Siłownik oparty na komórkach mięśnia sercowego i samostabilizujący się biorobot - część 2

Ogólnym celem tego badania jest wypełnienie mikrofabrykowanych urządzeń komórkami mięśnia sercowego oraz scharakteryzowanie właściwości biochemicznych i biomechanicznych komórek w tych urządzeniach, a także ich wydajności w czasie. Opisana tutaj materia może być łatwo zmodyfikowana do innych eksperymentów, które wymagają dodania komórek o dużej gęstości na mikrofabrykowanych urządzeniach. Główną zaletą biosiłownika opracowanego w tym filmie jest to, że można go łatwo zaadaptować do ilościowego określania sił skurczu komórek dowolnego innego typu komórek.

Może być również stosowany do badania zmian w cechach biomechanicznych komórek macierzystych w miarę ich różnicowania. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy wysiewu komórek są trudne do nauczenia się na podstawie opisów z tekstów. Muszą być przeprowadzone prawidłowo, aby zapewnić zlewające się połączenie komórek na ramionach wspornikowych, co jest niezbędne dla prawidłowej funkcji biologicznej.

Procedurę zademonstruje Neerajha Nagarajan z mojego laboratorium. Z biorobotem zacznij od kolby T25. Użyj magnesu, aby przytrzymać go na miejscu na dnie kolby.

Magnes nie jest potrzebny do siłowników biologicznych, ponieważ nie będą się one poruszać ze względu na ciężar szklanego koralika w podstawie. Zwiń mały kwadratowy arkusz z tworzywa sztucznego, aby użyć go jako lejka i umieść sterylny lejek nad siłownikami w biorobotach. Dostosuj średnicę na szerszym końcu, aby dopasować ją do urządzenia i wysokości, tak aby dobrze przylegała, gdy górna część kolby jest dokręcona.

Użyj oddzielnej kolby, aby przetestować i wyregulować dopasowanie lejka. Dokładne dopasowanie lejka zapewni, że nie dojdzie do wycieku komórek, jak wspomniano, do reszty pożywki. Jest to niezbędne do zapewnienia zlewnego pokrycia ramienia wspornikowego.

Po umieszczeniu lejka ponownie zawiesić kardiomiocyty w kompletnym DMEM o gęstości 16 milionów komórek na mililitr i powoli upuszczać 400 mikrolitrów zawiesiny na urządzenia przez każdy lejek. Następnie powoli przenieś kolby z powrotem do inkubatora, nie naruszając urządzeń ani znajdujących się w nich lejków. Pozwól komórkom przyczepić się przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po okresie inkubacji powoli wyjmij lejek. Delikatnie umyj próbki PBS i napełnij każdą kolbę 10 mililitrami świeżego DMEM w komplecie. Następnie wyjmij magnes z biorobota, aby unosił się na powierzchni i umieść kolby z powrotem w inkubatorze.

Zamontuj kamerę wyposażoną w obiektyw zmiennoogniskowy w inkubatorze, aby uwidocznić urządzenia w hodowli. Następnie dodaj pasek świetlny LED, który będzie używany jako źródło światła. Następnie podłącz aparat do komputera i otwórz program do obrazowania.

Po wejściu do programu kliknij obraz kamery w zakładce Plik, aby otworzyć wszystkie opcje kamery i wybierz podłączoną kamerę. Z listy kart wybierz opcję Na żywo i ręcznie ustaw ostrość obrazu, regulując pokrętło obiektywu. Następnie wybierz kadrowanie obszaru zainteresowania z górnego panelu.

Następnie ręcznie narysuj prostokąt w klatce wideo otaczający siłownik biologiczny i ramiona wspornikowe, aby zaznaczyć obszar zainteresowania. W przypadku biorobotów przechwytuje cały ekran, aby zarejestrować ruch pływacki urządzenia. Następnie wybierz Ustawienia aparatu i ustaw liczbę klatek na sekundę, dostosowując ekspozycję i proporcje pikseli obrazu na żywo.

Ustaw liczbę klatek na sekundę na około 30 klatek na sekundę. Na koniec kliknij przycisk nagrywania, aby rozpocząć nagrywanie filmów. Otwórz oprogramowanie do programowania, klikając ikonę.

Po załadowaniu kliknij Plik, Otwórz i wybierz plik skryptu m do uruchomienia analizy obrazu. Upewnij się, że nagrane obrazy TIF i ich wersje AVI znajdują się w tym samym folderze co plik m, a następnie kliknij przycisk Uruchom, aby uruchomić skrypt. Naciśnij przycisk Odtwórz, aby uruchomić właściwy program.

Po uruchomieniu kliknij przycisk Otwórz i zlokalizuj plik TIF lub AVI, który ma być analizowany. Następnie kliknij przycisk podstawowy. Wybierz punkt, w którym wspornik mocuje się do podstawy u góry i naciśnij Enter.

Spowoduje to umieszczenie kwadratowego znacznika na obrazie dla każdej klatki, aby wskazać położenie podstawy wspornika. Następnie kliknij przycisk skalowania, a następnie ręcznie kliknij jedną krawędź szklanego koralika. Przesuń wskaźnik myszy na przeciwną stronę szklanego koralika i naciśnij Enter.

Spowoduje to narysowanie linii, która mierzy średnicę szklanego koralika i odniesie średnicę do wyświetlanych pikseli. Kliknij przycisk Analizuj. Następnie kliknij wzdłuż wspornika w niewielkiej odległości od pierwszego kwadratowego znacznika reprezentującego podstawę wspornika.

Kontynuuj klikanie wzdłuż wspornika, w tym końcówki, a po zakończeniu naciśnij Enter. Spowoduje to umieszczenie znaku X w każdym klikniętym punkcie na wsporniku. Na koniec sprawdź, czy nałożony okrąg prawidłowo śledzi profil wspornika.

Jeśli to prawda, kliknij przycisk następnej klatki. Spowoduje to przełączenie do następnej klatki w pliku TIF. Powtórz ten proces dla wszystkich klatek.

Po przetworzeniu wszystkich ramek kliknij przycisk Eksportuj. Zacznij od otwarcia oprogramowania do analizy obrazu i załadowania pliku wideo z biorobotem pływającym. Następnie otwórz oprogramowanie arkusza kalkulacyjnego.

Na załadowanym filmie o biorobocie znajdź odniesienie do rozmiaru, takie jak szklany koralik. Użyj narzędzia Proste, aby narysować linię w poprzek szklanego koralika. Następnie kliknij przycisk Analizuj i wybierz opcję Ustaw skalę.

W polu Znana odległość ustaw wartość 3 000 mikrometrów i kliknij przycisk OK. Wybierz punkt na urządzeniu, który nie chwieje się między klatkami, aby działał jako znacznik i zapisz współrzędne X i Y tego punktu w arkuszu kalkulacyjnym. Przełącz się z powrotem do okna oprogramowania do analizy obrazu i naciśnij strzałki w prawo, aby przejść do następnej klatki. Ponownie wskaż znacznik i zapisz nowe współrzędne X i Y w arkuszu kalkulacyjnym.

Powtórz ten proces dla wszystkich ramek i wykorzystaj dane do analizy ruchu biorobota zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Naprężenia statyczne i dynamiczne siłownika były codziennie ekstrahowane z naprężeń powierzchniowych. Naprężenie statyczne to naprężenie skurczowe, które komórki wykazują na powierzchni w stanie spoczynku, a naprężenie dynamiczne to naprężenie generowane przez komórki przy maksymalnym skurczu.

W miarę dojrzewania komórek w hodowli obserwowano stopniowy wzrost naprężeń statycznych i dynamicznych w czasie. Wykazały one maksymalną siłę pociągową komórki wynoszącą 50 miliniutonów na metr i maksymalną siłę skurczu około 165 miliniutonów na metr w szóstym dniu. Równolegle do naprężeń statycznych i dynamicznych, markery dojrzewania, wzrostu i rozprzestrzeniania się kardiomiocytów oraz wzajemnych połączeń komórkowych również rosną do szóstego dnia.

Na podstawie analizy wideo przedstawiono porównanie średniej prędkości pływania, częstotliwości uderzeń i odległości przebytej na ruch dla trzech biorobotów o różnych profilach pływania. Chociaż pionowe bioroboty mają najmniejszą częstotliwość uderzeń, wykazywały najwyższą prędkość pływania i przebytą odległość. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zasiewać komórki mięśnia sercowego na mikrofabrykowanych urządzeniach, które mogą działać jako siłowniki biologiczne i bioroboty.

Proces pozyskiwania obrazu i późniejszej analizy danych opisany w tym filmie demonstruje wygodny sposób charakteryzowania zachowania komórki, a także wydajności urządzenia. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, że żywotność kardiomiocytów jest ograniczona, a aktywność komórek osiąga szczyt w szóstym dniu. Po czym z czasem maleje.