Wyzwalanie stresu i śmierci komórek za pomocą konwencjonalnej mikroskopii konfokalnej z laserem UV
3 lutego 2017
Ukierunkowane manipulacje mające na celu wywołanie ukierunkowanego stresu lub śmierci w poszczególnych komórkach były stosunkowo trudne do osiągnięcia. W tym artykule opisano metodę ablacji w rozdzielczości pojedynczej komórki, polegającą na selektywnym stresowaniu i zabijaniu pojedynczych komórek w hodowli komórkowej i żywych zwierzętach, w oparciu o standardowy konfokalny laser UV.
Ogólnym celem tego podejścia do ablacji komórek jest selektywne stresowanie lub zabijanie pojedynczych komórek w hodowli komórkowej lub u żywych zwierząt. Metoda ta pozwala naukowcom badać los pojedynczej umierającej komórki i reakcję komórek, takich jak mikroglej i astrocyty, na otaczające miejsce ablacji. Główną zaletą tej techniki jest precyzyjne celowanie w pojedyncze komórki, co można osiągnąć za pomocą zwykłego mikroskopu konfokalnego, który jest wyposażony w laser o długości 405 nanometrów.
Używamy danio pręgowanego jako systemu modelowego do badania chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba neuronu ruchowego czy otępienie czołowo-skroniowe. Wizualizacja śmierci neuronu ruchowego i jej następstw stanowi doskonałą okazję do lepszego zrozumienia dynamicznych procesów związanych z chorobą. Nasze podejście do wywoływania stresu komórkowego w sposób zależny od dawki pozwala na szczegółową charakterystykę interakcji komórkowych.
Na przykład usuwanie mikrogleju po śmierci noworodkowej. Chociaż metoda ta dostarcza informacji na temat mechanizmów chorobowych żywego organizmu, może być również podobnie stosowana w izolowanych komórkach w hodowli. Po ustawieniu męskich i żeńskich linii transgenicznych do krycia zgodnie z protokołem tekstowym, użyj plastikowego sitka do herbaty, aby zebrać zarodki po udanym tarle poprzez odcedzenie wody w zbiorniku.
Następnie użyj wody z jajka, aby opłukać jajka i przenieś je do wody jajecznej na szalce Petriego. Zbadaj zarodki pod mikroskopem świetlnym, aby określić zapłodnienie. Następnie wysiaduj zapłodnione jaja w temperaturze 28 stopni Celsjusza.
Gdy zarodki osiągną od dwóch do pięciu dni po zapłodnieniu lub DPF, umieść je pod mikroskopem związków fluorescencyjnych i przebadaj zarodki pod kątem odpowiedniej ekspresji fluoroforu. Następnie oddziel jaskrawo oznaczone ryby do świeżego naczynia z wodą jajeczną w celu późniejszego osadzenia. Aby zanurzyć danio pręgowanego w agarozie, przygotuj roztwór znieczulający, dodając kroplami cztery gramy na litr MS 222 do szalki Petriego zawierającej wodę jajeczną.
Przygotuj zapas z niskotopliwej agarozy i wody jajecznej i podziel go na 1,5 mililitra mikroprobówek wirówkowych. Umieść podwielokrotność w bloku grzewczym w temperaturze od 38 do 40 stopni Celsjusza i pozwól mu się zrównoważyć. W przypadku czasu obrazowania dłuższego niż cztery godziny, należy odpipetować około 300 mikrolitrów agarozy wzdłuż wewnętrznego okręgu naczynia ze szklanym dnem, aby przygotować okrąg w kształcie pączka z małym otworem pośrodku.
Aby zamontować danio pręgowanego w agarozie do mikroskopii, po znieczuleniu ryby zgodnie z protokołem tekstowym, użyj regulowanej pipety, aby pobrać larwę i pozwól jej opaść na dno końcówki. Wrzuć larwę w minimalnej objętości płynu do podgrzanej agarozy. Następnie narysuj rybę agarozą i szybko przelej ją do wcześniej przygotowanego, szklanego naczynia o średnicy 35 milimetrów.
Pod mikroskopem preparacyjnym użyj standardowego pędzla, aby ustawić zwierzę lub wiele zwierząt w agarozie na bokach, tak aby ciało i ogon były płaskie. Pozostaw osadzoną rybę na 10 do 15 minut, aż agaroza mocno się zetnie. Następnie użyj około dwóch mililitrów wody jajecznej z tricainą, aby ostrożnie uzupełnić 35-milimetrową szalkę Petriego.
Umieść szalkę Petriego z osadzoną larwą na stoliku mikroskopu konfokalnego i używając jasnego oświetlenia pola i 40-krotnego powiększenia, skup się na grzbietowej stronie rdzenia kręgowego zwierzęcia. Przełącz się na odpowiednie ustawienie fluorescencji i zwizualizuj interesującą Cię strukturę, aby potwierdzić, że wszystkie parametry obrazowania są zgodne z potrzebami do późniejszej ablacji. Aby określić grubość struktury do ablacji laserem UV, użyj napędu Z, aby zweryfikować górną i dolną część interesującej Cię struktury poprzez ręczne ogniskowanie w górę iw dół.
Ręcznie nagraj płaszczyznę Z, która zostanie poddana ablacji. Na przykład środek komórki. Aby przeprowadzić ablację laserową, uruchom Kreatora FRAP, klikając menu rozwijane u góry menu oprogramowania.
W nowym oknie określ parametry obrazu dla metody ablacji, wybierając format, szybkość skanowania i uśrednianie. Jeśli płaszczyzna Z do ablacji nie została jeszcze wybrana, naciśnij przycisk Live i ustaw ostrość na próbce, aż struktura fluorescencyjna lub żądana płaszczyzna Z, która ma zostać poddana ablacji, będzie ostra. Po ustawieniu ogólnych parametrów obrazu przejdź do kroku Wybielacz, aby sterować określonymi składnikami ablacji.
Następnie włącz laser 405 nanometrów, aktywując go w celu przeprowadzenia procedury wybielania. Następnie użyj opcji Powiększ, aby zmaksymalizować intensywność wybielania przy wybranym ROI, zmniejszając pole skanowania, maksymalizując w ten sposób czas przebywania. Wybierz jeden lub więcej ROI dla ablacji, korzystając z dowolnego narzędzia do rysowania w oknie Image Acquisition (Akwizycja obrazu).
Na przykład wyceluj w wzgórek aksonu za pomocą okrągłego narzędzia do rysowania o długości około czterech do ośmiu mikrometrów. Po ustaleniu ROI wybierz przycisk Time Course (Przebieg czasowy) i potwierdź liczbę cykli, w których ROI zostaną zeskanowane i usunięte. Wybierz odpowiednio klatki Pre-Bleach i Post-Bleach, aby umożliwić przegląd całego obrazu tuż przed i bezpośrednio po procesie wybielania.
Te ustawienia pozwalają badaczom na wiele warstw udoskonalenia. Dzięki regulacji mocy lasera, prędkości skanowania, uśredniania linii, wielkości obszaru zainteresowania i powtórzeń, technika ta oferuje wysoki stopień swobody w wywoływaniu stresu lub śmierci w poszczególnych komórkach. Po ustaleniu wszystkich niezbędnych parametrów ablacji naciśnij Uruchom eksperyment i monitoruj skuteczność ablacji.
Zapoznaj się z protokołem tekstowym, aby uzyskać dodatkowe informacje. W tym eksperymencie przeprowadzono ablację laserem UV na neuronach ruchowych GFP wyrażających się w rdzeniu kręgowym transgenicznego danio pręgowanego. Ekspresja GFP napędzana przez promotory neuronów ruchowych, takie jak 3 MINX one, IO one lub MET, umożliwia wizualizację w wysokiej rozdzielczości ciał komórek, głównych aksonów i gałęzi obwodowych rozciągających się do mięśni.
Udana ablacja neuronów w rdzeniu kręgowym została osiągnięta, gdy fluorescencja zanika natychmiast po ablacji i nigdy nie zostaje wznowiona. Specyfika tego podejścia została potwierdzona, jak pokazano tutaj, gdzie pojedynczy docelowy neuron został przekształcony za pomocą fotokonwertowalnego fotofluro Kaede, który zmienia swoją emisję z zielonej na czerwoną po ekspozycji na światło UV. Aby celować w komórki o różnej intensywności, dostępnych jest wiele warstw precyzyjnego dostrajania, dostosowując moc lasera, prędkość skanowania, uśrednianie linii, wielkość ROI do ablacji oraz powtórzenia.
Jak pokazano tutaj, neurony ruchowe z długimi wypustkami aksonalnymi, które zostały usunięte w somie przy niższym natężeniu lasera UV, ujawniły charakterystyczne pęcherzyki, które utrzymywały się od somy wzdłuż aksonu w czasie. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że każda konfiguracja konfokalna jest wyjątkowa, a moc wyjściowa lasera dla każdego instrumentu jest specyficzna i może się różnić. Po zabiegu można zaobserwować charakterystyczne cechy apoptotycznej śmierci komórek w neuronach, którym uległa ablacja.
Markery apoptotyczne, takie jak XN 5 lub zmiany morfologiczne, takie jak zwyrodnienie somalne lub zewnętrzne pęcherzyki, mogą być wykrywane w sposób powtarzalny. Można przeprowadzić dodatkowe testy, aby odpowiedzieć na dalsze pytania, takie jak wpływ ablacji jednego lub wielu neuronów w rdzeniu kręgowym na wydajność pływania. Krzyżując różne transgeniczne linie danio pręgowanego, naukowcy mogą badać reakcję innych komórek na indukowane laserem niszczenie komórek.
Metody te stanowią unikalną platformę eksperymentalną do zrozumienia precyzyjnych mechanizmów molekularnych choroby, takiej jak MND in vivo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować danio pręgowanego do mikroskopii konfokalnej i jak przeprowadzić ablację laserem UV pojedynczych komórek.
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje nową technikę ablacji z rozdzielczością pojedynczych komórek, która pozwala badaczom na selektywne wywoływanie stresu lub zabijanie poszczególnych komórek w hodwli komórkowych oraz w żywych organizmach. Wykorzystując standardowy konfokalny laser UV, metoda ta dostarcza wiedzy na temat reakcji i interakcji komórkowych następujących po ukierunkowanej śmierci komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Badania nad chorobami neurodegeneracyjnymi
Wprowadzenie
- Celowana manipulacja poszczególnymi komórkami stanowiła dotychczas wyzwanie.
- Zrozumienie odpowiedzi komórkowych na stres jest kluczowe w badaniach nad chorobami neurodegeneracyjnymi.
- Mikroglej i astrocyty odgrywają istotną rolę w odpowiedzi na śmierć neuronów.
- Ryba danio służy jako skuteczny model do badania tych procesów.
Cel badania
- Opracowanie precyzyjnej metody indukowania stresu lub śmierci w pojedynczych komórkach.
- Badanie losów obumierających komórek oraz towarzyszących im reakcji komórkowych w otoczeniu.
- Pogłębienie zrozumienia mechanizmów chorób neurodegeneracyjnych.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie mikroskopu konfokalnego wyposażonego w laser o długości fali 405 nm do ablacji.
- Zastosowanie podejścia zależnego od dawki w celu wywołania stresu komórkowego.
- Zatopienie larw zebrafish w agarozie w celu obrazowania i ablacji.
- Monitorowanie odpowiedzi komórkowych po ablacji przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.
Główne wyniki
- Skuteczna ablacja neuronów ruchowych u transgenicznych rybek danio pręgowanych.
- Natychmiastowy zanik fluorescencji po ablacji świadczy o efektywnym celowaniu.
- Charakterystyka usuwania resztek komórkowych przez mikroglej po śmierci neuronów.
- Wnioski dotyczące dynamicznych procesów występujących w chorobach neurodegeneracyjnych.
Wnioski
- Opracowana technika zapewnia wysoką precyzję w badaniu odpowiedzi pojedynczych komórek.
- Metodę tę można zastosować zarówno w warunkach in vivo, jak i in vitro.
- Dalsze badania mogą wykorzystać to podejście do analizy mechanizmów chorobowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Metoda ta umożliwia precyzyjną, zależną od dawki ablację pojedynczych komórek z wykorzystaniem standardowej mikroskopii konfokalnej, oferując skalowalny sposób badania odpowiedzi komórkowych na stres oraz sygnalizacji międzykomórkowej w modelach chorób neurodegeneracyjnych. Dzięki możliwości wizualizacji w czasie rzeczywistym reakcji mikrogleju i astrocytów na ukierunkowane uszkodzenia neuronów, metoda ta wspomaga mechanistyczną weryfikację ryzyka we wczesnych etapach walidacji celów oraz w procesach screeningu fenotypowego. Technika ta zwiększa pewność prognostyczną w identyfikacji wiodących kandydatów na leki, zapewniając ilościowe i powtarzalne wyniki kinetyki śmierci komórkowej oraz aktywacji glejowej w systemach istotnych fizjologicznie.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biopharmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez kontrolowaną indukcję stresu komórkowego w pojedynczych neuronach w obrębie nienaruszonej tkanki.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalną platformę do funkcjonalnej walidacji celu z wykorzystaniem parametrów ablacji zależnych od dawki i czasu.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez powiązanie wyników śmierci pojedynczych komórek z następczymi odpowiedziami glejowymi istotnymi dla szlaków neurozapalnych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Umożliwia uzyskanie ilościowych odczytów fluorescencyjnych dotyczących degeneracji aksonalnej i fragmentacji komórkowej w celu standaryzacji testu.
- Wartość operacyjna: Ułatwia przygotowanie do wysokoprzepustowych analiz obrazowych (high-content screening) dzięki regulowanym parametrom lasera (moc, prędkość skanowania, rozmiar ROI) w celu zapewnienia spójnej indukcji stresu.
- Skalowalność: Pozwala na ponowne wykorzystanie platformy w kulturach komórkowych oraz w modelach in vivo na rybkach Danio pręgowany bez konieczności stosowania specjalistycznego sprzętu poza systemem konfokalnym wyposażonym w laser 405-nm.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy obserwacje z fazy odkryć dotyczące ablacji pojedynczych komórek z przedkliniczną walidacją mechanizmów neurodegeneracyjnych u ryb zebrafish.
- Dostosowanie biomarkerów: Wspiera ocenę aktywacji mikrogleju i degeneracji aksonalnej jako translacyjnych biomarkerów uszkodzenia neuronów.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Umożliwia redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez charakteryzację fenotypów śmierci komórkowej zależnej od dawki oraz otaczających odpowiedzi komórkowych przed testowaniem związków.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, umożliwiając prowadzenie ukierunkowanych na hipotezy badań ablacyjnych, które pozwalają na potwierdzenie pewności co do wybranego celu oraz wyjaśnienie szlaków sygnałowych przed optymalizacją wiodących związków.
- Biologia odkryć: Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez precyzyjną i powtarzalną indukcję stresu komórkowego w celu wyjaśnienia szlaków śmierci oraz dynamiki aktywacji gleju.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych wyników rozdzielczych w czasie (np. utrata fluorescencji, pęcherzenie, degeneracja aksonalna), odpowiednich do zautomatyzowanej analizy obrazowej w badaniach przesiewowych związków.
- Analityka: Zapewnia dane dotyczące zależności dawka-odpowiedź oraz przebiegu czasowego, co umożliwia statystyczne porównanie warunków ablacji i odpowiedzi komórkowych w grupach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Zachowuje ciągłość od uszkodzeń pojedynczych komórek u danio pręgowanego po fenotypowe modele chorób neurodegeneracyjnych, wspierając walidację celów zgodnych z biomarkerami.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Funkcjonuje jako możliwość wielokrotnego wykorzystania przez zespoły zajmujące się odkryciami w dziedzinie neuronauk, z możliwością adaptacji do różnych typów komórek i modeli chorób przy użyciu standardowej infrastruktury konfokalnej.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności w mechanizmach śmierci specyficznych dla komórek oraz odpowiedziach glejowych.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację dzięki kontroli parametrów lasera oraz kompatybilności z konwencjonalnymi mikroskopami konfokalnymi.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go, umożliwiając wczesną ocenę zaangażowania celu poprzez fenotypowe odczyty śmierci neuronów i neurostanu zapalnego.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez generowanie danych mechanistycznych na temat zależnej od dawki śmierci komórek i następczych interakcji komórkowych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu mikroskopii konfokalnej, pracy z rybkami zebrafish oraz optymalizacji parametrów ablacji opartej na fluorescencji.
- Metoda zależy od dostępu do mikroskopu konfokalnego wyposażonego w laser o długości fali 405 nm oraz odpowiednie zestawy filtrów do wzbudzenia w UV i detekcji emisji.
- W celu uzyskania powtarzalnych wyników ablacji niezbędna jest standaryzacja mocy lasera, prędkości skanowania, rozmiaru ROI oraz liczby powtórzeń dla poszczególnych użytkowników i sesji.
- Stosowanie tej metody w różnych systemach modelowych (np. hodowle komórkowe w porównaniu z organizmami całymi) wymaga dostosowania protokołów zatapiania i obrazowania.
- Ograniczenia praktyczne obejmują potencjalną fototoksyczność poza docelowym obszarem ROI oraz zmienność mocy wyjściowej lasera między systemami konfokalnymi, co wymaga kalibracji dla każdego urządzenia.
