Wytwarzanie wariantów ucieczki neutralizujących przeciwciał monoklonalnych wirusa grypy

Ogólnym celem tej metody jest zapewnienie roboczego protokołu wyjaśniającego epitop neutralizującego przeciwciała monoklonalnego. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii i wirusologii, które mogą pomóc w zdefiniowaniu interakcji wirusa gospodarza, opracowaniu środków terapeutycznych i narzędzi diagnostycznych, z których wszystkie mogą pomóc w projektowaniu szczepionek. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją wykonać za pomocą podstawowych technik hodowli tkankowej i biologii molekularnej bez specjalnych narzędzi lub sprzętu.

Procedurę zademonstruje Mark Bailey, doktorant z laboratorium Petera Palese'a. Rozpocznij tę procedurę od scharakteryzowania przeciwciał w oparciu o hamowanie hemoaglutynacji lub HI i działania neutralizacyjne, jak opisano w protokole tekstowym. Przeciwciała neutralizujące, które mają aktywność HI, są dalej analizowane, najpierw przygotowując cztery rozcieńczenia interesującego przeciwciała w celu zwiększenia stężeń w jednym razy PBS w objętości 100 mikrolitrów na rozcieńczenie.

Następnie przygotuj zapas wirusa składający się z miliona jednostek tworzących płytki nazębne na mililitr w jednym czasie PBS w objętości 400 mikrolitrów. Następnie zmieszaj 100 mikrolitrów miliona jednostek tworzących blaszki na mililitr wirusa ze 100 mikrolitrami każdego rozcieńczenia przeciwciała lub 100 mikrolitrami jednorazowego PBS. Inkubuj próbki przez godzinę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.

Po krótkim wirowaniu wstrzyknąć 200 mikrolitrów każdej mieszaniny do określonych zarodków jaj kurzych wolnych od patogenów. Następnie wysiaduj jaja w temperaturze 37 stopni Celsjusza bez dwutlenku węgla przez 40 do 44 godzin. Po inkubacji należy złożyć zarodki jajowe zakażone wirusem, umieszczając je w temperaturze czterech stopni Celsjusza na co najmniej sześć godzin.

Następnie zbierz płyn omoczniowy z jaj, jak opisano wcześniej. Na koniec potwierdź warianty ucieczki, wykonując test HI zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby wytworzyć warianty ucieczki przeciwko przeciwciałom neutralizującym, które nie mają aktywności HI, wirus musi być przenoszony w obecności rosnących ilości przeciwciał.

Umieść komórki MDCK w sześciodołkowej płytce o gęstości miliona komórek na dołek. Inkubuj komórki przez co najmniej cztery godziny w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. W międzyczasie rozcieńczyć zapas wirusa do miliona jednostek tworzących płytkę nazębną na mililitr.

Przygotuj pojedyncze rozcieńczenie przeciwciała w dawce 0,02 miligrama na mililitr w jednorazowym MEM z trypsyną potraktowaną TPCK w objętości 250 mikrolitrów. Stosuj wyższe stężenia przeciwciał dla wszystkich kolejnych pasaży. Zmieszaj 250 mikrolitrów rozcieńczonego wirusa z 250 mikrolitrami rozcieńczonego przeciwciała lub 250 mikrolitrów jednorazowego MEM jako kontroli bez przeciwciał.

Inkubować mieszaninę przeciwciał wirusa przez 30 minut w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Po inkubacji komórek odessać pożywkę za pomocą szklanej pipety Pasteura i przemyć monowarstwę komórek jednym mililitrem jednorazowego PBS. Dodaj 500 mikrolitrów mieszanin do studzienek przed inkubacją w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez godzinę.

Po godzinie uzupełnij studzienki dwoma mililitrami jednorazowego MEM z trypsyną potraktowaną TPCK. Sprawdź komórki po 48 godzinach od zakażenia pod kątem oznak efektu cytopatycznego lub CPE pod mikroskopem lub wykonaj test hemoaglutynacji w celu wykrycia wzrostu wirusa. Jeśli w kulturze uzupełnionej przeciwciałem występuje wzrost CPE, zbierz supernatant w wielu krioprobówkach.

Oznacz probówki numerem przejścia i przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Zaoszczędź 100 mikrolitrów supernatantu, aby zainfekować świeżą monowarstwę MDCK dwoma mililitrami jednorazowego MEM uzupełnionego trypsyną TPCK i przeciwciałem. Pamiętaj, aby przy każdym przejściu dołączyć kontrolę bez przeciwciał.

Zwiększaj stężenie przeciwciała w każdym kolejnym pasażu, aż wzrost wirusa będzie nadal zdolny do życia, nawet przy końcowym stężeniu 0,6 miligrama na mililitr przeciwciała. Zamrozić wiele fiolek z supernatantem z każdego pasażu i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Kontynuuj izolację i analizę wariantów, z których wykluczono, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Przeciwciała wywołane szczepionką wyizolowane od osób zaszczepionych kandydującą szczepionką przeciwko grypie A H7N9 wykorzystano do wygenerowania zmutowanych wariantów ucieczki. Mapowanie zmutowanych ucieczek ujawniło, że wiele przeciwciał rozpoznawało krytyczne reszty w różnych miejscach wirusowego kwasu hialuronowego. Każda reszta, oznaczona kolorem czerwonym, reprezentuje lokalizację krytycznych aminokwasów wymaganych do skutecznego wiązania przeciwciała monoklonalnego, podczas gdy większość przeciwciał HI-dodatnich uciekła ze zmutowanych reszt w pobliżu wcześniej zgłoszonych miejsc antygenowych H7HA. Przeciwciała HI-ujemne wytworzyły mutanty ucieczki z mutacjami punktowymi w regionie podstawowym.

Po opanowaniu technika ta może być stosowana do wyjaśnienia strukturalnych uwarunkowań ochrony przed innymi patogenami. Technika ta nie ogranicza się tylko do generowania wariantów ucieczki przeciwciał monoklonalnych, ale także przeciwko związkom przeciwwirusowym. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyjaśnić epitop wiążący przeciwciała monoklonalne poprzez generowanie wariantów ucieczki in vitro.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zachowaniu ostrożności podczas pracy z wirusami i stosowaniu odpowiednich środków ochrony osobistej.