Spektrometria mas MALDI-TOF

Jonizacja desorpcji laserowej wspomagana matrycą (MALDI) to źródło jonów ze spektrometrią mas, idealne do analizy biomolekuł. Większość źródeł jonów usuwa informacje strukturalne z dużych, delikatnych biomolekuł. MALDI utrzymuje integralność strukturalną, a tym samym informację, jednocześnie przyspieszając cząsteczki do analizatora masy, który rozdziela związki na podstawie wielkości i ładunku. Najczęściej sprzężony z MALDI jest analizator czasu przelotu lub TOF. Ten film pokaże koncepcje jonizacji MALDI, ogólną procedurę i niektóre z jej zastosowań w biochemii.

Aby spektrometria mas działała, cząsteczki muszą zostać zjonizowane do stanu gazowego. W MALDI próbka jest osadzona w matrycy, zazwyczaj związku organicznym zawierającym podwójne wiązania aromatyczne i sprzężone.

Kiedy impuls laserowy uderza w tę mieszaninę, matryca pochłania większość energii, szybko się nagrzewa i jest desorbowana, czyli uwalniana z powierzchni. Energetyzowana matryca przekazuje część swojej energii biomolekułom, desorbując je, a następnie jonizując.

MALDI jest zwykle sparowany z analizatorem czasu przelotu lub TOF. Pole elektryczne przykłada energię kinetyczną do jonów, przenosząc je do obszaru wolnego od pola zwanego rurką dryfującą. Prędkość jonów poruszających się przez rurkę jest związana z ich stosunkiem masy do ładunku, więc cięższe cząstki przemieszczają się wolniej przez instrument. Detektor na końcu rurki mierzy czas lotu każdego jonu. Dzięki tej wiedzy, a także długości rurki i przyłożonemu natężeniu pola, można wyjaśnić stosunek masy do ładunku każdego jonu.

Ten wykres intensywności sygnału do stosunku masy do ładunku, znany jako widmo masowe, można porównać do biblioteki zebranych widm. Jeśli nie zostaną znalezione żadne dopasowania, cząsteczki można zidentyfikować za pomocą dalszych technik, takich jak tandemowa spektrometria mas. Aby uzyskać więcej informacji, zobacz film na ten temat w tej kolekcji.

Teraz, gdy podstawy MALDI-TOF zostały omówione, przyjrzyjmy się procesowi w laboratorium.

Przed rozpoczęciem eksperymentu ważne jest, aby rozważyć wybór matrycy, z której próbki będą desorbowane. Musi absorbować energię lasera, być stabilny w próżni, nie reagować z cząsteczkami docelowymi i być zdolny do desorpcji. W zależności od próbki preferowane są różne matryce. W przypadku dużego białka kombinacja CHCA i DHB wykazała lepszą separację pików, zwaną rozdzielczością, niż poszczególne matryce.

Próbki można przygotować na kilka sposobów. Pokażemy tak zwaną metodę "dwuwarstwową" lub "kanapkową". Na początek wyczyść płytkę MALDI ultraczystymi odczynnikami, ponieważ spektrometria mas jest bardzo wrażliwa na zanieczyszczenia. Osuszyć płytkę strumieniem gazu obojętnego.

Następnie sporządza się nasycony roztwór matrycy, zwykle z rozpuszczalnikiem organicznym . Roztwór rozprowadza się na płytce MALDI i suszy. Przygotowuje się drugi nasycony roztwór matrycy zawierający kwas trifluorooctowy lub TFA. TFA pomaga jonom wejść w fazę gazową.

Następnie roztwór próbki dodaje się na wierzch wysuszonej plamki matrycy. Dodać roztwór matrycy zawierający TFA na wierzch próbki, kończąc w ten sposób "kanapkę" matrycy. Jednorodność plamki można sprawdzić pod mikroskopem o małej mocy.

Płytka wzorca kalibracyjnego, która jest mieszaniną o szerokim zakresie znanych mas i służy do korelacji czasu przelotu z m/z. Na koniec pokryj samą matrycę jako kontrolę ujemną.

Aby przeanalizować plamki, umieść płytkę celowniczą w instrumencie. Upewnij się, że nie ma żadnych zanieczyszczeń, co pozwala na wytworzenie ścisłej próżni. W oprogramowaniu wybierz normę, kontrolę ujemną i próbki, które Cię interesują. Oznacz miejsca prawidłową identyfikacją.

Źródłem jonów i napięciami soczewek można manipulować w celu poprawy wydajności analizy. Będzie to zależało od specyfiki instrumentu i próbki. Skoncentruj się na standardowym miejscu i skalibruj przyrząd za pomocą oprogramowania.

Następnie zbierz widma z każdego z miejsc próbki. Wypróbuj kilka różnych lokalizacji na miejscu, aby zmaksymalizować jakość zebranych danych. Po zakończeniu płytki MALDI można zebrać i ponownie użyć po oczyszczeniu.

Teraz, gdy omówiliśmy procedurę, przyjrzyjmy się niektórym sposobom wykorzystania MALDI i innej technice jonizacji.

Oprócz biomolekuł, MALDI może być używany do analizy żywych komórek. Makrofagi to komórki odpornościowe, które przyjmują jedną z kilku różnych form, w zależności od ich mikrośrodowiska. Po wystawieniu komórek na działanie różnych cząsteczek sygnałowych lub cytokin, można je dodać bezpośrednio do płytki i przeanalizować. Widma MALDI mogą być używane jako unikalne "odciski palców", w zależności od użytej cytokiny.

Złożone próbki biologiczne, takie jak wydzieliny łojowe ssaków, wymagają etapu oczyszczania przed analizą MALDI. Chromatografia cienkowarstwowa jest jedną z takich technik, która opiera się na polarności składników. Związki są zbierane z pasztetu TLC, oczyszczane i przenoszone do matrycy MALDI. Uzyskane widma weryfikują tożsamość i czystość oddzielonych biomolekuł od wydzielin łojowych ssaków.

Innym powszechnym źródłem jonów dla biomolekuł jest jonizacja elektronrozpylacyjna lub ESI. W tej metodzie próbka jest wstrzykiwana do instrumentu, gdzie przykładane jest wysokie napięcie, tworząc aerozol naładowanych kropel. Gdy rozpuszczalnik w kropelce odparowuje, ładunek jest przenoszony na cząsteczki próbki, aż staną się całkowicie gazowe. ESI nie wymaga procedury wykrywania, a próbka może być wstrzykiwana bezpośrednio do urządzenia. Z drugiej strony, ESI jest bardziej wrażliwy na obecność składników buforowych i innych zanieczyszczeń, co oznacza, że MALDI jest bardziej wytrzymały.

Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat spektrometrii mas MALDI. Ten film opisał teorię stojącą za instrumentem, omówił ogólną procedurę i omówił niektóre zastosowania tej techniki. Dzięki za oglądanie!