Montaż i zastosowanie "pierścieni ścinających": nowy model śródbłonka dla orbitalnego, jednokierunkowego i okresowego przepływu płynów oraz naprężeń ścinających

Ogólnym celem tego modelu jest stworzenie prostej i ekonomicznej metody badań in vitro okresowego przepływu płynów i naprężeń ścinających na komórkach śródbłonka. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie fizjologii komórek śródbłonka. Na przykład, w jaki sposób okresowe ścinanie wpływa na kształt, strukturę i funkcjonowanie komórek śródbłonka.

Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje ona prosto zmontowane urządzenie do hodowli tkankowej, które zapewnia stosunkowo duże powierzchnie do oceny odpowiedzi komórkowych. Tę procedurę zademonstruje pan Luke White, student medycyny w moim laboratorium. Rozpocznij tę procedurę od użycia oprogramowania do prezentacji, aby utworzyć szablon konstrukcyjny pierścienia ścinanego o profilu krawędzi zewnętrznej 150 milimetrów i średnicy wewnętrznej 100 milimetrów umieszczonym w środku okręgu o średnicy 150 milimetrów.

Wydrukuj szablon na białym arkuszu papieru A4. Pracując pod wyciągiem z odpowiednią wentylacją i w rękawiczkach, należy pobrać pipetę z 10 milimetrowym chlorkiem metylenu do szklanej szalki Petriego o średnicy 150 milimetrów. Bardzo ważne jest, aby naczynie było szklane, ponieważ chlorek metylenu rozpuszcza większość tworzyw sztucznych.

Dopasuj plastikową szalkę Petriego o grubości 150 milimetrów do zewnętrznego szablonu ścinającego. Użyj narzędzia obrotowego, aby wywiercić trzy 3-milimetrowe otwory w środku 100-milimetrowej naczynia. Usuń wszelkie wióry plastikowe powstałe podczas wiercenia.

Trzymając 100-milimetrową szalkę Petriego ręką w rękawiczce, odwróć i zanurz górną krawędź szalki w kałuży chlorku metylenu na około trzy sekundy. Pozwól, aby nadmiar chlorku metylenu spłynął ze 100-milimetrowej naczynia, a następnie szybko przenieś zwilżoną krawędź naczynia w dół na środek 150-milimetrowej płytki. Ostrożnie wyrównaj 100-milimetrową czaszę do zaznaczonego szablonu.

Delikatnie obróć 100-milimetrową miskę zgodnie z ruchem wskazówek zegara i kilka razy przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, aby zapewnić dobrą przyczepność do 150-milimetrowej czaszy. Po wyschnięciu chlorku metylenu odwróć nowo oprawione szalki Petriego i dokładnie sprawdź punkty kontaktu. Jeśli szczelne uszczelnienie nie zostało całkowicie uformowane, wstrzyknąć 0,5 mililitra chlorku metylenu przez 3-milimetrowy otwór za pomocą pipety transferowej.

Podnieś naczynie i delikatnie je obróć, aby chlorek metylenu dotarł do krawędzi. Po upewnieniu się, że między dwiema szalkami Petriego powstało szczelne uszczelnienie, uszczelnij otwór w 100-milimetrowej szalce, nakładając 3-milimetrową kulkę uszczelniacza z gumy silikonowej. Za pomocą narzędzia obrotowego wyposażonego w płaską głowicę tnącą odetnij górną 3-centymetrową część 15-milimetrowej probówki do hodowli tkankowej z polistyrenu conocole, pozostawiając co najmniej jeden centymetr rurki poniżej nasadki.

Użyj płaskiej strony głowicy tnącej, aby wypolerować krawędź ciętej rury, aż będzie gładka i płaska. Usuń wszelkie wióry plastikowe powstałe podczas mielenia. Za pomocą markera odetnij 15-mililitrową rurkę concole na pokrywie 150-milimetrowej naczynia w odległości około 0,5 centymetra od krawędzi naczynia.

Wywierć otwór wewnątrz narysowanego koła, pozostawiając margines około jednego do dwóch milimetrów od krawędzi koła. Umieść odciętą rurkę conocole na wywierconym otworze. Za pomocą pitette transferowej nałóż około ćwierć mililitra lub 250 mikrolitrów chlorku metylenu na odcięte krawędzie rurki conocole, aby związać rurkę conocole z 150-milimetrową pokrywką.

Na koniec uszczelnij 150-milimetrową pokrywkę na 150-milimetrowej szalce, nakładając kulkę uszczelniacza z gumy silikonowej o grubości jednego milimetra wokół wewnętrznej krawędzi górnej szalki Petriego. Pokazano schemat zmontowanego pierścienia do przypalania. Kolor niebieski reprezentuje obszar platerowanych komórek śródbłonka.

Zewnętrzne i wewnętrzne czerwone strzałki wskazują ruch orbitalny pierścienia ścinającego i mediów wewnątrz pierścienia ścinanego po umieszczeniu na wytrząsarce orbitalnej. Przygotuj się do sterylizacji, pipetując około 10 milimetrów PBS do nowo utworzonego pierścienia ścinanego przez 15-mililitrowy port rurki conocole. Zakręć dookoła, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia z wnętrza pierścienia ścinanego.

Wyjmij PBS za pomocą pipety Pasteura i aspiratora próżniowego. Powtarzaj mycie PBS, aż wszystkie zanieczyszczenia zostaną usunięte. Do sterylizacji pierścienia ścinanego zostanie zastosowana kombinacja płukania 70% etanolem i naświetlania promieniowaniem UV.

Odkręć odpowietrzoną nakrętkę, odpipetuj około 10 mililitrów 70% etanolu przez port dostępowy i ponownie zakręć nakrętkę. Obróć i odwróć pierścień do przypalania wiele razy, upewniając się, że wnętrze pierścienia do przypalania jest dokładnie umyte. Pod kapturem do hodowli tkankowej odessać nadmiar 70% etanolu.

Za pomocą butelki z rozpylaczem dokładnie spryskaj port dostępowy i nakrętkę 70% etanolem. Następnie umieść pierścień ścinający i nasadkę pod promieniowaniem UV w kapturze do hodowli tkankowej, aż do całkowitego wyschnięcia. Gdy pierścień ścinany wyschnie, przykręć nakrętkę z powrotem.

Przechowuj wysterylizowane pierścienie ścinane w temperaturze pokojowej do czasu, aż zostaną użyte do posiewu kultur komórkowych. Aby przygotować się do badania naprężeń ścinających, najpierw umieść komórki śródbłonka w wysterylizowanych pierścieniach ścinanych zgodnie ze standardowym protokołem hodowli komórek. Pozwól, aby kultura osiągnęła zbieżność przed rozpoczęciem badań przepływu.

Gdy komórki osiągną zbieg, umieść eksperymentalne pierścienie ścinane na wytrząsarce orbitalnej, która jest umieszczona na dolnej półce w inkubatorze, aby zminimalizować naprężenia i wibracje półki. Umieść pierścienie ścinane grupy kontroli statycznej w tym samym inkubatorze. Pozostaw pierścienie ścinane na wytrząsarce na żądany czas przyłożenia naprężeń ścinających.

Po wystawieniu warstw komórek na ścinanie przez żądany okres czasu, usuń pierścienie ścinane z inkubatora. Zdejmij pokrywę pierścienia ścinanego i wyjmij komórki i/lub media do żądanej analizy punktu końcowego. Należy pamiętać, że po otwarciu pierścieni ścinanych badacze mogą pobrać komórki i pożywkę do analizy przy użyciu kilku metod.

Przedstawiono reprezentatywne wyniki wyglądu monowarstw ludzkich komórek śródbłonka mózgu CMEC D3 w pierścieniach ścinających, po 48 godzinach okresowego ścinania płynu lub ekspozycji statycznej zaobserwowano, że wyrównanie kultury nie zawsze jest równoległe do kierunku przepływu wskazanego przez strzałki. Niektóre reakcje na okresowe ścinanie są pokazane w monowarstwach komórek śródbłonka mikronaczyniowego siatkówki szczura. 72 godziny okresowego ścinania płynu w pierścieniach ścinanych spowodowały znaczne zmniejszenie cząsteczki adhezji komórek śródbłonka płytkowego w stosunku do kontroli obciążenia beta-aktyną.

Po opanowaniu można zbudować kilka pierścieni ścinanych w ciągu około trzech godzin, jeśli zostanie to wykonane prawidłowo Podczas próby tej procedury ważne jest, aby pamiętać o ostrożnym wyrównaniu naczynia wewnętrznego z zewnętrznym naczyniem i aby między nimi utworzyło się szczelne uszczelnienie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak konstruować i używać pierścieni ścinanych jako prostej metody wykonywania in vitro okresowych badań przepływu płynów i naprężeń ścinających na komórkach śródbłonka. Nie zapominaj, że praca z chlorkiem metylenu może być niebezpieczna, a środki ostrożności, takie jak praca pod wyciągiem, powinny być zawsze podejmowane podczas wykonywania czynności, które tego wymagają.