Name: Ocena rezerwy wapniowej retikulum sarkoplazmatycznego i wewnątrzkomórkowego rozkurczowego usuwania wapnia w izolowanych kardiomiocytach komorowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Poznaj metodę oceny rezerwy wapniowej retikulum sarkoplazmatycznego i usuwania wapnia w izolowanych kardiomiocytach. Technika ta pozwala badać zaburzenia gospodarki wapniowej w cukrzycy i niewydolności serca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (nr 81100159, Dongwu Lai; 81401147, Juhong Zhang), Programu Nauk Medycznych i Zdrowotnych Prowincji Zhejiang (Nr 201646246, Dongwu Lai) oraz Planu Nauki i Technologii Zdrowia Miasta Hangzhou (nr 2013A28, Ding Lin).

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Eksperymentalnym Centrum Badawczym, Chińskiej Akademii Chińskich Nauk Medycznych i Uniwersytecie Zhejiang.
1. Przygotowanie roztworu
<ol>
	<li>Przygotować wszystkie roztwory zgodnie z opisem w Tabeli 1.</li>
</ol>
2. Izolacja kardiomiocytów lewej komory (LV)
UWAGA: Kardiomiocyty LV są izolowane enzymatycznie za pomocą systemu perfuzji Langendroffa, jak opisano wcześniej7,8,9,10,11.
<ol>
	<li>Skonfiguruj system perfuzyjny Langendroffa. Napełnij system perfuzyjny roztworem Normal Tyrode (NT), ustaw temperaturę na 36,5 °C i usuń wszelkie pęcherzyki powietrza w probówce.</li>
	<li>Zważyć i znieczulić szczura Sprague-Dawley przez dootrzewnowe wstrzyknięcie (ip) wodzianu chloralu (400 mg/kg). Potwierdź stan znieczulenia, oceniając reakcję na uszczypnięcie ogona lub palca u nogi po 5 minutach.</li>
	<li>Otwórz jamę brzuszną pod wyrostkiem mieczykowatym nożyczkami chirurgicznymi, podnieś wyrostek mieczykowaty i otwórz klatkę piersiową nożyczkami. Usuń osierdzie, lekko unieś serce zakrzywionymi kleszczami, zidentyfikuj łuk aorty i odetnij serce nożyczkami od nasady aorty.</li>
	<li>Przełóż serce do naczynia o średnicy 60 mm i umyj je roztworem NT. Przytrzymaj aortę za pomocą dwóch kleszczy do mikropreparacji i zamontuj ją na kaniuli perfuzyjnej Langendorffa, a następnie mocno podwiąż aortę do kaniuli za pomocą szwów chirurgicznych. 
	UWAGA: Wykwalifikowany operator może zakończyć ten proces w ciągu 15 sekund.</li>
	<li>Wykonaj perfuzję serca za pomocą 30 ml roztworu NT, aby przywrócić krążenie w tętnicach wieńcowych. Następnie zmień perfuzat na 30 ml roztworu tylody wolnego od Ca2+ (10 mM tauryny, 1 mg/ml BSA), aby zatrzymać bicie serca. Następnie zmień perfuzat na roztwór izolacyjny kolagenazy A (0,6 mg/ml) w celu trawienia enzymatycznego. 
	UWAGA: Kolagenazę A należy stosować do eksperymentów na szczurach z cukrzycą lub kolagenazę II do eksperymentów bez szczurów z cukrzycą.</li>
	<li>Po trawieniu przez 20-25 minut szybko zmień roztwór perfuzyjny na roztwór Tyrode wolny od Ca2+, aby zatrzymać dalsze trawienie. Następnie przytrzymaj serce kleszczami, odetnij je od kaniuli i umieść serce w 35-milimetrowym naczyniu zawierającym roztwór KB (patrz Tabela 1).</li>
	<li>Wytnij ścianę LV nożyczkami i kleszczami. Odetnij przedsionek, prawą komorę i obszar połączenia przedsionkowo-komorowego. Pozostała tkanka to LV; przenieść go do nowej płytki o średnicy 35 mm z roztworem KB. Tkankę LV rozdrobnić na małe kawałki.</li>
	<li>Delikatnie odpipetować kawałki za pomocą plastikowego zakraplacza z filtrem i ponownie zawiesić w 10 ml roztworu KB.</li>
	<li>Przefiltrować komórki za pomocą filtra ze stali nierdzewnej o aperturze 150 μm i przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Wirować przy 150 x g przez 30 s i odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić miocyty w 10 ml roztworu KB, swobodnie osiąść na 6 minut, wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml roztworu KB. 
	UWAGA: Wszystkie etapy wykonano w temperaturze 36 °C w roztworach zagazowanych 100%O2.</li>
</ol>
3. Reintrodukcja wapnia
<ol>
	<li>Po osadzeniu się przez 20 minut w roztworze KB wyrzuć supernatant i ponownie zawieś miocyty za pomocą roztworu do reintrodukcji wapnia A (0,3 mM Ca2+, 4,5 ml roztworu tyrodu wolnego od Ca2+, 1,5 ml roztworu NT) przez 10 minut.</li>
	<li>Powtórzyć powyższą procedurę z roztworem B do ponownego wprowadzania wapnia (0,3 mM Ca2+, 3 ml roztworu tyrodu wolnego od Ca2+, 3 ml roztworu NT).</li>
	<li>Powtórz powyższą procedurę z roztworem NT (1,2 mM Ca2+) w celu oczyszczenia dostępnych miocytów. Przechowuj wyizolowane miocyty LV w tym roztworze i badaj je w ciągu 4-6 godzin.</li>
</ol>
4. Konfiguracja systemu perfuzji
<ol>
	<li>Podłącz rurkę dopływową z roztworem NT do perfuzji w komorze (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>W celu perfuzji igłowej docelowego miocytu podłącz wielolufową końcówkę kolektora (np. ołówek perfuzyjny, zwany dalej ołówkiem), zamocowaną w mikromanipulatorze, do systemu perfuzyjnego sterowanego zaworem. Dodaj roztwór NT i 10 mM roztworu kofeiny do każdej kolumny ołówka (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A).</li>
	<li>Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza z rur, aby uniknąć zablokowania powietrza.</li>
	<li>Policz liczbę kropli z mikronowej końcówki ołówka przez 10 s i ręcznie wyreguluj regulator przepływu, aby utrzymać prędkość przepływu na przybliżonym poziomie 3 kroplówki/10 s.</li>
</ol>
5. Pomiary wewnątrzkomórkowego Ca2+ przejściowego i sarkomerowego skrócenia 7,8,9
<ol>
	<li>Odpipetować 10 μl zawiesiny komórek na szkiełku, policzyć liczbę komórek za pomocą licznika komórek pod mikroskopem i obliczyć gęstość. Rozcieńczyć miocyty do przybliżonego stężenia 50 000 komórek/ml.</li>
	<li>Dodać bulion Fura-2 acetoksymetylowy (AM) (barwnik wrażliwy na wapń) do 1 ml zawiesiny miocytów, aby doprowadzić końcowe stężenie do 2 μM. Przechowywać w ciemności przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wirować przy 150 g przez 30 s i ponownie zawiesić kardiomiocyty roztworem NT 2 razy.</li>
	<li>Wyłącz światło i utrzymuj komórki w ciemności. Umieść miocyty w komorze perfuzyjnej na 15 minut. Następnie rozpocznij perfuzję w komorze (1,5 ml/min) roztworem NT. Stymulacja miocytów polem o częstotliwości 1 Hz za pomocą stymulatora (czas trwania fali 4,0 ms, amplituda impulsu 8,0 V) przez 5 minut.</li>
	<li>Wybierz miocyt o dobrym kształcie (kształt pręcika, ostra krawędź i wyraźne prążki krzyżowe) i stabilnym stymulowanym skurczu (bez spontanicznego skurczu) pod mikroskopijną soczewką obiektywu 10x. Następnie zmień powiększenie mikroskopowe na 40x i obróć orientację kamery CCD, aby utrzymać miocyt w pozycji poziomej.</li>
	<li>Opraw pojedynczy miocyt, regulując adapter ramki komórkowej. Upewnij się, że tło jest czyste.</li>
	<li>Wystaw miocyty na działanie światła emitowanego przez lampę ksenonową z filtrami wzbudzenia o długości fali 340 lub 380 nm i zobrazuj miocyty przez obiektyw 40x. Wykrywanie sygnału fluorescencji przy długości fali 510 nm. W międzyczasie zwróć uwagę na zmiany długości sarkomerów miocytów i jednocześnie rejestruj za pomocą modułu miękkiej krawędzi.</li>
	<li>Rejestruj fluorescencję za pomocą systemu fotopowielacza fluorescencji z podwójnym wzbudzeniem. Uruchom program do nagrywania systemu obrazowania wapnia, kliknij "Plik/nowy plik", aby utworzyć nowy plik nagrania, a następnie kliknij przycisk "start", aby synchronicznie zarejestrować długość fluorescencji i sarkomeru.</li>
</ol>
6. Ocena funkcji usuwania rezerwy i rozkurczu Ca2+ SR Ca2+ 7,8,9
<ol>
	<li>Połącz port "Aux Out" w stymulatorze z portem "Analog In" w systemie sterowania zaworem (np. sterownikiem zaworu, patrz Tabela materiałów) za pomocą BNC (w celu synchronizacji sygnału TTL).</li>
	<li>Zaprogramuj program do automatycznego przełączania zaworów perfuzyjnych, jak opisano wcześniej8,9; Szczegółowe kroki obsługi są wymienione poniżej.
	<ol>
		<li>Ustaw parametry w oprogramowaniu sterującym zaworem zgodnie z tabelą 2 i kliknij przycisk "Pobierz", aby pobrać sekwencję załadowaną w programie. Kliknij przycisk "Wyzwalacz", aby włączyć funkcję wyzwalania. 
		UWAGA: System sterowania zaworem może wykonać sekwencję po otrzymaniu sygnału TTL.</li>
		<li>Ustaw stymulator w trybie sekwencyjnym i ustaw parametry zgodnie z tabelą 3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw stymulator na "kroku S1", aby nadać tempo miocytom LV przy 1 Hz. Rozpocznij perfuzję igły z prędkością 1,5 ml/min z roztworem NT. 
	UWAGA: Ponieważ prędkość strumienia igły jest większa niż perfuzja w komorze, załamanie światła strumienia igły różni się od załamania światła perfuzji w komorze. Różnica załamania światła wskazuje na zakres efektywnej perfuzji igły, która otacza docelowe miocyty.</li>
	<li>Wybierz docelowy miocyt w widoku mikroskopowym o małej mocy (w kolejności od dołu do góry) i upewnij się, że można do niego dotrzeć za pomocą mikrokońcówki ołówka. Zmień powiększenie mikroskopu na 400x. Obróć orientację kamery CCD, aby utrzymać miocyty w pozycji poziomej. Dostosuj prostokątny otwór pod adapterem ramki komórkowej do odpowiedniego okna, które wypełnia się miocytami. Upewnij się, że tło jest minimalne; Nie pozwól, aby w tym oknie znalazły się inne miocyty lub resztki martwych komórek.</li>
	<li>Dostosuj położenie ołówka zamocowanego na mikromanipulatorze i ostrożnie umieść mikrokońcówkę w odległości promienia pola widzenia od docelowego miocytu pod 400-krotnym powiększeniem mikroskopu.</li>
	<li>Dostosuj zakres strumienia igły tak, aby obejmował głównie docelowy miocyt i upewnij się, że miocyt nie może zostać zmieciony przez przepływ igły.</li>
	<li>Po 60 s podstawowego tempa przesuń kursor stymulatora do "kroku D2". 
	UWAGA: Reszta protokołu zostanie wykonana automatycznie przez stymulator i system sterowania zaworem. W oparciu o powyższe ustawienie, protokół może być wykonywany automatycznie, jak w Rysunek 2A, podstawowa stymulacja 1 Hz z roztworem NT przez 60 s. Następnie wstrzymaj stymulację i opóźnij na 2 s, szybko przełącz się na 10 mM perfuzji kofeiny na 15 s (aby funkcjonalnie uwolnić zapas Ca2+ w SR), a następnie przełącz się z powrotem na roztwór NT.</li>
	<li>Na końcu nagrania wykryj fluorescencję tła dla poszczególnych miocytów. Kliknij przycisk "pauza", aby wstrzymać nagrywanie pliku, przesuń widok mikroskopowy do pobliskiego pustego obszaru. Kliknij przycisk "nagraj", aby wznowić nagrywanie na sekundy i nagrać numeryczne wartości intensywności 340 i 380 nm w celu korekcji tła.</li>
	<li>Otwórz okno dialogowe "Operacja/Stała" i wprowadź odpowiednio wartości w formularzu "tło"; oprogramowanie może skorygować wartości współczynnika Fura 2, odejmując tło.</li>
</ol>
7. Analiza danych 9
<ol>
	<li>W celu pomiarów stanów przejściowych wapnia i skrócenia sarkomeru na podstawowym etapie stymulacji, należy uśrednić impulsy drgawkowe, a następnie przeanalizować parametry dynamiczne, takie jak stany przejściowe wapnia, stała czasowa przejściowego rozpadu wapnia (Tau-1 Hz), korzystając z oprogramowania automatycznie. 
	UWAGA: Jeśli oprogramowanie nie pasuje dobrze do segmentu zaniku, wyeksportuj ślad spadku w celu ręcznego dopasowania krzywej monowykładniczej.</li>
	<li>W przypadku impulsów wapniowych wywołanych kofeiną wybierz tylko impuls o stromej fali do analizy funkcji usuwania wapnia. Wyklucz komórki z zakłóceniami sygnału, nieprawidłowym impulsem lub tymi, które odpłynęły w połowie.</li>
	<li>Zmierz amplitudę impulsu wapniowego wywołanego kofeiną (Ca-kofeina, wskaźnik rezerwySRCa 2+).</li>
	<li>Uzyskaj stałą czasu zaniku impulsu wapnia indukowanego kofeiną (Tau-kofeina) przez dopasowanie krzywej monowykładniczej (czas trwania 10 s) ręcznie z oprogramowania (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2C).</li>
</ol>

<ol><li>Capel, R. A., Terrar, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+Ca+%282%2B%29-dependent+mechanisms+for+the+initiation+of+the+heartbeat%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">The importance of Ca (2+)-dependent mechanisms for the initiation of the heartbeat.</a> Front Physiol. 6, 80(2015).</li>
<li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+cycling+and+signaling+in+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium cycling and signaling in cardiac myocytes.</a> Annu Rev Physiol. 70, 23-49 (2008).</li>
<li>Zhao, S. M., Wang, Y. L., Guo, C. Y., Chen, J. L., Wu, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+decay+of+Ca2%2B+homeostasis+in+the+development+of+diabetic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Diabetol%22%5BJournal%5D)">Progressive decay of Ca2+ homeostasis in the development of diabetic cardiomyopathy.</a> Cardiovasc Diabetol. 13, 75(2014).</li>
<li>Pereira, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+diabetic+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in diabetic cardiomyocytes.</a> Cell calcium. 56 (5), 372-380 (2014).</li>
<li>Coppini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+sodium+current+inhibition+reverses+electromechanical+dysfunction+in+human+hypertrophic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Late sodium current inhibition reverses electromechanical dysfunction in human hypertrophic cardiomyopathy.</a> Circulation. 127 (5), 575-584 (2013).</li>
<li>Ferrantini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R4496C+RyR2+mutation+impairs+atrial+and+ventricular+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">R4496C RyR2 mutation impairs atrial and ventricular contractility.</a> J Gen Physiol. 147 (1), 39-52 (2016).</li>
<li>Li, L., Chu, G., Kranias, E. G., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+myocyte+calcium+transport+in+phospholamban+knockout+mouse+relaxation+and+endogenous+CaMKII+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac myocyte calcium transport in phospholamban knockout mouse relaxation and endogenous CaMKII effects.</a> Am J Physiol. 274, H1335-H1347 (1998).</li>
<li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaMKII+inhibition+in+heart+failure%2C+beneficial%2C+harmful%2C+or+both%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">CaMKII inhibition in heart failure, beneficial, harmful, or both.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302, H1454-H1465 (2012).</li>
<li>Lai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rho+kinase+inhibitor%2C+fasudil%2C+ameliorates+diabetes-induced+cardiac+dysfunction+by+improving+calcium+clearance+and+actin+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">The Rho kinase inhibitor, fasudil, ameliorates diabetes-induced cardiac dysfunction by improving calcium clearance and actin remodeling.</a> J Mol Med (Berl). 95 (2), 155-165 (2017).</li>
<li>Lai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch+Current-Induced+Abnormal+Impulses+in+CaMKII%CE%B4+Knockout+Mouse+Ventricular+Myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Electrophysiol%22%5BJournal%5D)">Stretch Current-Induced Abnormal Impulses in CaMKIIδ Knockout Mouse Ventricular Myocytes.</a> J Cardiovasc Electrophysiol. 24 (4), 457-463 (2013).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+of+L-type+calcium+current+and+cardiac+function+in+CaMKII%7Bdelta%7D+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Alterations of L-type calcium current and cardiac function in CaMKII{delta} knockout mice.</a> Circ Res. 107 (3), 398-407 (2010).</li>
<li>Roussel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoyl-carnitine+increases+RyR2+oxidation+and+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+leak+in+cardiomyocytes%3A+Role+of+adenine+nucleotide+translocase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Palmitoyl-carnitine increases RyR2 oxidation and sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak in cardiomyocytes: Role of adenine nucleotide translocase.</a> Biochim Biophys Acta. 1852 (5), 749-758 (2015).</li>
<li>Yaras, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+diabetes+on+ryanodine+receptor+Ca2%2B+release+channel+%28RyR2%29+and+Ca2%2B+homeostasis+in+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Effects of diabetes on ryanodine receptor Ca2+ release channel (RyR2) and Ca2+ homeostasis in rat heart.</a> Diabetes. 54 (11), 3082-3088 (2005).</li>
<li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-Mediated+Overexpression+of+O-GlcNAcase+Improves+Contractile+Function+in+the+Diabetic+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-Mediated Overexpression of O-GlcNAcase Improves Contractile Function in the Diabetic Heart.</a> Circ Res. 96 (9), 1006-1013 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Strumień wapnia uwalniany z SR jest głównym źródłem Ca2+ dla skurczu w sercu. Do pewnego stopnia amplituda zawartości SR Ca2+ i ułamkowy Ca2+ uwalniany z SR odzwierciedlają rezerwę SR Ca2+ dostępną dla skurczu serca. Z drugiej strony, rezerwa Ca2+ SR zależy od zdolności wychwytu zwrotnego Ca2+ SR, wycieku Ca2+ SR i ich równowagi w SR podczas rozkurczu 12,13,14.<sup class="xref...

Wewnątrzkomórkowy recykling wapnia ([Ca2+]i) odgrywa kluczową rolę w regulacji funkcji skurczowej i rozkurczowej w kardiomiocytach1. Jak wiemy, wywołane wapniem uwalnianie Ca2+ inicjuje sprzężenie wzbudzenia-skurczu, które przekształca sygnał elektryczny na skurcz. Depolaryzacja błony aktywuje sarkolemmalne kanały Ca2 + typu L, które indukują uwalnianie Ca2 + z SR do cytoplazmy za pośrednictwem receptorów ryanodine 2 (RyR2). Przemijające podwyższone cytoplazmatyczne Ca2 + inicjuje skurcz miofibryli. Podczas rozkurczu cytoplazmatyczny Ca2+ jest regenerowany do SR za pomocą SR Ca2+-ATPazy 2 (SERCA2) i wypompowywany z kardiomiocytu przez wymiennik Na+-Ca2+ (NCX)2. Proces ten prowadzi do recyklingu skurczowo-relaksacyjnego w kardiomiocytach.
SR serca to wewnątrzkomórkowa sieć błonowa, która otacza kurczliwą maszynerię. Służy jako rezerwuar Ca2+ do skurczu i ponownie wchłania wewnątrzkomórkowy Ca2+ podczas relaksacji. Rezerwa SR Ca2+ dostępna dla uderzeń jest określona dla kurczliwości serca. Tymczasem usunięcie wewnątrzkomórkowego Ca2 + ma kluczowe znaczenie dla rozkurczu serca. W niektórych stanach patofizjologicznych, takich jak cukrzyca i niewydolność serca, upośledzony klirens Ca2 + i obniżony magazyn Ca2 + w kardiomiocytach mogą być zaangażowane w proces dysfunkcji serca2,3,4.
Do pomiaru uwalniania SR Ca2+ i rozkurczowego usuwania Ca2+ w kardiomiocytach, istnieją dwa szeroko stosowane podejścia: integralność prądu NCX oparta na patch-clamp5,6, oraz impuls Ca2+ wywołany kofeiną na podstawie obrazowania fluorescencyjnego Ca2+7,8,9. Pierwsze podejście opiera się na fakcie, że Ca2+ uwalniany z SR jest w dużej mierze wypompowywany z komórki przez NCX. Podejście to jest jednak ograniczone przez wymóg zaawansowanego sprzętu i umiejętnego działania. W niniejszym badaniu opisano wygodne podejście do oceny rezerwy Ca2 + SR i usuwania Ca2 + w miocytach poprzez pomiar impulsu Ca2 + wywołanego kofeiną w oparciu o system obrazowania fluorescencji Ca2 +. Krótko mówiąc, wewnątrzkomórkowa fluorescencja Ca2 + jest wskazywana przez Fura-2. Łącząc ze sobą system stymulacji i system perfuzji, przedstawiamy program do automatycznego przełączania systemu perfuzji i stymulacji. 10 mM kofeiny zastosowano w celu szybkiego wywołania całkowitego uwalniania Ca2 + w SR. Wykładnicze stałe czasu rozpadu (Tau) stanów przejściowych wapnia i impulsów wapnia wywołanych kofeiną uzyskano z dopasowania krzywej monowykładniczej, które odzwierciedlają udział SERCA i NCX w rozkurczowym usuwaniu Ca2+.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Alfa Aesar</td><td>012314</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Alfa Aesar</td><td>012315</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Alfa Aesar</td><td>11595</td><td></td></tr><tr><td>HEPEs</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16828</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Alfa</td><td>Aesar A18395</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Alfa</td><td>Aesar A18854</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Alfa Aesar</td><td>011594</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Alfa Aesar</td><td>3337</td><td></td></tr><tr><td>L-glutaminiczny</td><td>Alfa Aesar</td><td>A15031</td><td></td></tr><tr><td>Tauryna</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12403</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza A</td><td>Roche</td><td>10103586001</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza Typ II</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Roche</td><td>735094</td><td></td></tr><tr><td>kofeina</td><td>Sigma</td><td>C0750</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F1201</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>Olympus IX 71</td><td></td></tr><tr><td>System Langendorffa</td><td>Beijing Syutime Technology Co</td><td>PlexiThermo-S-LANGC</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Marchauser</td><td>MM33 linki</td><td></td></tr><tr><td>Komora perfuzyjna</td><td>IonOptix</td><td>FHD</td><td></td></tr><tr><td>Valve Controlled Grawitacyjny system perfuzyjny</td><td>ALA</td><td>VC 3-8</td><td></td></tr><tr><td>oprogramowanie sterownika zaworu</td><td>ALA</td><td>VC 3 1.0.1.2</td><td></td></tr><tr><td>Precyzyjny regulator przepływu</td><td>Delta Med</td><td>3204315</td><td></td></tr><tr><td>Multi-Barrel Manifold Perfusion Pencil</td><td>AutoMate Scientific</td><td>04-08-[360]</td><td></td></tr><tr><td>Wymienna końcówka Micron</td><td>AutoMate Scientific</td><td>360um i.d.</td><td></td></tr><tr><td>Systemy pomiaru fluorescencji i wymiarowania komórek</td><td>IonOptix</td><td>Hyperswitch</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do nagrywania</td><td>IonOptix</td><td>IonWizard 6.2.59</td><td></td></tr><tr><td>Stymulator</td><td>IonOptix</td><td>MyoPacer EP</td><td></td></tr><tr><td>Szczury Sprague-dawley</td><td>Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.</td><td>SCXK 2016-01-007436</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena rezerwy wapniowej retikulum sarkoplazmatycznego i wewnątrzkomórkowego rozkurczowego usuwania wapnia w izolowanych kardiomiocytach komorowych

Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

Wewnątrzkomórkowy recykling wapnia odgrywa kluczową rolę w regulacji funkcji skurczowej i rozkurczowej w kardiomiocytach. Retikulum sarkoplazmatyczne serca (SR) służy jako rezerwuar Ca2 + do skurczu, który wychwytuje zwrotnie wewnątrzkomórkowy Ca2 + podczas relaksacji. Rezerwa SR Ca2 + dostępna dla uderzeń jest określona dla kurczliwości serca, a usunięcie wewnątrzkomórkowego Ca2 + ma kluczowe znaczenie dla funkcji rozkurczowej serca. W niektórych stanach patofizjologicznych, takich jak cukrzyca i niewydolność serca, upośledzony klirens wapnia i magazynowanie SR Ca2 + w kardiomiocytach mogą być zaangażowane w postęp dysfunkcji serca. W tym miejscu opisujemy protokół oceny rezerwy SRCa2+ i rozkurczowego usuwania Ca2+. Krótko mówiąc, pojedynczy kardiomiocyt wyizolowano enzymatycznie, a wewnątrzkomórkowa fluorescencja Ca2 + wskazywana przez Fura-2 została zarejestrowana przez system obrazowania wapnia. Aby wykorzystać kofeinę do indukowania całkowitego uwalniania SRCa 2 +, zaprogramowaliśmy program automatycznego przełączania perfuzji poprzez połączenie systemu stymulacji i systemu perfuzji. Następnie wykorzystano dopasowanie krzywej monowykładniczej do analizy stałych czasu rozpadu stanów nieustalonych wapnia i impulsów wapniowych wywołanych kofeiną. W związku z tym oceniono udział SR Ca2+-ATPazy (SERCA) i wymiennika Na+-Ca2+ (NCX) w rozkurczowym usuwaniu wapnia.

W niniejszej pracy przedstawiamy przykład szczurów z cukrzycą indukowaną streptozotocyną (STZ) (DM) oraz szczurów rasy Sprague-Dawley (SD) w tym samym wieku. Samce szczurów SD w wieku 8 tygodni (200 ± 20 g) otrzymały pojedynczy wtrysk doszpikowy STZ (70 mg/kg, ip) w przypadku grupy DM lub bufor cytrynianowy w grupie kontrolnej. Tydzień po podaniu STZ szczury z poziomem glukozy we krwi &gt; 16,7 mmol/L uznano za cukrzycowe. Po 8 tygodniach dokonano enzymatycznej izolacji mioc...

Wewnątrzkomórkowy recykling wapnia odgrywa kluczową rolę w regulacji funkcji skurczowej i rozkurczowej w kardiomiocytach. W tym miejscu opisujemy protokół oceny rezerwy Ca2 + retikulum sarkoplazmatycznego i rozkurczowej funkcji usuwania wapnia w kardiomiocytach za pomocą systemu obrazowania wapnia.

Ocena rezerwy wapniowej retikulum sarkoplazmatycznego i wewnątrzkomórkowego rozkurczowego usuwania wapnia w izolowanych kardiomiocytach komorowych

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum ...

Ogólnym celem tej procedury jest ocena rezerwy wapnia w siateczce sarkoplazmatycznej oraz funkcji usuwania wapnia wewnątrzkomórkowego w fazie rozkurczowej w izolowanych kardiomiocytach. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące mechanizmów gospodarki wapniem wewnątrzkomórkowym w określonych stanach patofizjologicznych, takich jak cukrzyca i niewydolność serca. Główną zaletą tej techniki jest jej wygoda oraz mniejsze ograniczenia pod kątem technicznym i sprzętowym.Aby rozpocząć tę procedurę, przygotuj system perfuzji Langendorffa. Napełnij system perfuzyjny roztworem NT, ustaw temperaturę na 36,5 °C i usuń wszelkie pęcherzyki powietrza z rurki. Następnie otwórz jamę brzuszną poniżej wyrostka mieczowatego, unieś wyrostek mieczowaty i otwórz klatkę piersiową za pomocą nożyczek.Następnie należy usunąć osierdzie, delikatnie unieść serce za pomocą zakrzywionych pincet, zidentyfikować łuk aorty i odciąć serce u nasady aorty. Po tym czasie należy przenieść serce do naczynia o średnicy 60 mm i przemyć je roztworem NT. Chwyć aortę dwiema pincetami mikrochirurgicznymi i zamocuj ją na kaniuli perfuzyjnej Langendorffa.Następnie mocno przywiąż aortę do kaniuli za pomocą szwów chirurgicznych. Po tym przepłucz serce 30 mililitrami roztworu NT, aby przywrócić krążenie w tętnicach wieńcowych. Następnie zmień płyn perfuzyjny na 30 mililitrów roztworu Tyrode'a pozbawionego wapnia, aby zatrzymać akcję serca.Następnie należy zmienić perfuzat na roztwór izolacyjny z kolagenazą A w celu trawienia enzymatycznego. Po 20 do 25 minutach trawienia szybko zmień roztwór perfuzyjny na bezwapniowy roztwór Tyrode'a, aby zatrzymać dalszy proces trawienia. Następnie przytrzymaj serce pęsetą, odetnij je od kaniuli i umieść serce w 35 milimetrowej płytce zawierającej roztwór KB.Następnie zlokalizuj obszar lewej komory. Odetnij przedsionek, prawą komorę oraz obszar złącza przedsionkowo-komorowego. Następnie przenieś lewą komorę do nowej szalki 35 mm z roztworem KB i posiekaj tkankę na małe kawałki.Delikatnie przenieś fragmenty za pomocą plastikowej pipety z filtrem. Następnie przefiltruj komórki przez filtr ze stali nierdzewnej o rozmiarze oczek 150 micron oraz przenieś je do probówki do wirowania o pojemności 15 milliliter. Po tym odwiruj próbkę z prędkością 150 ×g przez 30 seconds i odlej supernatant.Resuspender miocyty w 10 mililitrach roztworu KB i pozostawić do odstania przez sześć minut. Następnie usunąć naddestaw i ponownie resuspender osad w 10 mililitrach roztworu KB na 20 minut. Po odstaniu w roztworze KB przez 20 minut usunąć naddestaw i resuspender miocyty w roztworze A do ponownego wprowadzenia wapnia. Powtórzyć powyższą procedurę z roztworem B do wprowadzenia wapnia. Następnie powtórzyć powyższą procedurę z roztworem NT w celu oczyszczenia dostępnych miocytów.Przechowywać wyizolowane kardiomiocyty lewej komory (LV) w tym roztworze i badać je w ciągu czterech do sześciu godzin. Następnie do każdej kolumny ołówka dodać roztwór NT oraz 10 mM roztwór kofeiny. Usunąć pęcherzyki powietrza z rurek, aby uniknąć zatorów powietrznych.Następnie podłącz rurkę dopływową z roztworem NT do perfuzji komory. W celu perfuzji igłowej docelowego miocytu podłącz wielokanałowy kolektor do systemu perfuzji sterowanego zaworem. Po tym czasie policz liczbę kropli spadających z mikrokońcówki przez 10 s i ręcznie dostosuj regulator przepływu, aby utrzymać prędkość przepływu na poziomie około trzech kropli na 10 s.W tej procedurze dodaj roztwór stokowy fura-2-acetometylu do jednego mililitra zawiesiny miocytów, aby uzyskać końcowe stężenie 2 µM. Przechowuj je w ciemności przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie odlej nadsącz i dwukrotnie resuspenduj kardiomiocyty w roztworze NT.Następnie należy wyłączyć światło i przechowywać komórki w ciemności. Miocyty należy umieścić w komorze perfuzyjnej na 15 minut przed rozpoczęciem perfuzji roztworem NT. Następnie należy stymulować miocyty polem o częstotliwości 1 Hz przez pięć minut przy użyciu stymulatora.Następnie, przy użyciu obiektywu mikroskopowego 10X, wybierz miocyt o dobrym kształcie i stabilnym skurczu stymulowanym. Kliknij File New File, aby utworzyć nowy plik rejestracji. Następnie zmień powiększenie mikroskopu na 40X i obróć kamerę CCD tak, aby miocyt znajdował się w pozycji poziomej.Następnie wykadruj pojedynczy miocyt, regulując adapter do kadrowania komórek, i upewnij się, że tło jest czyste. Następnie naświetl miocyty światłem emitowanym przez lampę ksenonową z filtrami wzbudzenia o długości fali 340 lub 380 nanometrów i wykonaj obrazowanie miocytów przez obiektyw 40X. Wykryj sygnał fluorescencyjny przy 510 nanometrach.Kliknij przycisk Start, aby synchronicznie rejestrować fluorescencję i długość sarkomeru za pomocą systemu podwójnej ekscytacji z fotopowielaczem fluorescencyjnym. Obserwuj zmiany długości sarkomerów w miocytach i jednocześnie dokonuj rejestracji za pomocą modułu soft edge. W tej procedurze połącz port aux out w stymulatorze z wejściem analogowym w systemie sterowania zaworami za pomocą kabla BNC.Następnie należy wprowadzić parametry w oprogramowaniu sterującym zaworami, kliknąć przycisk pobierania, aby pobrać sekwencję załadowaną w programie, a następnie kliknąć przycisk wyzwalania, aby aktywować funkcję wyzwalacza. Następnie należy przełączyć stymulator w tryb sekwencyjny i ustawić odpowiednie parametry. Po tym kroku należy ustawić stymulator w kroku S1, aby stymulować miocyty LV z częstotliwością 1 Hz.Rozpocząć perfuzję igłową z prędkością 1,5 milliliters per minute przy użyciu roztworu NT. Wybrać docelowy miocyt przy niskim powiększeniu mikroskopowym i upewnić się, że jest on dostępny dla mikrokońcówki urządzenia. Następnie zmienić powiększenie mikroskopu na 400X.Obróć kamerę CCD tak, aby miocyt znajdował się w pozycji poziomej. Następnie dostosuj prostokątną aperturę pod adapterem do kadrowania komórek, tak aby pole widzenia było wypełnione przez miocyty. Następnie wyreguluj położenie elektrody przymocowanej do mikromanipulatora i ostrożnie umieść mikrokońcówkę w odległości odpowiadającej promieniowi pola widzenia od docelowego miocytu.Następnie dostosuj zakres strumienia igły tak, aby obejmował on głównie docelowy miocyt, i upewnij się, że miocyt nie zostanie zniesiony przez przepływ igły. Po 60 sekundach stymulacji podstawowej przesuń kursor stymulatora do kroku D2. Pozostała część protokołu zostanie wykonana automatycznie przez stymulator i sterownik zaworów.Kliknij przycisk Pause, aby wstrzymać nagrywanie pliku i przesuń widok mikroskopowy na pobliski pusty obszar. Następnie kliknij przycisk Record, aby wznowić nagrywanie przez kilka sekund i zarejestrować numeryczne wartości intensywności dla 340 i 380 nanometrów w celu korekcji tła. Po tym kroku otwórz okno dialogowe Operation Constant i wprowadź wartości do formularza tła.Oprogramowanie może korygować wartości stosunku fura-2 poprzez odjęcie tła. Przedstawiono tutaj ilustrację protokołu automatycznego przełączania zaworów perfuzyjnych i systemu stymulacji. Rycina ta pokazuje wartości statystyczne zapasu wapnia w siateczce sarkoplazmatycznej oraz frakcyjnego uwalniania wapnia dla skurczów stymulowanych z częstotliwością 1 Hz w grupach cukrzycowej i Sprague Dawley.Grupa z cukrzycą wykazała istotnie zmniejszoną rezerwę wapnia w SR oraz mniejszy ułamkowy wyrzut wapnia z SR w porównaniu z grupą Sprague Dawley. Tutaj panel oprogramowania przedstawia ręczne dopasowanie krzywej monoeksponencjalnej dla stałej czasowej zaniku impulsu wapniowego indukowanego kofeiną. Te wykresy słupkowe porównują Tau-caffeine oraz stosunek Tau-1Hz/Tau-caffeine pomiędzy grupą z cukrzycą a grupą Sprague Dawley.W grupie z cukrzycą odnotowano istotnie wyższe wartości Tau-kofeina oraz Tau-1Hz/Tau-kofeina w porównaniu z grupą szczurów Sprague Dawley. Opisana procedura stanowi wykonalne i wygodne narzędzie do badania mechanizmów gospodarki wewnątrzkomórkowej wapnia w dysfunkcji serca. Podczas wykonywania tej procedury należy zwrócić uwagę na kilka kluczowych kwestii, takich jak stabilne przyleganie miocytów do naczynia, zabezpieczenie przełącznika kanału, kontrola prędkości przepływu perfuzji igłowej oraz zachowanie odpowiedniej odległości między końcówką igły a docelowym miocytem.

assessment-sarcoplasmic-reticulum-calcium-reserve-intracellular

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Pojedyncze kardiomiocyty od myszy typu dzikiego i zmutowanych mogą być izolowane z serca w celu zbadania ich kurczliwości i przejściowych stanów wapnia. Pozwala to na scharakteryzowanie udziału dysfunkcji komórkowej w dysfunkcji serca z dowolnej przyczyny.

Izolacja i analiza fizjologiczna kardiomiocytów myszy

Ten artykuł opisuje szczegółowy protokół i sprzęt niezbędny do podwójnego optycznego mapowania potencjału transbłonowego (Vm) i wolnej retikulum wewnątrzsarkoplazmatycznego (SR) Ca2+ w sercu królika z perfundacją Langendorffa. Metoda ta pozwala na bezpośrednią obserwację i kwantyfikację dynamiki Vm i SR Ca2+ w nienaruszonym sercu.

Mapowanie optyczne retikulum wewnątrzsarkoplazmatycznego Ca2+ i potencjału transbłonowego w sercu królika perfundowanym metodą Langendorffa

Obecnie, większość dostępnych wskaźników wapnia jest używana do ilościowego określania cytoplazmatycznych stanów przejściowych wapnia jako pośrednich miar wapnia uwalnianego z retikulum sarkoplazmatycznego w hodowanych komórkach mięśni gładkich. Protokół ten opisuje użycie specyficznego wskaźnika opartego na FRET, który umożliwia bezpośredni pomiar sygnałów wapniowych w świetle retikulum sarkoplazmatycznego.

Pomiar wahań stężenia wapnia w siateczce sarkoplazmatycznej hodowanych komórek mięśni gładkich za pomocą obrazowania konfokalnego opartego na FRET

Ten artykuł opisuje protokół, który ocenia zmiany wrażliwości miofilamentu Ca2+ podczas skurczu w izolowanych miocytach serca szczura. Wraz z elektrofizjologią serca, skurczowymi/rozkurczowymi poziomami cytozolu Ca2+ i skurczem/rozluźnieniem, pomiar ten jest niezbędny do wzmocnienia mechanizmów pośredniczących w sprzężeniu pobudzenia-skurczu serca w zdrowych i chorych sercach.

Ocena wrażliwości miofilamentu ca2+ leżącej u podstaw sprzężenia wzbudzenia-skurczu serca

Tutaj opisujemy zoptymalizowaną, opartą na Langendorffie procedurę izolacji jednokomórkowych kardiomiocytów przedsionkowych z szczurzego modelu niewydolności serca związanej z zespołem metabolicznym z zachowaną frakcją wyrzutową. Ręczna regulacja ciśnienia śródświetlnego w jamach serca jest wdrażana w celu uzyskania funkcjonalnie nienaruszonych miocytów odpowiednich do badań pobudzenia, skurczu i sprzężenia.

Izolacja kardiomiocytów przedsionkowych od szczurzego modelu niewydolności serca związanej z zespołem metabolicznym z zachowaną frakcją wyrzutową

Prezentujemy metodologię izolacji mysich miocytów oraz sposób uzyskiwania śladów napięcia lub wapnia jednocześnie ze śladami skracania sarkomeru za pomocą fotometrii fluorescencyjnej z jednoczesnymi cyfrowymi pomiarami geometrii komórek.

Obrazowanie optyczne izolowanych mysich miocytów komorowych

Ten protokół ma na celu opisanie krok po kroku techniki ekstrakcji i oceny funkcji serca za pomocą kardiomiocytów ze skóry. Metodologia ta umożliwia pomiar i ostrą modulację funkcji miofilamentów za pomocą małych zamrożonych biopsji, które można pobrać z różnych lokalizacji serca, od myszy po mężczyzn.

Ocena in vitro czynności serca przy użyciu kardiomiocytów ze skórą

Prezentowany jest protokół izolacji ludzkich i zwierzęcych kardiomiocytów komorowych z wyciętych wibratomem plastrów mięśnia sercowego. Wysoką wydajność komórek tolerujących wapń (do 200 komórek/mg) można uzyskać z niewielkich ilości tkanek (&lt;50 mg). Protokół ma zastosowanie do mięśnia sercowego narażonego na zimne niedokrwienie przez okres do 36 godzin.

Izolacja ludzkich kardiomiocytów komorowych z plastrów mięśnia sercowego wycinanych wibratomem

Modele mysie pozwalają badać kluczowe mechanizmy arytmogenezy. W tym celu niezbędne są wysokiej jakości kardiomiocyty do wykonywania pomiarów typu patch-clamp. W tym miejscu opisano metodę izolacji mysich miocytów przedsionków i komór za pomocą wstecznej perfuzji Langendorffa opartej na enzymach, która umożliwia jednoczesne pomiary stanów przejściowych wapnia i prądu wapniowego typu L.

Izolacja wysokiej jakości mysich miocytów przedsionkowych i komorowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca2+ i prądu wapniowego typu L

Przedstawiono zestaw protokołów, które opisują pomiar funkcji skurczu za pomocą wykrywania długości sarkomeru wraz z pomiarem przejściowym wapnia (Ca2+) w izolowanych miocytach szczurów. Uwzględniono również zastosowanie tego podejścia w badaniach na zwierzęcych modelach niewydolności serca.

Analiza dysfunkcji kurczliwości serca i stanów przejściowych Ca2+ w miocytach gryzoni

Ten protokół opisuje metodę jednoczesnego pomiaru cytozolu, wolnego wapnia [Ca2+]i i średnicy naczynia w kurczących się naczyniach limfatycznych w czasie rzeczywistym, a następnie obliczania bezwzględnych stężeń Ca2+ oraz parametrów kurczliwości/rytmiczności. Protokół ten może być stosowany do badania Ca2+ i dynamiki kurczliwości w różnych warunkach eksperymentalnych.

Ocena w czasie rzeczywistym bezwzględnego, cytozolowego, wolnego Ca2+ i odpowiadającej mu kurczliwości w izolowanych, ciśnieniowych naczyniach limfatycznych

Poznaj metodę oceny rezerwy wapniowej retikulum sarkoplazmatycznego i usuwania wapnia w izolowanych kardiomiocytach. Technika ta pozwala badać zaburzenia gospodarki wapniowej w cukrzycy i niewydolności serca.

Ocena rezerwy wapniowej retikulum sarkoplazmatycznego i wewnątrzkomórkowego rozkurczowego usuwania wapnia w izolowanych kardiomiocytach komorowych (Wideo) | JoVE Journal

Ocena rezerwy wapniowej retikulum sarkoplazmatycznego i wewnątrzkomórkowego rozkurczowego usuwania wapnia w izolowanych kardiomiocytach komorowych

Przeglądaj więcej filmów