Przeskakiwanie eksonów w bezpośrednio przeprogramowanych miotubach uzyskanych z ludzkich komórek pochodzących z moczu

Ustaliliśmy nowy protokół bezpośredniego przeprogramowania komórek pochodzących z ludzkiego moczu do miotub. To modelowanie in vitro pozwala nam ocenić przeskakiwanie eksonów w miotubach pochodzących od pacjenta z dystrofią mięśniową Duchenne'a. Odkryliśmy, że chlorowodorek 3-deazaneplanocyny A, DZnep, jest inhibitorem metylotransferazy histonowej, który może znacznie promować bezpośrednie badania przesiewowe UDC do miotubki w krótkim czasie.

To nowe autologiczne modelowanie chorób oparte na UDC może doprowadzić do zastosowania medycyny precyzyjnej w różnych chorobach mięśni. Na początek odwiruj całą próbkę moczu o masie 400 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie odessać supernatant, pozostawiając jeden mililitr w probówce.

Zawiesić granulki pojedynczo w pozostałym jednym mililitrze moczu. Zbierz je w jednej 50-mililitrowej tubie i dodaj 10 mililitrów buforu myjącego do probówki. Odwirować próbki o masie 200 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Odessać supernatant pozostawiając 0,2 mililitra w probówce. Ponownie zawiesić granulki komórek w 4,5 mililitra podłoża pierwotnego. Zasiej komórki w trzech dołkach sześciodołkowej płytki pokrytej żelatyną, 1,5 mililitra zawiesiny komórek na studzienkę.

Hodowla w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Przez trzy dni dodawaj 1,5 mililitra pożywki podstawowej każdego dnia. Czwartego dnia zastąp pożywkę 1,5 mililitra pożywki wzrostowej uzupełnionej zgodnie z opisem w manuskrypcie.

Po czwartym dniu wymieniaj uzupełnioną pożywkę wzrostową co drugi dzień, aż kultura UDC będzie zlewna w 80 do 90%. Następnie usuń pożywkę i umyj komórki PBS. Podziel komórki za pomocą 0,25% trypsyny-EDTA.

Zasiaj komórki o gęstości od 3 000 do 5 000 komórek na centymetr kwadratowy na nowej pokrytej żelatyną 60-milimetrowej szalce. Wysiewaj UDC w ilości od 3 000 do 5 000 komórek na centymetr kwadratowy na 60-milimetrowej szalce pokrytej żelatyną i umieść naczynie w inkubatorze. 24 godziny po wysianiu zainfekuj komórki rozmrożonym retrowirusem przy wielokrotności infekcji 200.

Stosować świeżą pożywkę o stężeniu bromku heksadimetryny wynoszącym 8 mikrogramów na mililitr. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Aby wybrać komórki transdukowane MYOD1, zastąp pożywkę hodowlaną świeżą pożywką wzrostową zawierającą jeden mikrogram na mililitr puromycyny.

Kontynuuj zmianę podłoża co drugi dzień przez siedem do 10 dni. Umieść transdukowane MYOD1 UDC w płytce wielodołkowej pokrytej kolagenem. Po inkubacji komórek przez 24 godziny zmień pożywkę wzrostową na pożywkę różnicującą opisaną w manuskrypcie.

Następnie po trzech dniach zmień pożywkę różnicującą na świeżą pożywkę różnicującą bez DZNep. Kontynuuj zmianę podłoża co trzy dni. Aby transfekować oligonukleotyd antysensowny do UDC transdukowanych MYOD1, należy zmieszać odczynnik do transfekcji ASO i pożywkę różnicującą do końcowego stężenia od jednego do 10 mikromolowych.

I użyj tej mieszaniny, aby zastąpić pożywkę w studzienkach. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i wilgotności 5%. Po 72 godzinach inkubacji z ASO, zmień pożywkę na świeżą pożywkę różnicującą bez ASO.

Trzy do siedmiu dni po transfekcji ASO usuń pożywkę różnicującą. Umyj UDC raz PBS i dodaj bufor do lizy komórek. Zbierz całkowite RNA za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA.

Zmierz stężenie RNA za pomocą spektrofotometru. Zgodnie z opisem w manuskrypcie, należy połączyć odczynniki do jednoetapowego RT-PCR w probówkach do PCR. Umieść probówki PCR w termocyklerze i uruchom termocykler.

Wykonaj elektroforezę mikroprocesorową i oblicz wydajność pomijania eksonów. UDC zebrano łatwo i nieinwazyjnie i utworzyły kolonie w ciągu tygodnia od hodowli pierwotnej. Transfekowane UDC MYOD1 w podłożu różnicującym z DZNep mogły łączyć się ze sobą i efektywnie tworzyć wielojądrowe miotuby.

RT-PCR wyraźnie wykrył przeskakiwanie eksonów w MYOD1-UDC pochodzących od pacjentów z dystrofią mięśniową Duchenne'a. Skuteczność przeskakiwania była zależna od dawki ASO. Zależne od dawki przeskakiwanie eksonów wykryto również za pomocą Western blot.

Intensywność dystrofiny mierzono za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego tydzień po transfekcji ASO. Znacznie wyższe sygnały fluorescencyjne zaobserwowano u MYOD1-UDC leczonych ASO niż w grupie kontrolnej. Możemy modelować każdą chorobę mięśniową, prowadząc do zrozumienia patofizjologii tych chorób.