Name: Analiza 3D wielokomórkowych odpowiedzi na gradienty chemoatraktantu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Poznaj metodę analizy odpowiedzi komórkowych w trójwymiarowych mikrośrodowiskach z zdefiniowanymi gradientami chemoatraktantów. Technika wykorzystuje urządzenia PDMS do badań nad organoidami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty dla AJE (NSF PD-11-7246, Breast Cancer Research Foundation (BCRF-17-048), oraz NCI U54 CA210173) i AL (U54CA209992).

Wszystkie prace nad zwierzętami były prowadzone zgodnie z protokołami sprawdzonymi i zatwierdzonymi przez Institutional Animal Care and Use Committee, Johns Hopkins University, School of Medicine.
1. Produkcja urządzenia mezofluidycznego
<ol>
	<li>Zaprojektuj maskę formy do urządzenia PDMS za pomocą oprogramowania CAD 3D.</li>
	<li>Wydrukuj formę za pomocą sprzętu stereolitograficznego z żywicą odporną na wysoką temperaturę. 
	UWAGA: Opisane tutaj procedury zostały przeprowadzone przez komercyjną usługę druku 3D.</li>
	<li>Dokładnie wymieszaj roztwór monomeru PDMS z utwardzaczem w stosunku 10:1. Do wytworzenia urządzenia potrzebne były 3 ml mieszaniny PDMS. Całkowita objętość zależy od liczby form do wyprodukowania.</li>
	<li>Odgazować mieszaninę poprzez zastosowanie próżni przy użyciu własnej laboratoryjnej pompy próżniowej lub pompy próżniowej w eksykatorze próżniowym przez 1 godzinę.</li>
	<li>Przetrzyj powierzchnię formy taśmą klejącą, aby usunąć kurz, a następnie wlej mieszaninę PDMS do formy. Jeśli w procesie zostaną wprowadzone pęcherzyki, należy powtórzyć odgazowanie w eksykatorze próżniowym. Bąbelki uwięzione między filarami formy można usunąć, kłując je ostrą igłą. 
	UWAGA: Proces odgazowywania w temperaturze pokojowej powinien nastąpić w ciągu 1 godziny lub krócej.</li>
	<li>Utwardzać PDMS przez ogrzewanie w temperaturze 80 °C przez 2 godziny. Pozwól formie ostygnąć w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przetnij granicę między formą a PDMS za pomocą ostrza, a następnie ostrożnie oderwij PDMS od formy.</li>
	<li>Przytnij część PDMS tak, aby pasowała do szkiełka nakrywkowego 22 mm x 22 mm i wybij otwór na wlocie. 
	UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.</li>
	<li>Wyczyść część PDMS i szkiełko nakrywkowe 22 mm x 22 mm, przecierając powierzchnie chusteczkami o niskiej zawartości kłaczków i 70% etanolem. Następnie usuń duże cząsteczki kurzu, przecierając je taśmą klejącą.</li>
	<li>Wysterylizuj część PDMS i szkiełko nakrywkowe przez autoklawowanie (121 °C przez 8 minut na mokro, 15 minut na sucho) lub przez wystawienie na działanie światła UV przez 1 godzinę.</li>
	<li>Poddaj dolną powierzchnię części PDMS i szkiełko nakrywkowe pistoletem do wyładowań koronowych przez 5 minut w kapturze do hodowli tkankowych, a następnie połącz je ze sobą. 
	UWAGA: Połóż na dnie dowolny materiał nieprzewodzący, taki jak pianka polistyrenowa, i usuń wszystkie materiały przewodzące podczas tego procesu. Natychmiast po zabiegu, w ciągu 5 minut, wstrzyknąć kolagen do urządzenia, aby zwiększyć wiązanie między żelem kolagenowym a szkiełkiem nakrywkowym.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek: pierwotna izolacja organoidów sutkowych
UWAGA: Szczegóły dotyczące izolacji organoidów sutkowych można znaleźć w poprzednim worku11. Każdy rodzaj pojedynczej komórki lub organoidu może być przygotowany zgodnie z własnymi protokołami izolacji/odłączenia.
<ol>
	<li>Tkankę gruczołu sutkowego myszy rozdrobnić skalpelem, aż tkanka się rozluźni i potrząsać nią przez 30 minut w temperaturze 37 °C w 50 ml roztworu kolagenazy/trypsyny (10 ml na mysz) w DEME/F12 uzupełnionym 0,1 g trypsyny, 0,1 g kolagenazy, 5 ml FBS, 250 μl 1 μg/ml insuliny, i 50 μl 50 μg/ml gentamycyny.</li>
	<li>Odwirować roztwór kolagenazy/trypsyny o stężeniu 1,250 x g przez 10 minut. Usunąć supernatant przez aspirację. Rozproszyć komórki w 10 ml DMEM/F12 i odwirować przy 1 250 x g przez 10 minut. Po usunięciu DMEM/F12 przez aspirację, ponownie zawiesić komórki w 4 ml DMEM/F12 uzupełnionym 40 μl DNazy (2 jednostki/μL).</li>
	<li>Potrząsać roztworem DNazy ręcznie przez 2-5 minut, a następnie odwirowywać przy 1 250 x g przez 10 minut.</li>
	<li>Oddzielić organoidy od pojedynczych komórek za pomocą czterech wirowań różnicowych (impuls do 1 250 x g i zatrzymanie wirówki na 3-4 s po osiągnięciu zamierzonej prędkości). Pomiędzy każdym impulsem odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml DMEM/F12.</li>
	<li>Ponownie zawiesić końcowy osad w żądanej ilości pożywki wzrostowej DMEM/F12 z 1% penicyliny/streptomycyny i 1% insulinotransferyny-selenu-X do przygotowania kolagenu.</li>
</ol>
3. Przygotowanie i iniekcja kolagenu
UWAGA: Inne rodzaje żeli ECM mogą być przygotowane zgodnie z własnymi protokołami żelowania.
<ol>
	<li>Przygotować roztwór kolagenu typu I (3,78 mg / ml), 10x DMEM, 1 N roztwór NaOH, normalne podłoże wzrostowe na lodzie. 
	UWAGA: Trzymaj na lodzie do momentu zakończenia procedury.</li>
	<li>Dodać 6 μl 1 N roztworu NaOH, 200 μl pożywki wzrostowej i 50 μl 10x DMEM do wstępnie schłodzonej probówki mikrowirówkowej i dokładnie wymieszać roztwór.</li>
	<li>Dodać 425 μl kolagenu do wstępnie zmieszanego roztworu i dokładnie wymieszać pipetując.</li>
	<li>Odwiruj mieszaninę kolagenu przez krótki czas (mniej niż 5 sekund), aby oddzielić i usunąć pęcherzyki z mieszaniny.</li>
	<li>Trzymaj zneutralizowany roztwór kolagenu na lodzie przez 1 godzinę, aby wywołać tworzenie się błonnika.</li>
	<li>Dodać 50 μl zawiesiny komórkowej do mieszaniny kolagenowej i dokładnie wymieszać. 
	UWAGA: Końcowe stężenie kolagenu wynosi 2 mg/mL.</li>
	<li>Wstrzyknąć roztwór za pomocą pipety o pojemności 200 μl przez wlot urządzenia PDMS, aż cała komora zostanie wypełniona. Jeśli mieszanina kolagenu przelewa się przez szczeliny filarów, po żelowaniu wytnij nadmiar żelu kolagenowego ostrym ostrzem chirurgicznym.</li>
	<li>Przechowywać urządzenie w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 1 godzinę w celu wywołania żelowania.</li>
	<li>Napełnij zbiorniki po obu stronach pożywką wzrostową i utrzymuj urządzenie w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 do czasu wykonania obrazowania konfokalnego.</li>
</ol>
4. 3D obrazowanie i kwantyfikacja
<ol>
	<li>Zainstalować komorę do obrazowania żywych komórek do mikroskopu konfokalnego i wstępnie ustawić temperaturę i CO2 do 37 °C i 5%. Aby uzyskać wilgotność, dodaj wodę do zbiornika komory i w razie potrzeby umieść w komorze wilgotne chusteczki.</li>
	<li>Umieścić urządzenie PDMS w komorze i dodać EGF do jednego ze zbiorników jako "źródło" EGF w formacji gradientowej. Drugi zbiornik będzie służył jako "pochłaniacz" niezbędny do opracowania przestrzennie stopniowanej dystrybucji EFG. W tym badaniu do zlewu dodano 2,5 nM EGF, aby uzyskać gradient 0,5 nM/mm.</li>
	<li>Ustaw zakres stosu Z obejmujący objętość interesujących organoidów i rozpocznij obrazowanie. 
	UWAGA: Aby uniknąć fototoksyczności, wypróbuj niższą intensywność lasera w obrazowaniu konfokalnym lub użyj technik obrazowania wielofotonowego.</li>
	<li>Zrekonstruuj obraz 3D ze stosów obrazów 2D za pomocą komercyjnego oprogramowania lub niestandardowego programu. Zmierz długość i kąt gałęzi wystających z organoidów lub migracji poszczególnych komórek. Tutaj wykonaj kwantyfikację, rysując odręczny kontur wokół ciała organoidu za pomocą ImageJ.</li>
</ol>

<ol><li>Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+and+extracellular+matrix+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).</li>
<li>Schwartz, M. A., Schaller, M. D., Ginsberg, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins%3A+emerging+paradigms+of+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrins: emerging paradigms of signal transduction.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 11, 549-599 (1995).</li>
<li>Yin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Stem+Cell+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Engineering Stem Cell Organoids.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).</li>
<li>Doyle, A. D., Carvajal, N., Jin, A., Matsumoto, K., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+3D+matrix+microenvironment+regulates+cell+migration+through+spatiotemporal+dynamics+of+contractility-dependent+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Local 3D matrix microenvironment regulates cell migration through spatiotemporal dynamics of contractility-dependent adhesions.</a> Nature Communications. 6, 8720(2015).</li>
<li>Meyvantsson, I., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+models+in+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Analytical+Chemistry+%28Palo+Alto%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Cell culture models in microfluidic systems.</a> Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 423-449 (2008).</li>
<li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li>
<li>Zervantonakis, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+microfluidic+model+for+tumor+cell+intravasation+and+endothelial+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13515-13520 (2012).</li>
<li>Barkefors, I., Thorslund, S., Nikolajeff, F., Kreuger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluidic+device+to+study+directional+angiogenesis+in+complex+tissue+and+organ+culture+models%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A fluidic device to study directional angiogenesis in complex tissue and organ culture models.</a> Lab on a Chip. 9 (4), 529-535 (2009).</li>
<li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+lapse+investigation+of+antibiotic+susceptibility+using+a+microfluidic+linear+gradient+3D+culture+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device.</a> Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).</li>
<li>Ellison, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+communication+enhances+the+capacity+of+cell+ensembles+to+sense+shallow+gradients+during+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), E679-E688 (2016).</li>
<li>Nguyen-Ngoc, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+culture+assays+of+murine+mammary+branching+morphogenesis+and+epithelial+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion.</a> Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Produkcja form PDMS została wykonana przy użyciu komercyjnej usługi druku 3D, ale może być również wykonana przez wysokiej klasy drukarkę 3D we własnym zakresie. Wśród różnych metod wytwarzania 3D, stereolitografia jest zalecana do generowania form w wysokiej rozdzielczości. Ponieważ utwardzanie PDMS odbywa się w wysokiej temperaturze (80 °C), materiały powinny być wystarczająco odporne termicznie, co powinno być wyraźnie określone, jeśli druk jest zlecany na zewnątrz. Termiczne utwardzanie końcowe można omówić z firmą p...

W środowisku fizjologicznym, komórki są osadzone w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i wystawione na działanie mnóstwa biomolekuł. Interakcje między komórkami a otaczającym je mikrośrodowiskiem regulują procesy wewnątrzkomórkowe kontrolujące różne fenotypy, w tym migrację, wzrost, różnicowanie i przetrwanie1,2. Wiele dowiedziano się o zachowaniach komórkowych w konwencjonalnej hodowli komórkowej 2D. Jednak wraz z pojawieniem się obrazowania przyżyciowego i eksperymentów z komórkami osadzonymi w hydrożelach 3D, zauważono ważne różnice w zachowaniu komórek w uproszczonych kulturach 2D in vitro vs. 3D środowiskach tkankopodobnych. Podczas gdy komórki oddziałują z włóknami ECM i wyczuwają ich właściwości mechaniczne w matrycy 3D, sztywność materiału żelu nie jest w pełni niezależną zmienną w systemie 2D in vitro. Wymiarowość zmienia tworzenie się zrostów ogniskowych, co skutkuje różną morfologią i zachowaniem komórek. Co więcej, komórki na powierzchni 2D są narażone na mniej sygnałów sygnalizacyjnych niż komórki otwarte na wszystkie kierunki w 3D.
Te ograniczenia zwiększyły zainteresowanie systemami 3D, które reprezentują przestrzenną i chemiczną złożoność żywych tkanek i lepiej przewidują funkcje tkanek in vivo. Zostały one opracowane w wielu formach, od organoidów jako samoorganizujących się mikrostruktur komórkowych po komórki losowo przeplatane w ECM3,4. Ostatnie postępy w technologiach mikroprodukcji ułatwiły pojawienie się różnych typów systemów hodowli 3D5,6,7,8,9 do badania zmian fenotypowych i odpowiedzi komórkowych na sygnały rozpuszczalne; Bariery technologiczne ograniczają jednak powszechne zastosowanie w laboratoriach badawczych. W wielu przypadkach procesy produkcyjne wymagają technik fotolitografii i podstawowej wiedzy w zakresie miękkiej litografii. Co więcej, różne czynniki muszą być kontrolowane, aby pomyślnie zbudować urządzenie i osiągnąć optymalną funkcję urządzenia przez długi okres czasu.
Nasza metoda opisuje, jak skonstruować urządzenie 3D PDMS do włączania komórek i organoidów wielokomórkowych do mikrośrodowiska 3D ze zdefiniowanymi gradientami chemoatraktantu, a następnie analizować odpowiedzi nabłonkowe na EGF10. Nasze dane pokazują, że zdolność organoidów do reagowania na płytkie gradienty EGF wynika z międzykomórkowego sprzężenia chemicznego poprzez połączenia szczelinowe. Sugeruje to potencjał organoidów w zakresie bardziej precyzyjnego wykrywania słabych i hałaśliwych, przestrzennie stopniowanych danych wejściowych. Proces produkcji nie wymaga pomieszczenia czystego ani technik fotolitografii. Jednak urządzenie 3D PDMS zawiera niezbędne czynniki środowiska fizjologicznego 3D. Ta metoda będzie pomocna w badaniu zachowań komórkowych 3D i ma ogromny potencjał badawczy z różnymi typami komórek, chemoatraktantami i kombinacjami ECM.

<table><tbody><tr><td>Szkiełko nakrywkowe 22mm x 22mm&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen I, Szczur</td><td>Fisher Scientific</td><td>CB-40236</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>COMSOL Multiphysics 4.2</td><td>COMSOL Inc</td><td></td><td>Służy do symulacji dynamiki dyfuzji</td></tr><tr><td>10x DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2429</td><td></td></tr><tr><td>DEME/F12</td><td>Thermo Fisher</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4623</td><td></td></tr><tr><td>EGF Rekombinowane białko myszy</td><td>Thermo Fisher</td><td>PMG8041</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Technologie życia</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Fidżi-ImageJ</td><td></td><td></td><td>Służy do pomiaru długości i kątów rozgałęzień</td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>GIBCO&nbsp;</td><td>5750-060</td><td></td></tr><tr><td>IMARIS</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19278</td><td></td></tr><tr><td>Insulina-Transferyna-Selen-X</td><td>GIBCO&nbsp;</td><td>51500</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczka</td><td></td>higieniczna <td>Kimberly-Clark Professional</td><td>Kimtech</td></tr><tr><td>Materiał formy</td><td>Proto labs</td><td>Accura SL5530&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt do drukowania form</td><td>Proto labs</td><td>Stereolithogrphy</td><td>Maksymalny wymiar: 127 mm x 127 mm x 63,5 mm, Grubość warstwy: 0,0254 mm</td></tr><tr><td>Usługa drukowania form</td><td>Proto labs</td><td>Niestandardowe</td><td>https://www.protolabs.com/</td></tr> <tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2770</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>VWR</td><td>16777-164P</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny wirujący dysk mikroskop</td><td>Solamere Technology Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>184 SIL ELAST KIT&nbsp;</td><td>Zestaw PDMS</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9935</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza 3d wielokomórkowych odpowiedzi na gradienty chemoatraktantu

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Różne ograniczenia systemów hodowli komórkowych 2D wzbudziły zainteresowanie platformami do hodowli i analizy komórek 3D, które lepiej naśladowałyby przestrzenną i chemiczną złożoność żywych tkanek i naśladowały funkcje tkanek in vivo. Ostatnie postępy w technologiach mikrowytwarzania ułatwiły opracowanie środowisk 3D in vitro, w których komórki mogą być zintegrowane z dobrze zdefiniowaną macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) i zdefiniowanym zestawem rozpuszczalnych lub związanych z matrycą biomolekuł. Bariery technologiczne ograniczyły jednak ich powszechne zastosowanie w laboratoriach badawczych. W tym miejscu opisujemy metodę konstruowania prostych urządzeń do hodowli 3D i eksperymentowania z komórkami i organoidami wielokomórkowymi w mikrośrodowiskach 3D o określonym gradieniu chemoatraktantu. Ilustrujemy wykorzystanie tej platformy do analizy odpowiedzi komórek nabłonkowych i organoidów na gradienty czynników wzrostu, takich jak naskórkowy czynnik wzrostu (EGF). Gradienty EGF były stabilne w urządzeniach przez kilka dni, co prowadziło do ukierunkowanego tworzenia się gałęzi w organoidach piersi. Ta analiza pozwoliła nam stwierdzić, że zbiorowe wykrywanie gradientu przez grupy komórek jest bardziej czułe w porównaniu z pojedynczymi komórkami. Opisano również metodę wytwarzania, która nie wymaga zaplecza fotolitograficznego ani zaawansowanych technik miękkiej litografii. Metoda ta będzie pomocna w badaniu zachowań komórkowych 3D w kontekście analizy rozwoju i stanów patologicznych, w tym nowotworów.

EGF jest niezbędnym regulatorem morfogenezy rozgałęzionej w gruczołach mlekowych oraz krytycznym chemoatraktantem kierującym migrację komórek nabłonkowych piersi podczas inwazyjnego wzrostu nowotworu. Wykorzystaliśmy opisane powyżej mezoskopowe urządzenia mikroprzepływowe do badania odpowiedzi komórek na określone gradienty EGF (Rycina 1A,B)10. Urządzenie tworzy obszar hodowlany o szerokości 5 mm, długości 10 mm i wyso...

Opisujemy metodę konstruowania urządzeń do hodowli 3D i eksperymentowania z komórkami i organoidami wielokomórkowymi. Urządzenie to umożliwia analizę odpowiedzi komórkowych na sygnały rozpuszczalne w mikrośrodowiskach 3D ze zdefiniowanymi gradientami chemoatraktantu. Organoidy są lepsze niż pojedyncze komórki w wykrywaniu słabych hałaśliwych sygnałów.

Analiza 3D wielokomórkowych odpowiedzi na gradienty chemoatraktantu

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Różnice w uproszczonych kulturach 2D in vitro w porównaniu ze środowiskami 3D podobnymi do tkanek zwiększyły zainteresowanie systemami 3D do przedstawiania przestrzennej i chemicznej złożoności żywych tkanek. Proces produkcji nie wymaga zaplecza ani technik fotolitografii. Jednak urządzenie 3D PDMS zawiera niezbędne wektory do zastosowań w środowisku fizjologicznym 3D.Do przygotowania urządzenia mezofluidycznego należy użyć odpowiedniego trójwymiarowego oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo, aby zaprojektować maskę formy dla urządzenia z polidimetylosiloksanu lub PDMS i wydrukować formę za pomocą sprzętu do litografii stereo z żywicą termoodporną. Gdy forma jest gotowa, z grubsza wymieszaj trzy mililitry roztworu monomeru PDMS na formę ze środkiem utwardzającym w stosunku 10 do jednego i użyj próżni do odgazowania mieszaniny w eksykatorze próżniowym przez godzinę. Pod koniec wysuszania użyj kawałka taśmy klejącej, aby usunąć kurz z powierzchni formy i ostrożnie napełnij formę odgazowanym roztworem PDMS.Następnie utwardź PDMS w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez dwie godziny, zanim forma ostygnie w temperaturze pokojowej. Gdy forma schłodzi się w dotyku, użyj ostrza, aby przeciąć granicę między formą a PDMS i ostrożnie oderwij PDMS od formy. Przytnij PDMS, aby pasował do szkiełka nakrywkowego o wymiarach 22 na 22 milimetry i wybij otwór na wlocie.Używając chusteczek higienicznych o niskiej zawartości kłaczków i 70% etanolu, wytrzyj urządzenie i szkiełko nakrywkowe, a następnie przetrzyj urządzenie nowym kawałkiem taśmy samoprzylepnej, aby usunąć wszelkie duże cząsteczki kurzu. Następnie autoklaw urządzenia PDMS i szkiełko nakrywkowe w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez osiem minut na mokro i 15 minut na sucho, a następnie potraktuj dolną powierzchnię części PDMS i szkiełko nakrywkowe pistoletem do wyładowań koronowych przez pięć minut w kapturze do hodowli tkankowych przed połączeniem kawałków ze sobą. Aby załadować urządzenie, należy najpierw ponownie zawiesić interesujące je komórki w odpowiedniej objętości pożywki wzrostowej uzupełnionej 1%penicyliną i streptomycyną oraz 1%insulinotransferyną-selenem-x.Następnie wymieszaj 50 mikrolitrów zawiesiny komórek gruczołu mlekowego z 425 mikrolitrami świeżo przygotowanego zneutralizowanego roztworu kolagenu i napełnij pipetę o pojemności 200 mikrolitrów zawiesiną komórek kolagenowych. Wstrzyknąć zawiesinę przez wlot do urządzenia PDMS, aż cała komora zostanie wypełniona i umieścić urządzenie w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla na jedną godzinę w celu wywołania żelowania przed napełnieniem zbiorników po obu stronach pożywką wzrostową i zwrócić urządzenie do inkubatora do czasu obrazowania konfokalnego. W przypadku obrazowania 3D i kwantyfikacji zainstaluj komorę do obrazowania żywych komórek na mikroskopie konfokalnym i ustaw temperaturę i dwutlenek węgla odpowiednio na 37 stopni Celsjusza i 5%.Dodaj wodę do zbiornika komory obrazowania, aby nawilżyć komorę, w razie potrzeby umieszczając mokre chusteczki w komorze i umieść urządzenie PDMS w komorze. Dodać naskórkowy czynnik wzrostu do jednego ze zbiorników jako źródło czynnika w tworzeniu gradientu, pozostawiając drugi zbiornik, aby służył jako zlew dla rozwoju przestrzennie stopniowanego rozkładu naskórkowego czynnika wzrostu. Następnie ustaw zakres stosu Z obejmujący objętość interesujących organoidów i rozpocznij obrazowanie.Na zakończenie eksperymentu użyj odpowiedniego programu do analizy obrazu, aby zmierzyć długość i kąt gałęzi wychodzących z organoidów lub migracji poszczególnych komórek. Zarówno testy in silico, jak i in vitro wykazały tworzenie się stabilnego liniowego gradientu naskórkowego czynnika wzrostu w całym obszarze hodowli komórkowej, który utrzymuje się przez około dwa dni bez uzupełniania zbiorników źródłowych lub zlewczych, co sugeruje, że naskórkowy czynnik wzrostu, białko o mocy 6,4 kilodaltonu, może tworzyć stabilny gradient oparty na dyfuzji w żelu kolagenowym przygotowanym, jak wykazano w stosunkowo krótkim czasie. Organoidy sutkowe tworzą wiele gałęzi w obecności przestrzennie jednorodnego 2,5-nanomolowego naskórkowego czynnika wzrostu bez odchylenia kierunkowego w ciągu trzech dni, jeśli naskórkowy czynnik wzrostu zostanie dodany w gradiencie liniowym, aby uzyskać 0,5 nanomola na mililitr.Jednak formacja gałęzi wykazuje znaczne odchylenie kierunkowe. Warto zauważyć, że dodanie inhibitorów połączeń szczelinowych hamuje zdolność organoidów do reagowania na gradient. pH roztworu kolagenu ma kluczowe znaczenie dla żelowania i żywotności komórek.Jeśli kolagen nie zostanie zneutralizowany przed zmieszaniem, żywotność komórek będzie niska. Metoda ta może zostać rozszerzona w celu dostosowania do bardziej realistycznego modelowania tkanek i może pomieścić tworzenie sieci naczyniowej z pojedynczych komórek w żelu.

3d-analysis-of-multi-cellular-responses-to-chemoattractant-gradients

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Niniejszy protokół opisuje opracowanie urządzenia mikroprzepływowego do badania chemotaksji bakteryjnej w stabilnych gradientach stężeń chemoefektorów.

Urządzenie mikroprzepływowe do ilościowego oznaczania chemotaksji bakteryjnej w stabilnych gradientach stężeń

Opisano metodę analizy migracji wyizolowanych komórek (komórek grzbietu neuronalnego tułowia). Metoda ta jest niedroga, łagodna i pozwala odróżnić chemotaksję zarówno od chemokinezy, jak i od innych czynników wpływających na polaryzację migracyjną, takich jak oddziaływania międzykomórkowe w pierwotnej kulturze komórek grzbietu neuronalnego tułowia.

Analiza migracji komórek grzbietowych neuralnych tułowia z wykorzystaniem zmodyfikowanego testu w komorze Zigmonda

Ten film demonstruje test chemotaksji neutrofili przy użyciu metody all-on-chip. Metoda ta pozwala na bezpośrednią izolację neutrofili z krwi pełnej poprzez immunomagnetyczną selekcję ujemną, a następnie test chemotaksji na chipie mikroprzepływowym.

Mikroprzepływowa metoda oparta na chipie do szybkiej analizy chemotaksji neutrofili przy użyciu krwi pełnej

Opisano metodę montażu adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów w komorze mikroskopowej do badań migracji żywych komórek. Zaprojektowane środowisko łączy powierzchnie przeciwporostowe i ścieżki adhezyjne z gradientami roztworu, a tym samym pozwala określić względne znaczenie wskazówek naprowadzających.

Tworzenie adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów do obrazowania migracji komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Trójwymiarowa komora przepływowa to nowatorska technologia in vitro do ilościowej i stopniowej oceny kaskady wynaczynień komórek krążących w warunkach fizjologicznego stresu ścinającego. W związku z tym urządzenie spełnia krytyczną potrzebę podstawowych, przedklinicznych i klinicznych badań migracji komórek.

Nowatorskie trójwymiarowe urządzenie z komorą przepływową do badania wynaczynienia komórek krążących w fizjologicznych warunkach przepływu kierowanego przez chemokinę

Migracja komórek jest ważną częścią rozwoju i życia człowieka. Aby zrozumieć mechanizmy, które mogą zmieniać migrację komórek, przedstawiamy planarny system dyfuzji gradientowej do badania chemotaksji w matrycy kolagenu 3D, co pozwala przezwyciężyć nowoczesne ograniczenia komory dyfuzyjnej istniejących testów.

Planarny system dyfuzji gradientowej do badania chemotaksji w matrycy kolagenowej 3D

Wizualne testy chemotaksji są niezbędne do lepszego zrozumienia, w jaki sposób komórki eukariotyczne kontrolują kierunkową migrację komórek za pośrednictwem chemoatraktantu. W tym miejscu opisujemy szczegółowe metody dla: 1) monitorowania w czasie rzeczywistym w wysokiej rozdzielczości wielu testów chemotaksji oraz 2) jednoczesnej wizualizacji gradientu chemoatraktantu i czasoprzestrzennej dynamiki zdarzeń sygnalizacyjnych w neutrofilopodobnych komórkach HL60.

Obrazowanie chemotaksji sprzężonej z białkiem G i jej zdarzeń sygnalizacyjnych w neutrofilowych komórkach HL60

Ten artykuł przedstawia szczegółową metodę przeprowadzania szybkiego testu chemotaksji neutrofili poprzez integrację wbudowanej izolacji neutrofili z krwi pełnej oraz testu chemotaksji na pojedynczym chipie mikroprzepływowym.

Kompleksowa metoda do szybkiej analizy chemotaksji neutrofili bezpośrednio z kropli krwi

Tutaj opisujemy metody oceny odpowiedzi komórkowej na ostrą stymulację mechaniczną. W teście opartym na mikroskopii badamy lokalizację biosensorów znakowanych fluorescencyjnie po krótkiej stymulacji przepływem ścinającym. Badamy również biochemicznie aktywację różnych interesujących nas białek w odpowiedzi na ostrą stymulację mechaniczną.

Ocena odpowiedzi Dictyostelium discoideum na ostrą stymulację mechaniczną

Zbiorowa migracja komórek w procesie rozwoju, gojenia ran i przerzutów nowotworowych jest często kierowana przez gradienty czynników wzrostu lub cząsteczek sygnałowych. Opisano tutaj eksperymentalny system łączący mikroskopię trakcyjną z układem mikroprzepływowym oraz demonstrację sposobu ilościowego określania mechaniki migracji zbiorowej w warunkach gradientu biochemicznego.

Mikroskopia trakcyjna zintegrowana z mikrofluidyką do chemotaktycznej migracji zbiorowej

Poznaj metodę analizy odpowiedzi komórkowych w trójwymiarowych mikrośrodowiskach z zdefiniowanymi gradientami chemoatraktantów. Technika wykorzystuje urządzenia PDMS do badań nad organoidami.

Analiza 3D wielokomórkowych odpowiedzi na gradienty chemoatraktantu

Przeglądaj więcej filmów