Name: Pozyskiwanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą immunochirurgii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-13T00:28:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Poznaj metodę izolacji ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą immunochirurgii. Technika ta umożliwia uzyskanie żywotnych linii komórkowych z wewnętrznej masy komórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

A.E.C. jest stypendystą Jane Coffin Childs Memorial Fund for Medical Research oraz Merck Research Laboratories. Dziękujemy D. Egli i C. Cowan za porady eksperymentalne oraz dyskusje.

Zamrożone ludzkie embriony wykorzystane do pozyskania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hES) zostały przekazane do badań po uzyskaniu odpowiedniej świadomej zgody, zgodnie z protokołami badawczymi, które zostały przejrzane i zatwierdzone zarówno przez komitet ds. wykorzystania ludzi jako obiektów badań, jak i przez komitet nadzorczy ds. badań nad embrionalnymi komórkami macierzystymi na Uniwersytecie Harvarda.
Poniższy protokół pisemny oparto na opublikowanych parametrach opisanych przez Cowana i wsp. 2004, z niewielkimi modyfikacjami.
Hodowla zarodków
Wymrozić ludzkie embriony przy użyciu zestawu Quinn's Advantage Thaw Kit i hodować w kropelkach medium Global uzupełnionego o 15% Plasmanate, aż do osiągnięcia stadium rozwiniętej blastocysty.
Izolacja wewnętrznej masy komórkowej metodą immunosurgery
Przygotowanie:
<ol>
<li>Przygotować płytki do usuwania błony przejrzystej (zona pellucida) oraz immunochirurgii (patrz poniżej), przygotowując krople każdego z roztworów w płytkach 10 cm. Przykryć olej mineralny, aby zapobiec odparowywaniu. Przygotować jeden rząd kropel na każdy zarodek przeznaczony do derywacji. 
<ul>
<li>Acidic Tyrodes EmbryoMax, stosować bez zmian.</li>
<li>Pożywka do derywacji komórek hES: 75% KO-DMEM, 10% KO-Serum Replacement, 10% Plasmanate, 2,5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) testowanej na komórkach ES, 2 mM Glutamax-I, 1% nieessentialnych aminokwasów, 50 jednostek/ml penicyliny, 50 µg/ml streptomycyny, 0,055 mM b-merkaptoetanolu, 5 ng/ml bFGF.</li>
<li>Królicze przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko ludzkim erytrocytom, zrekonstytuowane zgodnie z sugestią producenta, rozcieńczone 1:10 w pożywce do derywacji komórek hES.</li>
<li>Surowica komplementu świnki morskiej, zrekonstytuowana zgodnie z sugestią producenta, rozcieńczona 1:10 w pożywce do derywacji komórek hES. <img src="/files/ftp_upload/old/574_2008_9_18_6/574_Figure-01.png" alt="Schemat immunologiczny przedstawiający acid tyrode, przeciwciało pierwszorzędowe i komplement w konfiguracji testu komórkowego." width="600" height="166" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="574_Figure-01"> </li>
</ul>
</li>
<li>Przed użyciem wyrównać temperaturę wszystkich płytek do 37°C w inkubatorze do hodowli tkanek.</li>
<li>Przygotować pipety kapilarne 50 µl-100 µl (VWR) do przenoszenia zarodków. Odciąć końce za pomocą rylca diamentowego i używać z wężykiem pipety ustnej wyposażonym w filtr 0,2 µm.</li>
</ol>
Procedura immunochirurgiczna:
Uwagi:
<ul>
<li>W tej procedurze komórki trofektodermy są niszczone poprzez krótką ekspozycję na przeciwciała skierowane przeciwko komórkom ludzkim przy jednoczesnej aktywności dopełniacza. Z tego względu protokół działa najlepiej w przypadku wysokiej jakości embrionów z nienaruszoną trofektodermą, ponieważ jedynie integralność strukturalna blastocysty zapobiega podatności ICM na reakcję immunologiczną.</li>
<li>Wszystkie procedury wykonano przy użyciu mikroskopu do mikrodissekcji wyposażonego w podgrzewany stolik.</li>
</ul>
Kroki:
<ol>
<li>Opłucz pipetę do przenoszenia embrionów za pomocą FBS, aby zapobiec przywieraniu embrionów.</li>
<li>Przenieś blastocystę z naczynia hodowlanego do kropli hES na płytce AT.</li>
<li>Rozpocznij procedurę, przenosząc blastocystę z kropli hES przez serię kropli AT. W trzeciej kropli obserwuj rozpuszczanie błony przejrzystej (zazwyczaj trwa to 5-30 sekund). Należy uważać, aby nie przedobrzyć z zabiegiem, ponieważ może to naruszyć integralność embrionu. <img src="/files/ftp_upload/old/574_2008_7_21_2/574_Figure-02.png" alt="Porównanie struktury blastocysty; ICM, ZP, TE; obraz mikroskopowy; biologia rozwoju." width="551" height="273" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="574_Figure-02"> </li>
<li>Przenieś blastocystę przez serię kropli pożywki do wyprowadzenia komórek hES, aby wypłukać AT. Zaleca się wcześniejsze napełnienie pipety pożywką, aby natychmiast zneutralizować reakcję AT. Blastocysty można tu przechowywać, dopóki wszystkie nie zostaną poddane obróbce AT.</li>
<li>Przenieś blastocystę przez serię kropli przeciwciał pierwszorzędowych, pozostawiając ją w trzeciej kropli na 30 minut inkubacji w 37°C w inkubatorze do hodowli tkanek.</li>
<li>Przenieś blastocystę przez serię kropli pożywki do wyprowadzenia komórek hES, aby wypłukać przeciwciała pierwszorzędowe.</li>
<li>Przenieś blastocystę przez serię kropli dopełniacza, pozostawiając ją w trzeciej kropli w celu obserwacji lizy komórek trofektodermy. Przez pierwsze 30 sekund na stole mikroskopu obserwuj blastocystę pod kątem „pęcherzykowania” komórek trofektodermy podczas ich lizy. Jeśli liza zostanie zaobserwowana w tym czasie, pozostaw naczynie na stole mikroskopu, aby monitorować reakcję do jej zakończenia. Jeśli w ciągu pierwszych 30 sekund nie zaobserwowano pęcherzykowania, przenieś naczynie do inkubatora, sprawdzając je co 5 minut, aż większość trofektodermy ulegnie lizie. Może to potrwać od 5 do 15 minut. Ściśle monitoruj reakcję, aby zminimalizować czas trwania procesu i potencjalne uszkodzenie masy komórkowej wnętrza. <img src="/files/ftp_upload/old/574_2008_7_21_3/574_Figure-03.png" alt="Proces immunochirurgii, obraz mikroskopowy, TE blastocysty przed i po lizie, widoczne ICM." width="571" height="273" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="574_Figure-03"> </li>
<li>Przenieś blastocystę przez serię kropli pożywki do wyprowadzenia komórek hES, aby wypłukać aktywność dopełniacza.</li>
<li>Używając szklanej pipety o średnicy nieco mniejszej niż blastocysta (wyciągniętej z kapilar VWR 10µl), wciągnij i wypuść blastocystę, aby usunąć większość zlizowanej trofektodermy. <img src="/files/ftp_upload/old/574_2008_7_21_4/574_Figure-04.png" alt="Proces mikrolinsowania blastocysty, przed i po usunięciu TE, obraz mikroskopowy." width="577" height="270" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="574_Figure-0"> </li>
<li>Wyizolowane ICM wysiej na komórki zasilające z mitotycznie inaktywowanych fibroblastów embrionalnych myszy (MEF). MEF powinny zostać przygotowane dzień przed wyprowadzaniem i przeniesione na pożywkę do wyprowadzenia komórek hES w dniu zabiegu. Płytki NUNC z 4 dołkami dobrze sprawdzają się w początkowych etapach wyprowadzania.</li>
<li>Nie niepokoj płytki przez pierwsze 1-2 dni. Następnie codziennie sprawdzaj, czy pojawił się rozrost kolonii embrionalnych komórek macierzystych (zazwyczaj widoczny w ciągu 1-2 tygodni). Pożywkę należy wymieniać w połowie objętości co drugi dzień, zaczynając od 3. dnia.</li>
</ol>
Wzrost i pasażowanie komórek ES
Gdy przyrost komórek hES osiągnie wielkość około 0,5mm lub więcej, jest on gotowy do ekspansji poprzez mechaniczne pobieranie.
<ol>
<li>Mechanicznie rozdziel połowę przerostu i przenieś do nowych płytek zawierających świeże komórki karmne. Agregaty embrionalnych komórek macierzystych powinny liczyć około 30-50 komórek każdy. Pozostałą połowę przerostu zachowaj jako zapas dla pierwszego pasażu (p1). Przerost (p0) można pobierać kilkakrotnie w miarę jego dalszej ekspansji. <img src="/files/ftp_upload/old/574_2008_7_21_5/574_Figure-05.png" alt="Wzrost kolonii komórek hES; od niskiej do wysokiej gęstości; obrazy mikroskopowe; analiza komórkowa." width="639" height="219" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="574_Figure"> </li>
<li>Kolonie wtórne można w podobny sposób rozdzielać i powiększać w większych naczyniach hodowlanych aż do pasaży 3-5, po których nowe linie komórkowe mogą zostać zaadaptowane do pasażowania enzymatycznego z użyciem trypsyny. Zawartość surowicy w pożywkach hodowlanych powinna być również stopniowo redukowana do 1% i 0% podczas tych początkowych pasaży, aby zminimalizować różnicowanie komórek ES.</li>
<li>Wszystkie ustanowione linie embrionalnych komórek macierzystych powinny zostać zbankowane poprzez zamrożenie części wczesnych pasaży do późniejszej ekspansji.</li>
<li>Dodatkowo każda linia komórkowa powinna zostać scharakteryzowana poprzez analizę kariotypu i zwalidowana za pomocą badań pluripotencji i różnicowania in vitro oraz in vivo. </li>
</ol>

<ol><li>Cowan, C. A., Klimanskaya, I., McMahon, J., Atienza, J., Whitmyer, J., Zucker, J. P., Wang, S. P., Morton, C. C., McMahon, A. P., Powers, D., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+embryonic+stem-cell+lines+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22N+ENGL+J+MED%22%5BJournal%5D)">Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts.</a> N ENGL J MED. 350 (13), 1353-1356 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony tutaj protokół dostarcza badaczom zwięzłego i łatwego do śledzenia schematu pozyskiwania linii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych poprzez immunosurgicalną izolację wewnętrznej masy komórkowej.

<table><tbody><tr><td>Quinn&amp;rsquo;Zestaw do rozmrażania Advantage Thaw Kit </td><td>Szałwia</td><td>ART-8016</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka uniwersalna</td><td>Życie Globalne</td><td>GMGB-050</td><td></td></tr><tr><td>Plasmanate</td><td>Talecris</td><td>61325</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax Acidic Tyrodes</td><td>Chemicon International</td><td>MR-004-D</td><td></td></tr><tr><td>KO-DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>Zamiennik surowicy KO-Serum</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>definiowana płodowa surowica bydlęca przebadana pod kątem komórek ES</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax-I</td><td>Invitrogen</td><td>35050-079</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy nieistotne</td><td>Invitrogen</td><td>11140-076</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów</td><td>Invitrogen</td><td>13256-029</td><td></td></tr><tr><td>Beta-merkapto&amp;#8211;etanol </td><td>Invitrogen</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>królicze przeciwciało pierwotne przeciwko ludzkim erytrocytom</td><td>Rockland Immunochemicals</td><td>109-4139</td><td></td></tr><tr><td>Surowica z dopełniaczem świnki morskiej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-1639</td><td></td></tr><tr><td>Pipety kapilarne w rozmiarach 10 µL, 50 µL, 100 µL</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipety ustne z drenami</td><td>VWR international</td><td></td><td>zaopatrzone w pipety kapilarne marki VWR</td></tr><tr><td>filtr strzykawkowy Acrodisc 0,2 μm </td><td>Pall Corporation</td><td>PN4192</td><td></td></tr><tr><td>0,5% trypsyna-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300-120</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia do hodowli tkankowej</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naczynia do hodowli tkankowych</td><td>Nalge Nunc international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>stereomikroskop operacyjny Nikon SMZ1500 wyposażony w podgrzewany stół Nikon Tokai Hit ThermoPlate </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>embrionalne fibroblasty mysie (E12.5)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych metodą immunochirurgii

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

Zdolność ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do samoodnawiania się oraz różnicowania we wszystkie typy komórek organizmu wskazuje, że niosą one ogromny potencjał zarówno w zastosowaniach medycznych, jak i jako narzędzie badawcze służące do odpowiedzi na fundamentalne pytania dotyczące rozwoju i chorób. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy zwięzły, krok po kroku opisany protokół izolacji ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z embrionów poprzez immunosurgicalne wyodrębnienie masy komórkowej wnętrza.

Zdolność ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do samoodnawiania oraz różnicowania się we wszystkie typy komórek organizmu sprawia, że stanowią one ogromną obietnicę zarówno w zastosowaniach medycznych, jak i jako narzędzie badawcze służące do odpowiedzi na fundamentalne pytania dotyczące rozwoju i chorób. W niniejszym materiale przedstawiamy zwięzły, szczegółowy protokół izolacji ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z embrionów poprzez immunosurgicalną izolację masy komórkowej wnętrza.

Wytwarzanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych metodą immunochirurgii

Zdolność ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do samoodnawiania oraz różnicowania się we wszystkie typy komórek organizmu sugeruje, że niosą one ogromny potencjał zarówno dla...

Witam, nazywam się Alice Chen. Jestem pracownikiem post-doc w laboratorium melting, a dzisiaj zaprezentuję Państwu sposób pozyskiwania embrionalnych komórek macierzystych z ludzkich embrionów. Otrzymujemy embriony na różnych etapach rozwoju i hodujemy je in vitro, aż osiągną odpowiedni etap rozwiniętej blastocysty.Są to przykłady rozwoju zarodka od pierwszego stadium jednokomórkowego, przez wczesną blastocystę, aż po blastocystę rozwiniętą, z której pozyskujemy ludzkie embrionalne komórki macierzyste. Wybrane do izolacji wysokiej jakości zarodki są przenoszone przez trzy krople ACE-RDS, gdzie pozostawia się je i obserwuje rozpuszczanie błony przejrzystej. Proces neurochirurgiczny jest procesem nieswoistym, w którym przeciwciało królicze anty-ludzkie wiąże się z zewnętrzną warstwą komórek.W tym przypadku jest to tzw. trifecta derm. Po dodaniu dopełniacza z surowicy świnki morskiej wszystkie komórki z przyłączonymi przeciwciałami ulegną lizie. Na początek należy przygotować trzy płytki.Pierwsza płytka służy do ACE tyros, której używamy do usunięcia zita. Druga i trzecia płytka są przeznaczone do immunos surgery. W pierwszej kolejności przygotuję płytkę, na której umieścimy krople acid tyros oraz pochodne ludzkich embrionalnych komórek macierzystych.Krople pożywek. Na lewej stronie płytki przygotuj trzy krople kwasowego tyrosinu, a na prawej stronie płytki przygotuj trzy krople pożywki do hodowli ludzkich ES. Druga płytka zawiera przeciwciało pierwotne, którym jest królicze anty-human RBC.Ponownie, lewa strona płytki zostanie przeznaczona na przeciwciało pierwszorzędowe, po trzy krople na zarodek, a prawa strona płytki zostanie przeznaczona na hodowlę ludzkich komórek ES. Krople pożywki, ponownie po trzy krople na zarodek dla płytki uzupełniającej. Ponownie umieścimy trzy krople uzupełnienia po lewej stronie płytki, a następnie trzy krople pożywki do hodowli ludzkich komórek ES po prawej stronie płytki.Ponownie, każdy rząd jest przeznaczony dla jednego embrionu. Wszystkie trzy płytki są pokryte olejem mineralnym w celu zapobiegania parowaniu i umieszczone w inkubatorze w celu wyrównania temperatury. Jest to mikroskop do sekcji wewnątrz stanowiska do pobierania, gdzie występuje przepływ laminarny, podobnie jak w przypadku hodowli tkanek; tutaj wykonujemy większość manipulacji na ludzkich embrionach.Pierwszą rzeczą, którą należy przygotować przed rozpoczęciem pracy z embrionami, są pipety ustne. Jest to standardowy przewód pipety ustnej, z tą różnicą, że pomiędzy usta a miejsce wprowadzenia pipety wstawiliśmy filtr 0,2 µm. Służy to zapewnieniu sterylności.Pozwólcie, że zaprezentuję sposób wyciągania pipet kapilarnych. Preferuję przygotowywanie różnych rozmiarów. Wszystkie niezbędne elementy można nabyć w firmie VWR; ja zazwyczaj wyciągam pipety o średnicach odpowiadających objętościom 10 µL, 50 µL oraz 100 µL.Obecnie używam diamentowego rylca do przecięcia rurki mocującej. W tym pierwszym kroku wymagana jest dość duża średnica, ponieważ operujemy całym embrionem. Wybrane do derywacji wysokiej jakości embriony są następnie przenoszone przez trzy krople.Przenieś próbkę, przechodząc od pierwszej kropli do drugiej, a następnie do trzeciej, gdzie pozostawisz ją i będziesz obserwować rozpuszczanie się zap palita. Proces ten trwa zazwyczaj mniej niż 30 sekund i można w rzeczywistości zauważyć rozpuszczanie się zap palita. Gdy zap palita całkowicie się rozpuści.Następnie embriony przeniesiono przez trzy krople płuczące zawierające pożywkę do hodowli ludzkich komórek Es, przechodząc kolejno przez pierwszą, drugą i trzecią kroplę płuczącą. Następnie embrion przenosi się do kropel z przeciwciałem pierwszorzędowym, ponownie przechodząc z pierwszej kropli do drugiej i trzeciej, gdzie pozostawia się go na pół godziny inkubacji w inkubatorze do hodowli tkanek. Lizy trofektodermy można doczekać się, gdy zauważymy pęcherzykowanie komórek na zewnątrz embrionu. Oznacza to początek lizy komórek trofektodermalnych.Gdy liza jest widoczna na całym zewnętrznym brzegu zarodka, zarodek jest gotowy do przemycia w trzech kroplach pożywki hodowlanej humanus. Po zabiegu immunosurgery zarodki są mechanicznie truturowane przy użyciu pipety o mniejszej średnicy. Pipeta ta powinna mieć mniejszą średnicę niż pierwsza pipeta, aby proces truturowania był bardziej efektywny w usuwaniu fragmentów lizy.Komórki skóry. Po zakończeniu mechanicznej manipulacji w centrum pozostaje skupisko komórek. Jest to nienaruszona masa komórkowa wewnętrzna.Wokół tego obszaru znajduje się wiele zlizowanych komórek dermalnych trifecta, a także niektóre nienaruszone komórki dermalne trifecta. Ten izolat wewnętrznej masy komórkowej zostaje następnie umieszczony w dołku przygotowanym z warstwy komórek zasilających pochodzących z embrionu myszy. Płytka z warstwą komórek zasilających została przygotowana dzień wcześniej, a dziś rano zmieniłem medium z pożywki dla fibroblastów embrionarnych myszy na pożywkę do derywacji ludzkich es.Izolat masy komórek wewnętrznych jest następnie przenoszony z kropel płuczących po uzupełnieniu do tej studzienki zawierającej komórki warstwy karmnej. Naczynie to jest następnie zwracane do inkubatora i pozostawione bez ingerencji przez kilka dni, aby umożliwić przyleganie izolatu masy komórek wewnętrznych. Jest to przykład tego, jak rozwija się przerost.Gdy przyrost stanie się wystarczająco duży, można rozpocząć pierwszy pasaż, dzieląc ten przyrost na pół. Od pierwotnej izolacji minęło 14 dni; oto przykład przyrostu z jednej z naszych izolacji.Jest to przykład takiego przerostu, z którego dzisiaj pobiorę połowę materiału. Przerost ten zostanie podzielony na pół, a następnie pocięty na kwadratowe fragmenty, z których każdy zostanie przeniesiony do nowej studzienki zawierającej komórki dokarmiające. Warto pozostawić połowę przerostu nienaruszoną, aby dysponować ciągłym źródłem komórek, do którego można wrócić w celu ich namnożenia oraz zabezpieczenia wykonanych pasażów.Przez pierwsze dwa lub trzy pasażowania. Zaleca się mechaniczne pasażowanie w ten sposób, aby w dalszej kolejności przystosować komórki do dysocjacji enzymatycznej w celu bardziej wydajnego pasażowania. Nasze laboratorium konsekwentnie wyprowadza linie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do badań nad rozwojem i różnicowaniem.Linie te są również dystrybuowane na całym świecie do badaczy komórek macierzystych. Uważam, że istnieją cztery główne czynniki wpływające na sukcesywność wyprowadzenia linii. Pierwszym z nich jest jakość zarodka, która zależy także od tła genetycznego, sposobu zamrażania i rozmrażania zarodków, a także od jakości hodowli in vitro aż do etapu wyprowadzenia linii w stadium blastocysty.Drugim czynnikiem jest prawdopodobnie integralność jakościowa wewnętrznej masy komórkowej po izolacji, co może zależeć od techniki stosowanej do izolowania wewnętrznej masy komórkowej, a także od doświadczenia i umiejętności. Trzecim czynnikiem jest to, jak dobrze wyizolowana wewnętrzna masa komórkowa przytwierdza się do warstw pożywczych, a czwartym czynnikiem jest wzrost tego izolatu ICM. Nie uważam, aby był to proces trudny pod względem technicznym.Wymaga to jedynie odrobiny praktyki. W rzeczywistości każdy krok jest dość prosty, więc o ile można postępować zgodnie z protokołem, uważam, że przy niewielkiej wprawie każdy będzie w stanie to zrobić. To, co zaobserwowaliśmy w laboratorium, to fakt, że każda linia różni się nieco od innych z powodów, których nie do końca rozumiemy.Na przykład, testując potencjał różnicowania 10 linii, można zauważyć, że dwie lub trzy z nich mogą wykazywać większą skłonność do przekształcania się w typ komórek, który nas interesuje. Przypuszczam, że różnice te wynikają ze stadium zarodka, z którego pochodziły linie embrionalnych komórek macierzystych, a także z procedur manualnej hodowli tych komórek. Uważam, że ich właściwości czasami ulegają zmianie, a heterogeniczność linii komórkowych oraz ich potencjał to kwestie, o których każdy badacz komórek macierzystych musi pamiętać.Powtórzę, że nie wiem, co jest tego przyczyną, ale przyjmując mój projekt badawczy jako przykład, naszym ostatecznym celem jest wytworzenie insulinoprodukujących komórek beta trzustki. Pierwszym krokiem w kierunku stworzenia takiej linii komórkowej jest wygenerowanie endodermy z embrionalnych komórek macierzystych. Porównując od 10 do 20 linii, odkryliśmy, że jedna lub dwie z nich mogą wydajnie generować endodermę, połowa z nich może robić to z mniejszą wydajnością, a niektóre nie potrafią generować endodermy w ogóle. Dzięki temu wstępnemu procesowi przesiewowemu wybieramy komórki, które mają większą tendencję do tworzenia interesującego nas typu komórek, a następnie kontynuujemy różnicowanie z wykorzystaniem tych konkretnych typów komórek.Pierwszą wyprowadzenie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych opisano w pracy Thompson i współpracowników w 1998 roku, a w 2004 roku nasze laboratorium zgłosiło wyprowadzenie 17 nowych linii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Poprzez modyfikację tych opublikowanych protokołów – a zmiany te miały na celu przede wszystkim usprawnienie procesu wyprowadzania komórek – wprowadzono korekty w składzie pożywek, sposobie pasażowania komórek oraz metodzie ich zamrażania i rozmrażania.Od tego czasu, przy każdej indukcji, poszukujemy nowych sposobów usprawnienia protokołu oraz szybkości procesu. Na przykład nasze laboratorium bada alternatywne metody izolacji wewnętrznej masy komórkowej, nie wykorzystując odczynników ksenogenicznych, takich jak przeciwciała królicze czy dopełniacz surowicy świni morskiej, lecz stosując bardziej mechaniczną dyssekcję wewnętrznej masy komórkowej. Mamy nadzieję, że metody te doprowadzą do opracowania co najmniej porównywalnego, jeśli nie lepszego sposobu izolacji wewnętrznej masy komórkowej.

derivation-of-human-embryonic-stem-cells-by-immunosurgery

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pochodzenie ludzkich komórek macierzystych z zarodkowych przez immunochirurgię

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje proces otrzymywania transplantowalnych hematopoetycznych komórek macierzystych z mysich embrionalnych komórek macierzystych (ESC) oraz ich późniejszą iniekcję do letalnie napromieniowanych myszy biorców. W skrócie, ESC są różnicowane do postaci ciał embroidalnych, które następnie są infekowane retrowirusem HoxB4 i współhodowane z komórkami zrębowymi OP9 oraz cytokinami hematopoetycznymi.

Wytwarzanie komórek macierzystych krwi z mysich embrionalnych komórek macierzystych

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem indukowalnego lentiwirusa wykazującego ekspresję Oct4, Sox2, c-Myc oraz Klf4.

Generowanie komórek iPS z MEF poprzez wymuszoną ekspresję Sox-2, Oct-4, c-Myc i Klf4

Zdolność embrionalnych komórek zarodkowych do różnicowania się w pierwotne komórki płciowe podczas wczesnych etapów rozwoju stanowi idealny model do zweryfikowania naszej hipotezy dotyczącej nowotworów i niepłodności. Niniejszy protokół przedstawia sposób izolacji pierwotnych komórek płciowych z rozwijających się gonad w embrionach myszy w 10,5–11,5 dniu po zapłodnieniu (post coitum).

Izolacja i hodowla zarodkowych komórek macierzystych myszy

Kierowana różnicowanie hESC w konkretne komórki wzbudziło duże zainteresowanie w medycynie regeneracyjnej. Przedstawiamy zwięzły, szczegółowy protokół służący do określania losów wybranych hESC in vivo, który stanowi cenne narzędzie do charakteryzacji reagentów specyficznych dla tkanek w terapiach komórkowych.

Mapowanie losów ludzkich embrionalnych komórek macierzystych poprzez tworzenie potworniaków

Mysie embrionalne komórki macierzyste mogą być różnicowane do limfocytów T in vitro za pomocą systemu kohodowli OP9-DL1. Powodzenie tej procedury wymaga zwrócenia szczególnej uwagi na konserwację odczynnika/ogniwa oraz kluczowych kroków wrażliwych na technikę. W tym miejscu omawiamy te krytyczne parametry i przedstawiamy szczegółowy protokół, aby zachęcić do przyjęcia tej technologii.

Wyprowadzanie limfocytów T in vitro z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych dostarcza fascynujących perspektyw dla pochodnych autologicznych przeszczepów. Jednak progresja przez stan pluripotencjalny i pracochłonne różnicowanie nadal utrudnia translację kliniczną. Tutaj opisujemy pochodzenie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednią konwersję do indukowanych nerwowych komórek progenitorowych, a następnie różnicowanie w linie nerwowe.

Wyprowadzanie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednia konwersja do ekspandowalnych nerwowych komórek progenitorowych

Edycja genomu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) może być przeprowadzona szybko i efektywnie. Przedstawiono tutaj solidną procedurę eksperymentalną inżynierii genetycznej hPSC, której przykładem jest edycja locus AAVS1 w celu ekspresji EGFP i wprowadzenia oporności na antybiotyki.

Opracowanie ludzkich pluripotencjalnych linii komórek macierzystych z edytowanym genomem: od ukierunkowania do izolacji

Tutaj opisujemy metodę oczyszczania zróżnicowanych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, które są zaangażowane w ostateczną endodermę w celu poprawy dalszych zastosowań i dalszego różnicowania.

Szybka i skuteczna metoda oczyszczania komórek endodermy generowanych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje metody konstruowania humanizowanego modelu myszy szpiku kostnego/wątroby/grasicy z opartą na komórkach macierzystych odpornością na zakażenie wirusem HIV.

Zmodyfikowana odporność na zakażenie wirusem HIV oparta na komórkach macierzystych w humanizowanym modelu myszy

Ten artykuł opisuje protokół efektywnego pozyskiwania i hodowli pluripotencjalnych linii komórek macierzystych z embrionów myszy w stadium blastocysty.

Pozyskiwanie linii komórek macierzystych z zarodków myszy przed implantacją

Poznaj metodę izolacji ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą immunochirurgii. Technika ta umożliwia uzyskanie żywotnych linii komórkowych z wewnętrznej masy komórkowej.

Wytwarzanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych metodą immunochirurgii

Przeglądaj więcej filmów