Name: Przeszczepienie dożylne i owodniowe w macicy w modelu mysim (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: Poznaj technikę przeszczepienia dożylnego i owodniowego w macicy myszy, umożliwiającą wprowadzanie komórek i wektorów wirusowych w tolerancyjnym immunologicznie środowisku płodowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Szpitalu Dziecięcym w Filadelfii.
1. Tworzenie pipet iniekcyjnych
<ol>
	<li>Za pomocą pionowego ściągacza do mikropipet wyciągnij pipetę mikrokapilarną o pojemności 100 μl (<klasa silna="xfig">Rysunek 1A - 1C). Skalibruj ściągacz do mikropipet tak, aby zwężający się koniec miał > 1 cm długości. 
	UWAGA: Początkowo ustawienia ściągacza należy dostosować do optymalnej długości. Wyższe ustawienie ciepła sprawi, że końcówka będzie dłuższa, a wyższe ustawienie naciągu sprawi, że średnica końcówki będzie węższa.</li>
	<li>Przytnij zwężający się koniec tak, aby miał ≥ 1 cm długości. Upewnij się, że średnica wewnętrzna na końcu igły wynosi od 70 μm do 100 μm i jest odwrotnie proporcjonalna do długości stożkowego końca. 
	UWAGA: Średnica wewnętrzna zależy również od kalibracji ściągacza do mikropipet. Zapoznaj się z instrukcją producenta pionowego ściągacza do mikropipet lub innego preferowanego typu ściągacza do mikropipet.</li>
	<li>Po upewnieniu się, że igła ma odpowiednią średnicę wewnętrzną, utwórz skos 15 - 20 stopni, ostrząc końcówkę za pomocą ukosowarki do mikropipet z diamentowym kołem do ostrzenia (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A - 2C). Upewnij się, że delikatnie opierasz końcówkę na kole bez zbyt dużego nacisku, aby zmniejszyć ryzyko złamania lub pęknięcia końcówki. 
	UWAGA: Pędzlem malarskim można wytrzeć wszelkie zanieczyszczenia, które gromadzą się na końcówce igły.</li>
	<li>Oceń końcówkę pod mikroskopem i upewnij się, że końcówka jest okrągła, bez żadnych odprysków i pęknięć. Ponownie oceń średnicę wewnętrzną, aby upewnić się, że wynosi od 70 μm do 100 μm (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D - 2H).</li>
	<li>Narysuj linie na pozostałej części igły, aby oznaczyć 5 μl objętości między nimi (np. igły o średnicy wewnętrznej 1,3 mm powinny mieć linie narysowane w odstępach co 3,77 mm).</li>
	<li>Igły należy sterylizować w autoklawie przed użyciem w gabinecie chirurgicznym i obchodzić się z nimi w sterylnych rękawiczkach. </li>
</ol>
2. Zastrzyki in utero
<ol>
	<li>Przygotuj niezbędne instrumenty, sterylizując je z wyprzedzeniem w autoklawie. Dołącz niezbędne instrumenty, takie jak uchwyt igły do mikrowstrzykiwaczy, igła chirurgiczna, para kleszczyków Adson, para zakrzywionych nożyczek do zwykłych tkanek, strzykawka insulinowa o pojemności 1 ml, kilka aplikatorów z bawełnianą końcówką, pipeta transferowa, stożkowa rurka o pojemności 50 ml i zestaw nici 4-0 poliglaktyny 910.</li>
	<li>Stosując sterylną technikę, przymocować igłę do uchwytu igły i podłączyć ją do mikrowstrzykiwacza. 
	UWAGA: Ustawienia używanego sprężonego azotu są następujące: wstrzyknąć 4 - 6 psi, zrównoważyć 0 psi. W zależności od tego, co jest wstrzykiwane, a konkretnie od lepkości wstrzykiwanego środka, a także od wielkości mikropipety, czas wstrzykiwania waha się od 0,3 do 1,5 s.</li>
	<li>Oczyść końcówkę igły z wszelkich możliwych zanieczyszczeń, pobierając 5 - 10 μl sterylnego 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), a następnie usuwając ją. Powtórz to 2 - 3 razy.</li>
	<li>Przygotuj ciężarne samice myszy w wieku od 2 do 6 miesięcy do operacji, goląc ich brzuchy maszynką do strzyżenia. Uważaj, aby nie uszkodzić sutków. Podawać doustne leki przeciwbólowe (np. 100 μl 1,5 mg/ml zawiesiny doustnej meloksykamu na mysz).</li>
	<li>Rozpocznij napełnianie igły pożądanym materiałem (komórkami/wektorem/lekiem) o żądanej objętości. Uważaj, aby nie złamać końcówki igły podczas napełniania igły. 
	UWAGA: Objętość wstrzyknięcia na płód różni się w zależności od konkretnego projektu eksperymentalnego. 20 μL dobrze sprawdza się przy wstrzykiwaniu dużej liczby komórek (tj. do 107 komórek do żyły witelinowej. Na przykład dostarczyliśmy 1 x 107 całych komórek szpiku kostnego wyizolowanych z myszy C57BL / 6TgN (act-EGFP) OsbY01 ["B6 Green Fluorescent Protein (GFP)"] przez żyłę witelinową do płodów Balb / c w 14. dniu ciąży. W przypadku wstrzyknięć wektora wirusowego dobrze sprawdza się pojedyncze wstrzyknięcie 10 μl rozcieńczonego wektora w stosunku 1:1 z PBS.</li>
	<li>Aby skalibrować czas wtrysku, należy wykonać następujące czynności.
	<ol>
		<li>Naciśnij przycisk Mode 3x na mikrowtryskiwaczu, aby przejść do ekranu kalibracji wtrysku. Dostosuj czas wtrysku, dodając interwały 10 lub 100 ms i naciśnij przycisk Mode 2x.</li>
		<li>Naciśnij przycisk Balance i naciśnij raz pedał nożny. Teraz ponownie naciśnij pedał i oceń, ile objętości jest opróżniane z igły za jednym naciśnięciem. Jeśli nie jest skalibrowany do żądanej objętości 5 - 20 μl na naciśnięcie pedału, powtórz kroki 2.6.1 i 2.6.2. 
		UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, dobrze jest skalibrować każde naciśnięcie, aby dostarczyć połowę całkowitej głośności docelowej na raz. Chociaż możliwe jest wstrzyknięcie więcej niż 30 μl lub nawet 40 μl całkowitej objętości, na ogół nie przekraczamy 20 μl na płód, dożylnie lub dowodniowo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Napełnij igłę do żądanego poziomu.</li>
	<li>Rozpocznij podawanie znieczulenia myszy, ustawiając przepływomierz tlenu na 1 l/min, a parownik izofluranu na 3%.</li>
	<li>Sprawdź, czy mysz jest znieczulona, sprawdzając, czy nie ma odruchu pedałowania. Przenieś mysz na poduszkę grzewczą w pozycji leżącej.</li>
	<li>Nałóż nawilżający żel pod oczy, aby uniknąć wysuszenia rogówki. Zamocuj mysz na miejscu, przyklejając kończyny górną i dolną do podkładki.</li>
	<li>Przygotuj brzuch za pomocą peelingu z chlorheksydyną, a następnie alkoholem i wstrzyknij miejscowo znieczulenie (np. 100 μl 0,25% bupiwakainy) podskórnie (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A).</li>
	<li>Nożyczkami wykonaj nacięcie skóry o długości 1-2 cm, tak aby dolna granica nie znajdowała się bliżej niż 1 cm od introitu; powięź pod spodem była bardzo cienka i przezroczysta.</li>
	<li>Zidentyfikuj linię środkową deski rozdzielczej, która jest bardziej przezroczysta niż otaczający ją obszar. Uważaj, aby nie uszkodzić naczyń nadbrzusza, które leżą po obu stronach linii środkowej. Jeśli naczynia w nadbrzuszu ulegną uszkodzeniu, należy naciskać aplikatorami z bawełnianą końcówką, aby zatrzymać krwawienie.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy Adson uszczypnij powięź, nie chwytając żadnego z leżących poniżej narządów, takich jak jelita, pęcherz moczowy lub płody. Otwórz powięź nożyczkami, uważając, aby nie uszkodzić żadnego z narządów. Gdy już bezpiecznie znajdzie się w jamie brzusznej, przedłuż nacięcie powięziowe. Nie powinien być dłuższy niż nacięcie skóry.</li>
	<li>Użyj aplikatorów z bawełnianymi końcówkami, aby przesunąć jelita do górnej części brzucha, odsłaniając w ten sposób ciążącą macicę. Uwolnij macicę z nacięcia, ostrożnie identyfikując prawe i lewe jajniki, aby upewnić się, że wszystkie płody zostały policzone (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3B).</li>
	<li>Umieść lewą macicę z powrotem w jamie brzusznej tak, aby odsłonięta była tylko prawa macica; zapobiega to wysuszeniu macicy i utrzymuje ciepło płodów, którym nie wstrzyknięto</li> zastrzyku.
	<li>Trzymaj najbardziej boczny płód/worek owodniowy między kciukiem a palcem wskazującym niedominującej ręki operatora (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3C). Zawsze bądź delikatny, aby nie spowodować żadnych uszkodzeń płodów.</li>
	<li>Ustaw mikroskop preparacyjny (idealne jest 10-krotne powiększenie) i dostosuj ostrość tak, aby płód był w polu widzenia. Dostosuj oświetlenie, aby uzyskać lepszą wizualizację.</li>
	<li>Zidentyfikuj część, która zostanie wstrzyknięta (żyła witelinowa, owodniowa). W przypadku wstrzyknięć dożylnych należy najpierw uwidocznić zarówno żyły witelinowe, jak i ich zespolenie. W przypadku wstrzyknięć doowodniowych należy ustawić płód tak, aby był skierowany na prawą stronę do przodu.</li>
	<li>Dotrzyj igłą do przestrzeni docelowej, jak opisano poniżej.
	<ol>
		<li>W przypadku wstrzyknięcia dożylnego należy postępować zgodnie z poniższymi zasadami.
		<ol>
			<li>Obrócić macicę tak, aby wstrzykiwana żyła witelinowa była równoległa do końcówki igły; należy pamiętać, że wstrzyknięcia muszą być wykonywane w kierunku zespolenia obu żył</li>.
			<li>Połóż igłę na macicy pod kątem 5° i przebij ścianę macicy. Teraz, gdy końcówka znajduje się między ścianą macicy a workiem owodniowym, umieść końcówkę bezpośrednio na żyle żółtowej.</li>
			<li>Pod kątem prawie stycznym przesuwaj igłę po żyle, aż skos przebije się i wsunie do naczynia; jest to widoczne po błysku krwi widocznym na końcówce igły (<silna klasa="xfig">Rysunek 3D). 
			UWAGA: Uzyskanie dostępu do żyły może zająć kilka prób, ponieważ igła może nie przebić żyły przy pierwszym przesunięciu po żyle.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W przypadku wstrzyknięcia doowodniowego należy wykonać następujące czynności.
		<ol>
			<li>Obróć worek owodniowy i znajdź miejsce pozbawione naczyń do przekłucia.</li>
			<li>Skieruj igłę prostopadle do ściany macicy i przebij macicę, woreczek żółtkowy, a następnie worek owodniowy. Uważaj, aby nie przebić żadnej tkanki płodu. Upewnij się, że igła przeszła między kończynami, ponieważ potwierdza to, że igła znajduje się w worku owodniowym. Następnie należy przystąpić do wstrzykiwania.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstrzyknąć odpowiednią ilość żądanego materiału (zwykle 10 - 20 μL), naciskając pedał nożny. 
	UWAGA: Ponieważ wstrzykiwacz musi przez cały czas utrzymywać wizualizację końcówki igły pod mikroskopem, druga osoba musi odczytać oznaczenia na igle, aby określić ilościowo wstrzykniętą ilość i poinformować wstrzykiwacz, ile objętości pozostało do wstrzyknięcia. Rozmowa przed wstrzyknięciem między wstrzykiwaczem a asystentem jest ważna, aby uniknąć nieporozumień i opóźnień. Jest to szczególnie ważne w przypadku wstrzyknięć dożylnych, ponieważ opóźnione usunięcie igły pozwoli na cofnięcie się krwi żylnej do igły i spowoduje niedokładne dawkowanie.</li>
	<li>Pobrać igłę z miejsca wstrzyknięcia po dostarczeniu żądanej objętości. Ponieważ po wstrzyknięciach dożylnych może wystąpić krwawienie z miejsca nakłucia naczynia, należy utrzymać nacisk bokiem igły przez 10 - 15 sekund, aby zatrzymać krwawienie.</li>
	<li>Przejdź do następnego płodu. Kontynuuj, aż wszystkie płody prawego rogu macicy zostaną wstrzyknięte.</li>
	<li>Usuń lewy róg macicy z jamy brzusznej i umieść prawy róg macicy z powrotem w jamie otrzewnej. 
	UWAGA: Czasami konieczne jest ponowne napełnienie igły środkiem do wstrzykiwań.</li>
	<li>Po wstrzyknięciu wszystkich płodów umieść macicę w jamie brzusznej (<silna klasa="xfig">Rysunek 3E). Upewnij się, że unikasz skrętu macicy lub jelit.</li>
	<li>Za pomocą jednorazowej pipety transferowej umieść około 2 ml 1x PBS w jamie brzusznej, aby zastąpić wszelkie niezauważalne ubytki.</li>
	<li>Zamknij powięź i brzuch w jednej ciągłej warstwie za pomocą szwów 4-0 polyglactin 910, aby uniknąć uszkodzenia leżących poniżej narządów podczas zamykania (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3F - 3G).</li>
	<li>Usuń taśmę i przenieś mysz do klatki pod lampą grzewczą. Uważaj, aby nie umieścić grzejnika lamp zbyt blisko myszy. Upewnij się, że w klatce jest ściółka, jedzenie i woda. 
	UWAGA: Można również zastosować termostatycznie sterowaną ciepłą komorę. Mysz nie śpi, gdy jest wyprostowana i chodzi.</li>
	<li>Obserwuj mysz codziennie i w razie potrzeby podawaj leki przeciwbólowe. 
	UWAGA: Rutynowo podajemy meloksykam w 1. i 2. dniu po operacji, a czasami w 3. dniu, jeśli mysz wykazuje oznaki bólu.</li>
	<li>W przypadku wykonywania operacji wsadowej z użyciem tego samego materiału iniekcyjnego należy oczyścić igłę iniekcji za pomocą sterylnego PBS. W przypadku wstrzykiwania z użyciem innego materiału, wyrzucić igłę do pojemnika na ostre przedmioty i użyć nowej igły. 
	UWAGA: Zalecamy wychowywanie młodych z matkami zastępczymi natychmiast po urodzeniu na wypadek, gdyby matka wytworzyła odpowiedź immunologiczną na zastrzyk i przekazała młode przeciwciała wraz z mlekiem matki.</li>
</ol>

<ol><li>Loukogeorgakis, S., Flake, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+stem+cell+and+gene+therapy%3A+current+status+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">In utero stem cell and gene therapy: current status and future perspectives.</a> European Journal of Pediatric Surgery. 24, 237-245 (2014).</li>
<li>Vrecenak, J., Flake, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+hematopoietic+cell+transplantation%3A+recent+progress+and+the+potential+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">In utero hematopoietic cell transplantation: recent progress and the potential for clinical application.</a> Cytotherapy. 15, 525-535 (2013).</li>
<li>Peranteau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+murine+hemoglobinopathies+by+prenatal+tolerance+induction+and+postnatal+nonmyeloablative+allogeneic+BM+transplants%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Correction of murine hemoglobinopathies by prenatal tolerance induction and postnatal nonmyeloablative allogeneic BM transplants.</a> Blood. 126 (10), 1245-1254 (2015).</li>
<li>Vrecenak, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+Long-Term+Mixed+Chimerism+Achieved+in+a+Canine+Model+of+Allogeneic+in+utero+Hematopoietic+Cell+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Stable Long-Term Mixed Chimerism Achieved in a Canine Model of Allogeneic in utero Hematopoietic Cell Transplantation.</a> Blood. 124 (12), 1987-1995 (2014).</li>
<li>Peranteau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD26+Inhibition+Enhances+Allogeneic+Donor-Cell+Homing+and+Engraftment+after+in+utero+Hematopoietic-Cell+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD26 Inhibition Enhances Allogeneic Donor-Cell Homing and Engraftment after in utero Hematopoietic-Cell Transplantation.</a> Blood. 108 (13), 4268-4274 (2006).</li>
<li>Waddington, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+gene+transfer+of+human+factor+IX+to+fetal+mice+can+induce+postnatal+tolerance+of+the+exogenous+clotting+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In utero gene transfer of human factor IX to fetal mice can induce postnatal tolerance of the exogenous clotting factor.</a> Blood. 101 (4), 1359-1366 (2003).</li>
<li>Stitelman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+Stage+Determines+Efficiency+of+Gene+Transfer+to+Muscle+Satellite+Cells+by+in+utero+Delivery+of+Adeno-Associated+Virus+Vector+Serotype+2%2F9%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Developmental Stage Determines Efficiency of Gene Transfer to Muscle Satellite Cells by in utero Delivery of Adeno-Associated Virus Vector Serotype 2/9.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 1, 14040(2014).</li>
<li>Endo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Transfer+to+Ocular+Stem+Cells+by+Early+Gestational+Intraamniotic+Injection+of+Lentiviral+Vector%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Gene Transfer to Ocular Stem Cells by Early Gestational Intraamniotic Injection of Lentiviral Vector.</a> Molecular Therapy. 15 (3), 579-587 (2007).</li>
<li>Boelig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Intravenous+Route+of+Injection+Optimizes+Engraftment+and+Survival+in+the+Murine+Model+of+In+utero+Hematopoietic+Cell+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Blood+and+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">The Intravenous Route of Injection Optimizes Engraftment and Survival in the Murine Model of In utero Hematopoietic Cell Transplantation.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22 (6), 991-999 (2016).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-amniotic+Transient+Transduction+of+the+Periderm+with+a+Viral+Vector+Encoding+TGF%CE%B23+Prevents+Cleft+Palate+in+Tgf%CE%B23-%2F-.+Mouse+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Intra-amniotic Transient Transduction of the Periderm with a Viral Vector Encoding TGFβ3 Prevents Cleft Palate in Tgfβ3-/-. Mouse Embryos.</a> Molecular Therapy. 1, 8-17 (2013).</li>
<li>Roybal, J., Endo, M., Radu, A., Zoltick, P., Flake, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+gestational+gene+transfer+of+IL-10+by+systemic+administration+of+lentiviral+vector+can+prevent+arthritis+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Early gestational gene transfer of IL-10 by systemic administration of lentiviral vector can prevent arthritis in a murine model.</a> Gene Therapy. 18 (7), 719-726 (2011).</li>
<li>Reay, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-Length+Dystrophin+Gene+Transfer+to+the+Mdx+Mouse+in+utero%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Full-Length Dystrophin Gene Transfer to the Mdx Mouse in utero.</a> Gene Therapy. 15 (7), 531-536 (2008).</li>
<li>Ahmed, S., Waddington, S., Boza-Morán, M., Yáñez-Muñoz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Efficiency+Transduction+of+Spinal+Cord+Motor+Neurons+by+Intrauterine+Delivery+of+Integration-Deficient+Lentiviral+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">High-Efficiency Transduction of Spinal Cord Motor Neurons by Intrauterine Delivery of Integration-Deficient Lentiviral Vectors.</a> Journal of Controlled Release. 273, 99-107 (2018).</li>
<li>Haddad, M., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+Brain-Directed+AAV+Gene+Therapy+Results+in+Rapid%2C+Robust%2C+and+Persistent+Transduction+of+Mouse+Choroid+Plexus+Epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Fetal Brain-Directed AAV Gene Therapy Results in Rapid, Robust, and Persistent Transduction of Mouse Choroid Plexus Epithelia.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2, 101(2013).</li>
<li>Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., MacKenzie, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21307829">A mouse model of in utero transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2303(2011).</li>
<li>Davey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jaagsiekte+Sheep+Retrovirus+Pseudotyped+Lentiviral+Vector-Mediated+Gene+Transfer+to+Fetal+Ovine+Lung%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Jaagsiekte Sheep Retrovirus Pseudotyped Lentiviral Vector-Mediated Gene Transfer to Fetal Ovine Lung.</a> Gene Therapy. 19 (2), 201-209 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przeszczep in utero jest potencjalną terapią wielu wad wrodzonych, które można zdiagnozować na wczesnym etapie ciąży. Mysi model wkładki domacicznej pozwala naukowcom badać środowisko płodu lub eksperymentować z różnymi terapiami. W zależności od tego, co jest wstrzykiwane i co jest celowane, dożylny lub doowodniowy przeszczep w macicy może zapewnić niezawodne dostarczenie iniekcji do pożądanej przestrzeni.
W przypadku celowania w konkretne narządy ważne jest, aby wybrać odpo...

Ostatnie postępy w badaniach prenatalnych i diagnostyce ujawniły możliwość leczenia płodu z powodu wielu wrodzonych zaburzeń, które nie mają odpowiednich opcji leczenia poporodowego i skutkują znaczną zachorowalnością i śmiertelnością. W szczególności przeszczepienie krwiotwórczych komórek macierzystych in utero (IUHCT) i terapia genowa/edycja genomu mogą potencjalnie wykorzystać normalne właściwości rozwojowe płodu do leczenia wrodzonych zaburzeń hematologicznych, immunologicznych i genetycznych skuteczniej niż może to zrobić postnatalny przeszczep HSC i terapia genowa/edycja genomu1,2. W szczególności, ze względu na mały rozmiar płodu, dawka komórki dawcy lub wektora wirusowego może być zmaksymalizowana w zależności od masy biorcy. Ponadto niedojrzałość immunologiczna płodu pozwala na wstrzykiwanie HSC dawcy bez kondycjonowania mieloablacyjnego i immunosupresyjnego, które jest wymagane w protokołach przeszczepów poporodowych. Podobnie, wektory wirusowe przenoszące terapeutyczną technologię transgenu lub edycji genomu mogą być wstrzykiwane bez ograniczającej odpowiedzi immunologicznej na produkt transgenu lub wektor wirusowy. Wreszcie, dostępność i proliferacyjny charakter płodowych komórek macierzystych/progenitorowych dają możliwość bardziej efektywnej transdukcji docelowych komórek progenitorowych, a także pewnych trybów edycji genomu (naprawy ukierunkowanej na homologię), które wymagają komórek cyklicznych, aby działały wydajnie. Model mysi służy jako wnikliwy i niedrogi sposób na znalezienie odpowiedzi na ważne pytania w biologii i immunologii komórek macierzystych przed eksperymentami na przedklinicznych dużych modelach zwierzęcych i jako taki służył jako podstawowy model, w którym badano IUHCT i terapię genową in utero1,2,3.
Chociaż wiele zmiennych odgrywa ważną rolę w sukcesie IUHCT i terapii genowej in utero/edycji genomu w modelach mysich i dużych zwierząt, kluczową zmienną jest metoda dostarczania HSC lub wektora wirusowego. Wykazano, że podawanie dużych dawek HSC dawcy z efektem pierwszego przejścia występującym w wątrobie płodu, narządzie krwiotwórczym w czasie IUHCT, odgrywa zasadniczą rolę w osiąganiu makrochimerycznych poziomów wszczepienia w modelach mysich i dużych modelach zwierzęcych4,5. Osiągnięto to poprzez wstrzyknięcie komórek dawcy przez żyłę witelinową w modelu mysim oraz poprzez wstrzyknięcie dosercowe w modelu psów. Droga wstrzyknięcia odgrywa również fundamentalną rolę w celowaniu w komórki progenitorowe różnych narządów podczas rozwoju. Na przykład wykazano, że wstrzyknięcie dożylne przez żyłę witeliny skutecznie transdukuje kardiomiocyty i hepatocyty po wstrzyknięciu w późnej ciąży6,7. Alternatywnie, doowodniowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych pozwala na celowanie w narządy, które są fizycznie narażone na podstawie fałdowania/rozwoju zarodka w momencie wstrzyknięcia8. Najlepszym przykładem jest celowanie w nabłonek dróg oddechowych poprzez wstrzyknięcie doowodniowe pod koniec ciąży w celu wykorzystania normalnych ruchów "oddychania" płodu, co naraża drogi oddechowe na wektor wirusowy w płynie owodniowym9. Te dwa tryby IUT, dożylnie przez żyłę żółtliwą i doowodniowo, były podstawą wielu przeszłych i trwających eksperymentów w naszym laboratorium. W niniejszym protokole szczegółowo opisujemy metody wykonywania dożylnej i wewnątrzowodniowej wkładki wewnątrzmacicznej w modelu mysim.

<table><tbody><tr><td>Rękawice</td><td>Cardinal Health</td><td>2D73DP65</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Adson z zębami</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Adson bez zębów</td><td>Fine Science Tools</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywione nożyczki</td><td>Fine Science Tools</td><td>14075-11</td><td></td></tr><tr><td>Ciężkie nożyczki</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-13</td><td></td></tr><tr><td>Sterownik do igieł</td><td>Fine Science Tools</td><td>12005-15</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl 2.0</td><td>Ethicon</td><td>JB945</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta transferowa</td><td>Medline</td><td>GSI135010</td><td></td></tr><tr><td>Aplikatory z bawełnianą końcówką</td><td>Medline</td><td>MDS202000</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Rurka stożkowa</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Taśma</td><td>3M</td><td>1527-1</td><td></td></tr><tr><td>Smar do oczu</td><td>Major LubriFresh</td><td>0904-6488</td><td></td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza</td><td>K& H</td><td>3060</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica</td><td>MZ16</td><td></td></tr><tr><td>Wtryskiwacz</td><td>Narishige HI01PK01</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szklane rurki kapilarne</td><td>Kimble</td><td>71900-100</td><td></td></tr><tr><td>Pionowy ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>Skośnik mikroelektrod</td><td>Sutter Instruments</td><td>BV-10</td><td></td></tr><tr><td>IM-300 Pneumatyczny mikrowstrzykiwacz</td><td>Narishige</td><td>IM-300</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa&nbsp;</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtr</td> 305935 <td>Genesee Scientific</td><td>25-244</td><td></td></tr><tr><td>Compac5 Aparat anestezjologiczny</td><td>VetEquip Compac5</td><td>901812&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal Critical Care</td><td>NDC 66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>Gaz N2</td><td>Gaz Airgas</td><td>NI 125</td><td></td></tr><tr><td>Gaz O2</td><td>Gaz powietrzny</td><td>OX 125</td><td></td></tr><tr><td>Wektor wirusowy Ad-GFP</td><td>Penn Vector Core</td><td>H5'.040.CMV.eGFP</td><td></td></tr></tbody></table>

przeszczepienie dożylne i owodniowe w macicy w modelu mysim

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Przeszczep in utero (IUT) to unikalny i wszechstronny sposób terapii, który może być wykorzystany do wprowadzenia komórek macierzystych, wektorów wirusowych lub innych substancji na wczesnym etapie ciąży. Uzasadnienie IUT do celów terapeutycznych opiera się na niewielkich rozmiarach płodu, niedojrzałości immunologicznej płodu, dostępności i proliferacyjnym charakterze komórek macierzystych lub progenitorowych płodu oraz możliwości leczenia choroby lub wystąpienia objawów przed urodzeniem. Wykorzystując te normalne właściwości rozwojowe płodu, dostarczanie krwiotwórczych komórek macierzystych (HSC) za pośrednictwem IUT może potencjalnie leczyć wrodzone zaburzenia hematologiczne, takie jak niedokrwistość sierpowatokrwinkowa, bez wymaganego kondycjonowania mieloablacyjnego lub immunosupresyjnego wymaganego do poporodowych przeszczepów HSC. Podobnie, dostępność komórek progenitorowych w wielu narządach podczas rozwoju potencjalnie pozwala na bardziej efektywne celowanie w komórki macierzyste/progenitorowe po założeniu wkładki wektorów wirusowych w celu terapii genowej lub edycji genomu. Dodatkowo wkładka domaciczna może być stosowana do badania prawidłowych procesów rozwojowych, w tym między innymi rozwoju tolerancji immunologicznej. Model mysi stanowi cenny i niedrogi sposób na zrozumienie potencjału i ograniczeń wkładki wewnątrzmacicznej przed przedklinicznymi badaniami na dużych zwierzętach i ostatecznym zastosowaniem klinicznym. W tym miejscu opisujemy protokół wykonywania wkładki wewnątrzmacicznej u mysiego płodu drogą dożylną i doowodniową. Protokół ten został z powodzeniem wykorzystany do wyjaśnienia niezbędnych warunków i mechanizmów stojących za przeszczepem krwiotwórczych komórek macierzystych in utero, indukcją tolerancji i terapią genową in utero.

Przeżywalność i sukces engraftmentu są ważnymi miernikami skuteczności eksperymentów IUHCT. W zależności od konkretnych punktów końcowych eksperymentu, płody, które otrzymały IUHCT, mogą być analizowane prenatalnie poprzez cięcie cesarskie lub postnatalnie. Średnio wskaźniki przeżywalności po iniekcjach dożylnych wynoszą od 75 - 100%. Wskaźniki przeżywalności po iniekcjach dojamniowych mają tendencję do bycia lepszymi niż w przypadku iniekcji dożylnych i wynoszą około 85 - 100%.
<p cl...

Opisujemy protokół przeprowadzania przeszczepu in utero (IUT) poprzez dożylne i dożylne drogi iniekcji w modelu mysim. Protokół ten może być stosowany do wprowadzania komórek, wektorów wirusowych i innych substancji do unikalnego środowiska płodu tolerancyjnego na odporność.

Przeszczepienie dożylne i owodniowe w macicy w modelu mysim

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu embriologii, terapii genowej i transplantacji komórek macierzystych. Zaletą tej techniki jest to, że umożliwia analizę wpływu różnych eksperymentalnych terapii na płody myszy. Tę procedurę zademonstrują lekarze Nicholas Ahn i Barbara Coons, lekarze i pracownicy naukowi w naszym laboratorium.Przed rozpoczęciem zabiegu wrzuć od pięciu do 10 mikrolitrów sterylnego PBS do i z końcówki igły chirurgicznej, dwa do trzech razy, aby oczyścić ją z wszelkich możliwych zanieczyszczeń. Następnie napełnij igłę odczynnikiem o odpowiedniej objętości i stężeniu doświadczalnym. I naciśnij trzykrotnie przycisk trybu na mikrowtryskiwaczu, aby przejść do ekranu kalibracji wtrysku.Dodaj interwały 10 lub 100 milisekund, aby dostosować czas wtrysku, a następnie naciśnij przycisk trybu jeszcze dwa razy. Naciśnij przycisk równowagi i naciśnij raz pedał nożny. Następnie ponownie nacisnąć pedał i ocenić, jaka objętość roztworu jest opróżniana z igły za jednym naciśnięciem.Gdy mikrowstrzykiwacz zostanie skalibrowany do odpowiedniej objętości eksperymentalnej, napełnij igłę do poziomu odpowiedniego do wstrzyknięcia. Po oczyszczeniu wszystkich igieł

intravenous-intra-amniotic-utero-transplantation-murine

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Wewnątrzmaciczna iniekcja in vivo oraz elektroporacja nowokory embrionalnego szczura stanowią potężne narzędzie do manipulacji pojedynczymi komórkami progenitorowymi...

Wewnątrzkomorowe wstrzykiwanie i elektroporacja in utero embrionów szczura w 16. dniu rozwoju (E16)

In-utero in-vivo iniekcja i elektroporacja zarodkowego neokortyksu myszy stanowią potężne narzędzie do manipulacji pojedynczymi komórkami progenitorowymi ...

Wewnątrzkomorowe wstrzyknięcie i elektroporacja in utero embrionów myszy w 15. dniu rozwoju (E15)

In utero operacje przeżycia u myszy umożliwiają molekularną manipulację ekspresją genów podczas rozwoju. W niniejszej pracy opisujemy wykorzystanie obrazowania ultradźwiękowego o wysokiej częstotliwości do prowadzenia iniekcji wektorów retrowirusowych do mózgu myszy w 9,5 dniu embrionalnym (E).

Mikroiniekcja do przedniego mózgu myszy in utero w dniu E9.5 pod kontrolą ultradźwięków

Myszowy model transplantacji in utero jest wszechstronnym narzędziem, które może być wykorzystywane do badania potencjalnych zastosowań klinicznych transplantacji komórek macierzystych oraz terapii genowej u płodu. W niniejszym protokole przedstawiamy ogólne podejście do wykonania tej...

Model mysi transplantacji in utero

Kontrola ekspansji somatycznych komórek macierzystych jest głównym czynnikiem utrudniającym ich badanie oraz zastosowanie w terapii. W niniejszym opracowaniu opisujemy system czasowej kontroli ekspansji neuronalnych komórek macierzystych podczas rozwoju oraz w wieku dorosłym, który może zostać wykorzystany do zwiększenia liczby neuronów generowanych w mózgu myszy.

Ekspansja embrionalnych i dorosłych komórek macierzystych układu nerwowego poprzez elektroporację in utero lub stereotaksycyjne wstrzyknięcie wirusowe

Transfer zarodków macicowo-jajowodowych wykorzystuje połączenie macicowo-jajowodowe jako barierę zapobiegającą odpływowi zarodka, który może wystąpić podczas transferu macicy. Mężczyźni poddani wazektomii są zobowiązani do pozyskania biorców pseudociężarnych do transferu zarodków. Omówiono obie techniki.

Transfer zarodka macicowo-jajowodowego i wazektomia w modelu mysim

Zwierzęce modele chorób dziecięcych mogą doświadczyć wczesnego początku i agresywnego postępu choroby. Klinicznie istotne podanie terapii młodym modelom myszy może być technicznie trudne. Protokół ten opisuje nieinwazyjną metodę wstrzykiwań dożylnych dla nowonarodzonych myszy w ciągu pierwszych dwóch dni życia po urodzeniu.

Wstrzyknięcia dożylne u nowonarodzonych myszy

Opracowaliśmy model zapalenia błony płodowej, aby symulować narażenie płodu na stan zapalny matki (FEMI) bez komplikacji związanych z żywymi organizmami, aby zbadać wpływ FEMI na rozwój przewodu pokarmowego potomstwa. Pozwala to na badanie mechanistycznych przyczyn rozwoju uszkodzenia jelit po zapaleniu błony płodowej.

Mysi model narażenia płodu na stan zapalny matki w celu zbadania wpływu ostrego zapalenia błony płodowej na rozwój jelit noworodka

W tym protokole opisujemy, jak wstrzyknąć lentiwirusowi do mysiej jamy owodniowej w E7.5, prowadząc do jednolitej transdukcji całej płytki nerwowej, przy minimalnym szkodliwym wpływie na przeżycie lub rozwój embrionalny.

Celowanie w mysią płytkę nerwową za pomocą nanoiniekcji in utero (NEPTUNE) w 7. dniu embrionalnym

W tym badaniu opisujemy prostą metodę przeprowadzania analizy Evans Blue Dye (EBD) na larwach danio pręgowanego.  Technika ta jest potężnym narzędziem do charakteryzowania integralności mięśni szkieletowych i wyznaczania modeli dystrofii mięśniowej danio pręgowanego, a także jest cenną metodą opracowywania nowych metod terapeutycznych.

Analiza integralności mięśni szkieletowych larw danio pręgowanego za pomocą niebieskiego barwnika Evansa

Poznaj technikę przeszczepienia dożylnego i owodniowego w macicy myszy, umożliwiającą wprowadzanie komórek i wektorów wirusowych w tolerancyjnym immunologicznie środowisku płodowym.

Przeszczepienie dożylne i owodniowe w macicy w modelu mysim

Przeglądaj więcej filmów