Transdermalny pomiar szybkości filtracji kłębuszkowej u myszy

Dzisiaj zademonstrujemy technikę transdermalnego pomiaru filtracji kłębuszkowej lub tGFR u myszy. Jest kilka cech tej metody, o których myślę, że warto wspomnieć. Po pierwsze, obecnie tGFR jest najdokładniejszym sposobem oceny funkcji nerek u myszy.

Po drugie, tGFR jest wykonywany u przytomnych, swobodnie poruszających się myszach, dzięki czemu pozwala uniknąć powikłań znieczulenia. Po trzecie, po opanowaniu tej techniki rozsądnie jest być w stanie wykonać od 30 do 40 pomiarów tGFR w ciągu jednego dnia. Wreszcie, pomiary tGFR mogą być wykonywane wielokrotnie na myszach in vitro.

Oznacza to, że możemy wykonywać seryjne pomiary czynności nerek w stanach ostrych i przewlekłych. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona naukowcom mierzyć współczynnik filtracji kłębuszkowej lub GFR u świadomych, swobodnie poruszających się myszy z dużą precyzją i czułością. Jeden do dwóch dni przed pomiarem tGFR, po potwierdzeniu braku reakcji na uszczypnięcie palca, umieść znieczuloną mysz w pozycji leżącej na poduszce grzewczej.

Za pomocą golarki elektrycznej przycinaj w kierunku przeciwnym do kierunku wzrostu, aby usunąć większość sierści z jednej strony grzbietu myszy, od górnej części tylnych nóg do szyi i w poprzek żeber. Za pomocą wacika nałóż cienką warstwę kremu do depilacji na odsłoniętą skórę w kierunku przeciwnym do kierunku wzrostu, aby upewnić się, że krem jest nakładany jak najbliżej skóry i usuń krem po jednej do trzech minut czystymi wacikami i ciepłą wodą. W dniu zabiegu przyciąć plaster samoprzylepny o wymiarach sześć na trzy centymetry do rozmiaru urządzenia GFR, a następnie odkleić tylną część plastra i przykleić urządzenie do samoprzylepnej strony plastra za pomocą diod elektroluminescencyjnych umieszczonych bezpośrednio nad przezroczystym okienkiem.

Następnie przyklej mały kawałek plastra do baterii. Aby przymocować monitor, gdy znieczulona mysz znajduje się w pozycji leżącej, oczyść wstępnie ogoloną skórę 70% etanolem i dostosuj szerokość około 12-centymetrowego kawałka taśmy, rozrywając go wzdłuż. Umieść taśmę pod myszą tak, aby dwa centymetry z jednej strony zwierzęcia składały się na jednej krawędzi prawej strony taśmy, aby ułatwić umieszczanie i zdejmowanie po pomiarze.

Następnie podłącz baterię do urządzenia, zdejmując podkład z baterii i bezpiecznie umieszczając baterię na urządzeniu. Urządzenie jest gotowe do użycia, a akwizycja danych rozpoczyna się, gdy niebieskie diody LED zaczną migać. Usuń podkład z łatki na urządzeniu i umieść urządzenie na ogolonej skórze tak, aby okienko odsłaniające diody LED znajdowało się nad żebrami zabezpieczającymi prawą stronę urządzenia taśmą.

Ważne jest, aby zapewnić bezpieczne mocowanie urządzenia, nie ograniczając ruchomości myszy ani nie wywierając zbyt dużego nacisku na skórę. Następnie mocno owiń lewą stronę taśmy wokół myszy i urządzenia. Pozwól urządzeniu nagrywać stały odczyt tła przez trzy minuty.

W międzyczasie należy ogrzać ogon poduszką pod głowę i załadować strzykawkę insulinową odpowiednią eksperymentalną objętością FITC-sinistriny do wstrzyknięcia, zaokrągloną do najbliższych 10 mikrolitrów. FITC-sinistrin należy podawać dożylnie w jednym płynnym, ale szybkim bolusie. Ważne jest, aby użytkownik czuł się komfortowo z wstrzyknięciami dożylnymi, ponieważ konieczne jest skuteczne podanie FITC-sinistrin w jednym bolusie, a nie w kilku próbach, co spowoduje wiele pików na krzywej klirensu.

Aby zmierzyć tGFR, umieść mysz w jej własnej klatce z monitorowaniem do pełnego leżenia i pozwól, aby klirens FITC-sinistrin był rejestrowany przez 1,5 godziny. Pod koniec okresu pomiaru umieść mysz na ruszcie na górze klatki i pozwalając myszy chwycić metalowe pręty, przeciągnij taśmę od spodu brzucha jednym szybkim, płynnym ruchem. Następnie usuń taśmę z urządzenia i plaster ze skóry, uważając, aby bateria nie odłączyła się od urządzenia i umieść mysz z powrotem w klatce.

Aby ocenić dane, ostrożnie odłącz baterię i użyj USB, aby podłączyć urządzenie do komputera. Otwórz oprogramowanie do czytania i kliknij Połącz, Przeczytaj, Zmień nazwę i Zapisz. Następnie zamknij program i proces oraz oceń dane w oprogramowaniu analitycznym zgodnie z instrukcjami producenta.

Podczas gdy FITC-sinistryna jest szybko usuwana z krążenia u zdrowych myszy, klirens ten jest dramatycznie opóźniony u myszy z ostrym uszkodzeniem nerek. U myszy z bardzo ciężkim ostrym uszkodzeniem nerek może wystąpić bardzo mały lub żaden klirens fluorescencji FITC-sinistryny przez cały 90-minutowy okres pomiaru, co wskazuje na całkowity brak filtracji kłębuszkowej. Transdermalny pomiar GFR jest minimalnie inwazyjny i dlatego może być stosowany do monitorowania zmian w czynności nerek u poszczególnych zwierząt w wielu punktach czasowych.

Rzeczywiście, w tym reprezentatywnym eksperymencie sekwencyjne pomiary wykazały zmiany w funkcji nerek po zero, trzem, dwóch i czterech dniach po niedokrwieniu uszkodzenia reperfuzyjnego. W tym mysim modelu przewlekłej choroby nerek odwrotna zależność okresu półtrwania FITC-sinistryny do GFR może być bezpośrednio skorelowana z upośledzoną funkcją nerek obserwowaną u tych zwierząt. Rzeczywiście, okres półtrwania FITC-sinistryny ściśle koreluje z półilościową oceną histologiczną uszkodzenia kanalików w pełnym zakresie pomiarów GFR u myszy nieuszkodzonych i u myszy o różnym nasileniu ostrego uszkodzenia nerek wywołanego uszkodzeniem reperfuzyjnym niedokrwiennym.

W przeciwieństwie do tego, kreatynina w surowicy i azot mocznikowy we krwi wykazują dodatnią, ale słabszą korelację z klirensem FITC-sinistriny, co wskazuje, że przezskórne pomiary GFR zapewniają bardziej wiarygodną miarę uszkodzenia nerek niż kreatynina w surowicy lub azot mocznikowy we krwi. Transdermalny pomiar GFR jest bardziej czułą miarą czynności nerek niż tradycyjne biomarkery, takie jak kreatynina i BUN. Zapewnia to dokładniejszą ocenę skuteczności nowych terapii chorób nerek w badaniach przedklinicznych.

Najbardziej krytycznymi krokami w tej metodzie są prawidłowe przymocowanie urządzenia do grzbietu myszy i pomyślne podanie dożylnie FITC-sinistrin. Te kroki są niezbędne do uzyskania dokładnej oceny GFR u myszy.