Wytwarzanie wariantów ucieczki neutralizujących przeciwciał monoklonalnych wirusa grypy

Ogólnym celem tej metody jest dostarczenie praktycznego protokołu dotyczącego sposobu wyznaczania epitopu neutralizującego przeciwciała monoklonalnego. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu immunologii i wirusologii, co z kolei może pomóc w zdefiniowaniu interakcji między wirusem a gospodarzem, opracowaniu leków oraz narzędzi diagnostycznych, a wszystko to może wspomóc projektowanie szczepionek. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją przeprowadzić przy użyciu podstawowych technik hodowli tkankowych i biologii molekularnej, bez konieczności stosowania specjalistycznych instrumentów czy sprzętu.

Procedurę zademonstruje Mark Bailey, lekarz i doktorant z laboratorium Petera Palese'a. Należy rozpocząć tę procedurę od charakterystyki przeciwciał w oparciu o hamowanie hemaglutynacji (HI) oraz aktywność neutralizującą, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przeciwciała neutralizujące wykazujące aktywność HI są poddawane dalszej analizie, zaczynając od przygotowania czterech rozcieńczeń badanych przeciwciał o rosnącym stężeniu w 1x PBS, w objętości 100 µL na rozcieńczenie.

Następnie przygotuj zawiesinę wirusa o mianie jednego miliona jednostek tworzących plamy na mililitr w 1x PBS w objętości 400 µL. Potem zmieszaj 100 µL wirusa o mianie jednego miliona jednostek tworzących plamy na mililitr ze 100 µL każdego rozcieńczenia przeciwciał lub ze 100 µL 1x PBS. Inkubuj próbki przez jedną godzinę w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂.

Po krótkim wymieszaniu w wortexie, wstrzyknij 200 µL każdej mieszaniny do specyficznych, wolnych od patogenów zarodowanych jaj kurzych. Następnie inkubuj jaja w temperaturze 37 °C bez CO2 przez 40 do 44 godzin. Po inkubacji poświęć zainfekowane wirusem zarodowane jaja, umieszczając je w temperaturze 4 °C na minimum sześć godzin.

Następnie pobierz płyn allantoiczny z jaj zgodnie z wcześniej opisaną procedurą. Na koniec potwierdź warianty ucieczki, wykonując test HI zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby wygenerować warianty ucieczki przeciwko przeciwciałom neutralizującym pozbawionym aktywności HI, wirusa należy pasażować w obecności zwiększających się ilości przeciwciał.

Wysiać komórki MDCK na płytkę sześcio-dołkową z zagęszczeniem jednego miliona komórek na dołek. Inkubować komórki przez minimum cztery godziny w inkubatorze w temperaturze 37°C z 5% carbon dioxide. W tym czasie rozcieńczyć zapas wirusa do stężenia jednego miliona jednostek tworzących plak na mililitr.

Przygotuj pojedyncze rozcieńczenie przeciwciała w stężeniu 0,02 mg/ml w jednej objętości MEM z trypsyną traktowaną TPCK w objętości 250 µL. W przypadku wszystkich kolejnych pasażów stosuj wyższe stężenia przeciwciał. Wymieszaj 250 µL rozcieńczonego wirusa z 250 µL rozcieńczonych przeciwciał lub z 250 µL jednej objętości MEM jako kontrolę bez przeciwciał.

Inkubuj mieszaninę przeciwciał z wirusem przez 30 minut w inkubatorze w temperaturze 37°C z 5% CO₂. Po inkubacji komórek odessaj podłoże za pomocą szklanej pipety Pasteura i przemyj monowarstwę komórek 1 mL 1× PBS. Dodaj 500 µL mieszanin do dołków, a następnie inkubuj w temperaturze 37°C z 5% CO₂ przez jedną godzinę.

Po godzinie do dołków należy dodać 2 ml MEM o stężeniu 1× z trypsyną traktowaną TPCK. Po 48 godzinach od zakażenia należy sprawdzić pod mikroskopem, czy w komórkach pojawiły się oznaki efektu cytopatycznego (CPE), lub przeprowadzić test hemaglutynacji w celu wykrycia namnażania wirusa. Jeśli w kulturze uzupełnionej przeciwciałami występuje CPE, należy zebrać naddatek do wielu probówek kriogenicznych.

Oznacz probówki numerem pasażu i przechowuj je w temperaturze -80 °C. Odstaw 100 µL supernatantu, aby zainfekować nową monowarstwę komórek MDCK za pomocą 2 mL 1× MEM uzupełnionego o trypsynę TPCK i przeciwciała. Pamiętaj o uwzględnieniu kontroli bez przeciwciał dla każdego pasażu.

Zwiększaj stężenie przeciwciał w każdym kolejnym pasażu, aż do momentu, gdy wzrost wirusa pozostanie możliwy, nawet przy końcowym stężeniu przeciwciał wynoszącym 0,6 mg/ml. Zamroź wiele probówek z supernatorem z każdego pasażu i przechowuj w temperaturze -80 °C. Przejdź do izolacji i analizy wariantów ucieczki, zgodnie ze szczegółami opisanymi w protokole tekstowym.

Przeciwciała indukowane szczepionką, wyizolowane od osób zaszczepionych kandydowaną szczepionką przeciwko wirusowi grypy A H7N9, zostały wykorzystane do wygenerowania wariantów mutantów ucieczki. Mapowanie mutantów ucieczki wykazało, że wiele przeciwciał rozpoznawało krytyczne reszty w różnych lokalizacjach na wirusowej hemaglutyninie (HA). Każda reszta, zaznaczona na czerwono, reprezentuje położenie krytycznych aminokwasów niezbędnych do wydajnego wiązania przeciwciała monoklonalnego, podczas gdy większość przeciwciał HI-dodatnich posiada reszty mutantów ucieczki w pobliżu wcześniej opisanych miejsc antygenowych H7HA. Przeciwciała HI-ujemne wygenerowały mutanty ucieczki z mutacjami punktowymi w regionie łodyżkowym (stock region).

Po opanowaniu ta technika może zostać zastosowana do wyjaśnienia strukturalnych determinant ochrony przed innymi patogenami. Metoda ta nie ogranicza się jedynie do generowania wariantów ucieczki dla przeciwciał monoklonalnych, ale znajduje zastosowanie również w przypadku związków przeciwwirusowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak określić epitop wiązania przeciwciał monoklonalnych poprzez generowanie wariantów ucieczki in vitro.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zachowaniu ostrożności podczas pracy z wirusami oraz o stosowaniu odpowiednich środków ochrony osobistej.