Name: Rozwarstwienie larw tkanki gonad danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Naucz się izolować tkankę gonad z larw Danio rerio już od 17 dni po zapłodnieniu. Ta metoda umożliwia analizę molekularną i badanie mechanizmów różnicowania płciowego w biologii rozwoju.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy C Zhangowi za opiekę nad rybami. Praca ta była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (31171074, 31371099 i 31571067 do GP) oraz przez Pujiang Talent Project (09PJ1401900 do GP).

Eksperymenty z danio pręgowanym zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Fudan. Danio pręgowany był hodowany i hodowany zgodnie ze standardowymi procedurami20.
1. Przygotowania
<ol>
	<li>Hodowla 17 dpf i 25 dpf larw danio pręgowanego
	<ol>
		<li>Późnym popołudniem przed dniem krzyżowania przenieść 2 samce i 2 samice dorosłego danio pręgowanego (zdrowe, w wieku od 3 do 6 miesięcy, laboratoryjny szczep AB) do zbiornika krzyżowego. Oddziel samce i samice barierą. Następnego ranka odśwież wodę w zbiorniku i usuń barierę, aby umożliwić im łączenie się w pary. Jaja zbierać na szalkach Petriego o średnicy 100 mm 1 do 2 godzin po zapłodnieniu.</li>
		<li>Przechowywać około 40 zarodków na płytce o średnicy 100 mm z 40 ml pożywki dla zarodków (EM) w temperaturze 28,5 °C we wczesnym okresie rozwoju (4 dni) i odświeżać EM dwa razy dziennie. Przenieść larwy do zbiorników o pojemności 1 litra (40 larw na 300 ml wody systemowej) i karmić żywymi wrotkami (pełna dawka, dwa razy dziennie) po 5 dpf. Karm żywe krewetki solankowe zamiast diety wrotka po 10 dpf. Przenieś rybę do systemu recyrkulacji wody o stężeniu 14 dpf21.</li>
		<li>Hodować larwy danio pręgowanego w systemie recyrkulacji wody do 17 dpf lub 25 dpf. Upewnij się, że cykl światło/ciemność wynosi 14/10 godzin, a wartość pH wody systemowej wynosi około 7,2. Zmierz długość ciała larw 17 dpf (5,5 do 6,8 mm) i 25 dpf (8 do 11 mm)22.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj 2% płytki agarowe do sekcji.
	<ol>
		<li>Dodaj 4 g agaru do 200 ml sterylnej wody. Podgrzej mieszaninę w kuchence mikrofalowej, aż stanie się przezroczysta.</li>
		<li>Roztwór agaru schłodzić przez około 15 minut, a następnie wlać go do szalek Petriego o średnicy 60 mm (około 1/3 objętości płytki). Przechowywać zestalone płytki agarowe w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Protokół 1: Rozkrój tkanki gonadalnej larw 17 i 25 dpf
<ol>
	<li>Dodaj pokruszony lód do zbiornika, aby znieczulić larwy 17 dpf. Przenieść znieczulone larwy na schłodzoną 100 mm szalkę Petriego z 30 ml zimnego roztworu Ringera. Trzymaj ryby inkubowane w schłodzonym roztworze Ringera przez co najmniej 15 minut, aby w pełni znieczulić larwy.</li>
	<li>Przenieś larwy na wstępnie schłodzoną płytkę agarową za pomocą małej plastikowej łyżki. Zanurz całe ciało ryby w 10 ml schłodzonego roztworu Ringera i delikatnie połóż je na boku.</li>
	<li>Wykonaj następujące czynności w polu widzenia mikroskopu stereoskopowego 25X. Zaciśnij pień ryby pęsetą w celu stabilizacji. Rozerwij brzuch wzdłużnie od odbytu do serca za pomocą innej pęsety. Delikatnie usuń skórę i mięśnie po jednej stronie ciała, aby odsłonić narządy wewnętrzne.</li>
	<li>Ostrożnie usuń masę narządów brzusznych do pęcherza pławnego. Unikaj uszkodzenia gonady przyczepionej do pęcherza pławnego.</li>
	<li>Odetnij połączenie między pęcherzem pławnym a przednim ciałem. Delikatnie wyciągnij cały pęcherz pławny i tkankę gonadalną. 
	UWAGA: W większości przypadków tkanka gonad o stężeniu 17 dpf zawiera otaczającą tkankę nabłonkową i protonefrydium. Nie da się ich łatwo oddzielić od siebie, ale przy 25 dpf można je łatwo rozdzielić. Gonada jest również połączona z odbytem. Wyraźnie widoczne będzie połączenie z lewą i prawą gonadą połączoną ze sobą w odbycie.</li>
	<li>Za pomocą pęsety ostrożnie oddziel tkankę gonadalną od pęcherza pławnego i oczyść otaczającą tkankę tłuszczową.</li>
	<li>Natychmiast przenieś wyizolowaną tkankę gonad do wstępnie schłodzonej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 200 μl roztworu Ringera. Trzymaj probówkę na lodzie, aż wszystkie tkanki gonad zostaną oddzielone od larw.</li>
	<li>Rozciąć gonady larw 25 dpf zgodnie z opisem w krokach 2.1 - 2.7.</li>
</ol>
3. Protokół 2: Analiza ekspresji genów izolowanych tkanek gonad
<ol>
	<li>Ekstrakcja całkowitego RNA z tkanek larw gonad.
	<ol>
		<li>Przenieś izolowane tkanki gonad do nowej probówki 1,5 ml wolnej od RNaz i usuń roztwór Ringera. Dodać 100 μl roztworu do lizy. Wiruj, aż tkanki zostaną całkowicie zlizowane.</li>
		<li>Procedurę ekstrakcji całkowitego RNA należy przeprowadzić zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Dodać 1/10 objętości 10x buforu DNazy I i 1 μl DNazy I do roztworu RNA i delikatnie wymieszać. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Dodać odczynnik inaktywacji DNazy o objętości 1/10 do roztworu RNA. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 70 °C. Zmierzyć stężenie całkowitego RNA za pomocą spektrofotometru. Przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj syntezę pierwszej nici cDNA
	<ol>
		<li>Użyj startera oligo(dT)-linker, aby przeprowadzić syntezę pierwszej nici cDNA zgodnie z protokołem producenta. Dodać 1 do 2 μg RNA do całkowitej objętości reakcji do 20 μl.</li>
		<li>Inkubować roztwór reakcyjny przez 90 minut w temperaturze 45 °C. Zakończyć reakcję przez ogrzewanie w temperaturze 70 °C przez 5 minut.</li>
		<li>Dodaj 1 μl RNazy H do roztworu cDNA, aby usunąć resztki RNA. Delikatnie wymieszać i odwirować przez 10 s w temperaturze ~ 13 000 x g. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C. Dodać 20 μl wody wolnej od nukleaz. Przechowywać w temperaturze -70 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj fluorescencyjną ilościową reakcję PCR
	<ol>
		<li>Wykonaj qPCR na systemie cyklerowym z barwnikiem fluorescencyjnym. Stosować następujące warunki cykliczne PCR: 35 cykli w temperaturze 95 °C przez 15 s, Tm-5 °C przez 15 s, 68 °C przez 30 s. Użyj sekwencji starterów w następujący sposób: amh (fwd: GTGGATGGCAGCAGTACGAC; rev: GCGGAGAGGTGGAAGAGAGAGAGAATG), cyp19a1a (fwd: GTCCTGTTGTCTCTCTCTGTCG; rev: CATTTGAGTTGAATATGCCCTG), nanos3 (fwd: GCTCGGTGTACGCCAAATCAACAT; rev: CCAAGTGAAACACACACAACCAGTGC), vasa (fwd: ATCGCATAGGAAGAACTGGACGCT; rev: CCAAGTGAAACACAACAACCAGTGC) i β-aktyna (fwd: AGTGCGACGTGGACATCCGTA; rev: GCACTTCCTGTGGACGATGGA)19.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wilson, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild+sex+in+zebrafish%3A+loss+of+the+natural+sex+determinant+in+domesticated+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Wild sex in zebrafish: loss of the natural sex determinant in domesticated strains.</a> Genetics. 198 (3), 1291-1308 (2014).</li>
<li>Liew, W. C., Orban, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+sex%3A+a+complicated+affair%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Zebrafish sex: a complicated affair.</a> Genomics. 13 (2), 172-187 (2014).</li>
<li>Orban, L., Sreenivasan, R., Olsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+and+winding+roads%3A+Testis+differentiation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Long and winding roads: Testis differentiation in zebrafish.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 312 (1-2), 35-41 (2009).</li>
<li>Blaser, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+from+non-motile+behaviour+to+directed+migration+during+early+PGC+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Transition from non-motile behaviour to directed migration during early PGC development in zebrafish.</a> J. Cell Sci. 118, 4027-4038 (2005).</li>
<li>Wang, X. G., Orban, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-M%C3%BCllerian+hormone+and+11+%CE%B2-hydroxylase+show+reciprocal+expression+to+that+of+aromatase+in+the+transforming+gonad+of+zebrafish+males%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dynam%22%5BJournal%5D)">Anti-Müllerian hormone and 11 β-hydroxylase show reciprocal expression to that of aromatase in the transforming gonad of zebrafish males.</a> Dev. Dynam. 236 (5), 1329-1338 (2007).</li>
<li>Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+line+control+of+female+sex+determination+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Germ line control of female sex determination in zebrafish.</a> Dev. Biol. 324 (2), 277-287 (2008).</li>
<li>Uchida, D., Yamashita, M., Kitano, T., Iguchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+apoptosis+during+the+transition+from+ovary-like+tissue+to+testes+during+sex+differentiation+of+juvenile+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Oocyte apoptosis during the transition from ovary-like tissue to testes during sex differentiation of juvenile zebrafish.</a> J. Exp. Biol. 205 (Pt 6), 711-718 (2002).</li>
<li>Groh, K. J., Schönenberger, R., Eggen, R. I. L., Segner, H., Suter, M. J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+expression+in+zebrafish+during+gonad+differentiation+by+targeted+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Gen.+Comp.+Endocr%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein expression in zebrafish during gonad differentiation by targeted proteomics.</a> Gen. Comp. Endocr. 193, 210-220 (2013).</li>
<li>Siegfried, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+search+of+determinants%3A+gene+expression+during+gonadal+sex+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Fish+Biol%22%5BJournal%5D)">In search of determinants: gene expression during gonadal sex differentiation.</a> J. Fish Biol. 76 (8), 1879-1902 (2010).</li>
<li>Small, C. M., Carney, G. E., Mo, Q., Vannucci, M., Jones, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microarray+analysis+of+sex-+and+gonad-biased+gene+expression+in+the+zebrafish%3A+evidence+for+masculinization+of+the+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A microarray analysis of sex- and gonad-biased gene expression in the zebrafish: evidence for masculinization of the transcriptome.</a> BMC Genomics. 10, 579(2009).</li>
<li>Chiang, E. F., Yan, Y. L., Guiguen, Y., Postlethwait, J., Chung, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11264405">Two Cyp19 (P450 aromatase) genes on duplicated zebrafish chromosomes are expressed in ovary or brain.</a> Mol. Biol. Evol. 18 (4), 542-550 (2001).</li>
<li>Kishida, M., Callard, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+cytochrome+P450+aromatase+isoforms+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29+brain+and+ovary+are+differentially+programmed+and+estrogen+regulated+during+early+development%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Distinct cytochrome P450 aromatase isoforms in zebrafish (Danio rerio) brain and ovary are differentially programmed and estrogen regulated during early development.</a> Endocrinology. 142 (2), 740-750 (2001).</li>
<li>Rodríguez-Marí, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+expression+pattern+of+zebrafish+anti-M%C3%BCllerian+hormone+%28amh%29+relative+to+sox9a%2C+sox9b%2C+and+cyp19a1a%2C+during+gonad+development%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr.Patterns%22%5BJournal%5D)">Characterization and expression pattern of zebrafish anti-Müllerian hormone (amh) relative to sox9a, sox9b, and cyp19a1a, during gonad development.</a> Gene Expr.Patterns. 5 (5), 655-667 (2005).</li>
<li>Krovel, A. V., Olsen, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+vas%3A%3AEGFP+transgene+in+primordial+germ+cells+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Expression of a vas::EGFP transgene in primordial germ cells of the zebrafish.</a> Mech Dev. 116 (1-2), 141-150 (2002).</li>
<li>Krovel, A. V., Olsen, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+dimorphic+expression+pattern+of+a+splice+variant+of+zebrafish+vasa+during+gonadal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sexual dimorphic expression pattern of a splice variant of zebrafish vasa during gonadal development.</a> Dev. Biol. 271 (1), 190-197 (2004).</li>
<li>Tzung, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+depletion+of+primordial+germ+cells+in+zebrafish+promotes+testis+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Early depletion of primordial germ cells in zebrafish promotes testis formation.</a> Stem Cell Reports. 4 (1), 61-73 (2015).</li>
<li>Hsiao, C., Tsai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+zebrafish+with+fluorescent+germ+cell%3A+a+useful+tool+to+visualize+germ+cell+proliferation+and+juvenile+hermaphroditism+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transgenic zebrafish with fluorescent germ cell: a useful tool to visualize germ cell proliferation and juvenile hermaphroditism in vivo.</a> Dev. Biol. 262 (2), 313-323 (2003).</li>
<li>Jorgensen, A., Nielsen, J. E., Morthorst, J. E., Bjerregaard, P., Leffers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+of+gonads+from+juvenile+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection of gonads from juvenile zebrafish.</a> Reprod Biol Endocrinol. 7, 97(2009).</li>
<li>Chen, S., Zhang, H., Wang, F., Zhang, W., Peng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nr0b1+%28DAX1%29+mutation+in+zebrafish+causes+female-to-male+sex+reversal+through+abnormal+gonadal+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">nr0b1 (DAX1) mutation in zebrafish causes female-to-male sex reversal through abnormal gonadal proliferation and differentiation.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 433, 105-116 (2016).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+The+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The Zebrafish Book: A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio)</a>. , Eugene: University of Oregon Press. University of Oregon. (2000).</li>
<li>Liew, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polygenic+sex+determination+system+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Polygenic sex determination system in zebrafish.</a> PLoS One. 7 (4), e34397(2012).</li>
<li>Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+table+of+postembryonic+zebrafish+development%3A+staging+by+externally+visible+anatomy+of+the+living+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish.</a> Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).</li>
<li>Gupta, T., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Organs+from+the+Adult+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of Organs from the Adult Zebrafish.</a> J. Vis Exp. (37), (2010).</li>
<li>Arnaout, R., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+Adult+Zebrafish+Hearts+for+High-throughput+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications.</a> J. Vis Exp. (94), (2014).</li>
<li>Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+Adult+Zebrafish+Kidney%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of the Adult Zebrafish Kidney.</a> J. Vis Exp. (54), (2011).</li>
<li>Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+vasa+homologue+RNA+is+localized+to+the+cleavage+planes+of+2-+and+4-cell-stage+embryos+and+is+expressed+in+the+primordial+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells.</a> Development. 124 (16), 3157-3165 (1997).</li>
<li>Braat, A. K., Speksnijder, J. E., Zivkovic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+line+development+in+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Germ line development in fishes.</a> Int. J. Dev. Biol. 43 (7), 745-760 (1999).</li>
<li>Huang, H. Y., Ketting, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+zebrafish+gonads+for+RNA+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of zebrafish gonads for RNA isolation.</a> Methods Mol Biol. 1093, 183-194 (2014).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Danio pręgowany stał się potężnym modelem i jest szeroko stosowany w badaniach rozwojowych i związanych z chorobami. Metody izolacji narządów u dorosłych ryb danio pręgowanego, takich jak mózg, serce, gonada i nerki, zostały dobrze udokumentowane 23,24,25. Ze względu na mały rozmiar i dynamiczną przebudowę tkanek gonad u larw danio pręgowanego, izolacja tkanki gonad jest trudnym zadaniem. W poprzednich badaniach wykorzystano cał...

Główny determinant płci żeńskiej w chromosomie 4 dzikiego danio pręgowanego został utracony lub zmodyfikowany u udomowionych danio pręgowanych (tj. powszechnych szczepów laboratoryjnych)1. Zamiast tego mają poligeniczny system determinacji płci, któremu towarzyszą czynniki środowiskowe, takie jak temperatura, niedotlenienie, dostępność pożywienia i gęstość zaludnienia. Szczegółowe mechanizmy rozwoju płciowego danio pręgowanego nie są w pełni poznane. Podstawowe pytania, takie jak to, kiedy następuje determinacja płci danio pręgowanego, jakie są główne sygnały determinacji płci i które geny regulują pierwszy etap transformacji gonad, pozostają bez odpowiedzi2,3.
W procesie rozwoju płci danio pręgowanego rozpoznano kilka ważnych etapów. We wczesnej fazie rozwoju, począwszy od 4 hpf (godzin po zapłodnieniu), pierwotne komórki rozrodcze (PGC) przechodzą specyfikację, migrację do grzbietu narządów płciowych i proliferację. Liczby PGC i wzajemne interakcje między komórkami rozrodczymi a komórkami somatycznymi są ważne dla różnicowania gonad4. Po 13 dpf (dni po zapłodnieniu) gonady są w stadium niezróżnicowanym. Do 17 dpf gonady rozwijają się w jajniki o podwójnym potencjale zarówno u przyszłych samic, jak i mężczyzn. Zależne od apoptozy przejście z jajnika do jądra rozpoczyna się przy 21 do 25 dpf i może trwać kilka tygodni. Do 35 dpf płeć gonady została określona, a produkcja gamet specyficznych dla płci trwa zarówno w jajnikach, jak i jądrach5,6,7.
Do tej pory zaproponowano różne geny kandydujące i mechanizmy determinacji płci. Proteomika i analiza transkryptomiczna wyizolowały wiele genów o ekspresji dymorficznej płciowo, a geny te zostały wykorzystane do badania zróżnicowania płci u danio pręgowanego8,9,10. Na przykład u larw danio pręgowanego gen cyp19a1a ulega specyficznej ekspresji w jajniku, ale nie w jądrze11,12. Ponadto gen amh ulega słabej ekspresji w komórkach ziarnistych pęcherzyka jajnikowego, ale silnie w komórkach Sertoliego jądra13. W przeciwieństwie do tego, gen vasa ulega ciągłej ekspresji w komórkach rozrodczych zarówno samic, jak i samca danio pręgowanego, co czyni go odpowiednim markerem gonad14,15.
Badanie poziomów ekspresji genów gonad jest kluczowe dla zrozumienia molekularnego mechanizmu determinacji i różnicowania płci, zwłaszcza w fazie jajnika o potencjale dwupotencjałowym3,9. Jednak mały rozmiar larw danio pręgowanego i odpowiednio małe gonady komplikują izolację tkanki gonad do dalszej analizy molekularnej. W poprzednich badaniach wykorzystano wypreparowany cały obszar tułowia między wieczkiem a porem odbytu16. Preparat ten, choć zawiera gonady, składa się z wielu tkanek i narządów. Alternatywnie, transgeniczne zwierzęta z ekspresją GFP specyficzną dla gonad, takie jak vasa: EGFP, wykorzystano do izolacji tkanek gonad za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) i mikrorozwarstwienia laserowego17,18. Ale ich powszechne zastosowanie jest ograniczone. W tym miejscu opisujemy prostą procedurę izolacji tkanki gonadalnej od larw danio pręgowanego przy 17 dpf i 25 dpf. Pokazujemy położenie gonad w stosunku do innych narządów i izolujemy morfologicznie nienaruszone gonady od otaczających tkanek. Ponadto pokazujemy, że geny specyficzne dla gonad, takie jak vasa i cyp19a1a, są wysoce eksprymowane w izolowanych gonadach w porównaniu z tkanką tułowia za pomocą ilościowej analizy PCR (qPCR). Obecny protokół umożliwia identyfikację, izolację, oczyszczanie RNA i amplifikację genów specyficznych dla gonad od larw danio pręgowanego, umożliwiając w ten sposób późniejszą analizę molekularną tkanki gonad19.

<table><tbody><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych 100 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>Do inkubacji zarodków</td></tr><tr><td>20x EM</td><td></td><td></td><td>Na 1 L potrzebny: dodać 17,5 g NaCl, 0,75 g KCl i 2,9 g CaCl&#183; 2H2O; następnie dodać 0,41 g KH2PO4, 0,412 g Na2HPO4 bezwodnego i 4,9 g MgSO4&#183; 7H2O.</td></tr><tr><td>1x EM</td><td></td><td></td><td>Rozcieńczony 20x EM w wodzie destylowanej</td></tr><tr><td>AGAROSE G-10</td><td>Gene</td><td>121985</td><td>Do przygotowania 2% płytek agarowych</td></tr><tr><td>Odczynnik Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>Do izolacji RNA</td></tr><tr><td>Miernik szklany</td><td>Shen Bo</td><td>250 ml</td><td>Do przygotowania 2% płytek agarowych</td></tr><tr><td>Kuchenka mikrofalowa</td><td></td><td>Midea M1-211A</td><td>Do podgrzewania AGAR</td></tr><tr><td>Pęseta DUMONT#5INOX</td><td>World Precision Instrument</td><td>500341</td><td>Do preparacji</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Motic</td><td>SMZ168</td><td>Do preparacji</td></tr><tr><td>Sprzęt do czystej wody</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ringer' s roztwór</td><td></td><td></td><td>Dla 1 l potrzeba: Dodaj 6,78 g NaCl, 0,22 g KCl, 0,26 g CaCl2 i 1,19 g Hepes; następnie napełnij do 1 l; następnie napełnij do 1 l; Dostosuj pH do 7,2. Sterylizować przez filtrację i przechowywać w autoklawowanym przezroczystym pojemniku z poliwęglanu.</td></tr><tr><td>Pipeta transferowa</td><td>Samco</td><td>202, 204</td><td></td></tr><tr><td>Wanna metalowa</td><td>QiLinbeier</td><td></td><td>Model GL-150</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica&nbsp;</td><td>M205 FA</td> Do wirówki <td>do mikrofotografii</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji RNA w skali mikro</td><td>Ambion</td><td>AM1931</td><td>Do izolacji RNA z tkanek gonad</td></tr><tr><td>Dnaza I</td><td>Sigma</td><td>AMPD1-1KT</td><td>Do trawienia DNA w roztworze RNA</td></tr><tr><td>Zestaw do syntezy pierwszej nici cDNA</td><td>RevertAid Thermo Scientific</td><td>#K1631</td><td>Do syntezy pierwszej nici cDNA</td></tr><tr><td>Rnase</td><td>H Thermo Scientific</td><td>#EN0202</td><td>Do trawienia resztkowego RNA w roztworze cDNA.</td></tr><tr><td>SYBR Green Realtime PCR Master Mix</td><td>TOYOBO</td><td>QPK-201</td><td>Ten produkt jest 2x główną mieszanką na bazie polimerazy DNA Taq do PCR w czasie rzeczywistym i&nbsp; ma zastosowanie do testu interkalacyjnego z SYBR Green I.</td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Ne Drop</td><td>OD-2000+</td><td>Pomiar stężenia całkowitego RNA</td></tr><tr><td>Mastercycler</td><td>Eppendorf</td><td>AG 22331 Hamburg</td><td>profilowanie ekspresji genów</td></tr></tbody></table>

rozwarstwienie larw tkanki gonad danio pręgowanego

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

Chociaż dzikie danio pręgowane posiadają system determinacji płci ZZ/ZW, udomowione danio pręgowane utraciły chromosom płciowy. Wykorzystują poligeniczny system determinacji płci, w którym kilka genów rozmieszczonych w całym genomie wspólnie określa tożsamość płciową poszczególnych ryb. Obecnie geny zaangażowane w regulację rozwoju gonad i sposób ich działania pozostają nieuchwytne. Zwykle wyizolowanie tkanki gonadalnej jest pierwszym krokiem do zbadania procesów rozwoju płci. W artykule przedstawiono procedurę izolacji tkanki gonadalnej od larw danio pręgowanego o wartości 17 dpf (dni po zapłodnieniu) i 25 dpf dpf. Wyizolowana tkanka gonadalna może być następnie badana za pomocą morfologii i profilowania ekspresji genów.

Disekcje gonad przeprowadzono na larwach danio pręgowanego szczepu AB. Rycina 1 przedstawia typową tkankę gonad larw danio pręgowanego w 17. i 25. dniu po zapłodnieniu (dpf). Najpierw nacięto skórę i mięśnie jednej strony brzucha, aby odsłonić narządy wewnętrzne. Po usunięciu masy narządów wewnętrznych, w tułowiu pozostały pęcherz pławny wraz z gonadą. Gonada była przytwierdzona do brzusznej strony pęcherza pławnego (strzałka na Rycina 1B...

Tutaj prezentujemy protokół izolacji tkanki gonad larw danio pręgowanego, który ułatwi badania różnicowania i utrzymania płci danio pręgowanego.

Rozwarstwienie larw tkanki gonad danio pręgowanego

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja tkanki gonadalnej z larw danio pręgowanego oraz analiza właściwości molekularnych wyizolowanej tkanki. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu rozwoju płci u danio pręgowanego, takie jak konserwacja genów regulujących rozwój gonad oraz molekularne podstawy rozwoju płci u tego gatunku. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wypreparowania tkanek gonadalnych z larw danio pręgowanego już w 17. dniu po zapłodnieniu w celu analizy stanu komórkowego i biologii molekularnej.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności ze względu na niewielki rozmiar oraz dynamiczną przebudowę tkanek gonadalnych u larw zebrafish. Aby przygotować się do sekcji gonad, należy przenieść dwie dorosłe ryby zebrafish płci męskiej i dwie płci żeńskiej na przeciwległe strony podzielonego zbiornika do krzyżowania. Następnego ranka należy odświeżyć wodę w zbiorniku i usunąć barierę, aby zainicjować proces godowy.Od jednej do dwóch godzin po zapłodnieniu zebrać i przenieść około czterdziestu jaj do płytki 100 mm zawierającej 40 ml medium do embrionów (EM). Inkubować embriony w temperaturze 28,5 °C przez cztery dni, odświeżając EM dwa razy dziennie. Po inkubacji przenieść larwy do zbiorników o pojemności jednego litra. Po pięciu dniach od zapłodnienia (DPF) karmić ryby żywymi wrotkami.Gdy larwy osiągną 10. dzień po zapłodnieniu (DPF), karmić ryby żywymi solankowcami. Następnie, w 14. dniu DPF, przenieść ryby do recyrkulacyjnego systemu wodnego. Hodować larwy danio pręgowanego do 17. lub 25. dnia DPF.Następnie zmierz długość ciała larw w 17. i 25. dniu po zapłodnieniu (DPF). Przygotuj dwuprocentowe płytki agarowe do sekcji, dodając cztery gramy agaru do 200 ml sterylnej wody. Podgrzewaj mieszaninę w kuchence mikrofalowej do momentu, aż stanie się przezroczysta.Schładzać agar przez 15 minut, a następnie wlać go do szalek Petri o średnicy 60 mm. Zastygłe płytki agarowe przechowywać w temperaturze 4 °C. Do znieczulonych larw w 17 DPF dodać kruszony lód do zbiornika.Przenieś znieczulone larwy do schłodzonej szalki Petriego o średnicy 100 mm zawierającej 30 ml zimnego roztworu Ringera. Inkubuj ryby w schłodzonym roztworze Ringera przez co najmniej 15 minut, aby w pełni znieczulić larwy. Za pomocą plastikowej łyżki przenieś larwy na wstępnie schłodzoną płytkę z agarem.Zanurz całe ciało ryby w dziesięciu mililitrach schłodzonego roztworu Ringera i ostrożnie ułóż ją na boku. Pod stereomikroskopem, przy 25-krotnym powiększeniu, użyj pęsety, aby unieruchomić tułów ryby w celu stabilizacji. Następnie, za pomocą drugiej pęsety, rozetnij brzuch wzdłużnie od odbytu do serca.Następnie delikatnie usuń skórę i mięśnie z jednej strony ciała, aby odsłonić narządy wewnętrzne. Następnie ostrożnie usuń duże narządy znajdujące się brzusznie w stosunku do pęcherza pławnego. Unikaj uszkodzenia gonady przymocowanej do pęcherza pławnego.Przetnij połączenie między pęcherzem pławny a wnętrzem ciała. Następnie ostrożnie wyciągnij cały pęcherz pławny oraz tkankę gonadną. Za pomocą pęsety ostrożnie oddziel tkankę gonadną od pęcherza pławnego.Następnie należy oczyścić tkankę z otaczającej ją tkanki tłuszczowej. Wyizolowaną tkankę gonadalną należy niezwłocznie przenieść do schłodzonej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml, zawierającej 200 µl roztworu Ringera. Probówkę należy przechowywać w lodzie do czasu oddzielenia wszystkich tkanek gonadalnych od larw.Aby wyizolować całkowite RNA z tkanki gonad larwalnych, należy przenieść wyizolowane gonady do nowej, wolnej od RNaz probówki o pojemności 1,5 ml i usunąć roztwór Ringera. Następnie należy dodać 100 µL roztworu lizującego i mieszać probówkę w wirówce typu vortex do całkowitej lizy tkanki.Po przeprowadzeniu całkowitej ekstrakcji RNA, zgodnie z instrukcjami producenta, dodać do roztworu RNA objętość buforu do DNazy I równą jednej dziesiątej objętości próbki oraz 1 µL DNazy I, a następnie delikatnie wymieszać zawartość probówki. Inkubować próbkę w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Następnie dodać do roztworu RNA objętość odczynnika do inaktywacji DNazy równą jednej dziesiątej objętości próbki.Inkubować próbkę w temperaturze 70 °C przez dziesięć minut. Następnie, za pomocą spektrofotometru, zmierzyć stężenie całkowitego RNA. Aby przeprowadzić syntezę pierwszej nici cDNA, należy użyć primera z linkerem oligo-dT oraz od jednego do dwóch mikrogramów RNA, postępując zgodnie z protokołem producenta.Inkubować reakcję w temperaturze 45 °C przez 90 minut. Następnie przerwać reakcję, podgrzewając próbkę do 70 °C przez pięć minut. Do roztworu cDNA dodać 1 µL RNazy H w celu usunięcia pozostałego RNA.Delikatnie wymieszać zawartość probówki i odwirować próbkę z prędkością około 13 000 ×g przez dziesięć sekund. Inkubować probówkę w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Następnie dodać do próbki 20 µL wody wolnej od nukleaz.Następnie cDNA należy przechowywać w temperaturze -70 °C. Na koniec, przy użyciu barwnika fluorescencyjnego, należy przeprowadzić qPCR zgodnie z warunkami i przy użyciu starterów wymienionych w protokole tekstowym. Na tej rycinie przedstawiono typową tkankę gonad larwalnych danio pręgowanych w 17. dniu po zapłodnieniu (DPF).Gonada jest przymocowana do brzusznej strony pęcherza pławnego, co widać tutaj. W 17. dniu po zapłodnieniu (DPF) larwy posiadają lewą i prawą gonadę, które są półprzezroczyste. W większości przypadków gonady są otoczone tkanką nabłonkową oraz protonefrydium.W 25. dniu po zapłodnieniu (DPF) gonada jest często otoczona tkanką tłuszczową, a obserwowalne mogą być gonady duże lub małe. Na koniec, aby przeanalizować właściwości molekularne wyizolowanej tkanki gonadalnej, za pomocą QPCR zbadano poziomy ekspresji markerów gonadalnych amh, cyp19a1a, nanos3 i vasa. Wyniki wykazują istotne wzrosty genów markerowych w tkance gonadalnej w porównaniu z tkanką kontrolną.Po opanowaniu tej techniki, przy jej prawidłowym wykonaniu, można ją przeprowadzić w ciągu godziny. Podczas realizacji tej procedury ważne jest zapewnienie jednolitych warunków hodowli larw zebrafish, ponieważ jest to kluczowe dla uzyskania oczekiwanych rezultatów. Po opracowaniu ta technika utorowała drogę badaniom w dziedzinie rozwoju płci w celu zgłębienia mechanizmów determinacji płci u zebrafish.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak izolować tkanki gonadalne z larw ryb danio prążkowanych.

dissection-of-larval-zebrafish-gonadal-tissue

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejszy protokół opisuje procedurę identyfikacji i wycinania narządów z dorosłego danio pręgowanego.

Disekcja organów dorosłej rybki zebrafish

Niniejszy artykuł opisuje metodę mikrodyssekcji siatkówek zebrafish (danio pręgowanego) z dołączonym lub usuniętym nabłonkiem barwnikowym siatkówki, z embrionów od jednego do trzech dni po zapłodnieniu.

Mikrodysekcja tkanek embrionalnego oka rybki zebrafish

Opisano przejrzystą, zestandaryzowaną metodę sekcji i izolacji serca danio pręgowanego na wielu etapach rozwoju. Omówiono również techniki adnotacji i kwantyfikacji.

Sekcja serca w larwalnym, młodzieżowym i dorosłym zebrafish, Danio rerio

Przedstawiamy nowatorską metodę mikrozgavage u larw danio pręgowanego, wykorzystującą standardowy sprzęt do mikroiniekcji embrionów oraz stereomikroskopię. Wykazujemy, że mikrozgavage jest bezpieczną i wydajną techniką, przydatną do dostarczania kontrolowanych ilości różnorodnych materiałów bezpośrednio do światła jelita larw danio pręgowanego.

Mikrogaważ larw danio pręgowanego

Po przecięciu kręgosłupa, dorosłe rybki pręgowane wracają do stanu funkcjonalnego w ciągu sześciu tygodni po urazie. Aby wykorzystać przezroczystość larw i szybszy powrót do zdrowia, przedstawiamy metodę transekcji rdzenia kręgowego larwy. Po przecięciu obserwujemy regenerację czuciową rozpoczynającą się po 2 dniach od urazu i ruch zgięcia C po 3 dniach od urazu.

Przekrój rdzenia kręgowego u larw danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy ustandaryzowaną serię protokołów do obserwacji górnej bruzdy ocznej, niedawno zidentyfikowanej, ewolucyjnie zachowanej struktury w oku kręgowców. Wykorzystując larwy danio pręgowanego, demonstrujemy techniki niezbędne do identyfikacji czynników, które przyczyniają się do powstawania i zamykania górnej bruzdy ocznej.

Wizualizacja bruzdy ocznej górnej podczas embriogenezy Danio rerio

Tutaj udostępniamy protokół sekcji wymagany do zobrazowania na żywo późnej embrionalnej męskiej gonady Drosophila. Protokół ten pozwoli na obserwację dynamicznych procesów komórkowych w normalnych warunkach lub po manipulacji transgenicznej lub farmakologicznej.

Sekcja i obrazowanie na żywo późnej embrionalnej gonady Drosophila

Ten protokół opisuje procedurę usuwania brzusznego płata wątroby u dorosłego danio pręgowanego, aby umożliwić badanie regeneracji wątroby.

Częściowa hepatektomia u dorosłych danio pręgowanego

Artykuł wyjaśnia, jak chirurgicznie usunąć oczy z żywych larw danio pręgowanego, co jest pierwszym krokiem w kierunku zbadania, jak wejście siatkówki wpływa na wzrost i rozwój tektum nerwu wzrokowego. Ponadto artykuł zawiera informacje na temat znieczulenia, fiksacji i preparacji larw, a następnie immunohistochemii i obrazowania konfokalnego.

Usunięcie oczu u żywych larw danio pręgowanego w celu zbadania zależnego od unerwienia wzrostu i rozwoju układu wzrokowego

To jest powszechnie stosowana metoda do sekcji gonad C. elegans, po której następuje pęknięcie zamrażające, która wytwarza próbki linii zarodkowej do immunofluorescencji poprzez barwienie przeciwciał, lub do prostego barwienia DAPI w celu wizualizacji DNA. Protokół ten okazał się skuteczny w przypadku studentów studiów licencjackich w laboratorium badawczym i w ramach badań licencjackich opartych na kursach.

C. elegans (C. elegans) Rozwarstwienie gonad i pęknięcie zamrażające do barwienia immunofluorescencyjnego i DAPI

Tutaj opisujemy metodę izolacji jelit od larw danio pręgowanego po 5 dniach od zapłodnienia, do analizy sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki.

Izolacja jelit od larw danio pręgowanego do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek

Naucz się izolować tkankę gonad z larw Danio rerio już od 17 dni po zapłodnieniu. Ta metoda umożliwia analizę molekularną i badanie mechanizmów różnicowania płciowego w biologii rozwoju.

Rozwarstwienie larw tkanki gonad danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów