Name: Montaż i zastosowanie pierścieni ścinających: nowy model śródbłonka dla orbitalnego, jednokierunkowego i okresowego przepływu płynów oraz naprężeń ścinających (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Poznaj metodę pierścieni ścinających do badania wpływu okresowego przepływu płynów na komórki śródbłonka. Prosta, ekonomiczna technika umożliwia ocenę morfologii i funkcji komórek w warunkach kontrolowanego naprężenia ścinającego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za pomoc Panu Christopherowi Nguyenowi, Aaronowi Hunterowi oraz programom szkoleniowym Shreveport Jumpstart, SMART i Biostart, a także wydziałowi Biofizyki Centenary College of Louisiana, Shreveport, LA.

1. Konstrukcja pierścieni ścinających o średnicy 150 mm (Rysunek 1)
UWAGA: Pierścienie ścinające można konstruować w wielu różnych wymiarach, zmieniając rozmiary zewnętrznej i wewnętrznej szalki Petriego, co pozwala na uzyskanie urządzeń o różnej całkowitej powierzchni, wydajności komórek i zakresach generowanych sił ścinających. Niniejszy raport opisuje zastosowanie szalki 150 mm w połączeniu z wewnętrzną szalką 100 mm, co daje całkowitą powierzchnię 98 cm2 (Rysunek 2).
<img alt="Schemat hodowli komórek śródbłonka z zestawem z wentylowaną zakrętką, ilustrujący dynamikę przepływu rozpuszczalnika." src="/files/ftp_upload/54632/54632fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Montaż pierścienia ścinającego. Górna część ryciny przedstawia częściowo zmontowany pierścień ścinający. Jeśli między naczyniem wewnętrznym a zewnętrznym nie utworzyła się całkowicie szczelna spoina, należy wstrzyknąć 0,5 ml chlorku metylenu przez otwór o średnicy 3 mm za pomocą pipety transferowej. Pierścień ścinający zostaje uszczelniony poprzez nałożenie warstwy silikonowego kleju gumowego o grubości 1 mm wokół wewnętrznej krawędzi górnej części pierścienia. Dolna część ryciny przedstawia zmontowany pierścień ścinający. Kolor niebieski reprezentuje obszar wysianych komórek śródbłonka. Zewnętrzne i wewnętrzne czerwone strzałki wskazują ruch orbitalny pierścienia ścinającego oraz medium wewnątrz pierścienia po umieszczeniu go na wytrząsarce orbitalnej. <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54632/54632fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat równowagi statycznej z opisanymi pomiarami; tarcza okrągła, wymiary 100mm-150mm." src="/files/ftp_upload/54632/54632fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Pomiary powierzchni dla pierścienia ścinającego o średnicy 150 mm (nie w skali). Górny panel przedstawia odśrodkowe przemieszczanie się cieczy w stronę zewnętrznego pierścienia w odpowiedzi na rotację orbitalną. <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54632/54632fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol>
	<li>Utwórz szablon konstrukcyjny pierścienia ścinającego, generując w programie do prezentacji profil krawędzi zewnętrznej o średnicy 150 mm z wewnętrzną średnicą 100 mm umieszczoną w centrum koła 150 mm. Wydrukuj szablon na arkuszu białego papieru A4.</li>
	<li>Pipetuj 10 ml chlorku metylenu (dichlorometanu) do szklanej szalki Petriego o średnicy 150 mm. Krytyczne jest, aby szalka była szklana, a nie polistyrenowa (ani z innego tworzywa winylowego), ponieważ chlorek metylenu rozpuszcza większość tworzyw sztucznych i jest tutaj wykorzystywany do łączenia komponentów plastikowych. 
	UWAGA: Podczas wszystkich prac konstrukcyjnych należy używać rękawic i zapewnić odpowiednią wentylację w dygestorium. Chlorek metylenu jest substancją drażniącą w kontakcie ze skórą i wykazuje działanie hepatotoksyczne.</li>
	<li>Dopasuj plastikową szalkę Petriego o średnicy 150 mm do zewnętrznego szablonu pierścienia ścinającego.</li>
	<li>Wywierć otwór o średnicy 3 mm w centrum szalki 100 mm za pomocą narzędzia rotacyjnego. Usuń wszelkie wióry plastikowe powstałe podczas wiercenia.</li>
	<li>Trzymając szalkę w rękawiczce, odwróć ją i zanurz górną krawędź szalki Petriego 100 mm z poprzedniego kroku w chlorku metylenu na około 3 s.</li>
	<li>Przenieś „zwilżoną” szalkę 100 mm krawędzią w dół na środek szalki 150 mm, starannie dopasowując szalkę 100 mm do zaznaczonego szablonu. Chlorek metylenu stopi tworzywo, łącząc szalki 100 mm i 150 mm. Delikatnie obracaj szalkę 100 mm zgodnie i przeciwnie do ruchu wskazówek zegara kilka razy, aby zapewnić dobrą adhezję do szalki 150 mm. 
	UWAGA: Należy zachować szczególną ostrożność, aby zapewnić prawidłowe ustawienie wewnętrznej szalki w centrum szalki zewnętrznej. Ekscentryczne ustawienie może prowadzić do różnic w naprężeniu ścinającym w różnych miejscach pierścienia ścinającego. Należy uważać, aby chlorek metylenu przypadkowo nie skapnął na zewnętrzną część toru szalki Petriego 150 mm podczas umieszczania szalki 100 mm. Spowoduje to stopienie tworzywa na dolnej powierzchni, na której będą rosły komórki, tworząc nierówną powierzchnię, co może powodować zaburzenia przepływu.</li>
	<li>Po wyschnięciu chlorku metylenu odwróć nowo połączone szalki Petriego i dokładnie sprawdź punkty styku, aby upewnić się, że między dwiema szalkami Petriego powstała szczelna spoina.</li>
	<li>Jeśli szczelna spoina nie powstała całkowicie, wstrzyknij 0,5 ml chlorku metylenu przez otwór 3 mm za pomocą pipety transferowej. Podnieś szalkę i delikatnie nią zakręć, aby chlorek metylenu dotarł do krawędzi. 
	UWAGA: Jeśli obrót będzie zbyt szybki, chlorek metylenu może wylać się do zewnętrznej części szalki 150 mm, deformując powierzchnię wzrostu komórek i niszcząc pierścień ścinający. Nieszczelne pierścienie ścinające należy odrzucić.</li>
	<li>Uszczelnij otwór w szalce 100 mm, nakładając pasek silikonowego uszczelniacza o szerokości 3 mm.</li>
	<li>Za pomocą narzędzia rotacyjnego z płaską głowicą tnącą odetnij górną część (3 cm) stożkowej polistyrenowej probówki do hodowli tkankowej o pojemności 15 ml, pozostawiając co najmniej 1 cm probówki poniżej zakrętki. Wypoleruj krawędź odciętej probówki do uzyskania gładkiej i płaskiej powierzchni, używając płaskiej strony głowicy tnącej. Usuń wszelkie wióry plastikowe powstałe podczas szlifowania.</li>
	<li>Odrysuj odciętą stożkową probówkę 15 ml na pokrywce szalki 150 mm za pomocą markera, w odległości około 0,5 cm od krawędzi szalki. Wywierć otwór wewnątrz narysowanego koła, pozostawiając margines około 1-2 mm od krawędzi koła.</li>
	<li>Umieść górną część odciętej probówki stożkowej nad wywierconym otworem. Za pomocą pipety transferowej nanieś około 250 µl chlorku metylenu na odcięte krawędzie probówki stożkowej, aby połączyć probówkę z pokrywką 150 mm.</li>
	<li>Zamknij pokrywkę 150 mm na szalce 150 mm, nakładając pasek silikonowego uszczelniacza o grubości 1 mm wokół wewnętrznej krawędzi górnej szalki Petriego.</li>
</ol>
2. Sterylizacja pierścieni ścinających
<ol>
	<li>Do nowo utworzonego pierścienia ścinającego (shear ring) pipetować około 10 ml soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) przez otwór probówki stożkowej o pojemności 15 ml. Obracać naczynie, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia z wnętrza pierścienia. Usunąć PBS za pomocą pipety Pasteura lub aspiratora próżniowego.</li>
	<li>Powtarzać poprzedni krok do momentu usunięcia zanieczyszczeń.</li>
	<li>W celu sterylizacji pierścienia ścinającego zastosować kombinację płukania 70% etanolem oraz naświetlania promieniowaniem UV.
	<ol>
		<li>Odkręcić odpowietrzoną zakrętkę, pipetować około 10 ml 70% etanolu przez otwór dostępowy, a następnie ponownie zakręcić naczynie. Kilkakrotnie obracać i odwracać pierścień ścinający, upewniając się, że jego wnętrze zostało dokładnie wypłukane.</li>
		<li>W dygestorium odessać nadmiar 70% etanolu. Za pomocą butelki z rozpylaczem dokładnie spryskać zakrętkę oraz otwór dostępowy 70% etanolem.</li>
		<li>Umieścić pierścień ścinający wraz z zakrętką pod promieniowaniem UV w komorze do hodowli tkanek do całkowitego wyschnięcia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po wyschnięciu ponownie zakręcić naczynie i przechowywać wysterylizowane pierścienie ścinające w temperaturze pokojowej do czasu ich użycia podczas wysiewu komórek.</li>
</ol>
3. Badania nad naprężeniem ścinającym
<ol>
	<li>Wysiać komórki śródbłonka w wysterylizowanych pierścieniach do generowania naprężeń ścinających (shear rings) zgodnie ze standardowym protokołem hodowli komórkowej, zazwyczaj stosując stosunek rozcieńczenia 1:4 dla przekształconych linii komórek śródbłonka. 
	UWAGA: Komórki śródbłonka mikro naczyniowego siatkówki szczura zostały zakupione komercyjnie. Komórki śródbłonka mózgu człowieka (hCMEC/D3) zostały przekazane jako darowizna od dr. Pierre-Olivera Courauda (Inserm, Francja) i były hodowane w pełnej podstawowej pożywce dla komórek śródbłonka (EBM).</li>
	<li>Pozostawić hodowle do momentu osiągnięcia konfluencji przed rozpoczęciem badań nad przepływem. Użyć 30 ml pożywki do hodowli tkanek (10% płodowej surowicy cielęcej, pożywki Eagle'a modyfikowanej przez Dulbecco z 1% penicyliny/streptomycyny/amfoterycyny). Wymieniać pożywkę do hodowli komórkowej co 3 dni i utrzymywać komórki w temperaturze 37 °C przy 7,5% CO2 i 92,5% powietrza pokojowego.</li>
	<li>Umieścić wytrząsarkę orbitalną w inkubatorze. 
	Uwaga: Wytrząsarki orbitalne są zazwyczaj ciężkie (&gt;10 kg). Należy umieścić wytrząsarkę orbitalną na dolnej półce inkubatora, aby zminimalizować obciążenie półki i wibracje.</li>
	<li>Umieścić eksperymentalne pierścienie do generowania naprężeń ścinających na wytrząsarce orbitalnej. Pierścienie kontrolne (statyczne) umieścić w tym samym inkubatorze.</li>
	<li>Oszacować maksymalne naprężenie ścinające wewnątrz pierścienia za pomocą równania <img alt="Równanie równowagi statycznej dla maksymalnego naprężenia, wzór T_max = r√(np(2πf)^3)." src="/files/ftp_upload/54632/54632eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 1"> gdzie <img alt="Wykres wzbudzenia optycznego; analiza absorpcji z użyciem systemu spektroskopowego; piki emisji." src="/files/ftp_upload/54632/54632eq2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 2"> to promień rotacji wytrząsarki orbitalnej (w cm), <img alt="Symbol η, reprezentujący lepkość w równaniach, z ulepszonym kolorem dla przejrzystości edukacyjnej." src="/files/ftp_upload/54632/54632eq3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 3"> to lepkość pożywki (w poizach), <img alt="Równanie gęstości cieczy, ρ; symbol; ważny w obliczeniach dynamiki płynów i badaniach naukowych." src="/files/ftp_upload/54632/54632eq4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 4"> to gęstość pożywki (w g/ml), a <img alt="Notacja funkcji \( f(x) \) w analizie matematycznej, reprezentacja wzoru, wyrażenie matematyczne." src="/files/ftp_upload/54632/54632eq5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 5"> to częstotliwość obrotów (w obrotach/s)24.</li>
	<li>Ustawić prędkość obrotową na wytrząsarce orbitalnej na pożądaną wartość rpm (np. 90 rpm), pozostawiając pierścienie na wytrząsarce przez wymagany czas aplikacji naprężenia ścinającego (np. 72 h). 
	UWAGA: Wytrząsarki orbitalne mogą generować ciepło, dlatego należy początkowo monitorować temperaturę w inkubatorze, aby upewnić się, że przez cały czas trwania eksperymentu utrzymuje się 37 °C. Alternatywnie pierścienie można przenieść do komór środowiskowych (np. modułowej komory inkubacyjnej), a następnie umieścić je w inkubatorze rotacyjnym.</li>
	<li>Po wystawieniu warstw komórek na działanie sił ścinających przez pożądany czas, wyjąć pierścienie z inkubatora. Zdjąć pokrywkę pierścienia i pobrać komórki i/lub pożywkę do przeprowadzenia wybranych analiz końcowych (np. Western blotting, FACS, itp.)25.</li>
</ol>

<ol><li>Resnick, N., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamic+forces+are+complex+regulators+of+endothelial+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression.</a> FASEB J. 9 (10), 874-882 (1995).</li>
<li>Malek, A. M., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+endothelial+cell+gene+expression+by+flow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Control of endothelial cell gene expression by flow.</a> J Biomech. 28 (12), 1515-1528 (1995).</li>
<li>Ando, J., Kamiya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-dependent+Regulation+of+Gene+Expression+in+Vascular+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Flow-dependent Regulation of Gene Expression in Vascular Endothelial Cells.</a> Jpn Heart J. 37 (1), 19-32 (1996).</li>
<li>Resnick, N., Yahav, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Gene+Regulation+by+Laminar+Shear+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Endothelial Gene Regulation by Laminar Shear Stress.</a> Adv Exp Med Biol. 430, 155-164 (1997).</li>
<li>Gaucher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+impact+of+physiological+shear+stress+on+endothelial+cells+gene+expression+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Hemorheol+Mico%22%5BJournal%5D)">In vitro impact of physiological shear stress on endothelial cells gene expression profile.</a> Clin Hemorheol Mico. 37 (1-2), 99-107 (2007).</li>
<li>Fisslthaler, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+cis+-Element+Regulating+Transcriptional+Activity+in+Response+to+Fluid+Shear+Stress+in+Bovine+Aortic+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endothelium-J+Endoth%22%5BJournal%5D)">Identification of a cis -Element Regulating Transcriptional Activity in Response to Fluid Shear Stress in Bovine Aortic Endothelial Cells.</a> Endothelium-J Endoth. 10 (4-5), 267-275 (2003).</li>
<li>Chen, W., Bacanamwo, M., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+p300+Histone+Acetyltransferase+Activity+Is+an+Early+Endothelial+Response+to+Laminar+Shear+Stress+and+Is+Essential+for+Stimulation+of+Endothelial+Nitric-oxide+Synthase+mRNA+Transcription%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Activation of p300 Histone Acetyltransferase Activity Is an Early Endothelial Response to Laminar Shear Stress and Is Essential for Stimulation of Endothelial Nitric-oxide Synthase mRNA Transcription.</a> J Biol Chem. 283 (24), 16293-16298 (2008).</li>
<li>Sumpio, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+PDGF-B+in+Endothelial+Cells+Exposed+to+Cyclic+Strain%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscl+Throm+Vas%22%5BJournal%5D)">Regulation of PDGF-B in Endothelial Cells Exposed to Cyclic Strain.</a> Arterioscl Throm Vas. 18 (3), 349-355 (1998).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triplex-forming+oligonucleotide+inhibits+the+expression+of+tissue+factor+gene+in+endothelial+cells+induced+by+the+blood+flow+shear+stress+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharm+Sinic%22%5BJournal%5D)">Triplex-forming oligonucleotide inhibits the expression of tissue factor gene in endothelial cells induced by the blood flow shear stress in rats.</a> Acta Pharm Sinic. 41 (9), 808-813 (2006).</li>
<li>Sumpio, B. E., Chang, R., Xu, W. -J., Wang, X. -J., Du, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+tPA+in+endothelial+cells+exposed+to+cyclic+strain%3A+role+of+CRE%2C+AP-2%2C+and+SSRE+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of tPA in endothelial cells exposed to cyclic strain: role of CRE, AP-2, and SSRE binding sites.</a> Am J Physiol. 273 (5 Pt 1), C1441-C1448 (1997).</li>
<li>Silberman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress-induced+transcriptional+regulation+via+hybrid+promoters+as+a+potential+tool+for+promoting+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nato+Adv+Sci+Inst+Se%22%5BJournal%5D)">Shear stress-induced transcriptional regulation via hybrid promoters as a potential tool for promoting angiogenesis.</a> Nato Adv Sci Inst Se. 12 (3), 231-242 (2009).</li>
<li>Dschietzig, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-induced+pressure+differentially+regulates+endothelin-1%2C+urotensin+II%2C+adrenomedullin%2C+and+relaxin+in+pulmonary+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Flow-induced pressure differentially regulates endothelin-1, urotensin II, adrenomedullin, and relaxin in pulmonary vascular endothelium.</a> Biochem Biophys Res Commun. 289 (1), 245-251 (2001).</li>
<li>Nagel, T., Resnick, N., Atkinson, W. J., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+selectively+upregulates+intercellular+adhesion+molecule-1+expression+in+cultured+human+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Shear stress selectively upregulates intercellular adhesion molecule-1 expression in cultured human vascular endothelial cells.</a> J Clin Invest. 94 (2), 885-891 (1994).</li>
<li>Bateman, G. A., Levi, C. R., Schofield, P., Wang, Y., Lovett, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+venous+manifestations+of+pulse+wave+encephalopathy%3A+windkessel+dysfunction+in+normal+aging+and+senile+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroradiology%22%5BJournal%5D)">The venous manifestations of pulse wave encephalopathy: windkessel dysfunction in normal aging and senile dementia.</a> Neuroradiology. 50 (6), 491-497 (2008).</li>
<li>Juurlink, B. H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+there+a+pulse+wave+encephalopathy+component+to+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Neurovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Is there a pulse wave encephalopathy component to multiple sclerosis.</a> Curr Neurovasc Res. 12 (2), 199-209 (2015).</li>
<li>Topper, J. N., Gimbrone, M. A. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+flow+and+vascular+gene+expression%3A+fluid+shear+stress+as+a+modulator+of+endothelial+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med+Today%22%5BJournal%5D)">Blood flow and vascular gene expression: fluid shear stress as a modulator of endothelial phenotype.</a> Mol Med Today. 5 (1), 40-46 (1999).</li>
<li>Tzima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanosensory+complex+that+mediates+the+endothelial+cell+response+to+fluid+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A mechanosensory complex that mediates the endothelial cell response to fluid shear stress.</a> Nature. 437 (7057), 426-431 (2005).</li>
<li>Li, Y. -S. J., Haga, J. H., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+the+effects+of+shear+stress+on+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells.</a> J Biomech. 38 (10), 1949-1971 (2005).</li>
<li>Reinhart-King, C. A., Fujiwara, K., Berk, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiologic+Stress-Mediated+Signaling+in+the+Endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Physiologic Stress-Mediated Signaling in the Endothelium.</a> Method Enzymol. 443, 25-44 (2008).</li>
<li>Frangos, J. A., McIntire, L. V., Eskin, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+induced+stimulation+of+mammalian+cell+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Shear stress induced stimulation of mammalian cell metabolism.</a> Biotechnol Bioeng. 32 (8), 1053-1060 (1988).</li>
<li>Lane, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel-plate+Flow+Chamber+and+Continuous+Flow+Circuit+to+Evaluate+Endothelial+Progenitor+Cells+under+Laminar+Flow+Shear+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress.</a> J Vis Exp. (59), (2012).</li>
<li>Reinitz, A., DeStefano, J., Ye, M., Wong, A. D., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+brain+microvascular+endothelial+cells+resist+elongation+due+to+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Human brain microvascular endothelial cells resist elongation due to shear stress.</a> Microvasc Res. 99, 8-18 (2015).</li>
<li>Dewey, C. F., Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Dynamic+Response+of+Vascular+Endothelial+Cells+to+Fluid+Shear+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">The Dynamic Response of Vascular Endothelial Cells to Fluid Shear Stress.</a> J Biomed Eng. 103 (3), 177(1981).</li>
<li>Dardik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+orbital+and+laminar+shear+stress+on+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Differential effects of orbital and laminar shear stress on endothelial cells.</a> J Vasc Surg. 41 (5), 869-880 (2005).</li>
<li>Honda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-induced+adhesion+to+activated+endothelium+and+to+vascular+cell+adhesion+molecule-1+in+lymphocytes+transfected+with+the+N-formyl+peptide+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ligand-induced adhesion to activated endothelium and to vascular cell adhesion molecule-1 in lymphocytes transfected with the N-formyl peptide receptor.</a> J Immunol. 152 (8), 4026-4035 (1994).</li>
<li>Watt, S. M., Gschmeissner, S. E., Bates, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PECAM-1%3A+its+expression+and+function+as+a+cell+adhesion+molecule+on+hemopoietic+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">PECAM-1: its expression and function as a cell adhesion molecule on hemopoietic and endothelial cells.</a> Leukemia Lymphoma. 17 (3-4), 229-244 (1995).</li>
<li>Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+endothelial+cell+adhesion+molecule-1+and+mechanotransduction+in+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Platelet endothelial cell adhesion molecule-1 and mechanotransduction in vascular endothelial cells.</a> J Intern Med. 259 (4), 373-380 (2006).</li>
<li>Dusserre, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PECAM-1+Interacts+With+Nitric+Oxide+Synthase+in+Human+Endothelial+Cells%3A+Implication+for+Flow-Induced+Nitric+Oxide+Synthase+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscl+Throm+Vas%22%5BJournal%5D)">PECAM-1 Interacts With Nitric Oxide Synthase in Human Endothelial Cells: Implication for Flow-Induced Nitric Oxide Synthase Activation.</a> Arterioscl Throm Vas. 24 (10), 1796-1802 (2004).</li>
<li>Bagi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PECAM-1+Mediates+NO-Dependent+Dilation+of+Arterioles+to+High+Temporal+Gradients+of+Shear+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscl+Throm+Vas%22%5BJournal%5D)">PECAM-1 Mediates NO-Dependent Dilation of Arterioles to High Temporal Gradients of Shear Stress.</a> Arterioscl Throm Vas. 25 (8), 1590-1595 (2005).</li>
</ol>

J. Winny Yun jest stypendystką fundacji Annette Funicello. J. Steven Alexander ma wsparcie badawcze z Wydziału Neurologii, LSUHSC-S.

Konstrukcja układu pierścieni ścinanych do wystawiania komórek śródbłonka na ścinanie jest prostym podejściem do wykonywania badań naprężeń ścinających. Niemniej jednak istnieje kilka kroków, które mają kluczowe znaczenie dla uzyskania doskonałych pierścieni ścinanych i lepszych wyników. Między pierścieniem wewnętrznym i zewnętrznym należy wykonać pełne uszczelnienie, aby zapobiec wyciekom mediów, które mogłyby spowodować niespójne naprężenia ścinające między próbkami. Jeżeli nie zostanie wykonane pełne uszczelnienie, na...

Wykazano, że naprężenie ścinające płynu moduluje programy genów śródbłonka 1-5 poprzez aktywację elementów cis-regulatorowych6, aktywność acetylotransferazy histonowej7 i elementów odpowiedzi na stres ścinający (SSRE)8. Naprężenie ścinające wpływa na wkład śródbłonka w krzepnięcie poprzez modulację ekspresji czynnikatkankowego 9 i tkankowego aktywatora plazminogenu (tPA)10. Naprężenie ścinające wpływa również na kontrolę angiogenezy11 i przebudowę naczyń poprzez regulację syntezy i reakcji PDGF-B8. Śródbłonkowe mediatory wazoaktywne adrenomedullina, endotelina-1, urotensyna II i relaksyna są również regulowane przez ścinanie12. Transkrypcja śródbłonkowej produkcji syntazy tlenku azotu i produkcji tlenku azotu jest zależna od ścinania10. Ścinanie kontroluje również śródbłonkową ekspresję ICAM-113. Naprężenie ścinające wywołane przepływem może zatem silnie wpływać na dużą różnorodność reakcji śródbłonka. Co ważne, pulsacje naczyń krwionośnych wydają się obecnie odgrywać ważną rolę w patofizjologii zarówno prawidłowego starzenia się naczyń, jak i form otępienia naczyniowego14, a nawet mogą przyczyniać się do innych chorób neurodegeneracyjnych, takich jak stwardnienie rozsiane15.
Komórki śródbłonka żylnego i tętniczego są z natury narażone na różnorodne wzorce przepływu hemodynamicznego in vivo, a wiele różnych fenotypów komórek śródbłonka może być wykazywanych16. W zależności od wielkości i okresowości przepływu, wpływ na komórki śródbłonka może obejmować aktywację komórek zapalnych i apoptozę, co może odzwierciedlać zmiany w ekspresji genów lub białek17,18. Badania nad reakcjami komórek śródbłonka na zjawisko ścinania pozostają zatem skomplikowane ze względu na trudności w tworzeniu modeli in vitro, które odpowiednio wytwarzają takie wzorce ścinania.
Wiele różnych eksperymentalnych protokołów zostało opracowanych w celu zastosowania naprężeń ścinających płynu do monowarstw komórek śródbłonka. Jednym z najczęściej stosowanych systemów jest równoległa płytowa komora przepływowa, która tworzy równomierny przepływ laminarny w komorze19-21. Pompa perystaltyczna jest zwykle podłączona w celu wytworzenia przepływu okresowego, który może podsumować charakterystykę przepływu zwykle występującą w wielu miejscach in vivo22. Inna popularna konfiguracja wykorzystuje model "stożka i płyty", w którym naprężenie ścinające płynu jest określane przez prędkość obrotową stożka23. Zarówno systemy, jak i inne podobne do nich układy, mogą być żmudne w konfiguracji i wymagać komponentów, które mogą być stosunkowo drogie i niedostępne dla wielu laboratoriów.
Innym poważnym ograniczeniem tych obecnych modeli jest stosunkowo mała liczba powtórzonych badań, które mogą być wykonywane jednocześnie, każde o stosunkowo małej powierzchni. Zwiększa to czas i złożoność takich podejść. Dlatego idealnym modelem, który indukuje jednokierunkowe i okresowe ścinanie, może być taki, w którym można łatwo skonfigurować dużą liczbę powtórzeń badań, z których każdy ma stosunkowo dużą powierzchnię. Ponadto wyżej wymienione modele wymagają dość wyrafinowanej konfiguracji, co dla wielu użytkowników może być zbyt kosztowne. Model, który może powodować zakłócenia ścinania płynów przy użyciu podstawowych materiałów laboratoryjnych, może mieć kilka zalet.
Prosta i bardzo ekonomiczna metoda stosowania jednokierunkowego, okresowego naprężenia ścinającego polega na umieszczeniu okrągłych czaszek na wytrząsarce orbitalnej24. Protokół ten jest bardzo prosty i w razie potrzeby można go skalować w celu uzyskania dużej liczby powtórzeń badań, z których każdy ma stosunkowo dużą powierzchnię. Jednak komórki znajdujące się w środku naczynia są wystawione na inne wzorce przepływu niż komórki wzdłuż obwodu, powodując mieszane komórkowe odpowiedzi fenotypowe w tym samym naczyniu.
W tym bieżącym raporcie opisujemy budowę i zastosowanie 'pierścieni ścinających', naszego modelu do tworzenia jednokierunkowych i okresowych naprężeń ścinających. Konstrukcja pierścienia ścinanego skutecznie ogranicza "mieszane" fenotypy wywołane ścinaniem komórkowym poprzez ograniczenie ścieżki przepływu w okrągłej naczyniu hodowlanej do peryferii poprzez umieszczenie pierścienia wewnętrznego. Konstrukcja i działanie pierścienia ścinającego jest proste i ekonomiczne i można je łatwo skalować, aby pomieścić szeroką gamę wytrząsarek orbitalnych przy użyciu powszechnie dostępnych materiałów do hodowli tkankowych. Model ten można zastosować w eksperymentach z komórkami śródbłonka w celu zapewnienia jednokierunkowych i okresowych wzorców przepływu na poziomie fizjologicznym i patofizjologicznym.

<table><tbody><tr><td>100 x 20 mm plastikowe naczynie do hodowli tkankowych</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>Naczynia muszą być polistyrenowe</td></tr><tr><td>150 x 25 mm plastikowe naczynie do hodowli tkankowych</td><td>Corning</td><td>430599</td><td>Naczynia muszą być polistyrenowe</td></tr><tr><td>150 mm szklane szalki Petriego</td><td>Fisher</td><td>3160150BO</td><td></td></tr><tr><td>15 ml plastikowe rurki do kultur tkankowych z polistyrenu</td><td>Falcon</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek metylenu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D65100</td><td></td></tr><tr><td>uszczelniacz z kauczuku silikonowego</td><td>DAP</td><td>7079808641</td><td></td></tr><tr><td>etanol</td><td>Decon</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta transferowa 3 ml</td><td></td><td></td> Rękawice do nożyczek do papieru do drukarki Becton-Dickinson 357524 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>narzędzie obrotowe i zestaw</td><td>Dremel</td><td>4000-6/50</td><td></td></tr><tr><td>narzędzie obrotowe głowica tnąca</td><td>Dremel</td><td>EZ476</td><td></td></tr><tr><td>narzędzie obrotowe głowica</td><td></td><td></td><td></td>wiertarska</tr><tr><td>wytrząsarka orbitalna</td><td></td> wody <td></td> destylowanej VWR 57018-754 <td></td></tr><tr><td>inkubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> mikronaczyniowy śródbłonka siatkówki szczura <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Biologia komórkowa</td><td>RA-6065</td><td></td></tr></tbody></table>

montaż i zastosowanie "pierścieni ścinających": nowy model śródbłonka dla orbitalnego, jednokierunkowego i okresowego przepływu płynów oraz naprężeń ścinających

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Odchylenia od normalnych poziomów i wzorce ścinania płynu naczyniowego odgrywają ważną rolę w fizjologii i patofizjologii naczyń krwionośnych, wywołując adaptacyjne i patologiczne zmiany w fenotypie śródbłonka i ekspresji genów. W szczególności nieprzystosowawcze skutki okresowego, jednokierunkowego naprężenia ścinającego wywołanego przepływem mogą wywoływać różnorodne skutki dla kilku typów komórek naczyniowych, w szczególności komórek śródbłonka. Chociaż do tej pory wyhodowano komórki śródbłonka o różnym pochodzeniu anatomicznym, dogłębne analizy ich reakcji na ścinanie płynu były utrudnione przez względną złożoność modeli ścinania (np. równoległa komora przepływu płytkowego, stożek i model przepływu płytkowego). Chociaż wszystkie te podejścia są doskonałe, takie modele są skomplikowane technicznie i mają wady, takie jak stosunkowo długi i złożony czas konfiguracji, małe powierzchnie, wymagania dotyczące pomp i ciśnienia, często wymagające uszczelniaczy i uszczelek, co stwarza wyzwania zarówno dla utrzymania sterylności, jak i niemożności przeprowadzenia wielu eksperymentów. Gdyby jednak dostępne były modele przepływu i ścinania o wyższej przepustowości, większy postęp w zakresie reakcji ścinania śródbłonka naczyniowego, w szczególności badań nad okresowym ścinaniem na poziomie molekularnym, mógłby być szybszy. W tym miejscu opisujemy budowę i zastosowanie pierścieni ścinających: nowatorski, prosty w montażu i niedrogi model hodowli tkankowej o stosunkowo dużej powierzchni, który z łatwością pozwala na dużą liczbę powtórzeń eksperymentalnych w jednokierunkowych, okresowych badaniach naprężeń ścinających na komórkach śródbłonka.

W niniejszym opracowaniu prezentujemy reprezentatywne wyniki uzyskane zarówno dla monowarstw komórek śródbłonka mózgu hCMEC/D3, jak i komórek śródbłonka mikrokrążenia siatkówki szczura, hodowanych w pierścieniach ścinających.
Po doprowadzeniu monowarstw komórek śródbłonka mózgu hCMEC/D3 do konfluencji w pełnej pożywce EBM, pierścienie ścinające umieszczono na wytrząsarce orbitalnej na 72 godziny. Korzystając z równania z kroku 3...

Różne poziomy i wzorce ścinania płynu są znane z modulowania ekspresji genów śródbłonka, fenotypu i podatności na choroby. Omawiamy montaż i zastosowanie "pierścieni ścinających": modelu, który wytwarza jednokierunkowe, okresowe wzorce naprężeń ścinających. Pierścienie ścinane są proste w montażu, ekonomiczne i mogą wytwarzać wysoką wydajność ogniw.

Montaż i zastosowanie "pierścieni ścinających": nowy model śródbłonka dla orbitalnego, jednokierunkowego i okresowego przepływu płynów oraz naprężeń ścinających

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

Ogólnym celem tego modelu jest opracowanie prostej i ekonomicznej metody prowadzenia in vitro okresowych badań przepływu płynów oraz naprężeń ścinających na komórkach śródbłonka. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu fizjologii komórek śródbłonka, takie jak wpływ okresowego ścinania na kształt, strukturę i funkcjonowanie komórek śródbłonka.Główną zaletą tej techniki jest wykorzystanie prosto skonstruowanego urządzenia do hodowli tkankowej, które zapewnia stosunkowo duże powierzchnie do oceny odpowiedzi komórkowych. Procedurę tę zaprezentuje pan Luke White, student medycyny w moim laboratorium. Rozpocznij procedurę od użycia oprogramowania do prezentacji w celu utworzenia szablonu konstrukcji pierścienia ścinającego z zewnętrznym profilem krawędzi o średnicy 150 mm i średnicą wewnętrzną 100 mm umieszczoną w centrum koła o średnicy 150 mm.Wydrukuj szablon na arkuszu białego papieru A4. Pracując pod dygestorium z odpowiednią wentylacją i w rękawiczkach, pipetuj 10 ml chlorku metylenu do szklanej szalki Petriego o średnicy 150 mm. Kluczowe jest użycie szklanej szalki, ponieważ chlorek metylenu rozpuszcza większość tworzyw sztucznych.Ustaw plastikową szalkę Petriego o średnicy 150 mm na zewnętrznym szablonie do ścinania. Za pomocą narzędzia rotacyjnego wywierć otwór o średnicy 3 mm w centrum szalki o średnicy 100 mm. Usuń wszelkie opiłki plastiku powstałe podczas wiercenia.Trzymając szalkę Petriego o średnicy 100 mm w rękawiczce, należy ją odwrócić i zanurzyć górną krawędź szalki w kąpieli z chlorkiem metylenu na około trzy sekundy. Pozostawić nadmiar chlorku metylenu do odcieknięcia z szalki 100 mm, a następnie szybko przenieść zwilżoną krawędź szalki na środek szalki o średnicy 150 mm. Należy starannie dopasować szalkę 100 mm do zaznaczonego szablonu.Delikatnie obróć szalkę o średnicy 100 mm kilka razy zgodnie i przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, aby zapewnić dobre przyleganie do szalki o średnicy 150 mm. Po wyschnięciu chlorku metylenu odwróć nowo połączone szalki Petriego i dokładnie sprawdź punkty styku. Jeśli szczelne połączenie nie utworzyło się całkowicie, wstrzyknij 0,5 ml chlorku metylenu przez otwór o średnicy 3 mm za pomocą pipety transferowej.Podnieś szalkę i delikatnie nią obróć, aby dichlorometan dotarł do krawędzi. Po upewnieniu się, że między dwiema szalkami Petrigo powstało szczelne połączenie, zamknij otwór w szalce 100 mm, nakładając 3 mm pasek silikonowego uszczelniacza. Za pomocą narzędzia rotacyjnego z płaską głowicą tnącą odetnij górną część o długości 3 cm z 15 mm konikalnej probówki polistyrenowej do hodowli tkankowej, pozostawiając co najmniej 1 cm probówki poniżej zakrętki.Używając płaskiej strony głowicy tnącej, wypoleruj krawędź przeciętej probówki, aż będzie gładka i płaska. Usuń wszelkie plastikowe opiłki powstałe podczas szlifowania. Za pomocą markera odrysuj odciętą probówkę typu conical 15 milliliter na pokrywie szalki 150 millimeter, w odległości około 0.5 centimeters od krawędzi szalki.Wywierć otwór wewnątrz narysowanego koła, zachowując margines około jednego do dwóch milimetrów od krawędzi koła. Umieść odciętą górną część probówki typu conocole nad wywierconym otworem. Używając pipety transferowej, nanieś około jednej czwartej mililitra, czyli 250 µL chlorku metylenu na odcięte krawędzie probówki conocole, aby przymocować probówkę conocole do 150 mm pokrywy.Na koniec uszczelnij pokrywkę o średnicy 150 mm na szalce o średnicy 150 mm, nakładając warstwę silikonowego uszczelniacza gumowego o grubości 1 mm wzdłuż wewnętrznej krawędzi górnej szalki Petriego. Przedstawiono schemat zmontowanego pierścienia uszczelniającego. Kolor niebieski oznacza obszar z wysianymi komórkami śródbłonka.Zewnętrzne i wewnętrzne czerwone strzałki wskazują ruch orbitalny pierścienia ścinającego oraz medium wewnątrz pierścienia podczas umieszczenia go na wytrząsarce orbitalnej. W celu przygotowania do sterylizacji należy pipetować około 10 ml PBS do nowo utworzonego pierścienia ścinającego, poprzez otwór rurki stożkowej o pojemności 15 ml. Należy zamieszać roztwór, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia z wnętrza pierścienia ścinającego.Usuń PBS za pomocą pipety Pasteura i aspiratora próżniowego. Powtarzaj płukanie PBS do czasu usunięcia wszystkich zanieczyszczeń. W celu sterylizacji pierścienia ścinającego zastosowana zostanie kombinacja płukania 70% etanolem oraz naświetlania promieniami UV.Odkręć odpowietrzaną zakrętkę, pipetuj około 10 mililitrów 70% etanolu przez otwór dostępowy, a następnie zakręć zakrętkę. Kilkukrotnie obracaj i odwracaj pierścień wysiewowy, upewniając się, że jego wnętrze zostało dokładnie wypłukane. W komorze z laminarnym przepływem powietrza odessaj nadmiar 70% etanolu.Za pomocą butelki z atomizerem dokładnie spryskaj port dostępu oraz zakrętkę 70% ethanol. Następnie umieść pierścień ścinający i zakrętkę pod promieniowaniem UV w komorze do hodowli tkanek do całkowitego wyschnięcia. Po wyschnięciu pierścienia ścinającego przykręć z powrotem zakrętkę.Sterylne pierścienie do ścinania należy przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu ich wykorzystania w wysiewaniu kultur komórkowych. Aby przygotować się do badania naprężeń ścinających, w pierwszej kolejności należy wysiać komórki śródbłonka w sterylnych pierścieniach do ścinania, zgodnie ze standardowym protokołem hodowli komórkowych. Przed rozpoczęciem badań nad przepływem należy doprowadzić kulturę do stanu konfluencji.Po osiągnięciu przez komórki pełnej konfluencji, należy umieścić pierścienie ścinające do grupy eksperymentalnej na wytrząsarce orbitalnej, ustawionej na dolnej półce inkubatora, aby zminimalizować naprężenia półki i wibracje. Pierścienie ścinające dla statycznej grupy kontrolnej należy umieścić w tym samym inkubatorze. Pozostawić pierścienie ścinające na wytrząsarce przez wymagany czas aplikacji naprężenia ścinającego.Po wystawieniu warstw komórek na działanie sił ścinających przez pożądany czas, należy wyjąć pierścienie ścinające z inkubatora. Zdejmij pokrywkę pierścienia ścinającego i pobierz komórki oraz/lub medium do planowanej analizy końcowej. Należy pamiętać, że po otwarciu pierścieni ścinających badacze mogą zebrać komórki i medium do analizy, stosując kilka różnych metod.Przedstawiono reprezentatywne wyniki wyglądu monowarstw ludzkich komórek śródbłonka mózgu CMEC D3 w pierścieniach ścinających po 48 godzinach okresowego ścinania płynu lub ekspozycji statycznej; zaobserwowano, że orientacja hodowli nie zawsze jest równoległa do kierunku przepływu wskazanego przez strzałki. Niektóre odpowiedzi na okresowe ścinanie pokazano na monowarstwach komórek śródbłonka mikrokrążenia siatkówki szczura. 72 godziny okresowego ścinania płynu w pierścieniach ścinających doprowadziły do znacznej redukcji cząsteczki adhezyjnej płytek krwi i komórek śródbłonka w stosunku do kontroli załadunku Beta-actin.Po opanowaniu techniki, kilka pierścieni ścinających (Shear Rings) można wykonać w ciągu około trzech godzin, jeśli procedura zostanie przeprowadzona prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby uważnie dopasować naczynie wewnętrzne do naczynia zewnętrznego, tak aby między nimi utworzyła się szczelna uszczelka. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak konstruować i używać pierścieni ścinających jako prostej metody do przeprowadzania okresowych badań przepływu płynów i naprężeń ścinających in vitro na komórkach śródbłonka. Proszę pamiętać, że praca z chlorkiem metylenu może być niebezpieczna i należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak praca pod wyciągiem laboratoryjnym, podczas wykonywania kroków, które tego wymagają.

the-assembly-application-shear-rings-novel-endothelial-model-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy metodę poddawania przylegających komórek naprężeniom ścinającym w przepływie laminarnym w sterylnym obwodzie przepływu ciągłego. Poprzez przezroczystą komorę można badać adhezję i morfologię komórek, a z obwodu można pobierać próbki do analizy metabolitów oraz zbierać komórki po ekspozycji na siły ścinające do dalszych eksperymentów lub hodowli.

Komora przepływowa z równoległymi płytkami i obwód przepływu ciągłego do oceny komórek progenitorowych śródbłonka pod wpływem naprężenia ścinającego w przepływie laminarnym

Niniejszy artykuł przedstawia wszechstronną metodę tworzenia pierścieni tkankowych pochodzenia komórkowego poprzez samoorganizację komórkową. Komórki mięśni gładkich zasiane w pierścieniowatych studzienkach agarozowych agregują i kurczą się, tworząc wytrzymałe tkanki trójwymiarowe (3D) w ciągu 7 dni. Pierścienie tkankowe o skali milimetrowej nadają się do testów mechanicznych i służą jako podstawowe elementy do montażu tkanek.

Kierowana samoorganizacja komórkowa w celu wytwarzania pierścieni tkankowych pochodzenia komórkowego do analiz biomechanicznych i inżynierii tkankowej

Platforma mikrokanałów na chipie została opracowana przez połączenie techniki fotorezystu fotolitografii rozpływowej, miękkiej litografii i mikrofluidyki. Platforma mikrokanalizacyjna naśladuje trójwymiarową (3D) geometrię mikronaczyń in vivo, działa w kontrolowanym ciągłym przepływie perfuzyjnym, umożliwia wysokiej jakości obrazowanie w czasie rzeczywistym i może być stosowana do badań mikronaczyniowych.

Procedura opracowywania wielogłębokościowych, okrągłych, śródbłonkowych mikrokanałów o przekroju międzybłonkowym na chipie

Ten manuskrypt przedstawia metodę formowania wtryskowego do inżynierii mikronaczyń, które podsumowują fizjologiczne właściwości śródbłonka. Proces oparty na mikroprzepływach tworzy opatentowane sieci naczyniowe 3D z dostosowanymi warunkami, takimi jak przepływ, skład komórkowy, geometria i gradienty biochemiczne. Opisano proces wytwarzania i przykłady potencjalnych zastosowań.

Mikrowzorowanie i montaż trójwymiarowych mikonaczyń

Tutaj przedstawiono przebieg pracy dla hodowli i analizy ekspresji genów komórek śródbłonka pod wpływem naprężeń ścinających. Uwzględniono fizyczny układ do jednoczesnego przechowywania i monitorowania wielu komór przepływowych w kontrolowanym środowisku oraz zastosowanie egzogennego referencyjnego RNA do ilościowej reakcji PCR.

Analiza ekspresji genów komórek śródbłonka narażonych na naprężenia ścinające przy użyciu wielu komór przepływowych z równoległą płytką

Celem tego protokołu jest opisanie zmodyfikowanej równoległej komory przepływowej do wykorzystania w badaniu w czasie rzeczywistym aktywacji mechanowrażliwych kanałów jonowych przez naprężenie ścinające.

Elektrofizjologiczne zapisy prądów jonowych pojedynczych ogniw pod wpływem dobrze zdefiniowanego naprężenia ścinającego

Ten protokół opisuje metodę powlekania w celu ograniczenia wzrostu komórek śródbłonka do określonego obszaru 6-dołkowej płytki w celu przyłożenia naprężeń ścinających przy użyciu modelu wytrząsarki orbitalnej.

Segmentacja wzrostu komórek śródbłonka w 6-dołkowych płytkach na wytrząsarce orbitalnej do badań mechanobiologicznych

Tutaj dostarczamy chip mikroprzepływowy i automatycznie sterowany, wysoce wydajny system mikroprzepływowy krążenia, który podsumowuje początkowe mikrośrodowisko neowaskularyzacji, umożliwiając stymulację komórek śródbłonka (EC) przez wysokie naprężenie ścinające światło, fizjologiczny poziom przepływu przezśródbłonkowego i rozkład różnych czynników wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) jednocześnie.

Model mikroprzepływowy naśladujący początkowe zdarzenie neowaskularyzacji

Istnieje potrzeba określenia, które zmiany miażdżycowe będą postępować w unaczynieniu wieńcowym, aby kierować interwencją przed wystąpieniem zawału mięśnia sercowego. W tym artykule przedstawiono biomechaniczne modelowanie tętnic za pomocą optycznej tomografii koherentnej przy użyciu technik interakcji płyn-struktura w komercyjnym solverze elementów skończonych, aby pomóc przewidzieć tę progresję.

Optyczna tomografia koherentna Biomechaniczna analiza interakcji płyn-struktura progresji miażdżycy tętnic wieńcowych

Przedstawiamy tutaj protokół do wytworzenia i obsługi układu mikrofluidalnego, który naraża komórki śródbłonka na zsynchronizowany oscylatorny hiperglikemię i pulsujące naprężenia ścinające. Takie podejście zapewnia fizjologicznie istotny in vitro model do badania cukrzycowej dysfunkcji śródbłonka. Ten protokół umożliwia ilościowe pomiary stresu oksydacyjnego i reakcji komórek śródbłonka.

System mikrofluidyczny do modelowania dysfunkcji endotelialnych w warunkach połączonego fizjologicznego pulsującego stresu ścinającego i oscylacyjnej hiperglikemii

Poznaj metodę pierścieni ścinających do badania wpływu okresowego przepływu płynów na komórki śródbłonka. Prosta, ekonomiczna technika umożliwia ocenę morfologii i funkcji komórek w warunkach kontrolowanego naprężenia ścinającego.

Montaż i zastosowanie pierścieni ścinających: nowy model śródbłonka dla orbitalnego, jednokierunkowego i okresowego przepływu płynów oraz naprężeń ścinających (Wideo) | JoVE Journal

Montaż i zastosowanie "pierścieni ścinających": nowy model śródbłonka dla orbitalnego, jednokierunkowego i okresowego przepływu płynów oraz naprężeń ścinających

Przeglądaj więcej filmów