Name: Wytwarzanie wariantów ucieczki neutralizujących przeciwciał monoklonalnych wirusa grypy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania wariantów ucieczki neutralizujących przeciwciał monoklonalnych wirusa grypy. Technika ta pozwala zidentyfikować kluczowe reszty aminokwasowe dla wiązania przeciwciał i ma zastosowanie w projektowaniu szczepionek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt został częściowo sfinansowany z funduszy federalnych z National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, na podstawie umowy CEIRS HHSN272201400008C (F.K.); NIH U19AI109946-01 (F.K.); oraz P01AI097092-04S1 (P.E.L.).

<ol><li>Shaw, M. L., Palese, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShaw%2C+ML+%22Orthomyxoviridae%3A+the+viruses+and+their+replication%22">Orthomyxoviridae: the viruses and their replication</a>. , (2013).</li>
<li>Nelson, M. I., Holmes, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+epidemic+influenza%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The evolution of epidemic influenza.</a> Nat Rev Genet. 8 (3), 196-205 (2007).</li>
<li>Lauring, A. S., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quasispecies+Theory+and+the+Behavior+of+RNA+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Quasispecies Theory and the Behavior of RNA Viruses.</a> PLoS Pathog. 6 (7), e1001005(2010).</li>
<li>Henry Dunand, C. J., Leon, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preexisting+human+antibodies+neutralize+recently+emerged+H7N9+influenza+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Preexisting human antibodies neutralize recently emerged H7N9 influenza strains.</a> J Clin Invest. 125 (3), 1255-1268 (2015).</li>
<li>Dunand, C. J. H., Leon, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+Neutralizing+and+Non-Neutralizing+Human+H7N9+Influenza+Vaccine-Induced+Monoclonal+Antibodies+Confer+Protection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Both Neutralizing and Non-Neutralizing Human H7N9 Influenza Vaccine-Induced Monoclonal Antibodies Confer Protection.</a> Cell Host Microbe. 19 (6), 800-813 (2016).</li>
<li>Tan, G. S., Lee, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+Broadly+Neutralizing+Monoclonal+Antibody+That+Targets+the+Fusion+Domain+of+Group+2+Influenza+A+Virus+Hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a Broadly Neutralizing Monoclonal Antibody That Targets the Fusion Domain of Group 2 Influenza A Virus Hemagglutinin.</a> J Virol. 88 (23), 13580-13592 (2014).</li>
<li>Tan, G. S., Leon, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly-Reactive+Neutralizing+and+Non-neutralizing+Antibodies+Directed+against+the+H7+Influenza+Virus+Hemagglutinin+Reveal+Divergent+Mechanisms+of+Protection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Broadly-Reactive Neutralizing and Non-neutralizing Antibodies Directed against the H7 Influenza Virus Hemagglutinin Reveal Divergent Mechanisms of Protection.</a> PLoS Pathog. 12 (4), e1005578(2016).</li>
<li>Smith, K., Garman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+generation+of+fully+human+monoclonal+antibodies+specific+to+a+vaccinating+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen.</a> Nat Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).</li>
<li>Steel, J., Lowen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus+vaccine+based+on+the+conserved+hemagglutinin+stalk+domain%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Influenza virus vaccine based on the conserved hemagglutinin stalk domain.</a> mBio. 1 (1), (2010).</li>
<li>Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+hemagglutinin+influenza+virus+vaccine+constructs+elicit+broadly+protective+stalk-specific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly protective stalk-specific antibodies.</a> J Virol. 87 (12), 6542-6550 (2013).</li>
<li>Wang, T. T., Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccination+with+a+synthetic+peptide+from+the+influenza+virus+hemagglutinin+provides+protection+against+distinct+viral+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Vaccination with a synthetic peptide from the influenza virus hemagglutinin provides protection against distinct viral subtypes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18979-18984 (2010).</li>
<li>Impagliazzo, A., Milder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+trimeric+influenza+hemagglutinin+stem+as+a+broadly+protective+immunogen%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen.</a> Science. 349 (6254), 1301-1306 (2015).</li>
<li>Krammer, F., Palese, P., Steel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+Universal+Influenza+Virus+Vaccine+Design+and+Antibody+Mediated+Therapies+Based+on+Conserved+Regions+of+the+Hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Advances in Universal Influenza Virus Vaccine Design and Antibody Mediated Therapies Based on Conserved Regions of the Hemagglutinin.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. , (2014).</li>
<li>Wohlbold, T. J., Nachbagauer, R., Margine, I., Tan, G. S., Hirsh, A., Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccination+with+soluble+headless+hemagglutinin+protects+mice+from+challenge+with+divergent+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Vaccination with soluble headless hemagglutinin protects mice from challenge with divergent influenza viruses.</a> Vaccine. 33 (29), 3314-3321 (2015).</li>
<li>Ekiert, D. C., Bhabha, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+recognition+of+a+highly+conserved+influenza+virus+epitope%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope.</a> Science. 324 (5924), 246-251 (2009).</li>
<li>Ekiert, D. C., Friesen, R. H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Highly+Conserved+Neutralizing+Epitope+on+Group+2+Influenza+A+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses.</a> Science. 333 (6044), 843-850 (2011).</li>
<li>Dreyfus, C., Laursen, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Conserved+Protective+Epitopes+on+Influenza+B+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Highly Conserved Protective Epitopes on Influenza B Viruses.</a> Science. 337 (6100), 1343-1348 (2012).</li>
<li>Tran, E. E. H., Podolsky, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+Microscopy+Structures+of+Chimeric+Hemagglutinin+Displayed+on+a+Universal+Influenza+Vaccine+Candidate%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron Microscopy Structures of Chimeric Hemagglutinin Displayed on a Universal Influenza Vaccine Candidate.</a> mBio. 7 (2), e00257(2016).</li>
<li>Wiley, D. C., Wilson, I. A., Skehel, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+identification+of+the+antibody-binding+sites+of+Hong+Kong+influenza+haemagglutinin+and+their+involvement+in+antigenic+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural identification of the antibody-binding sites of Hong Kong influenza haemagglutinin and their involvement in antigenic variation.</a> Nature. 289 (5796), 373-378 (1981).</li>
<li>Gerhard, W., Yewdell, J., Frankel, M. E., Webster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+structure+of+influenza+virus+haemagglutinin+defined+by+hybridoma+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antigenic structure of influenza virus haemagglutinin defined by hybridoma antibodies.</a> Nature. 290 (5808), 713-717 (1981).</li>
<li>Jackson, D. C., Murray, J. M., White, D. O., Gerhard, W. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+antigenic+sites+of+influenza+virus+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Enumeration of antigenic sites of influenza virus hemagglutinin.</a> Infect Immun. 37 (3), 912-918 (1982).</li>
<li>Matsuzaki, Y., Sugawara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+Mapping+of+the+Hemagglutinin+Molecule+of+A%2F%28H1N1%29pdm09+Influenza+Virus+by+Using+Monoclonal+Antibody+Escape+Mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Epitope Mapping of the Hemagglutinin Molecule of A/(H1N1)pdm09 Influenza Virus by Using Monoclonal Antibody Escape Mutants.</a> J Virol. 88 (21), 12364-12373 (2014).</li>
<li>Tan, G. S., Krammer, F., Eggink, D., Kongchanagul, A., Moran, T. M., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pan-H1+anti-hemagglutinin+monoclonal+antibody+with+potent+broad-spectrum+efficacy+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A pan-H1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo.</a> J Virol. 86 (11), 6179-6188 (2012).</li>
<li>Geneva: World Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22WHO+manual+on+animal+influenza+diagnosis+and+surveillance%22">WHO manual on animal influenza diagnosis and surveillance</a>. , (2002).</li>
<li>Brauer, R., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+Virus+Propagation+in+Embryonated+Chicken+Eggs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs.</a> J Vis Exp. (97), e52421(2015).</li>
<li>Martínez-Sobrido, L., García-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Recombinant+Influenza+Virus+from+Plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA.</a> J Vis Exp. (42), e2057(2010).</li>
<li>Hoffmann, E., Stech, J., Guan, Y., Webster, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+primer+set+for+the+full-length+amplification+of+all+influenza+A+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22ArchVirol%22%5BJournal%5D)">Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses.</a> ArchVirol. 146 (12), 2275-2289 (2001).</li>
<li>Zhou, B., Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+Influenza+B+Virus+Genomic+Amplification+Facilitates+Sequencing%2C+Diagnostics%2C+and+Reverse+Genetics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Universal Influenza B Virus Genomic Amplification Facilitates Sequencing, Diagnostics, and Reverse Genetics.</a> J Clin Microbiol. 52 (5), 1330-1337 (2014).</li>
<li>Sidhu, S. S., Kossiakoff, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+and+designing+protein+function+with+restricted+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Exploring and designing protein function with restricted diversity.</a> Curr Opin Chem Biol. 11, 347-354 (2007).</li>
<li>Chen, C. -W., Chang, C. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+Scanning-assisted+Identification+of+a+Monoclonal+Antibody-recognized+Linear+B-cell+Epitope%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope.</a> J Vis Exp. (121), e55417(2017).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Chociaż większość reszt zidentyfikowanych za pomocą mutantów ucieczki była dokładna, jednym z głównych zastrzeżeń tego podejścia jest to, że mutacje punktowe wariantów ucieczki niekoniecznie muszą być mapowane w obrębie śladu molekularnego przeciwciała, jak określono na podstawie analiz strukturalnych. Wynika to ze zdolności mutacji na określonej reszcie do prowadzenia do zmiany konformacyjnej dystalnie do lokalizacji zmutowanej reszty, analogicznie do efektu allosterycznego. Innym ograniczeniem jest to, że ta metodologia może być stosowana tylko do przeciwciał neutralizujących; przeciwciała, które nie mają ciśnienia selekcyjnego in vitro , nie doprowadzą do ucieczki mutantów. Ograniczenie to można jednak przezwyciężyć za pomocą panelu wariantów ucieczki generowanych przez wcześniej scharakteryzowane przeciwciała neutralizujące. Tan i in. wykorzystali wariant ucieczki neutralizującego mAb do wirusa H7N9 do mapowania epitopu przeciwciała nieneutralizującego7.
Niemniej jednak wyjaśnienie epitopów przeciwciał poprzez generowanie wariantów ucieczki stanowi realną alternatywę dla krystalografii i mikroskopii krioelektronowej, które wymagają znacznych inwestycji w sprzęt. Inne alternatywy to określenie minimalnego regionu wiązania mAb za pomocą skanowania alaniny lub mutantów skanowania/obcinania peptydów. Skaningowa mutageneza alaninowa może wymagać znacznego nakładu pracy w celu wygenerowania dużej liczby wariantów podczas badania przesiewowego29, podczas gdy skanowanie peptydowe jest ograniczone do epitopów liniowych30. Metoda opisana w tym protokole nie wymaga specjalnego sprzętu ani techniki i w rzeczywistości wykorzystuje istniejące testy neutralizacji in vitro zmodyfikowane w celu wygenerowania wariantów ucieczki badanych przeciwciał.
Protokół generowania wariantów ucieczki, które wymagają wielu pasaży (np. przeciwciała specyficzne dla łodygi) jest w dużym stopniu zależny od początkowego stężenia przeciwciała w pasażu 0. Lepiej jest zachować ostrożność i zacząć od logarytmu do pół logarytmu niższego niż połowa maksymalnego stężenia hamującego przeciwciała i pozwolić na silny wzrost wirusa. Badacz może spekulować, że hodowla wirusa o wysokim mianie w obecności niskiego ciśnienia immunologicznego będzie miała dużą zmienność genetyczną w populacji wirusa. Warianty ucieczki można wybrać, stopniowo zwiększając stężenie przeciwciał w kolejnych przejściach. W przypadku, gdy wzrost wirusa zmniejszy się, ilość supernatantu wirusa może zostać zwiększona w następnym pasażu, przy zachowaniu tego samego stężenia przeciwciał w poprzednim pasażu.
Celem większości uniwersalnych szczepionek przeciw grypie jest wywołanie silnej odpowiedzi przeciwciał w kierunku łodygi kwasu hialuronowego. Analizy wariantów ucieczki przeciwciał specyficznych dla łodygi są ważne dla określenia związku między zdolnością wirusa grypy a ciśnieniem immunologicznym. Co ciekawe, zmutowane wirusy ucieczki wynikające z mAb specyficznych dla łodygi zostały wszystkie osłabione in vivo w mysich badaniach LD50 4. Badania te dostarczają mocnych argumentów za platformami szczepień opartymi na łodygach. Ponadto protokół ten może być wykorzystany do identyfikacji mutantów ucieczki do innych związków przeciwwirusowych, takich jak inhibitory małocząsteczkowe. Wreszcie, metodologia ta nie ogranicza się do glikoprotein powierzchniowych wirusa grypy, ale może być również szerzej stosowana do określania epitopów innych glikoprotein wirusowych.

Podobnie jak inne wirusy RNA, wirusy grypy A posiadają podatną na błędy polimerazę, która pozwala na generowanie wielu wariantów antygenowych w każdej rundzie replikacji1,2,3. Wirus grypy A ma zadziwiającą zdolność adaptacji i unikania ludzkiej odpowiedzi immunologicznej poprzez dryf antygenowy, co osiąga się poprzez akumulację mutacji na powierzchni glikoprotein, co prowadzi do utraty wiązania przeciwciał. Dryf antygenowy glikoprotein powierzchniowych wirusa, HA i neuraminidazy (NA), wymaga corocznej zmiany składu i podawania szczepionki.
Postęp technologiczny w izolacji i generowaniu przeciwciał specyficznych dla antygenu zaowocował dużą liczbą przeciwciał mAb wywołanych szczepionką4,5,6,7,8. Z kolei charakterystyka epitopów mAb, które szeroko neutralizują wirusy grypy A, znacznie pomogła w opracowaniu kilku uniwersalnych kandydatów na szczepionki przeciw grypie9,10,11,12,13,14. Wyjaśnienie śladu antygenowego mAb ujawnia strukturalne uwarunkowania neutralizacji i pozwala na świadome podejście do projektowania szczepionek. Jednak nie jest ani realistyczne, ani opłacalne, aby laboratoria strukturalnie charakteryzowały rozległe panele mAb za pomocą krystalografii rentgenowskiej lub mikroskopii krioelektronowej w celu mapowania epitopów na antygenie wirusowym 15,16,17,18.
Krystalografia rentgenowska lub mikroskopia krioelektronowa wymagają drogiego sprzętu, specjalistycznych technik i potencjalnie dużej ilości czasu na generowanie danych. Alternatywnym i szybszym podejściem jest wykorzystanie szybkiego generowania zróżnicowanych populacji wirusów za pomocą podatnej na błędy polimerazy RNA zależnej od RNA do generowania mutantów ucieczki w celu określenia epitopów mAbs19,20,21,22,23. Generowanie wariantów ucieczkowych nie wymaga żadnego specjalnego sprzętu ani techniki i może być wykonywane przy użyciu konwencjonalnych odczynników i sprzętu laboratoryjnego.
Tutaj opisujemy metodę, która pozwala na mapowanie krytycznych pozostałości wymaganych do wiązania mAb, które rozpoznają wirusa grypy.

<table><tbody><tr><td>Falcon 96-dołkowa, przezroczysta, płaska płytka hodowlana poddana działaniu TC z pokrywką Corning</td><td>, Inc.</td><td>353072</td><td>Zastosowanie płytki testowej do testu mikroneutralizacji</td></tr><tr><td>Falcon 96-well clear V-bottom plate</td><td>Corning, Inc.</td><td>353263</td><td>Zastosowanie płytki testowej do testu hamowania hemaglutynacji</td></tr><tr><td>1X Minimal Essential Medium (MEM)</td><td>Gibco</td><td>11095080</td><td>Pożywka infekcyjna</td></tr><tr><td>Trypsyna poddana działaniu tozylofenyloalanylu chlorometylowego (TPCK)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8802</td><td>Rozszczepia niedojrzałe przeciwciało pierwotne anty-NP (IAV) 0 do HA1 i HA2</td></tr><tr><td>Biotynylowane przeciwciało anty-NP (IAV)</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB8258B</td><td>Przeciwciało, które rozpoznaje białko NP wirusów grypy A</td></tr><tr><td>Biotynylowane przeciwciało pierwotne anty-NP (IBV)</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB8260B-5</td><td>Przeciwciało, które rozpoznaje białko NP wirusów grypy B</td></tr><tr><td>Przeciwciało Streptawidyna-HRP</td><td>EMD Millipore</td><td>18-152</td><td>Jest stosowane jako przeciwciało drugorzędowe dla biotynylowanego substratu przeciwciała anty-NP</td></tr><tr><td>HRP (SIGMAFAST-OPD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9187-5SET</td><td>dichlorowodorek o-fenylenodiaminy rozpuszczalny w wodzie substrat do HRP</td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka V-dolna</td> Płytka <td>Nunc</td><td>249662</td><td>testowa używana do testu hemaglutynacji</td></tr><tr><td>Czerwone krwinki kurczaka</td><td>Lampire Biological Laboratories</td><td>7201403</td><td>Służy do oceny zdolności wirusa grypy do aglutynacji</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Ambion</td><td>15596026</td><td>Ekstrakcja RNA</td></tr><tr><td>Indeks górny III</td><td>Invitrogen</td><td>12574018</td> Zestaw do ekstrakcji żelem <td>z odwrotną transkryptazą</td></tr><tr><td></td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Izolacja amplifikowanego produktu PCR</td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668027</td><td>Odczynnik do transfekcji</td></tr><tr><td>Anty-ludzka IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11013</td><td>Fluorescencyjne przeciwciało drugorzędowe dla ludzi przeciwciała</td></tr><tr><td>Anty-mysie IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>Fluorescencyjne przeciwciało drugorzędowe dla przeciwciał mysich</td></tr><tr><td>6-dołkowa mikropłytka polistyrenowa</td><td>Corning, Inc.</td><td></td><td></td>353934</tr><tr><td>UltraPure</td><td>Agarose Invitrogen</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene długotrwałe przechowywanie Krioprobówki</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5012-0020</td><td>Zamrażanie reasortantu supernatantu kultur wirusowych</td></tr><tr><td>A/California/04/09 (H1)</td><td>Palese Laboratory</td><td></td><td>reasortant wirusa eksprymującego HA i NA A/California/04/09 (H1N1) z wewnętrznymi segmentami A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)</td></tr><tr><td>reasortant A/Shanghai/1/13 (H7)</td><td>Palese Laboratory</td><td></td><td>reasortant virus wykazujący ekspresję HA i NA A/Shanghai/1/13 (H7N9) z wewnętrznymi segmentami A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)</td></tr><tr><td>Roztwór albuminy surowicy bydlęcej (35%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7979</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstracji żelu Qiagen</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Oczyszczanie fragmentów DNA za pomocą membrany krzemionkowej</td></tr></tbody></table>

wytwarzanie wariantów ucieczki neutralizujących przeciwciał monoklonalnych wirusa grypy

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Wirusy grypy wykazują niezwykłą zdolność do adaptacji i unikania odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Jednym ze sposobów są zmiany antygenowe, które zachodzą na powierzchni glikoprotein wirusa. Generowanie wariantów ucieczki jest potężną metodą w wyjaśnianiu, w jaki sposób wirusy unikają wykrycia immunologicznego i w identyfikacji krytycznych pozostałości wymaganych do wiązania przeciwciał. W tym miejscu opisujemy protokół generowania wariantów ucieczki wirusa grypy A za pomocą ludzkich lub mysich przeciwciał monoklonalnych (mAb) skierowanych przeciwko wirusowej hemaglutyniny (HA). Korzystając z naszej techniki, wcześniej scharakteryzowaliśmy krytyczne reszty wymagane do wiązania przeciwciał skierowanych przeciwko głowie lub łodydze nowego ptasiego H7N9 HA. Protokół można łatwo dostosować do innych systemów antywirusowych. Analizy wariantów ucieczki są ważne dla modelowania dryfu antygenowego, określania polimorfizmów pojedynczych nukleotydów (SNP) nadających oporność i przydatność wirusa, a także w projektowaniu szczepionek i/lub środków terapeutycznych.

Wcześniej stosowaliśmy modyfikacje tej metody do generowania wariantów ucieczki od ludzkich i mysich mAbs indukowanych przez sezonową szczepionkę przeciwko wirusowi grypy, szczepienie H7N9 lub sekwencyjne szczepienie DNA/rekombinowanym białkiem HA4,5,6,7. Jak opisano powyżej, przeciwciała scharakteryzowano najpierw za pomocą testów HI oraz mikroneutralizacji, aby ustalić, który konkretny protokół należy zastosować w dalszej kolejności4,5. Stwierdzono, że przeciwciała 07-5D03, 07-5F01, 07-5G01, 07-4B03, 07-4E02 i 07-4D05 wykazują aktywność HI i neutralizacyjną przeciwko ptasiemu wirusowi H7N9 (A/Shanghai/1/2013) (Tabela 1), w związku z czym wykorzystano protokół 1 (krok 2.1). W przypadku mAbs neutralizujących, które nie wykazują aktywności HI, takich jak 41-5E04, 045-051310-2B06, 042-100809-2F04 i S6-B01 (Tabela 1), do generowania wariantów ucieczki zastosowano protokół 2 (krok 2.2). Mapowanie mutantów ucieczki wykazało, że wiele przeciwciał rozpoznaje krytyczne reszty w różnych miejscach wirusowego HA4,5 (Rycina 4). Podczas gdy większość przeciwciał HI-dodatnich posiada reszty mutantów ucieczki w pobliżu wcześniej opisanych miejsc antygenowych H7 HA, przeciwciała HI-ujemne wygenerowały mutanty ucieczki z mutacjami punktowymi w regionie trzonka4,5.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Przeciwciało</td>
			<td>Aktywność HI</td>
			<td>aktywność NEUT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-5D03</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-5F01</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-5G01</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-4B03</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-4E02</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-4D05</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>41-5E04</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>045-051310-2B06</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>042-100809-2F04</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S6-B01</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Tabela aktywności HI i neutralizacyjnej przeciwciał. Dziesięć specyficznych dla H7 przeciwciał monoklonalnych (mAbs), wyizolowanych od osób zaszczepionych eksperymentalną szczepionką przeciw H7N9, wykazuje różną aktywność przeciwwirusową in vitro5.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="4">Starter forward (5' do 3')</td>
			<td colspan="4">Starter odwrotny (5' do 3')</td>
			<td colspan="2">Warunki termocyklera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAV</td>
			<td colspan="4">TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG</td>
			<td colspan="4">ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT</td>
			<td colspan="2">42 ºC przez 60 min, 94 ºC przez 2 min/5 cykli: 94 ºC przez 20 s, 50 ºC przez 30 s i 68 ºC przez 3 min 30 s, a następnie 40 cykli: 94 ºC przez 20 s, 58 ºC przez 30 s i 68 ºC przez 3 min 30 s z końcową elongacją w temperaturze 68 ºC przez 10 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBV</td>
			<td colspan="4">GGGGGGAGCAGAAGCAGAGC</td>
			<td colspan="4">CCGGGTTATTAGTAGTAACAAGAGC</td>
			<td colspan="2">45 ºC przez 60 min, 55 ºC przez 30 min, 94 ºC przez 2 min/5 cykli: 94 ºC przez 20 s, 40 ºC przez 30 s i 68 ºC przez 3 min 30 s, a następnie 40 cykli: 94 ºC przez 20 s, 58 ºC przez 30 s i 68 ºC przez 3 min 30 s z końcową elongacją w 68 ºC przez 10 min</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Uniwersalne startery do wirusa grypy. Pary starterów do amplifikacji segmentów HA wirusów grypy A27 i B28 oraz odpowiadające im warunki termocyklera.
<img alt="Test inhibicji hemaglutynacji; miareczkowanie przeciwciał; schemat mikropłytki; wyniki serii rozcieńczeń." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Test HI. (A) Schemat przygotowania testu HI w celu sprawdzenia aktywności dwóch mysich przeciwciał mAb specyficznych dla H1: 7B2 (specyficznych dla głowy) i 6F12 (specyficznych dla trzonu) z użyciem płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V oraz (B) przykład wyników testu HI23. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat testu mikroneutralizacji przedstawiający 3-krotne rozcieńczenie przeciwciał 4D05, CR9114; analiza wirusa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Test mikroneutralizacji. Schemat przygotowania testu mikroneutralizacji w celu zbadania aktywności dwóch ludzkich przeciwciał monoklonalnych 4D055 oraz CR911417. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig2large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Schemat przeciwciał hamujących hemaglutynację; interakcja wirus-przeciwciało, przedstawiono pasażowanie seryjne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Generowanie mutantów ucieczki. Sugerowana metodologia będzie zależeć od aktywności HI i mikroneutralizacyjnej wykazanej przez przeciwciało. Generowanie mutantów ucieczki przeciwko (A>) neutralizującym przeciwciałom HI-dodatnim może wymagać pojedynczego pasażowania w jajach, podczas gdy (B>) neutralizujące przeciwciała HI-ujemne mogą wymagać wielokrotnych pasaży z rosnącymi ilościami przeciwciał w hodowli tkankowej komórek. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Diagram mutacji struktury białka wyróżniający zmiany aminokwasowe wraz z 3D modelem molekularnym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Przykład mapy epitopów nowego ptasiego HA H7N9 wygenerowanej przy użyciu wariantów mutantów ucieczki. Przeciwciała indukowane szczepionką, wyizolowane od osób zaszczepionych kandydacką szczepionką przeciwko wirusowi grypy A H7N9, zostały wykorzystane do wygenerowania wariantów mutantów ucieczki. Każdy pozostały aminokwas zaznaczony na czerwono reprezentuje miejsce krytycznych aminokwasów niezbędnych do wydajnego wiązania przeciwciała mAb. Dane zostały zaadaptowane z Dunand-Henry et al., 20154. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Opisujemy metodę, za pomocą której identyfikujemy krytyczne pozostałości wymagane do wiązania ludzkich lub mysich przeciwciał monoklonalnych, które celują w wirusową hemaglutyninę wirusów grypy A. Protokół można dostosować do innych glikoprotein powierzchniowych wirusa i odpowiadających im przeciwciał neutralizujących.

Wytwarzanie wariantów ucieczki neutralizujących przeciwciał monoklonalnych wirusa grypy

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Ogólnym celem tej metody jest dostarczenie praktycznego protokołu dotyczącego sposobu wyznaczania epitopu neutralizującego przeciwciała monoklonalnego. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu immunologii i wirusologii, co z kolei może pomóc w zdefiniowaniu interakcji między wirusem a gospodarzem, opracowaniu leków oraz narzędzi diagnostycznych, a wszystko to może wspomóc projektowanie szczepionek. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją przeprowadzić przy użyciu podstawowych technik hodowli tkankowych i biologii molekularnej, bez konieczności stosowania specjalistycznych instrumentów czy sprzętu.Procedurę zademonstruje Mark Bailey, lekarz i doktorant z laboratorium Petera Palese'a. Należy rozpocząć tę procedurę od charakterystyki przeciwciał w oparciu o hamowanie hemaglutynacji (HI) oraz aktywność neutralizującą, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przeciwciała neutralizujące wykazujące aktywność HI są poddawane dalszej analizie, zaczynając od przygotowania czterech rozcieńczeń badanych przeciwciał o rosnącym stężeniu w 1x PBS, w objętości 100 µL na rozcieńczenie.Następnie przygotuj zawiesinę wirusa o mianie jednego miliona jednostek tworzących plamy na mililitr w 1x PBS w objętości 400 µL. Potem zmieszaj 100 µL wirusa o mianie jednego miliona jednostek tworzących plamy na mililitr ze 100 µL każdego rozcieńczenia przeciwciał lub ze 100 µL 1x PBS. Inkubuj próbki przez jedną godzinę w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂.Po krótkim wymieszaniu w wortexie, wstrzyknij 200 µL każdej mieszaniny do specyficznych, wolnych od patogenów zarodowanych jaj kurzych. Następnie inkubuj jaja w temperaturze 37 °C bez CO2 przez 40 do 44 godzin. Po inkubacji poświęć zainfekowane wirusem zarodowane jaja, umieszczając je w temperaturze 4 °C na minimum sześć godzin.Następnie pobierz płyn allantoiczny z jaj zgodnie z wcześniej opisaną procedurą. Na koniec potwierdź warianty ucieczki, wykonując test HI zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby wygenerować warianty ucieczki przeciwko przeciwciałom neutralizującym pozbawionym aktywności HI, wirusa należy pasażować w obecności zwiększających się ilości przeciwciał.Wysiać komórki MDCK na płytkę sześcio-dołkową z zagęszczeniem jednego miliona komórek na dołek. Inkubować komórki przez minimum cztery godziny w inkubatorze w temperaturze 37°C z 5% carbon dioxide. W tym czasie rozcieńczyć zapas wirusa do stężenia jednego miliona jednostek tworzących plak na mililitr.Przygotuj pojedyncze rozcieńczenie przeciwciała w stężeniu 0,02 mg/ml w jednej objętości MEM z trypsyną traktowaną TPCK w objętości 250 µL. W przypadku wszystkich kolejnych pasażów stosuj wyższe stężenia przeciwciał. Wymieszaj 250 µL rozcieńczonego wirusa z 250 µL rozcieńczonych przeciwciał lub z 250 µL jednej objętości MEM jako kontrolę bez przeciwciał.Inkubuj mieszaninę przeciwciał z wirusem przez 30 minut w inkubatorze w temperaturze 37°C z 5% CO₂. Po inkubacji komórek odessaj podłoże za pomocą szklanej pipety Pasteura i przemyj monowarstwę komórek 1 mL 1× PBS. Dodaj 500 µL mieszanin do dołków, a następnie inkubuj w temperaturze 37°C z 5% CO₂ przez jedną godzinę.Po godzinie do dołków należy dodać 2 ml MEM o stężeniu 1× z trypsyną traktowaną TPCK. Po 48 godzinach od zakażenia należy sprawdzić pod mikroskopem, czy w komórkach pojawiły się oznaki efektu cytopatycznego (CPE), lub przeprowadzić test hemaglutynacji w celu wykrycia namnażania wirusa. Jeśli w kulturze uzupełnionej przeciwciałami występuje CPE, należy zebrać naddatek do wielu probówek kriogenicznych.Oznacz probówki numerem pasażu i przechowuj je w temperaturze -80 °C. Odstaw 100 µL supernatantu, aby zainfekować nową monowarstwę komórek MDCK za pomocą 2 mL 1× MEM uzupełnionego o trypsynę TPCK i przeciwciała. Pamiętaj o uwzględnieniu kontroli bez przeciwciał dla każdego pasażu.Zwiększaj stężenie przeciwciał w każdym kolejnym pasażu, aż do momentu, gdy wzrost wirusa pozostanie możliwy, nawet przy końcowym stężeniu przeciwciał wynoszącym 0,6 mg/ml. Zamroź wiele probówek z supernatorem z każdego pasażu i przechowuj w temperaturze -80 °C. Przejdź do izolacji i analizy wariantów ucieczki, zgodnie ze szczegółami opisanymi w protokole tekstowym.Przeciwciała indukowane szczepionką, wyizolowane od osób zaszczepionych kandydowaną szczepionką przeciwko wirusowi grypy A H7N9, zostały wykorzystane do wygenerowania wariantów mutantów ucieczki. Mapowanie mutantów ucieczki wykazało, że wiele przeciwciał rozpoznawało krytyczne reszty w różnych lokalizacjach na wirusowej hemaglutyninie (HA). Każda reszta, zaznaczona na czerwono, reprezentuje położenie krytycznych aminokwasów niezbędnych do wydajnego wiązania przeciwciała monoklonalnego, podczas gdy większość przeciwciał HI-dodatnich posiada reszty mutantów ucieczki w pobliżu wcześniej opisanych miejsc antygenowych H7HA. Przeciwciała HI-ujemne wygenerowały mutanty ucieczki z mutacjami punktowymi w regionie łodyżkowym (stock region).Po opanowaniu ta technika może zostać zastosowana do wyjaśnienia strukturalnych determinant ochrony przed innymi patogenami. Metoda ta nie ogranicza się jedynie do generowania wariantów ucieczki dla przeciwciał monoklonalnych, ale znajduje zastosowanie również w przypadku związków przeciwwirusowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak określić epitop wiązania przeciwciał monoklonalnych poprzez generowanie wariantów ucieczki in vitro.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zachowaniu ostrożności podczas pracy z wirusami oraz o stosowaniu odpowiednich środków ochrony osobistej.

generation-escape-variants-neutralizing-influenza-virus-monoclonal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje technikę generowania wariantów ucieczki neutralizujących przeciwciał monoklonalnych wirusa grypy. Zawiesina wirusa zneutralizowanego przez przeciwciała jest wstrzykiwana do zarodków jaj kurzych w celu selektywnego rozmnażania wariantów ucieczki. W ten sposób powstaje populacja wirusa składająca się głównie z wariantów ucieczki, potwierdzonych za pomocą testu hemaglutynacji.

Wytwarzanie wariantów ucieczki wirusa grypy przeciwko przeciwciałom neutralizującym

Film prezentuje metodę tworzenia rekombinowanych wirusów grypy dostosowanych do zimna. Polega na transfekcji komórek ludzkich dwukierunkowymi plazmidami, a następnie inkubacji w niższej temperaturze w celu uzyskania wirusów odpowiednich do produkcji szczepionek, charakteryzujących się zmniejszoną replikacją w cieplejszych warunkach.

Wytwarzanie rekombinowanych, żywych, atenuowanych wirusów grypy do szczepionek

Ratowanie rekombinowanych arenawirusów ze sklonowanych cDNA, podejście określane jako genetyka odwrotna, pozwala badaczom badać rolę określonych produktów genowych wirusa, a także wkład ich różnych specyficznych domen i reszt, w wielu różnych aspektach biologii arenawirusa. Podobnie, techniki genetyki odwrotnej w zatwierdzonych przez FDA liniach komórkowych (Vero) do opracowywania szczepionek zapewniają nowe możliwości generowania skutecznych i bezpiecznych szczepionek do zwalczania ludzkich...

Generowanie rekombinowanego arenawirusa do opracowania szczepionki w komórkach Vero zatwierdzonych przez FDA

Tutaj opisujemy sposób na wyrażenie prawidłowo złożonych i funkcjonalnych antygenów powierzchniowych wirusa grypy pochodzących z nowego chińskiego wirusa H7N9 w komórkach owadów. Technikę tę można dostosować do ekspresji ektodomen dowolnych wirusowych lub komórkowych białek powierzchniowych.

Ekspresja funkcjonalnych rekombinowanych białek hemaglutyniny i neuraminidazy nowego wirusa grypy H7N9 przy użyciu systemu ekspresji bakulowirusa

Przedstawiono zoptymalizowany protokół generowania przeciwciał monoklonalnych opartych na technologii hybrydomy. Myszy uodporniono immunokoniugatem. Komórki śledziony zostały połączone za pomocą PEG i impulsu elektrycznego z nieśmiertelnymi komórkami szpiczaka. Komórki hybrydoma wytwarzające przeciwciała wybrano za pomocą HAT i badania przesiewowego ELISA swoistego dla antygenu.

Wytwarzanie mysich przeciwciał monoklonalnych za pomocą technologii Hybridoma

To badanie opisuje test mikroneutralizacji oparty na obrazowaniu, aby przeanalizować relacje antygenowe między wirusami. Protokół wykorzystuje skaner płaski i składa się z czterech etapów, w tym miareczkowania, miareczkowania, neutralizacji i kwantyfikacji neutralizacji. Test działa dobrze z obecnymi krążącymi wirusami grypy A(H1N1)pdm09, A(H3N2) i B.

Optymalizacja ilościowego testu mikroneutralizacji

Opisujemy metodę pomiaru aktywacji funkcji efektorowych za pośrednictwem Fc przez przeciwciała skierowane przeciwko hemaglutyniny wirusa grypy. Test ten można również dostosować do oceny zdolności przeciwciał monoklonalnych lub surowic poliklonalnych ukierunkowanych na inne glikoproteiny powierzchniowe wirusa do indukowania odporności zależnej od Fc.

Metoda oceny funkcji efektorowych za pośrednictwem Fc indukowanych przez przeciwciała specyficzne dla hemaglutyniny grypy

Przeciwciała neutralizujące grypę korelują z ochroną przed infekcjami grypowymi. Testy mikroneutralizacji mierzą przeciwciała neutralizujące w surowicach ludzkich i są często stosowane w serologii grypy u ludzi. Opisujemy test mikroneutralizacji z wykorzystaniem komórek MDCK-SIAT1 do pomiaru miana przeciwciał neutralizujących wobec współczesnych wirusów 3C.2a i 3C.3a A(H3N2) po szczepieniu lub zakażeniu grypą.

Pomiar odpowiedzi przeciwciał neutralizujących grypę na wirusy A(H3N2) w surowicach ludzkich za pomocą testów mikroneutralizacji z wykorzystaniem komórek MDCK-SIAT1

To badanie opisuje wysokoprzepustowy, oparty na obrazowaniu test mikroneutralizacji w celu określenia miana przeciwciał neutralizujących specyficznych dla syncytialnego wirusa oddechowego (RSV). Ten format testu został przetestowany na różnych typach próbek.

Ulepszony i wysokoprzepustowy test mikroneutralizacji syncytialnego wirusa oddechowego (RSV)

Ten protokół opisuje eksperymentalny proces wytwarzania zakaźnych cząsteczek pseudotypowych wirusa o wysokim mianie (pp) z glikoproteinami otoczkowymi z dwóch szczepów grypy A i jak określić ich zakaźność. Protokół ten jest wysoce elastyczny do tworzenia pps dowolnego innego typu wirusów otoczkowych z różnymi glikoproteinami otoczki.

Produkcja zakaźnych cząstek pseudotypowanych grypy zakaźnej o wysokim mianie z glikoproteinami otoczkowymi z wysoce zjadliwych wirusów H5N1 i ptasich H7N9

Ten protokół opisuje zastosowanie nowego hybrydowego pseudowirusa alfawirusa SARS-CoV-2 (Ha-CoV-2) jako platformy do szybkiej oceny zakaźności wariantów SARS-CoV-2 i ich wrażliwości na przeciwciała neutralizujące.

Zastosowanie pseudowirusa Ha-CoV-2 do szybkiej kwantyfikacji wariantów SARS-CoV-2 i przeciwciał neutralizujących

Poznaj metodę wytwarzania wariantów ucieczki neutralizujących przeciwciał monoklonalnych wirusa grypy. Technika ta pozwala zidentyfikować kluczowe reszty aminokwasowe dla wiązania przeciwciał i ma zastosowanie w projektowaniu szczepionek.

Wytwarzanie wariantów ucieczki neutralizujących przeciwciał monoklonalnych wirusa grypy

Przeglądaj więcej filmów