na wimentynę i CD326; analiza w kontraście fazowym." src="/files/ftp_upload/54259/54259fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Usuwanie komórek mysich ułatwia dalsze hodowle ludzkich komórek nowotworowych14. Fibroblasty mysie często utrudniają hodowlę ludzkich komórek nowotworowych po dysocjacji przeszczepionych tkanek lub prowadzą do powstania kultur heterogenicznych. Fibroblasty przywierają i namnażają się efektywniej, przez co przerastają komórki docelowe. Zaburza to analizy hodowli komórkowych in vitro (np. testy cytotoksyczności leków), ponieważ w większości przypadków matematyczna korekta efektów wynikających z zanieczyszczenia komórkami mysimi jest niemożliwa. Frakcje negatywne (B) i pozytywne (C) po usunięciu komórek mysich hodowano przez trzy dni, utrwalono i zabarwiono na specyficzny dla myszy marker fibroblastów (wimentynę) oraz specyficzny dla ludzi marker nowotworowy CD326 (EpCAM). Jako kontrolę, hodowano i zabarwiono również oryginalną frakcję zawierającą nieposeparowane komórki (A). Nawet po trzech dniach hodowli w frakcji negatywnej (B) obserwowano niemal czystą populację ludzkich komórek nowotworowych, podczas gdy frakcja niesortowana (A) została niemal całkowicie przerostowana przez fibroblasty. Do frakcji pozytywnej (C) utracono jedynie niewielką część komórek docelowych. Zmodyfikowano na podstawie14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54259/54259fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza danych ksenoprzeszczepów; tabela i wykres słupkowy porównujący klastry komórek nowotworowych, gęstość i wydajność." src="/files/ftp_upload/54259/54259fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Sekwencjonowanie całego egzomu (WES) próbek nowotworowych przed i po usuwaniu komórek mysich (MCD)15. Przeprowadzono WES w trzech różnych modelach ksenoprzeszczepów pochodzących z ludzkiego raka nerki, płuca i pęcherza moczowego, aby ocenić wpływ MCD na jakość danych sekwencjonowania następnej generacji. DNA z całej masy guza oraz z wyizolowanych komórek nowotworowych po usuwaniu komórek mysich wykorzystano do generowania bibliotek sekwencjonowania z wychwytem egzomu przy użyciu zestawu do wychwytu egzomu. Do sekwencjonowania na sekwenatorze pulpitowym zastosowano zestaw odczynników do sekwenatora pulpitowego (150 cykli), aby wygenerować odczyty par końców (paired-end reads) o długości 75 bp. W próbkach po usunięciu komórek mysich zaobserwowano istotny wzrost (p &lt; 0.05) gęstości klastrów (A) oraz średni wzrost liczby odczytów o 33% (B), co wskazuje na poprawę jakości próbek. Odpowiednio, silną redukcję debris i martwych komórek po MCD można było również wykazać w analizie cytometrii przepływowej (patrz Rysunek 3). Zmodyfikowano z15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54259/54259fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat dopasowania genomu i wykresy kołowe; analiza pochodzenia odczytów ludzkich i mysich; diagram bioinformatyczny." src="/files/ftp_upload/54259/54259fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Usuwanie komórek mysich (MCD) znacznie redukuje liczbę błędnie zmapowanych odczytów mysich po sekwencjonowaniu całego egzomu (WES)15. Ponieważ oligonukleotydy do przechwytywania stosowane w celowanym wzbogacaniu sekwencji kodujących białka zostały zaprojektowane w oparciu o genom ludzki, oczekiwano wstępnego wzbogacenia fragmentów DNA pochodzenia ludzkiego z mieszaniny komórek mysich i ludzkich. Aby ocenić liczbę oligonukleotydów do przechwytywania, które mogłyby ulec hybrydyzacji krzyżowej z mysim DNA genomowym, przeprowadziliśmy wyszukiwania BLAST dla każdej pojedynczej sondy do szybkiego przechwytywania egzomu przeciwko genomowi mysiemu. Wynikowe parametry dopasowania wykorzystano do określenia możliwej hybrydyzacji krzyżowej. W zależności od progów selekcji (długość dopasowania, liczba niedopasowań, liczba przerw), przewidzieliśmy reaktywność krzyżową 5 - 10% sond do przechwytywania z transkryptami mysimi (dane nie pokazano). Po przycięciu adapterów (trimmomatic v0.3216), zmapowaliśmy odczyty ze wszystkich próbek przeciwko genomom ludzkiemu i mysiemu (bwa v0.7.1217) i określiliśmy ich przypuszczalne pochodzenie na podstawie odpowiednich parametrów dopasowania (powłoka LINUX, wiersz poleceń Perl) (A). Średnio 12% odczytów pochodzących z próbek guza zbiorczego przypisano komórkom mysim. Ilość tę można było zredukować do 0,3% poprzez wcześniejsze usunięcie komórek mysich (B). Ponieważ średnio 15% odczytów pochodzenia mysiego błędnie zmapowało się do genomu ludzkiego, co odpowiada 1,9% całkowitych odczytów w próbkach guza zbiorczego i 0,04% w izolowanych komórkach nowotworowych, można oczekiwać silnego pozytywnego wpływu usuwania komórek mysich na analizy następcze. Rysunek 6B obrazuje szczegółowe przypisanie odczytów dla guza zbiorczego i izolowanych ludzkich komórek nowotworowych pochodzących z ksenoprzeszczepu raka pęcherza moczowego. Zmodyfikowano z15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54259/54259fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Diagramy Venna porównujące białka nerek, płuc i pęcherza moczowego; próbki niewzbogacone vs. MCD, z zaznaczonymi wartościami procentowymi." src="/files/ftp_upload/54259/54259fig7.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7. MCD znacząco redukuje liczbę błędnie przewidzianych SNP15. Aby określić wpływ odczytów mysich zmapowanych do ludzkiego genomu, ustalono liczbę przewidzianych SNP dla próbek ksenoprzeszczepów przed i po MCD. Ponieważ do porównania nie było dostępnych zdrowych tkanek, SNP zdefiniowano jako różnicę między sekwencjonowaną próbką a genomem referencyjnym (hg19). Po usunięciu duplikatów odczytów przeprowadzono identyfikację SNP oraz INDEL18, ograniczając ją do regionów docelowych zestawu do wychwytywania egzomu. 63 ± 10% wszystkich SNP przewidzianych dla próbek guza masowego nie było już wykrywanych po usunięciu komórek mysich, natomiast 18 ± 1% było specyficznych dla wyizolowanych ludzkich komórek nowotworowych (A). Podczas gdy pierwsze były spowodowane głównie przez błędnie zmapowane odczyty mysie, drugie wydawały się być wykrywane dzięki większej liczbie odczytów i w konsekwencji wyższemu pokryciu w próbkach wyizolowanych ludzkich komórek nowotworowych. Efekt ten był widoczny również w przypadku przewidzianych INDEL (B). Zmodyfikowano na podstawie15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54259/54259fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat sekwencjonowania genomicznego, ludzkie komórki nowotworowe vs. masa guza, analiza wariantów, genomika porównawcza." src="/files/ftp_upload/54259/54259fig8.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8. MCD poprawia predykcję wysokowpływowych SNP15. (A) Przedstawiono wpływ MCD na predykcję SNP w obrębie eksonu kodującego białko genu POLA119. Podczas gdy błędnie zmapowane odczyty mysie spowodowały szereg fałszywie zpredykowanych SNP w masie ksenoprzeszczepu raka nerki, SNP te zniknęły po zastosowaniu MCD. Ponadto MCD poprawiło predykcję wysokowpływowych SNP. Na przykład odczyty mysie zmapowane do ludzkiego genomu referencyjnego w próbce z masy guza doprowadziły do błędnego zpredykowania zniszczenia kodonu startowego genu GRIA3 (B). Zmodyfikowano na podstawie15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54259/54259fig8large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Diagram Venna porównujący dane in silico i in vitro dla badań nad nerkami, płucami i pęcherzem moczowym." src="/files/ftp_upload/54259/54259fig9.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 9"> 
Rycina 9. In silico Usuwanie odczytów pochodzenia mysiego nie może w pełni zastąpić IIn Vitro MCD15. Odczyty, co do których przewidywano, że pochodzą od myszy, zostały usunięte z danych sekwencyjnych drogą obliczeniową, a następnie powtórzono proces wyznaczania SNP. Dzięki temu podejściu liczba SNP przewidywanych dla próbek guza zbiorczego uległa znacznemu zmniejszeniu z 63% do 8,5% całkowitej liczby SNP (porównać z Rysunek 8). Jednakże to in silico podejście nie mogło całkowicie zastąpić in vitro MCD, zwłaszcza jeśli weźmie się pod uwagę poprawioną jakość próbek oraz towarzyszący temu wzrost liczby odczytów i pokrycia. Zmodyfikowano z15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54259/54259fig9large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ksenoprzeszczepy ludzkich nowotworów są unaczyniane i infiltrowane przez komórki pochodzenia mysiego podczas fazy wzrostu in vivo. Aby obejść odchylenia spowodowane przez te zanieczyszczające komórki podczas dalszej analizy, opracowaliśmy metodę pozwalającą na kompleksowe zubożenie wszystkich komórek myszy poprzez magnetyczne sortowanie komórek.

Zubożenie komórek myszy z ludzkich ksenoprzeszczepów nowotworowych znacznie poprawia dalszą analizę komórek docelowych

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest szybka izolacja ksenotransplantowanych ludzkich komórek nowotworowych z organizmów myszy w celu usprawnienia dalszych analiz wybranych komórek docelowych. Eliminacja zanieczyszczających komórek mysich za pomocą tej metody umożliwia specyficzną ocenę ekspresji genów ludzkich komórek nowotworowych lub bezpośrednich odpowiedzi in vitro. Główną zaletą tej techniki jest możliwość szybkiej i łatwej izolacji ludzkich komórek nowotworowych bez konieczności identyfikacji jakichkolwiek markerów powierzchniowych na komórkach docelowych.Należy rozpocząć od usunięcia tkanki tłuszczowej i obszarów martwiczych z próbki guza za pomocą pęsety i skalpela. Następnie guz należy posiekać na kawałki o wielkości od dwóch do czterech milimetrów. W kolejnym kroku fragmenty tkanki należy przenieść do probówki do dysocjacji w zawiesinę jednokomórkową zawierającej mieszaninę trawienną i szczelnie zamknąć probówkę.Umieść probówkę dnem do góry w uchwycie laboratoryjnego dysocjatora tkanek i upewnij się, że fragmenty tkanki znajdują się w obszarze rotora i statora. Podłącz grzałkę do dysocjatora, następnie kliknij symbol folderu na ekranie dotykowym i za pomocą strzałek w górę i w dół wybierz odpowiedni tryb dysocjacji guza. Następnie wybierz pozycję uchwytu, w której znajduje się próbka, i rozpocznij dysocjację.Po uzyskaniu zawiesiny pojedynczych komórek szybko odwiruj probówkę, aby osadzić komórki na dnie. Przefiltruj komórki przez sito o oczkach 70 µm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i wypłucz sito 20 ml pożywki, zbierając płuczkę do probówki z próbką. Następnie odwiruj komórki i resuspenduj osad komórek stromalnych myszy z ludzkiego guza w 5 ml buforu PB.Po zliczeniu, należy zebrać komórki poprzez kolejną wirowkę i zawiesić osad w 80 µL buforu PB na każde 1 x 10⁷ komórek łącznie. Na tym etapie ważne jest użycie mikroskopu i wykonanie pomiaru metodą wykluczania niebieskiego barwnika zamiast korzystania z licznika komórek, aby uzyskać dokładną liczbę żywych komórek. Liczniki komórek często wykazują problemy z analizą niejednorodnych próbek po dysocjacji tkanki.Następnie wymieszaj 20 µl odczynnika do znakowania magnetycznego komórek mysich z zawiesiną komórkową i inkubuj komórki przez 15 minut w lodówce. Podczas znakowania komórek umieść kolumnę LS w odpowiednim magnesie i przepłucz kolumnę 3 ml buforu PB. Po zakończeniu inkubacji dodaj 420 µl buforu, aby zwiększyć całkowitą objętość próbki do 500 µl, a 50 µl alikwot odstaw w temperaturze od 2 do 8 °C do późniejszej analizy cytometrycznej lub molekularnej.Następnie nanieś komórki na kolumnę, używając wyrównanego sita o rozmiarze oczek 70 µm. Zbierz przepływ nieoznakowanych komórek docelowych. Gdy zbiornik będzie pusty, przemyj kolumnę dwukrotnie 1 ml buforu, zbierając eluat do tej samej probówki co frakcję komórek negatywnych.Aby zebrać komórki mysie związane z koralikami magnetycznymi, przenieś kolumnę do nowej probówki stożkowej i przepuść przez nią 3 mL buforu. Wykorzystanie nowej kombinacji przeciwciał antymysich jest znacznie bardziej wydajne w zakresie kompleksowego wykrywania komórek mysich w tkankach docelowych w ksenotransplantacjach niż łączone znakowanie CD45 i MHC klasy I. Rzeczywiście, zastosowanie tej nowej kombinacji przeciwciał do magnetycznego sortowania komórek ułatwia izolację ludzkich komórek nowotworowych niezależnie od typu nowotworu.Oprócz usuwania komórek mysich, podczas magnetycznej separacji komórek usuwane są również zanieczyszczenia. Komórki guza ludzkiego pozbawione komórek mysich mogą być następnie hodowane, co prowadzi do wytworzenia czystych kultur ludzkich komórek nowotworowych. Usunięcie komórek mysich przed przeprowadzeniem sekwencjonowania całego egzomu próbek guzów ksenoprzeszczepionych nie tylko znacznie zwiększa całkowitą liczbę odczytów, ale także wyraźnie redukuje liczbę odczytów pochodzących od gospodarza zmapowanych do ludzkiego genomu referencyjnego oraz liczbę błędnie przewidzianych polimorfizmów pojedynczego nukleotydu.Metody bioinformatycznego usuwania odczytów pochodzących od myszy in silico nie mogą jednak w pełni zastąpić procedury eksperymentalnej, ponieważ nie jest możliwe jednoznaczne przypisanie gatunku pochodzenia na podstawie sekwencji dla wszystkich odczytów. Jak pokazano tutaj w przypadku liczby przewidywanych SNP, procedura in silico nie jest w stanie skorygować poprawionej jakości oraz towarzyszącego jej wyższego pokrycia odczytami w próbkach poddanych deplekcji in vitro. Po opanowaniu techniki, cała procedura, obejmująca przygotowanie guza, dysocjację, liczenie i separację magnetyczną, może zostać ukończona w ciągu dwóch godzin, jeśli jest przeprowadzana prawidłowo.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby odpowiednio przygotować próbkę tkanki do dysocjacji, nie stosować agresywnych enzymów oraz upewnić się, że uzyskano dokładną liczbę komórek. Po przeprowadzeniu tej procedury oczyszczone ludzkie komórki nowotworowe mogą być wykorzystane do dowolnego rodzaju analizy końcowej, hodowli, a nawet do późniejszego sortowania komórek metodą magnetyczną lub przepływową. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie onkologii do badania ludzkich komórek nowotworowych i rakowych komórek macierzystych pobranych od pacjenta oraz z ksenograftów półbezpośrednich, bez zakłóceń wynikających z obecności komórek mysich.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobre wyobrażenie o tym, jak szybko i łatwo można usprawnić analizy końcowe, pracując z czystymi populacjami komórek docelowych.

depletion-mouse-cells-from-human-tumor-xenografts-significantly

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Nowy protokół opisany w niniejszym badaniu umożliwia selekcyjne wykrywanie przerzutów do płuc z rozdzielczością pojedynczych komórek u myszy poprzez połączenie perfuzji i fiksacji płuc in-situ oraz barwienia X-Gal komórek nowotworowych znakowanych genem lacZ.

Ulepszona wizualizacja przerzutów do płuc w rozdzielczości pojedynczych komórek u myszy poprzez połączoną perfuzję in-situ tkanki płucnej i barwienie X-Gal komórek nowotworowych znakowanych lacZ

W niniejszym opracowaniu opisano generowanie i charakterystykę limfocytów T specyficznych dla nowotworu z wykorzystaniem myszy humanizowanych. Tkanka grasicy człowieka oraz genetycznie zmodyfikowane ludzkie komórki macierzyste krwi są przeszczepiane myszom z niedoborem odporności. Prowadzi to do rekonstrukcji zmodyfikowanego ludzkiego układu odpornościowego, co umożliwia badanie odpowiedzi immunologicznej przeciwnowotworowej in vivo.

Wykorzystanie humanizowanych myszy BLT jako modelu nowotworowego w genoterapii opartej na komórkach macierzystych

Ten film demonstruje test do generowania humanizowanego modelu myszy ksenoprzeszczepu. Myszom z obniżoną odpornością wstrzykuje się cyklofosfamid, aby spowodować wyczerpanie komórek odpornościowych. Komórki nowotworowe pochodzące od pacjenta zmieszane z ludzkimi komórkami jednojądrzastymi krwi obwodowej (PBMC) w hydrożelu są wstrzykiwane podskórnie myszy, tworząc guz z naciekającymi limfocytami T.

Technika generowania ludzkiego, humanizowanego modelu myszy ksenoprzeszczepu wszczepionego w PBMC

Ksenografty ludzkich nowotworów u myszy z niedoborem odporności są cennymi narzędziami do badania biologii raka.  Opisano specyficzne protokoły generowania ksenoprzeszczepów podskórnych i wewnątrzwątrobowych z ludzkich komórek raka wątrobowokomórkowego lub fragmentów guza.  Regeneracja wątroby wywołana częściową hepatektomią u myszy biorców jest przedstawiana jako strategia ułatwiająca wszczepienie wewnątrzwątrobowe.

Wytwarzanie podskórnych i wewnątrzwątrobowych ksenoprzeszczepów ludzkiego raka wątrobowokomórkowego u myszy z niedoborem odporności

Opisujemy metodę stabilnego znakowania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX) cząstkami lentiwirusowymi wyrażającymi białko zielonej fluorescencji i reportery lucyferazy. Metoda ta pozwala na śledzenie wzrostu PDX w miejscu pierwotnym, a także wykrywanie spontanicznych i eksperymentalnych przerzutów za pomocą systemów obrazowania in vivo.

Znakowanie ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem piersi za pomocą identyfikowalnych reporterów do badań wzrostu guza i przerzutów

Opisujemy powstawanie ortotopowych guzów jelita grubego poprzez wstrzykiwanie komórek nowotworowych lub organoidów do jelita ślepego myszy i późniejszą izolację krążących komórek nowotworowych (CTC) z tego modelu.

Izolacja krążących komórek nowotworowych w ortotopowym mysim modelu raka jelita grubego

Chłoniak z komórek płaszcza (MCL) jest trudnym do leczenia zaburzeniem komórek B i równie trudno jest stworzyć mysi model ksenoprzeszczepu pierwotnego MCL w celu zbadania i opracowania terapii. W tym miejscu opisujemy udane wprowadzenie ksenoprzeszczepów MCL u myszy, aby pomóc zrozumieć ich biologię.

Wszczepienie guza w mysim modelu ksenoprzeszczepu chłoniaka z ludzkich komórek płaszcza

Tutaj opisujemy metodę rozdzielania i wzbogacania składników mikrośrodowiska immunologicznego i nieimmunologicznego guza w ustalonych guzach podskórnych. Technika ta pozwala na oddzielną analizę nacieków immunologicznych guza i nieimmunologicznych frakcji guza, co może pozwolić na kompleksową charakterystykę mikrośrodowiska immunologicznego guza.

Wzbogacenie i charakterystyka mikrośrodowisk immunologicznych i nieimmunologicznych guza w ustalonych podskórnych guzach myszy

Tutaj prezentujemy protokół do wywoływania i oceniania choroby w modelu xenoGVHD (xenoGVHD) ksenogenicznej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi. xenoGVHD dostarcza model in vivo do badania immunosupresji ludzkich limfocytów T. Dodatkowo opisujemy, jak wykrywać ludzkie limfocyty T w tkankach za pomocą cyfrowego PCR jako narzędzia do ilościowego określania immunosupresji.

Indukcja i ocena choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi w ksenogenicznym mysim modelu i kwantyfikacja ludzkich limfocytów T w tkankach myszy przy użyciu cyfrowego PCR

Ten protokół opisuje generowanie myszy z ludzkim układem odpornościowym (HIS) do badań immunoonkologicznych. Przedstawiono instrukcje i rozważania dotyczące stosowania tego modelu do testowania ludzkich immunoterapeutyków na ludzkich nowotworach wszczepionych w tym modelu z naciskiem na scharakteryzowanie odpowiedzi ludzkiego układu odpornościowego na guz.

Testowanie immunoterapeutyków przeciwnowotworowych w humanizowanym modelu mysim z ludzkimi nowotworami

Ten protokół opisuje procedurę szybkiej dysocjacji próbek ludzkich i mysich guzów do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek.

Dysocjacja próbek tkanek nowotworowych ludzi i myszy do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek

Poznaj metodę izolacji ludzkich komórek nowotworowych z ksenoprzeszczepów myszy przy użyciu sortowania magnetycznego z przeciwciałami anti-mouse. Technika ta eliminuje zanieczyszczenie komórkami myszy, poprawiając jakość analiz ekspresji genów i sekwencjonowania.

Zubożenie komórek myszy z ludzkich ksenoprzeszczepów nowotworowych znacznie poprawia dalszą analizę komórek docelowych

Przeglądaj więcej filmów