Name: Proste podejście do wykonywania pomiarów TEER za pomocą samodzielnie wykonanego woltoamperomierza z programowalną częstotliwością wyjściową (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Naucz się mierzyć impedancję transepitelialną w hodowlach komórkowych za pomocą samodzielnie zbudowanego woltoamperomierza z programowalną częstotliwością wyjściową. Ta metoda umożliwia dokładne badanie funkcji bariery w warstwach nabłonkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Hermanowi Liggesmeyerowi i Marvinowi Bende za ich fachowe porady w dziedzinie elektrotechniki i informatyki.

1. Montaż podstawowego woltoamperomierza do pomiaru TEER
<ol>
	<li>Przygotuj standardową ładowarkę USB jako zasilacz 5 V DC, przedłużacz USB, mikrokontroler, który będzie służył jako programowalny generator fal prostokątnych, dwa standardowe multimetry, które są w stanie mierzyć prąd i napięcie przemienne jako średnią kwadratową (True-RMS), cztery z wtykami bananowymi, przedłużacz telefoniczny ze złączem żeńskim RJ14 wraz z sześcioma pinami z wewnętrznymi czterema przewodowymi (6P4C), dwa krótkie, końcówka połyskowa, rezystor wstępny 120 kΩ, końcówki kablowe i końcówki lutownicze. Wymagane narzędzia to ściągacz izolacji, zaciskarka i lutownica.</li>
	<li>Najpierw podłącz rozszerzenie USB do płytki mikrokontrolera.</li>
	<li>Zdejmij izolację końcową z dwóch krótkich. jedną stronę na bezpośrednio do pinów 0 i 2 mikrokontrolera lub do końcówek lutowniczych, które z kolei są zatrzaskiwane na odpowiednich pinach. Zaciśnij drugie końce do końcówek kablowych i podłącz je do końcówki połyskowej, jak pokazano na Rysunek 1.</li>
	<li>Podłącz wtyki bananowe do multimetrów. Zdejmij izolację i zaciśnij drugi koniec każdego z czterech.</li>
	<li>Przetnij przedłużacz telefoniczny na dwie części, a następnie zdemontuj i zaciśnij przewody po stronie zawierającej złącze żeńskie. Sprawdź ciągłość przewodów i styków.</li>
	<li>Pierwszy multimetr będzie służył do pomiaru prądu w μA (należy pamiętać, że tryb AC musi być ustawiony wyraźnie). Podłącz go szeregowo za pomocą rezystora wstępnego 120 kΩ do pinów piątego i szóstego złącza RJ14, odpowiadających parze elektrod zewnętrznych elektrody pałeczki.</li>
	<li>Na koniec połącz drugi multimetr, który będzie używany do pomiaru transnabłonkowego spadku napięcia w mV, przez zacisk połysku do pinów trzeciego i czwartego złącza RJ14, odpowiadających wewnętrznej parze elektrod elektrody pałeczki.</li>
	<li>W razie potrzeby zamontuj instalację w obudowie.</li>
</ol>
2. Programowanie mikrokontrolera
<ol>
	<li>W razie potrzeby zmodyfikuj podany kod źródłowy (dodatkowy plik kodowania 1). W podanej formie piny 0 i 2 będą przełączać się między masą a +5 V z połowicznym czasem oscylacji 40 ms. W ten sposób zostanie wygenerowany sygnał fali prostokątnej o amplitudzie 5 V i częstotliwości około 12,5 Hz. Rzeczywiste wartości mogą się różnić ze względu na niedokładność emitera czasu mikrokontrolera.</li>
	<li>Podłącz mikrokontroler do komputera stacjonarnego przez port USB i prześlij kod źródłowy z pasującym oprogramowaniem25.</li>
</ol>
3. Zapis oscylogramów napięć (opcjonalnie)
<ol>
	<li>Omiń piny piąty i szósty złącza RJ14 rezystorem testowym 1 kΩ i podłącz do oscyloskopu.</li>
	<li>Sprawdź częstotliwość, napięcie szczytowe i przebieg. Digitalizacja i eksport danych.</li>
	<li>W razie potrzeby zapisz oscylogramy z urządzenia referencyjnego (EVOM) i samodzielnie zmontowanego woltamperomierza dla porównania. 
	UWAGA: W tym przypadku dane zostały zarejestrowane za pomocą cyfrowego zakresu pamięci HM 208. Będąc bardzo prostym oscyloskopem cyfrowym, obraz mógł być wewnętrznie zdigitalizowany (zamrożony), ale musiał zostać wykreślony za pomocą analogowego rejestratora PM 8143 X-Y. Obraz został następnie zeskanowany.</li>
</ol>
4. Hodowla komórek i pomiar TEER
<ol>
	<li>Nasienne komórki ludzkiego brodawczaka splotu naczyniówkowego (HIBCPP) na wkładkach filtracyjnych do hodowli komórkowych o wielkości porów 3 μm w DMEM/F12 (patrz tabela materiałów) zawierających 10% płodowej surowicy cielęcej9. Hoduj komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze nasyconej wodą zawierającej 5% CO2 zgodnie z opisem Dinner et al.9.</li>
	<li>Gdy filtry osiągną impedancję 70 Ω ∙ cm2, zmień na DMEM/F12 bez surowicy i zdefiniuj punkt czasowy jako Dzień 0.</li>
	<li>Podłącz elektrodę do portu RJ14 samodzielnie zmontowanego woltamperomierza i podłącz zasilacz USB. Ustaw multimetry odpowiednio w trybie napięcia AC (mV) i trybu prądu AC (μA).
	<ol>
		<li>Alternatywnie podłącz elektrodę do dostępnego w handlu urządzenia referencyjnego i włącz zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sterylizuj elektrodę w 80% etanolu przez 10 minut i równoważ w odpowiednim medium przez kolejne 10 minut.</li>
	<li>Umieść elektrodę w obu komorach systemu wkładów filtracyjnych do hodowli komórkowych (dłuższa część elektrody w dolnej komorze i krótsza część w górnej komorze) zawierających warstwę ogniw HIBCPP, aż wartości pomiarowe pozostaną stałe.</li>
	<li>W przypadku urządzenia referencyjnego należy zanotować impedancję bezpośrednio lub obliczyć impedancję zgodnie z prawem Ohma (R = U/I) dla woltamperomierza do samodzielnego montażu. Należy pamiętać, że kąt elektrody ma wpływ na pomiary.</li>
	<li>Powtórz pomiar TEER (kroki 3−6) od dnia 0 do dnia 4.</li>
</ol>

<ol><li>Matter, K., Balda, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+tight+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of tight junctions.</a> Methods. 30, 228-234 (2003).</li>
<li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+Automation%22%5BJournal%5D)">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> Journal of Laboratory Automation. 20, 107-126 (2015).</li>
<li>Daniels, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+human+cerebral+microvascular+endothelial+cells+maintain+the+properties+of+primary+cells+in+an+in+vitro+model+of+immune+migration+across+the+blood+brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Immortalized human cerebral microvascular endothelial cells maintain the properties of primary cells in an in vitro model of immune migration across the blood brain barrier.</a> Journal of Neuroscience Methods. 212, 173-179 (2013).</li>
<li>Weksler, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology+Journal%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 19, 1872-1874 (2005).</li>
<li>Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+retinoic+acid-enhanced%2C+multicellular+human+blood-brain+barrier+model+derived+from+stem+cell+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources.</a> Scientific Reports. 4, 4160(2014).</li>
<li>Stins, M. F., Badger, J., Sik Kim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+invasion+and+transcytosis+in+transfected+human+brain+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathogenesis%22%5BJournal%5D)">Bacterial invasion and transcytosis in transfected human brain microvascular endothelial cells.</a> Microbial Pathogenesis. 30, 19-28 (2001).</li>
<li>Muruganandam, A., Herx, L. M., Monette, R., Durkin, J. P., Stanimirovic, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+immortalized+human+cerebromicrovascular+endothelial+cell+line+as+an+in+vitro+model+of+the+human+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology+Journal%22%5BJournal%5D)">Development of immortalized human cerebromicrovascular endothelial cell line as an in vitro model of the human blood-brain barrier.</a> Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 11, 1187-1197 (1997).</li>
<li>Ishiwata, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+malignant+choroids+plexus+papilloma+cell+line+%28HIBCPP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Cell%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human malignant choroids plexus papilloma cell line (HIBCPP).</a> Human Cell. 18, 67-72 (2005).</li>
<li>Dinner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Choroid+Plexus+Epithelial+Cell-based+Model+of+the+Human+Blood-Cerebrospinal+Fluid+Barrier+to+Study+Bacterial+Infection+from+the+Basolateral+Side%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Choroid Plexus Epithelial Cell-based Model of the Human Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier to Study Bacterial Infection from the Basolateral Side.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2016).</li>
<li>Schwerk, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+invasion+and+translocation+of+Neisseria+meningitidis+and+Streptococcus+suis+in+a+novel+human+model+of+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Polar invasion and translocation of Neisseria meningitidis and Streptococcus suis in a novel human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier.</a> PLoS One. 7, e30069(2012).</li>
<li>Tenenbaum, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+bacterial+invasion+and+translocation+of+Streptococcus+suis+across+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro.</a> Cellular Microbiology. 11, 323-336 (2009).</li>
<li>Gath, U., Hakvoort, A., Wegener, J., Decker, S., Galla, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+choroid+plexus+cells+in+culture%3A+expression+of+polarized+phenotype%2C+maintenance+of+barrier+properties+and+apical+secretion+of+CSF-components%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Porcine choroid plexus cells in culture: expression of polarized phenotype, maintenance of barrier properties and apical secretion of CSF-components.</a> European Journal of Cell Biology. 74, 68-78 (1997).</li>
<li>Haselbach, M., Wegener, J., Decker, S., Engelbertz, C., Galla, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+Choroid+plexus+epithelial+cells+in+culture%3A+regulation+of+barrier+properties+and+transport+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Porcine Choroid plexus epithelial cells in culture: regulation of barrier properties and transport processes.</a> Microscopy Research and Technique. 52, 137-152 (2001).</li>
<li>Strazielle, N., Ghersi-Egea, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+blood-brain+interfaces+in+relation+to+brain+disposition+of+small+compounds+and+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Physiology of blood-brain interfaces in relation to brain disposition of small compounds and macromolecules.</a> Molecular Pharmaceutics. 10, 1473-1491 (2013).</li>
<li>Hilgendorf, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caco-2+versus+Caco-2%2FHT29-MTX+co-cultured+cell+lines%3A+permeabilities+via+diffusion%2C+inside-+and+outside-directed+carrier-mediated+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Caco-2 versus Caco-2/HT29-MTX co-cultured cell lines: permeabilities via diffusion, inside- and outside-directed carrier-mediated transport.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 89, 63-75 (2000).</li>
<li>Mathia, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+characteristics+of+calu-3+human+bronchial+epithelial+cells%3A+in+vitro-in+vivo+correlation+to+predict+lung+absorption+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Drug+Targeting%22%5BJournal%5D)">Permeability characteristics of calu-3 human bronchial epithelial cells: in vitro-in vivo correlation to predict lung absorption in rats.</a> Journal of Drug Targeting. 10, 31-40 (2002).</li>
<li>Fuchs, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+alveolar+epithelial+cells+in+primary+culture%3A+morphological+characterization+and+synthesis+of+caveolin-1+and+surfactant+protein-C%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human alveolar epithelial cells in primary culture: morphological characterization and synthesis of caveolin-1 and surfactant protein-C.</a> Cell and Tissue Research. 311, 31-45 (2003).</li>
<li>Furie, M. B., Cramer, E. B., Naprstek, B. L., Silverstein, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+endothelial+cell+monolayers+that+restrict+the+transendothelial+passage+of+macromolecules+and+electrical+current%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cultured endothelial cell monolayers that restrict the transendothelial passage of macromolecules and electrical current.</a> The Journal of Cell Biology. 98, 1033-1041 (1984).</li>
<li>Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+human+colon+carcinoma+cell+line+%28Caco-2%29+as+a+model+system+for+intestinal+epithelial+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability.</a> Gastroenterology. 96, 736-749 (1989).</li>
<li>Yeste, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+correction+factor+for+transepithelial+electrical+resistance+measurements+in+Transwell+and+microfluidic+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics+D+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">Geometric correction factor for transepithelial electrical resistance measurements in Transwell and microfluidic cell cultures.</a> Journal of Physics D Applied Physics. 49 (37), 3754(2016).</li>
<li>Northrup, E. VI: The Measurement of Low Resistance. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNorthrup%2C+E+%22Methods+of+Measuring+Electrical+Resistance%22">Methods of Measuring Electrical Resistance</a>. , McGraw-Hill. 100-131 (1912).</li>
<li>Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial+electrical+measurements+with+the+Ussing+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cystic+Fibrosis%22%5BJournal%5D)">Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 3 (Suppl 2), 123-126 (2004).</li>
<li>Griep, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BBB+on+chip%3A+microfluidic+platform+to+mechanically+and+biochemically+modulate+blood-brain+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function.</a> Biomedical Microdevices. 15, 145-150 (2013).</li>
<li>Esch, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+chip+porous+polymer+membranes+for+integration+of+gastrointestinal+tract+epithelium+with+microfluidic+%27body-on-a-chip%27+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">On chip porous polymer membranes for integration of gastrointestinal tract epithelium with microfluidic 'body-on-a-chip' devices.</a> Biomedical Microdevices. 14, 895-906 (2012).</li>
<li>Arduino IDE. Arduino Web Editor. , https://www.arduino.cc/en/Main/Software (2019).</li>
<li>Benson, K., Cramer, S., Galla, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impedance-based+cell+monitoring%3A+barrier+properties+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 10, 5(2013).</li>
<li>Hufnagl, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Time+Resolved+Transepithelial+Impedance+Spectroscopy+Of+Caco+2+Monolayers+Relying+on+Lithographically+Patterned+Basolateral+Electrode+Cell+Arrays%22">Time Resolved Transepithelial Impedance Spectroscopy Of Caco 2 Monolayers Relying on Lithographically Patterned Basolateral Electrode Cell Arrays</a>. , University of Vienna. (2010).</li>
<li>Guimerà, A., Gabriel, G., Parramon, D., Calderón, E., Villa, R. Portable 4 Wire Bioimpedance Meter with Bluetooth Link. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGuimer%C3%A0%2C+A+%22World+Congress+on+Medical+Physics+and+Biomedical+Engineering.+International+Federation+of+Medical+and+Biological+Engineering+Proceedings%22">World Congress on Medical Physics and Biomedical Engineering. International Federation of Medical and Biological Engineering Proceedings</a>. Dössel, O., Schlegel, W. C. 25/7, Springer. Berlin, Heidelberg. (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.

Zanim woltamperomierz własnej produkcji będzie mógł być używany w codziennej rutynie, konieczne jest sprawdzenie urządzenia pod kątem prawidłowego działania. W naszym przypadku zaprogramowany był półczas oscylacji wynoszący 40 ms (12,5 Hz), ale efektywny czas oscylacji okazał się wynosić 60 ms (16,7 Hz). Ta niedokładność emitera czasu mikrokontrolera nie miała wykrywalnego wpływu na pomiary TEER. Najlepszym rozwiązaniem może być określenie rzeczywistej częstotliwości za pomocą ustawienia częstotliwości jednego z multimet...

Komórki nabłonkowe i śródbłonkowe funkcjonują jako granice komórkowe, oddzielając wierzchołkową i podstawno-boczną stronę ciała. Jeśli są one połączone ścisłymi połączeniami, pasywna dyfuzja substancji przez przestrzenie parakomórkowe jest ograniczona1, co powoduje powstanie selektywnie przepuszczalnej bariery. Opracowano kilka systemów sztucznej bariery2 wykorzystujących mikronaczyniowe komórki śródbłonka (HBMEC, bariera krew-mózg3,4,5,6,7), komórki nabłonka splotu naczyniówkowego (HIBCPP/PCPEC, bariera krew-płyn mózgowo-rdzeniowy8,9, 10,11,12,13,14), komórki gruczolakoraka jelita grubego (Caco-2, modele przewodu pokarmowego15) lub linie komórkowe dróg oddechowych/pęcherzyków płucnych (modele płucne16,17). Systemy te zazwyczaj składają się z komórek hodowanych w monowarstwie na przepuszczalnych membranach (tj. systemach wkładów filtracyjnych), aby umożliwić dostęp do strony wierzchołkowej i podstawnej. Ważne jest, aby integralność systemu modelowego odpowiadała warunkom in vivo. W związku z tym opracowano kilka technik analizy funkcji bariery poprzez pomiar parakomórkowej dyfuzji związków znakujących w warstwie komórkowej. Substancje te obejmują znakowaną radioaktywnie sacharozę, albuminę znakowaną barwnikiem, inulinę znakowaną zgodnie z FITC lub znakowaną barwnikiem dektrans2. Jednak barwniki chemiczne mogą sprawić, że komórki nie będą nadawały się do dalszych eksperymentów. Do nieinwazyjnego monitorowania systemów barierowych można wykorzystać pomiar przeznabłonkowego/przezśródbłonkowego oporu elektrycznego (TEER) na monowarstwie komórkowej2,18,19. Ponieważ na bipolarne systemy elektrod wpływa impedancja polaryzacji elektrod na granicy faz elektroda-elektrolit, pomiary tetrapolarne są zwykle stosowane w celu przezwyciężenia tego ograniczenia20. Technika podkładania to czterozaciskowe wykrywanie (4T), które zostało po raz pierwszy opisane w 1861 roku przez Williama Thomsona (Lorda Kelvina)21. Krótko mówiąc, prąd jest wstrzykiwany przez parę elektrod przewodzących prąd, podczas gdy druga para elektrod wykrywających napięcie służy do pomiaru spadku napięcia20. Obecnie tak zwane elektrody pałeczkowe składają się z pary podwójnych elektrod, z których każda zawiera granulkę srebra/chlorku srebra do pomiaru napięcia i srebrną elektrodę do przepuszczania prądu2. Impedancja elektryczna jest mierzona między przedziałem wierzchołkowym a podstawno-bocznym z warstwą ogniwa pomiędzy nimi (ryc. 1). Sygnał fali prostokątnej o częstotliwości zwykle 12,5 Hz jest przykładany do elektrod zewnętrznych i mierzony jest wynikowy prąd przemienny (AC). Dodatkowo spadek potencjału w warstwie ogniwa jest mierzony przez drugą (wewnętrzną) parę elektrod. Impedancja elektryczna jest następnie obliczana zgodnie z prawem Ohma. Wartości TEER są normalizowane przez pomnożenie impedancji i powierzchni warstwy komórkowej i są zwykle wyrażane jako Ω ∙ cm2.
Istnieją systemy, w których ogniwa i elektrody są rozmieszczone w bardziej wyrafinowany sposób, ale są również oparte na zasadzie pomiaru 4T i mogą być używane z tymi samymi urządzeniami pomiarowymi. Na przykład systemy EndOhm, w których umieszczony jest filtr, zawierają komorę i nasadkę z parą koncentrycznych elektrod o takiej samej strukturze jak elektroda pałeczkowa. Kształt elektrod pozwala na bardziej równomierny przepływ gęstości prądu przez membranę, zmniejszając w ten sposób różnice między odczytami. Jeszcze bardziej złożona (ale też dokładniejsza) jest komora Usinga, w której warstwa komórek oddziela dwie komory wypełnione roztworem Ringera22. Sama komora może być zagazowana tlenem, CO2 lub N2 i mieszana lub uzupełniana substancjami doświadczalnymi. Gdy zachodzi transport jonów przez warstwę komórkową, różnica potencjałów może być mierzona przez dwie elektrody wykrywające napięcie w pobliżu tkanki. Napięcie to jest niwelowane przez dwie elektrody przewodzące prąd umieszczone obok warstwy ogniwa. Zmierzony prąd da następnie transport jonów netto, a rezystancję transnabłonkową, która odzwierciedla integralność bariery, można określić22. Pomiar TEER może być również stosowany w systemach body-on-a-chip, które reprezentują modele tkanki barierowej23,24. Systemy te naśladują warunki in vivo komórek i często składają się z kilku typów komórek, ułożonych jedna na drugiej w warstwach.
Poniższy protokół wyjaśnia, jak skonfigurować ekonomiczny i niezawodny woltamperomierz z programowalną częstotliwością wyjściową, który nie powoduje statystycznie istotnych różnic w TEER w porównaniu z dostępnymi na rynku systemami pomiarowymi.

<table><tbody><tr>Rezystor <td></td><td></td><td>120 kOhm</td><td>Wyposażenie ogólne (ogólne)</td></tr><tr><td>wtykowe bananowe</td><td></td><td></td><td>Wyposażenie ogólne (ogólne)</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Wyposażenie ogólne (ogólne)</td></tr><tr><td>Elektroda pałeczki</td><td>Merck Millicell</td><td>MERSSTX01</td><td></td></tr><tr><td>Elektroda pałeczki (alternatywna)</td><td>WPI World Precision Instruments</td><td>STX2</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzie</td><td></td><td></td> do zaciskania <td>Narzędzie ogólne</td></tr><tr><td>Digispark / ATtiny85</td><td>AZ-Delivery Vertriebs GmbH</td><td>Digispark Rev.3 Kickstarter</td><td></td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Gibco (Thermo Fisher)</td><td>31330038</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu (FCS)/Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Wkłady filtracyjne 3&micro; m półprzezroczysty</td><td>Greiner Bioone</td><td>662631</td><td></td></tr><tr><td>HIBCPP</td><td></td><td></td><td>Hiroshi Ishikawa / Horst Schroten</td></tr><tr><td>Ściągacz</td><td></td><td></td> izolacji <td>Narzędzie ogólne</td></tr><tr><td>Końcówka połysku Wyposażenie</td><td></td><td></td><td>ogólne</td></tr><tr><td>Oscyloskop</td><td>HAMEG</td><td>Cyfrowy zakres pamięci HM 208</td><td></td></tr><tr><td>Ploter</td><td>PHILIPS</td><td>PM 8143 Rejestrator X-Y</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Arduino</td><td>https://www.arduino.cc</td><td>Arduino 1.8.9</td><td></td></tr><tr><td>Lutownica</td><td></td><td></td><td>Narzędzie ogólne</td></tr><tr><td>Końcówki</td><td></td><td></td> lutownicze <td>Wyposażenie ogólne</td></tr><tr><td>telefoniczny ze złączem</td><td></td><td></td> RJ14 (6P4C) <td>Wyposażenie ogólne (ogólne)</td></tr><tr><td>Rezystor testowy</td><td>Merck Millicell</td><td>MERSSTX04</td><td></td></tr><tr><td>Multimetry True-RMS</td><td>Ładowarka</td><td></td> USB VOLTCRAFT VC185 <td></td></tr><tr><td>Wyposażenie ogólne (ogólne)</td><td></td> Przedłużacz USB Wyposażenie ogólne (ogólne) Woltomierz do pomiaru TEER WPI World Precision Instruments EVOM Woltomierz do pomiaru TEER (alternatywny)Merck Millicell ERS <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Końcówki</td><td></td><td></td> kablowe <td>Wyposażenie ogólne (ogólne)</td></tr></tbody></table>

proste podejście do wykonywania pomiarów teer za pomocą samodzielnie wykonanego woltoamperomierza z programowalną częstotliwością wyjściową

A Simple Approach to Perform TEER Measurements Using a Self-Made Volt-Amperemeter with Programmable Output Frequency

Transepitelial/śródbłonkowy opór elektryczny (TEER) jest używany od lat 80. do określania zbieżności i przepuszczalności modelowych systemów barierowych in vitro. W większości przypadków elektrody pałeczkowe są używane do określania impedancji elektrycznej między górną i dolną komorą systemu wkładów filtracyjnych do hodowli komórkowych zawierających monowarstwy komórkowe. Membrana filtrująca umożliwia komórkom przyleganie, polaryzację i interakcję poprzez budowanie ścisłych połączeń. Technika ta została opisana na wielu różnych liniach komórkowych (np. komórkach bariery krew-mózg, bariery krew-płyn mózgowo-rdzeniowy lub przewodu pokarmowego i płucnego). Urządzenia pomiarowe TEER można łatwo nabyć u różnych dostawców sprzętu laboratoryjnego. Istnieją jednak bardziej opłacalne i konfigurowalne rozwiązania, które można sobie wyobrazić, jeśli odpowiedni woltamperomierz jest montowany samodzielnie. Ogólnym celem tej publikacji jest stworzenie niezawodnego urządzenia z programowalną częstotliwością wyjściową, które może być używane z dostępnymi na rynku elektrodami pałeczkowymi do pomiaru TEER.

W celu porównania działania woltamperometru zbudowanego samodzielnie z jego komercyjnym odpowiednikiem, zarejestrowano oscylogram napięcia obu urządzeń.
Jak pokazano na Ryc. 2A, urządzenie referencyjne wygenerowało sygnał prostokątny o amplitudzie 80 mV i czasie oscylacji 80 ms, co odpowiada częstotliwości 12,5 Hz, podczas pracy pod obciążeniem z rezystorem testowym 1 kΩ.
<p class="jove_cont...

Tutaj pokazujemy, jak skonfigurować tani woltoamperomierz z programowalną częstotliwością wyjściową, który może być używany z dostępnymi na rynku elektrodami pałeczkowymi do pomiarów przezprzeznabłonkowego/śródbłonkowego oporu elektrycznego.

Proste podejście do wykonywania pomiarów TEER za pomocą samodzielnie wykonanego woltoamperomierza z programowalną częstotliwością wyjściową

Transepithelial/endothelial electrical resistance (TEER) has been used since the 1980s to determine confluency and permeability of in vitro barrier model ...

Pomiar transnabłonkowej impedancji elektrycznej jest stosowany od lat 80. XX wieku w celu określenia zbiegu i funkcji barierowej monowarstw nabłonka w hodowli komórkowej. Podstawową techniką jest wykrywanie z czterema zaciskami, które wykorzystuje różne pary elektrod przewodzących prąd i wykrywających napięcie w celu uzyskania dokładniejszych pomiarów. Na rynku dostępnych jest kilka urządzeń do pomiaru impedancji przeznabłonkowej, ale pomimo łatwości obsługi i wysokiej niezawodności, istnieją również pewne wady, takie jak nietranslowana częstotliwość wyjściowa i ich drogość.W ten sposób przedstawiamy, jak zbudować ekonomiczny i programowalny woltomierz. Na początku chcemy pokazać, jak działa pomiar TEER za pomocą dostępnych na rynku urządzeń. W tym celu przeprowadziliśmy hodowlę warstwy komórkowej komórek brodawczaka nabłonkowego splotu naczyniówkowego na filtrach Transwell o wielkości porów wynoszącej trzy mikrometry.To ustawienie zostało opisane przez Schrotena i wsp. jako model in vitro bariery krew-płyn mózgowo-rdzeniowy. Teraz elektroda pałeczki jest podłączona do nabłonkowego woltomierza amperomierza.Urządzenie jest włączone i ustawione na pomiar rezystancji. Elektroda jest sterylizowana w 80% etanolu, a następnie równoważona w odpowiednim medium. Impedancja, która ma być mierzona, posłuży jako wartość odniesienia w celu oceny niezawodności woltomierza, który zostanie następnie zmontowany.W tym przykładzie rejestrujemy impedancję 680 omów. Zacznijmy od montażu niskobudżetowego woltomierza z programowalną częstotliwością wyjściową. Przede wszystkim będziesz potrzebować standardowej ładowarki USB i przedłużacza USB jako pięciowoltowego zasilacza prądu stałego.8-bitowy mikrokontroler na płytce rozwojowej USB zostanie następnie wykorzystany do wygenerowania prądu o fali prostokątnej. Cztery z wtykami bananowymi są podłączone do dwóch standardowych multimetrów w celu pomiaru napięcia i prądu. Upewnij się, że multimetry są w stanie mierzyć prąd w zakresie niektórych mikroamperów za pomocą TrueRMS.Żeńskie złącze RJ14 można znaleźć w standardowych telefonicznych. Upewnij się tylko, że złącze ma sześć pinów, z których co najmniej cztery wewnętrzne są okablowane. Wreszcie, będziesz potrzebować standardowego wyposażenia, takiego jak nasze, końcówka połyskująca, rezystor 120 kiloomów i kilka narzędzi, takich jak ściągacze izolacji, narzędzie do zaciskania, końcówki kablowe i lutownica.Urządzenie jest zmontowane dokładnie tak, jak pokazano na schemacie układu. Na początku rozszerzenie USB jest podłączone do mikrokontrolera. Podczas normalnej pracy jest zasilany przez pięciowoltową ładowarkę USB prądu stałego, którą można łatwo podłączyć do komputera osobistego w celu programowania.Dwa są odizolowane i zaciśnięte za pomocą końcówek kablowych z jednej strony. Druga strona jest przylutowana albo bezpośrednio do pinu zero i drugiego mikrokontrolera, albo do końcówek lutowniczych, które z kolei są zatrzaskiwane na odpowiednich pinach. Następnie zasilające są podłączane do zacisku połysku.Pierwszy multimetr będzie służył do pomiaru prądu i jest połączony szeregowo z rezystorem 120 kiloomów i elektrodami przepuszczającymi prąd. Taki układ zapewnia, że prąd wyjściowy jest ograniczony, więc pomiar nie będzie miał wpływu na żywotność ogniwa. Cztery żyły przedłużacza telefonicznego są zdemontowane i zaciśnięte na tulejkach, jak pokazano wcześniej.Po przygotowaniu należy przetestować ciągłość przewodów i pinów. W naszym przykładzie piny od trzeciego do szóstego są podłączone do białego, brązowego, zielonego i żółtego przewodnika. Teraz piny piąty i szósty, czyli zielony i żółty, są podłączone do zacisku połysku, aby przyłożyć napięcie do zewnętrznej pary elektrod.Na koniec będziesz musiał podłączyć drugi multimetr, który będzie służył do pomiaru przeznabłonkowego spadku napięcia, do pinów trzeciego i czwartego, czyli w naszym przykładzie do biało-brązowego przewodnika. Zdecydowaliśmy się na montaż instalacji w tanim podwoziu z tworzywa sztucznego. Przed pierwszym użyciem mikrokontroler musi zostać zaprogramowany.Kod źródłowy jest napisany w języku C+i może być przesyłany przez USB. Krótko mówiąc, przypnij zero do trybu wyjścia środkowego. Po włączeniu pętla funkcyjna zacznie zmieniać się jako piny między masą a plus pięć woltów ze zmiennym opóźnieniem.W naszym przykładzie użyliśmy teoretycznego czasu półoscylacji wynoszącego 40 milisekund. Zobaczmy, jak wyniki pomiarów wypadają w porównaniu z wartościami referencyjnymi, które uzyskaliśmy wcześniej. Elektroda pałeczki jest przenoszona na ostatnio zmontowany woltomierz amperomierz.Urządzenie jest włączane w trzech krokach. Oznacza to podłączenie ładowarki USB, przełączenie lewego multimetru na pomiar napięcia AC i przełączenie drugiego multimetru na mikroamper. Zwróć uwagę, że prąd przemienny musi być wybrany wyraźnie.W tym przykładzie spadek potencjału w systemie filtrów Transwell jest mierzony jako około 25 miliwoltów, podczas gdy rejestrujemy prąd o natężeniu 37,1 mikroampera. Zgodnie z prawem Ohma impedancję elektryczną można łatwo obliczyć przy 674 omach, czyli bardzo blisko wartości odniesienia 680. Wykazaliśmy, że wartości pomiarowe są wiarygodne w zakresie od zera do 1,8 kilooma.Dzięki temu opisywany woltomierz może być używany zarówno do wstępnych eksperymentów, jak i do dalszych badań. Jeśli jednak Twoje wyniki mają zostać opublikowane, zawsze możesz chcieć poprzeć swoje dane, mierząc strumień cząsteczek w odpowiedniej warstwie komórki.

a-simple-approach-to-perform-teer-measurements-using-self-made-volt

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano wytwarzanie, kalibrację oraz zastosowanie nieinwazyjnych sond wibracyjnych do pomiaru prądu bioelektrycznego w różnych systemach biologicznych.

Pomiar prądu bioelektrycznego za pomocą wibrującej sondy

Przedstawiono protokół dla projektowania wiązki o stałej i stałej wiązce za pomocą laserowego wibrometru dopplerowskiego (LDV), w tym pomiar strojenia częstotliwości, modyfikację możliwości strojenia oraz unikanie awarii i problemów urządzenia. Wyższość metody LDV nad analizatorem sieci wynika z jej wyższej zdolności modalnej.

Metodologia projektowania i charakteryzacji wydajnych filtrów MEMS o szerokim zakresie

To badanie poprawia dokładność przepływomierza elektromagnetycznego poprzez optymalizację przebiegów wzbudzenia, zastosowanie wielostopniowego filtrowania i użycie prostowania opartego na Complex Programmable Logic Device (CPLD). Nowatorska metoda wykrywania pustych rur oparta na kształcie fal zwiększa niezawodność. Eksperymenty wykazały dokładność 0,1% w zakresie 0,1-15 m/s, co potwierdza możliwość zastosowania w przemyśle.

Precyzyjny przepływomierz elektromagnetyczny z wykrywaniem pustej rury za pomocą złożonego programowalnego systemu rozpoznawania przebiegów opartego na urządzeniach logicznych

W niniejszej pracy omawiano protokół projektowania i opracowania urządzenia E-Eye-Enable POCT do wykrywania Fe, Cr, As i F w próbkach środowiskowych, próbkach biologicznych oraz żywności i napojach. Przetestowano prawie 2000 próbek, a wyniki odpowiadają standardowej technice.

TD-DFT Guided Advanced E-Eye Sensing Technique do kwantyfikacji na miejscu Fe, Cr, F oraz As w próbkach środowiskowych, biologicznych i spożywczych

W niniejszym filmie demonstrujemy sposób wytwarzania i wykorzystywania mikrofabrykowanych detektorów w postaci macierzy słupków (mPADs) do oceny modulacji kurczliwości komórkowej.

Mikrofabrykowane detektory w postaci macierzy słupków (mPADs): podejście do izolowania sił mechanicznych

W tym filmie pokazano, jak używać programowalnej wyciągarki do wykonywania pipet do patch-clampu oraz ostrych elektrod do elektrofizjologii. Tę samą procedurę można zastosować do wykonania różnych narzędzi szklanych, w tym igieł do iniekcji.

Wytwarzanie pipet do patch-clamp oraz mikroelektrod za pomocą programowalnej wyciągarki

Niniejsza procedura przedstawia sposób wykorzystania systemu do elektroporacji Gene Pulser MXcell w celu szybkiego i łatwego zidentyfikowania optymalnych warunków elektroporacji dla embrionalnych fibroblastów mysich (MEFs) lub innych komórek pierwotnych. W towarzyszącym filmie omówiono również kwestie związane z rozwiązywaniem problemów.

Wykorzystanie systemu elektroporacji Gene Pulser MXcell do wysokowydajnej transfekcji komórek pierwotnych

Immunocytochemiczne barwienie w zawiesinie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSCs) pod kątem markerów powierzchniowych komórek (SSEA-3/SSEA-4) zostało przeprowadzone z wykorzystaniem własnego urządzenia do cytocentryfugacji w celu stworzenia monowarstwy komórek do obserwacji i kwantyfikacji.

Analiza immunocytochemiczna ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem własnoręcznie wykonanego urządzenia do cytocentryfugacji

Konstrukcje typu Function-Spacer-Lipid (FSL) pozwalają na modyfikację charakterystyki powierzchni żywych komórek i wirionów bez utraty ich żywotności. Metoda ta wymaga jedynie prostego kontaktu roztworu konstrukcji FSL z komórką lub wirionem, co prowadzi do spontanicznej i stabilnej inkorporacji w powierzchnię.

Konstrukcje FSL: prosta metoda modyfikowania powierzchni komórek/wirionów za pomocą szeregu markerów biologicznych bez wpływu na ich żywotność

Przedstawiamy prostą, półilościową metodę badania tworzenia się biofilmu in vitro. Metoda ta wykorzystuje stereomikroskop Zeiss stemi 2000-C (z dołączoną kamerą) do monitorowania czasu oraz wzorca tworzenia się biofilmu, ocenianego na podstawie rozwoju pomarszczonych kolonii.

Półilościowe podejście do oceny tworzenia biofilmu z wykorzystaniem rozwoju pomarszczonych kolonii

Naucz się mierzyć impedancję transepitelialną w hodowlach komórkowych za pomocą samodzielnie zbudowanego woltoamperomierza z programowalną częstotliwością wyjściową. Ta metoda umożliwia dokładne badanie funkcji bariery w warstwach nabłonkowych.

Proste podejście do wykonywania pomiarów TEER za pomocą samodzielnie wykonanego woltoamperomierza z programowalną częstotliwością wyjściową (Wideo) | JoVE Journal

Proste podejście do wykonywania pomiarów TEER za pomocą samodzielnie wykonanego woltoamperomierza z programowalną częstotliwością wyjściową

Przeglądaj więcej filmów