Siłownik oparty na komórkach mięśnia sercowego i samostabilizujący się biorobot - część 2
9 maja 2017
W tym badaniu, biologiczny aktywator i samostabilizujący się, pływający biorobot z funkcjonalizowanymi elastomerowymi ramionami wspornikowymi są obsiewane kardiomiocytami, hodowane i charakteryzowane pod kątem ich biochemicznych i biomechanicznych właściwości w czasie.
Ogólnym celem tego badania jest wypełnienie mikrofabrykowanych urządzeń komórkami mięśnia sercowego oraz scharakteryzowanie właściwości biochemicznych i biomechanicznych komórek w tych urządzeniach, a także ich wydajności w czasie. Opisana tutaj materia może być łatwo zmodyfikowana do innych eksperymentów, które wymagają dodania komórek o dużej gęstości na mikrofabrykowanych urządzeniach. Główną zaletą biosiłownika opracowanego w tym filmie jest to, że można go łatwo zaadaptować do ilościowego określania sił skurczu komórek dowolnego innego typu komórek.
Może być również stosowany do badania zmian w cechach biomechanicznych komórek macierzystych w miarę ich różnicowania. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy wysiewu komórek są trudne do nauczenia się na podstawie opisów z tekstów. Muszą być przeprowadzone prawidłowo, aby zapewnić zlewające się połączenie komórek na ramionach wspornikowych, co jest niezbędne dla prawidłowej funkcji biologicznej.
Procedurę zademonstruje Neerajha Nagarajan z mojego laboratorium. Z biorobotem zacznij od kolby T25. Użyj magnesu, aby przytrzymać go na miejscu na dnie kolby.
Magnes nie jest potrzebny do siłowników biologicznych, ponieważ nie będą się one poruszać ze względu na ciężar szklanego koralika w podstawie. Zwiń mały kwadratowy arkusz z tworzywa sztucznego, aby użyć go jako lejka i umieść sterylny lejek nad siłownikami w biorobotach. Dostosuj średnicę na szerszym końcu, aby dopasować ją do urządzenia i wysokości, tak aby dobrze przylegała, gdy górna część kolby jest dokręcona.
Użyj oddzielnej kolby, aby przetestować i wyregulować dopasowanie lejka. Dokładne dopasowanie lejka zapewni, że nie dojdzie do wycieku komórek, jak wspomniano, do reszty pożywki. Jest to niezbędne do zapewnienia zlewnego pokrycia ramienia wspornikowego.
Po umieszczeniu lejka ponownie zawiesić kardiomiocyty w kompletnym DMEM o gęstości 16 milionów komórek na mililitr i powoli upuszczać 400 mikrolitrów zawiesiny na urządzenia przez każdy lejek. Następnie powoli przenieś kolby z powrotem do inkubatora, nie naruszając urządzeń ani znajdujących się w nich lejków. Pozwól komórkom przyczepić się przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Po okresie inkubacji powoli wyjmij lejek. Delikatnie umyj próbki PBS i napełnij każdą kolbę 10 mililitrami świeżego DMEM w komplecie. Następnie wyjmij magnes z biorobota, aby unosił się na powierzchni i umieść kolby z powrotem w inkubatorze.
Zamontuj kamerę wyposażoną w obiektyw zmiennoogniskowy w inkubatorze, aby uwidocznić urządzenia w hodowli. Następnie dodaj pasek świetlny LED, który będzie używany jako źródło światła. Następnie podłącz aparat do komputera i otwórz program do obrazowania.
Po wejściu do programu kliknij obraz kamery w zakładce Plik, aby otworzyć wszystkie opcje kamery i wybierz podłączoną kamerę. Z listy kart wybierz opcję Na żywo i ręcznie ustaw ostrość obrazu, regulując pokrętło obiektywu. Następnie wybierz kadrowanie obszaru zainteresowania z górnego panelu.
Następnie ręcznie narysuj prostokąt w klatce wideo otaczający siłownik biologiczny i ramiona wspornikowe, aby zaznaczyć obszar zainteresowania. W przypadku biorobotów przechwytuje cały ekran, aby zarejestrować ruch pływacki urządzenia. Następnie wybierz Ustawienia aparatu i ustaw liczbę klatek na sekundę, dostosowując ekspozycję i proporcje pikseli obrazu na żywo.
Ustaw liczbę klatek na sekundę na około 30 klatek na sekundę. Na koniec kliknij przycisk nagrywania, aby rozpocząć nagrywanie filmów. Otwórz oprogramowanie do programowania, klikając ikonę.
Po załadowaniu kliknij Plik, Otwórz i wybierz plik skryptu m do uruchomienia analizy obrazu. Upewnij się, że nagrane obrazy TIF i ich wersje AVI znajdują się w tym samym folderze co plik m, a następnie kliknij przycisk Uruchom, aby uruchomić skrypt. Naciśnij przycisk Odtwórz, aby uruchomić właściwy program.
Po uruchomieniu kliknij przycisk Otwórz i zlokalizuj plik TIF lub AVI, który ma być analizowany. Następnie kliknij przycisk podstawowy. Wybierz punkt, w którym wspornik mocuje się do podstawy u góry i naciśnij Enter.
Spowoduje to umieszczenie kwadratowego znacznika na obrazie dla każdej klatki, aby wskazać położenie podstawy wspornika. Następnie kliknij przycisk skalowania, a następnie ręcznie kliknij jedną krawędź szklanego koralika. Przesuń wskaźnik myszy na przeciwną stronę szklanego koralika i naciśnij Enter.
Spowoduje to narysowanie linii, która mierzy średnicę szklanego koralika i odniesie średnicę do wyświetlanych pikseli. Kliknij przycisk Analizuj. Następnie kliknij wzdłuż wspornika w niewielkiej odległości od pierwszego kwadratowego znacznika reprezentującego podstawę wspornika.
Kontynuuj klikanie wzdłuż wspornika, w tym końcówki, a po zakończeniu naciśnij Enter. Spowoduje to umieszczenie znaku X w każdym klikniętym punkcie na wsporniku. Na koniec sprawdź, czy nałożony okrąg prawidłowo śledzi profil wspornika.
Jeśli to prawda, kliknij przycisk następnej klatki. Spowoduje to przełączenie do następnej klatki w pliku TIF. Powtórz ten proces dla wszystkich klatek.
Po przetworzeniu wszystkich ramek kliknij przycisk Eksportuj. Zacznij od otwarcia oprogramowania do analizy obrazu i załadowania pliku wideo z biorobotem pływającym. Następnie otwórz oprogramowanie arkusza kalkulacyjnego.
Na załadowanym filmie o biorobocie znajdź odniesienie do rozmiaru, takie jak szklany koralik. Użyj narzędzia Proste, aby narysować linię w poprzek szklanego koralika. Następnie kliknij przycisk Analizuj i wybierz opcję Ustaw skalę.
W polu Znana odległość ustaw wartość 3 000 mikrometrów i kliknij przycisk OK. Wybierz punkt na urządzeniu, który nie chwieje się między klatkami, aby działał jako znacznik i zapisz współrzędne X i Y tego punktu w arkuszu kalkulacyjnym. Przełącz się z powrotem do okna oprogramowania do analizy obrazu i naciśnij strzałki w prawo, aby przejść do następnej klatki. Ponownie wskaż znacznik i zapisz nowe współrzędne X i Y w arkuszu kalkulacyjnym.
Powtórz ten proces dla wszystkich ramek i wykorzystaj dane do analizy ruchu biorobota zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Naprężenia statyczne i dynamiczne siłownika były codziennie ekstrahowane z naprężeń powierzchniowych. Naprężenie statyczne to naprężenie skurczowe, które komórki wykazują na powierzchni w stanie spoczynku, a naprężenie dynamiczne to naprężenie generowane przez komórki przy maksymalnym skurczu.
W miarę dojrzewania komórek w hodowli obserwowano stopniowy wzrost naprężeń statycznych i dynamicznych w czasie. Wykazały one maksymalną siłę pociągową komórki wynoszącą 50 miliniutonów na metr i maksymalną siłę skurczu około 165 miliniutonów na metr w szóstym dniu. Równolegle do naprężeń statycznych i dynamicznych, markery dojrzewania, wzrostu i rozprzestrzeniania się kardiomiocytów oraz wzajemnych połączeń komórkowych również rosną do szóstego dnia.
Na podstawie analizy wideo przedstawiono porównanie średniej prędkości pływania, częstotliwości uderzeń i odległości przebytej na ruch dla trzech biorobotów o różnych profilach pływania. Chociaż pionowe bioroboty mają najmniejszą częstotliwość uderzeń, wykazywały najwyższą prędkość pływania i przebytą odległość. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zasiewać komórki mięśnia sercowego na mikrofabrykowanych urządzeniach, które mogą działać jako siłowniki biologiczne i bioroboty.
Proces pozyskiwania obrazu i późniejszej analizy danych opisany w tym filmie demonstruje wygodny sposób charakteryzowania zachowania komórki, a także wydajności urządzenia. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, że żywotność kardiomiocytów jest ograniczona, a aktywność komórek osiąga szczyt w szóstym dniu. Po czym z czasem maleje.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie koncentruje się na zasiedlaniu mikrofabrykowanych urządzeń komórkami mięśnia sercowego oraz charakteryzacji ich właściwości biochemicznych i biomechanicznych w czasie. Opracowany bioaktuator umożliwia kwantyfikację sił skurczu komórek oraz badanie różnicowania komórek macierzystych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Aktuatory biologiczne
- Kultura kardiomiocytów
- Charakterystyka biomechaniczna
Wprowadzenie
- Urządzenia mikrofabricated są niezbędne do badania zachowania komórek.
- Komórki mięśnia sercowego (kardiomiocyty) mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia funkcji serca.
- Charakteryzacja komórek na takich urządzeniach może dostarczyć istotnych informacji.
- Prawidłowe wysiewanie komórek jest krytyczne dla ich funkcji biologicznych.
Cel badania
- Opracowanie metody wysokogęstościowego wysiewu komórek na urządzeniach mikrofabrykowanych.
- Charakterystyka wydajności kardiomiocytów w czasie.
- Przedstawienie wizualnej demonstracji technik wysiewu komórek.
Zastosowane metody
- Wysiew kardiomiocytów na elastomerowych ramionach wspornikowych.
- Kultywowanie i monitorowanie właściwości biochemicznych.
- Ocena właściwości biomechanicznych w czasie.
- Demonstracje wizualne wspomagające naukę technik wysiewu komórek.
Główne wyniki
- Pomyślne wysiewanie kardiomiocytów na urządzeniach mikrofabrykowanych.
- Osiągnięcie charakterystyki właściwości biochemicznych i biomechanicznych.
- Wykazanie zdolności do ilościowego określania sił skurczu komórek.
- Metoda możliwa do zaadaptowania dla innych typów komórek i badań.
Wnioski
- Opracowany bioaktuator może być wykorzystywany dla różnych typów komórek.
- Metody wizualne usprawniają zrozumienie złożonego procesu zasiewu komórek.
- Wyniki przyczyniają się do rozwoju inżynierii tkankowej oraz medycyny regeneracyjnej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejsza praca ustanawia skalowalną platformę do kwantyfikacji sił skurczowych kardiomiocytów, umożliwiając mechanistyczną redukcję ryzyka w procesie walidacji celów terapeutycznych serca oraz przesiewu fenotypowego. Poprzez dostarczenie ilościowych odczytów biomechanicznych, system ten zwiększa pewność prognostyczną w identyfikacji wiodących związków oraz wyborze modeli przedklinicznych dla terapii układu sercowo-naczyniowego. Adaptacyjność systemu do innych typów komórek zwiększa jego użyteczność w procesach badawczych wymagających funkcjonalnej oceny tkanek.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez bezpośredni pomiar sił skurczowych generowanych przez komórki jako funkcjonalny odczyt stopnia oddziaływania z celem molekularnym.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez ilościowe określanie dojrzałości kardiomiocytów i ich integracji funkcjonalnej w czasie, co zmniejsza niejednoznaczność w zakresie mechanizmu działania celu.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje standaryzowane, ilościowe dane biomechaniczne (stres statyczny/dynamiczny, częstotliwość skurczów, prędkość pływania), które są odpowiednie do opracowywania testów i przesiewania związków.
- Wartość operacyjna: Zapewnia gotowość testu poprzez powtarzalne wysiewanie komórek i tworzenie zlewnej warstwy, co umożliwia wiarygodną ocenę związków w badaniach nad układem sercowo-naczyniowym.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Dostarcza istotnych z punktu widzenia choroby informacji o systemie poprzez powiązanie markerów dojrzewania kardiomiocytów z wydajnością funkcjonalną, co wspiera dopasowanie biomarkerów translacyjnych.
- Wartość operacyjna: Ułatwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju w oparciu o analizę ryzyka poprzez monitorowanie spadku funkcji po osiągnięciu szczytowej aktywności, co pozwala na ocenę ciągłości badań przedklinicznych i segregację portfela projektów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w proces odkrywania leków, od wczesnej walidacji celu, przez identyfikację związku wiodącego, aż po ocenę przedkliniczną, dostarczając dane funkcjonalne, które stanowią podstawę do decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań na każdym z tych etapów.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez korelację perturbacji genetycznych lub farmakologicznych ze zmianami siły skurczu i stresu komórkowego.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analiz oraz powtarzalność dzięki zestandaryzowanym protokołom wysiewania komórek i mierzalnym odczytom biomechanicznym w wielu punktach czasowych.
- Analityka: Umożliwia pomiary rozdzielone w czasie w zakresie stresu statycznego/dynamicznego, częstotliwości skurczów oraz wskaźników napędowych, co pozwala na analizę porównawczą efektów działania związków lub modyfikacji genetycznych.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną, wykazując ciągłość w funkcjonalnym dojrzewaniu kardiomiocytów oraz śledzeniu wydajności z wykorzystaniem urządzeń.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako wielokrotnego użytku platforma, którą można dostosować do różnych typów komórek i schematów badań, maksymalizując zwrot z inwestycji (ROI) w wielu obszarach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną dzięki ilościowej, rozdzielczej w czasie charakterystyce biomechanicznej kurczliwości i dojrzewania komórek.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i skalowalność poprzez zdefiniowane protokoły wysiewania, obrazowania i analizy, które minimalizują zmienność zależną od użytkownika.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez redukcję biologicznego ryzyka na późnych etapach dzięki wczesnej funkcjonalnej ocenie ryzyka celów kardiologicznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez dostarczenie obiektywnych, ilościowych wskaźników do porównywania głównych kandydatów lub modeli chorób.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli pierwotnych kardiomiocytów, obsłudze mikrofabrykacji oraz analizie obrazów time-lapse.
- Zależy od dostępu do inkubatorów z możliwością obrazowania, obiektywów zoom, oświetlenia LED oraz oprogramowania do śledzenia ruchu i obliczania naprężeń.
- Wymaga standaryzacji gęstości wysiewu, wykonania lejków oraz ustawień częstotliwości klatek między zespołami w celu zapewnienia powtarzalnych wyników w różnych ośrodkach.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania parametrów przy rozszerzeniu metody na typy komórek inne niż kardiomiocyty, w tym funkcjonalizację powierzchni i harmonogramy dojrzewania.
- Ograniczone przez skończoną żywotność pierwotnych kardiomiocytów, których szczytowa aktywność przypada około szóstego dnia, co wymaga terminowej realizacji eksperymentu.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
1:14
Cell Seeding and Culture of the Biorobots and Actuators
2:52
Imaging Biorobots and Actuators
4:14
Image Analysis of the Biological Actuators on a Stationary Base
6:01
Analysis of Swimming Biorobots
7:20
Results: Biomechanical Analysis of Cardiomyocyte-loaded Actuators and Biorobots
8:41
Conclusion
