Name: Test wzrostu neurytów i ocena neurotoksyczności z ludzkimi neuronami pochodzącymi z neuronów progenitorowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-06T15:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Naucz się testu wzrostu neurytów i oceny neurotoksyczności z wykorzystaniem ludzkich neuronów pochodzących z komórek progenitorowych. Ta metoda umożliwia badanie wpływu małych cząsteczek na rozwój neuronalny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie zostało sfinansowane z grantu badawczego NIMAD (940714) przyznanego MAF.

<ol><li>Sherman, S. P., Bang, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screen+for+compounds+that+modulate+neurite+growth+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">High-throughput screen for compounds that modulate neurite growth of human induced pluripotent stem cell-derived neurons.</a> Disease Models & Mechanisms. 11 (2), (2018).</li>
<li>Al-Ali, H., Beckerman, S. R., Bixby, J. L., Lemmon, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">In vitro models of axon regeneration.</a> Experimental Neurology. 287, 423-434 (2017).</li>
<li>Kudo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+neurite+outgrowth+in+PC12+cells+treated+with+temperature-controlled+repeated+thermal+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Induction of neurite outgrowth in PC12 cells treated with temperature-controlled repeated thermal stimulation.</a> PloS One. 10 (4), 0124024(2015).</li>
<li>Higgins, S., Lee, J. S., Ha, L., Lim, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducing+neurite+outgrowth+by+mechanical+cell+stretch%5BTitle%5D)+AND+%22BioResearch+Open+Access%22%5BJournal%5D)">Inducing neurite outgrowth by mechanical cell stretch.</a> BioResearch Open Access. 2 (3), 212-216 (2013).</li>
<li>Muramatsu, R., Ueno, M., Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+regenerative+mechanisms+of+central+nervous+system+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Trends%22%5BJournal%5D)">Intrinsic regenerative mechanisms of central nervous system neurons.</a> Bioscience Trends. 3 (5), (2009).</li>
<li>Read, D. E., Herbert, K. R., Gorman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+enhances+NGF-induced+neurite+elongation+which+is+not+mediated+by+Hsp25+in+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Heat shock enhances NGF-induced neurite elongation which is not mediated by Hsp25 in PC12 cells.</a> Brain Research. 1221, 14-23 (2008).</li>
<li>Finan, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+Compound+Screen+for+Pharmacological+Enhancers+of+Apolipoprotein+E+in+Primary+Human+Astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Bioactive Compound Screen for Pharmacological Enhancers of Apolipoprotein E in Primary Human Astrocytes.</a> Cell Chemical Biology. 23 (12), 1526-1538 (2016).</li>
<li>Magistri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+transcriptomic+analysis+of+astrocytes+differentiation+from+human+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A comparative transcriptomic analysis of astrocytes differentiation from human neural progenitor cells.</a> European Journal of Neuroscience. 44 (10), 2858-2870 (2016).</li>
<li>Bez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosphere+and+neurosphere-forming+cells%3A+morphological+and+ultrastructural+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization.</a> Brain Research. 993 (1-2), 18-29 (2003).</li>
<li>Grandjean, P., Landrigan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurobehavioural+effects+of+developmental+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neurobehavioural effects of developmental toxicity.</a> The Lancet Neurology. 13 (3), 330-338 (2014).</li>
<li>Finkbeiner, S., Frumkin, M., Kassner, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+screening%3A+extracting+meaning+from+complex+data%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cell-based screening: extracting meaning from complex data.</a> Neuron. 86 (1), 160-174 (2015).</li>
<li>An, W. F., Tolliday, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+assays+for+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-based assays for high-throughput screening.</a> Molecular Biotechnology. 45 (2), 180-186 (2010).</li>
<li>Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+evaluation+of+in+vitro+cell+culture+models+for+high-throughput+drug+screening+and+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity.</a> Pharmacology & Therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).</li>
<li>Swinney, D. C., Anthony, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+were+new+medicines+discovered%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">How were new medicines discovered.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (7), 507(2011).</li>
<li>Ryan, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+outgrowth+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+neurons+as+a+high-throughput+screen+for+developmental+neurotoxicity+or+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Neurite outgrowth in human induced pluripotent stem cell-derived neurons as a high-throughput screen for developmental neurotoxicity or neurotoxicity.</a> Neurotoxicology. 53, 271-281 (2016).</li>
<li>Magistri, M., Velmeshev, D., Makhmutova, M., Faghihi, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomics+profiling+of+Alzheimer%27s+disease+reveal+neurovascular+defects%2C+altered+amyloid-%CE%B2+homeostasis%2C+and+deregulated+expression+of+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Transcriptomics profiling of Alzheimer's disease reveal neurovascular defects, altered amyloid-β homeostasis, and deregulated expression of long noncoding RNAs.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 48 (3), 647-665 (2015).</li>
<li>Darbinyan, A., Kaminski, R., White, M. K., Darbinian, N., Khalili, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+propagation+of+primary+human+and+rodent+embryonic+neural+progenitor+cells+and+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuronal+Cell+Culture%22%5BJournal%5D)">Isolation and propagation of primary human and rodent embryonic neural progenitor cells and cortical neurons.</a> Neuronal Cell Culture. , 45-54 (2013).</li>
<li>Gil-Perotín, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neural+stem+cells+from+the+subventricular+zone%3A+a+review+of+the+neurosphere+assay%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Adult neural stem cells from the subventricular zone: a review of the neurosphere assay.</a> The Anatomical Record. 296 (9), 1435-1452 (2013).</li>
<li>Ebert, A. D., McMillan, E. L., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating%2C+expanding%2C+and+infecting+human+and+rodent+fetal+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolating, expanding, and infecting human and rodent fetal neural progenitor cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 6 (1), 2(2008).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676(2012).</li>
<li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+for+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">ImageJ for microscopy.</a> Biotechniques. 43 (1), 25-30 (2007).</li>
<li>Bagheri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC+Inhibitors+Induce+BDNF+Expression+and+Promote+Neurite+Outgrowth+in+Human+Neural+Progenitor+Cells-Derived+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">HDAC Inhibitors Induce BDNF Expression and Promote Neurite Outgrowth in Human Neural Progenitor Cells-Derived Neurons.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1109(2019).</li>
<li>Sartor, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+BDNF+expression+and+memory+by+HDAC+inhibition+requires+BET+bromodomain+reader+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enhancement of BDNF expression and memory by HDAC inhibition requires BET bromodomain reader proteins.</a> Journal of Neuroscience. 39 (4), 612-626 (2019).</li>
<li>Conde, C., Cáceres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+assembly%2C+organization+and+dynamics+in+axons+and+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites.</a> Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319(2009).</li>
<li>Schmitz, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+neuronal+morphology%2C+synapse+number+and+synaptic+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment.</a> Journal of Neuroscience Methods. 195 (2), 185-193 (2011).</li>
<li>Grandjean, P., Landrigan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+neurotoxicity+of+industrial+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Developmental neurotoxicity of industrial chemicals.</a> The Lancet. 368 (9553), 2167-2178 (2006).</li>
<li>Dragunow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+human+brain+in+preclinical+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">The adult human brain in preclinical drug development.</a> Nature reviews Drug Discovery. 7 (8), 659(2008).</li>
<li>Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+brain+in+a+dish%3A+the+promise+of+iPSC-derived+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons.</a> Cell. 145 (6), 831-834 (2011).</li>
<li>Pan, C., Kumar, C., Bohl, S., Klingmueller, U., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomic+phenotyping+of+cell+lines+and+primary+cells+to+assess+preservation+of+cell+type-specific+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomic phenotyping of cell lines and primary cells to assess preservation of cell type-specific functions.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 8 (3), 443-450 (2009).</li>
<li>Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+protein+profiling+of+primary+versus+immortalized+human+RPE+cells+identifies+expression+patterns+associated+with+cytoskeletal+remodeling+and+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival.</a> Journal of Proteome Research. 5 (4), 862-878 (2006).</li>
<li>Yeo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Neural+Lineages+as+In+Vitro+Models+for+Screening+the+Neuroprotective+Properties+of+Lignosus+rhinocerus+%28Cooke%29+Ryvarden%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Human Embryonic Stem Cell-Derived Neural Lineages as In Vitro Models for Screening the Neuroprotective Properties of Lignosus rhinocerus (Cooke) Ryvarden.</a> BioMed Research International. 2019, (2019).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy wskazują na brak potencjalnego konfliktu interesów.

Protokół ten jest jedną z niewielu opublikowanych prac opisujących test długości neurytu po leczeniu związkami testowymi. Ponadto opisujemy, jak używać hNPC do testu wzrostu neurytów i oceny neurotoksyczności. Wykorzystując ten test wzrostu neurytów i ocenę neurotoksyczności neuronów pochodzących z hNPC, wykazano potencjał neurogenny kategorii epigenetycznych związków małocząsteczkowych, inhibitorów HDAC, w indukowaniu wzrostu neurytów22. Ponadto, w innym artykule przedstawionym przez Sartora i ws...

Wzrost neurytu to proces fundamentalny dla tworzenia sieci neuronalnej i regeneracji nerwów1,2. Po urazie wyrost neurytów odgrywa kluczową rolę w regeneracji układu nerwowego. Przerost neurytowy jest również ważnym elementem sygnalizacji zewnątrzkomórkowej w indukowaniu aktywności regeneracyjnej neuronów w celu poprawy wyników w przypadku zaburzeń neurodegeneracyjnych i uszkodzeń neuronów3,4,5,6.
Zachowując swój potencjał różnicowania w wytwarzaniu różnych linii nerwowych, ludzkie neuronalne komórki progenitorowe (hNPC) mogą stanowić modelowy system do badań funkcji i rozwoju ośrodkowego układu nerwowego (OUN)7,8,9. Wysoki potencjał translacyjny i fizjologiczne znaczenie hNPC jako pierwotnego modelu komórki ludzkiej dają znaczną przewagę w badaniach przesiewowych związanych z odkrywaniem leków związanych z przerostem neurytów. Jednak utrzymanie i skalowanie podstawowych modeli komórek dla testów o wysokiej przepustowości może być czasochłonne i pracochłonne10,11,12,13.
Oprócz zastosowania przedstawionej metody w badaniach nad wzrostem neurytów, ocena neurotoksyczności jest kolejnym zastosowaniem wykorzystującym neurony pochodzące z hNPC. Istnieją tysiące komercyjnych związków chemicznych, które albo nie są badane, albo mają słabo poznany potencjał neurotoksyczności. W związku z tym istnieje duże zapotrzebowanie na bardziej wiarygodne i skuteczne eksperymenty przesiewowe w celu oceny, rozróżnienia i uszeregowania związków na podstawie ich potencjału do wywoływania neurotoksyczności rozwojowej14. Wzrost częstości występowania i częstości występowania zaburzeń neurologicznych wraz z obfitością nieprzebadanych związków w środowisku wymaga opracowania bardziej wiarygodnych i wydajnych eksperymentów w celu identyfikacji niebezpiecznych związków środowiskowych, które mogą powodować neurotoksyczność15.
Przedstawiona tutaj metoda może być wykorzystana do badania zdolności związków do wywoływania wzrostu neurytów i neurotoksyczności poprzez wykorzystanie ludzkich neuronów pochodzących z neuronów progenitorowych, modelu komórkowego ściśle reprezentującego ludzką biologię.

<table><tbody><tr><td>Szkiełka komorowe 4-dołkowe</td><td>Sigma</td><td>PEZGS0816</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>R37117</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotykowo-Przeciwgrzybicze</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Anti-&Beta;-Tubulin III</td><td>Thermo</td><td>MA1-118X</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermo</td><td></td><td></td>17504001</tr><tr><td>B27 - bez witaminy A</td><td>Thermo</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>PeproTech</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A8531</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo</td><td>Promega</td><td>G7572</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell</td><td>Corning</td><td>432000</td><td>Pojemniki do zamrażania komórek zapewniające znormalizowaną kontrolowaną szybkość -1&#176; C/minutę zamrażania komórek w -80&#176; C zamrażarka</td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>StemCell Technologies</td><td>7930</td><td>Pożywka do kriokonserwacji zawierająca 10% DMSO</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>34869-100ML</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Gibco</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>FGF</td><td>Gibco</td><td>PHG6015</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Thermo</td><td>FB002</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>PeproTech</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>Suplement L-alanylo-L-glutaminy</td></tr><tr><td>Kozia surowica</td><td>Thermo</td><td>50062Z</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Calbiochem</td><td>375095</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy</td><td>Sigma</td><td>A92902-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-lizyna</td><td>Sigma</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>MEM aminokwasy endogenne</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>mFreSR</td><td>StemCell Technologies</td><td>5854</td><td>Pożywka do kriokonserwacji bez surowicy przeznaczona do kriokonserwacji ludzkich embrionalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych</td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 384-well Polistyren Białe mikropłytki</td><td>Thermo</td><td>164610</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna</td><td>Sigma</td><td>P5899-5MG</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Thermo</td><td>P10144</td><td></td></tr><tr><td>Kwas retinowy</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>Odczynnik do dysocjacji komórek zawierający enzymy proteolityczne i kolagenolityczne</td></tr><tr><td>Synaptophysin</td><td>Thermo</td><td>MA5-14532</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>Płyta X100-100ML</td><td></td></tr></tbody></table>

test wzrostu neurytów i ocena neurotoksyczności z ludzkimi neuronami pochodzącymi z neuronów progenitorowych

A Neurite Outgrowth Assay and Neurotoxicity Assessment with Human Neural Progenitor Cell-Derived Neurons

Test wzrostu neurytu i ocena neurotoksyczności to dwa główne badania, które można przeprowadzić przy użyciu przedstawionej tutaj metody. Protokół ten zapewnia wiarygodną analizę morfologii neuronów wraz z ilościowymi pomiarami modyfikacji długości neurytów oraz lokalizacji i obfitości białek synaptycznych po leczeniu związkami małocząsteczkowymi. Oprócz zastosowania przedstawionej metody w badaniach wzrostu neurytów, można przeprowadzić ocenę neurotoksyczności w celu oceny, rozróżnienia i uszeregowania komercyjnych związków chemicznych na podstawie ich potencjalnego wpływu na neurotoksyczność rozwojową.
Mimo że linie komórkowe są obecnie szeroko stosowane w badaniach przesiewowych w neurobiologii, często różnią się genetycznie i fenotypowo od swojego tkankowego pochodzenia. Z drugiej strony komórki pierwotne utrzymują ważne markery i funkcje obserwowane in vivo. W związku z tym, ze względu na potencjał translacyjny i znaczenie fizjologiczne, które komórki te mogą oferować test wzrostu neurytów i ocenę neurotoksyczności, można znacznie skorzystać z zastosowania ludzkich nerwowych komórek progenitorowych (hNPC) jako podstawowego modelu komórek ludzkich.
Przedstawiona tutaj metoda może być wykorzystana do badania zdolności związków do wywoływania rozrostu neurytów i neurotoksyczności poprzez wykorzystanie ludzkich neuronów pochodzących z komórek progenitorowych, modelu komórkowego ściśle reprezentującego ludzką biologię."

Protokół przedstawiony w manuskrypcie został pomyślnie zastosowany w dwóch niedawno opublikowanych pracach22,23. Rysunek 3 demonstruje wykorzystanie neuronów pochodzących z hNPCs do zbadania wpływu inhibitorów HDAC jako związków epigenetycznych na wydłużanie neurytów, co służy jako marker wzrostu neurytów i późniejszej zdolności neurogennej związków małocząsteczkowych.
Ponadto, na Rysu...

Prezentowany protokół opisuje metodę badania wzrostu neurytów i oceny neurotoksyczności związków małocząsteczkowych.

Test wzrostu neurytów i ocena neurotoksyczności z ludzkimi neuronami pochodzącymi z neuronów progenitorowych

Neurite outgrowth assay and neurotoxicity assessment are two major studies that can be performed using the presented method herein. This protocol provides ...

Przedstawiono protokół opisujący test przerostu neurytów, który ma duże znaczenie dla biologii człowieka i oceny neurotoksyczności związków małocząsteczkowych. Wysoki potencjał translacyjny i fizjologiczne znaczenie ludzkich neuronalnych komórek progenitorowych jako podstawowego modelu komórek ludzkich dają znaczną przewagę w badaniach przesiewowych w zakresie odkrywania leków związanych z przerostem neurytów i ocenie neurotoksyczności. Wykorzystując przedstawiony protokół, ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste i ludzkie embrionalne neurony pochodzące z komórek macierzystych mogą być również wykorzystywane jako alternatywne źródła komórek do testu wzrostu neurytów i oceny neurotoksyczności.Zacznij od zebrania pożywki z pływającymi neurosferami i przeniesienia jej do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Odwirować probówkę z prędkością od 300 do 400 g przez trzy minuty. Następnie ostrożnie odessać supernatant.i ponownie zawiesić kulki w 500 mikrolitrach rozmrożonego odczynnika do dysocjacji komórek. Inkubuj kulki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć do 15 minut. Następnie dodaj od pięciu do 10 mililitrów wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej i odwir

a-neurite-outgrowth-assay-neurotoxicity-assessment-with-human-neural

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejszy artykuł opisuje nowy protokół oraz zestaw odczynników opracowanych do czułego pomiaru efektów neurotoksyczności związków i metod leczenia w kokulturach neuronów i astrocytów z wykorzystaniem analizy wysokotreściowej (high content analysis). Wyniki wskazują, że analiza wysokotreściowa stanowi obiecującą, nową technologię w ocenie neurotoksyczności.

Test kokultury neuronów i astrocytów do wysokoprzepustowej analizy treści (high content analysis) w badaniach neurotoksyczności

Opracowaliśmy protokół indukcji neuroblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z zastosowaniem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów neuronalnych oraz typów komórek neuronalnych rozwijającego się OUN w celu regeneracji tkanki nerwowej.

Efektywne wyprowadzanie ludzkich progenitorów neuronalnych i neuronów z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z zastosowaniem indukcji małymi cząsteczkami

Niniejszy protokół wideo demonstruje nową metodę generowania i następnego oczyszczania neuronalnych komórek progenitorowych z odnawialnego źródła neuralnych komórek macierzystych (NSCs) w oparciu o ich właściwości fizyczne (rozmiar i ziarnistość wewnętrzną) oraz fluorescencyjne, z wykorzystaniem technologii cytometrii przepływowej.

Analiza neuroblastów: metoda generowania i wzbogacania populacji neuronalnych komórek progenitorowych z różnicujących się potomków neuronalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem cytometrii przepływowej

Ten film demonstruje test migracji neurosfery komórek prekursorowych neuronów - test in vitro do badania odpowiedzi migracyjnej neuronalnych komórek prekursorowych z neurosfery - za pomocą analizy mikroskopowej.

Test neurosfery NPC: Test in vitro do oceny odpowiedzi migracyjnej neuronalnych komórek prekursorowych z neurosfery

W tym filmie opisujemy metodę opartą na luminescencji, która pozwala ocenić neurotoksyczność związków małocząsteczkowych sprzyjających wzrostowi neurytów na żywotność neuronów pochodzących z hNPC. Test mierzy wewnątrzkomórkowy poziom ATP, wskaźnik żywotności komórek, w celu oceny neurotoksyczności po poddaniu działaniu badanego związku.

Test oparty na luminescencji do oceny neurotoksyczności badanych związków na neurony

Z zamiarem scharakteryzowania zmian w miRNA na zróżnicowanych ludzkich nerwowych komórkach macierzystych (hNSC) opisujemy różnicowanie hNSC w systemie trójwymiarowym, ocenę zmian w ekspresji mikroRNA za pomocą macierzy miRNA PCR oraz analizę obliczeniową do przewidywania celu miRNA i jego walidacji za pomocą testu podwójnej lucyferazy.

Różnicowanie ludzkiej linii nerwowych komórek macierzystych w hodowlach trójwymiarowych, analiza mikroRNA i przypuszczalnych genów docelowych

W neurobiologii i neurowirusologii kluczowe jest posiadanie niezawodnego, powtarzalnego systemu in vitro, który służy jako model translacyjny dla tego, co dzieje się in vivo w ludzkich neuronach. Protokół ten opisuje, jak hodować i różnicować ludzkie komórki nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y w żywotne neurony do wykorzystania w zastosowaniach in vitro.

Różnicowanie ludzkiej linii komórkowej nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y

Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) są uważane za potężne narzędzie do badań przesiewowych leków i substancji chemicznych oraz do rozwoju nowych modeli in vitro do testowania toksyczności, w tym neurotoksyczności. W tym miejscu opisano szczegółowy protokół różnicowania hiPSC w neurony i komórki glejowe.

Protokół różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w mieszane kultury neuronów i gleju do badań neurotoksyczności

Procesy neurorozwojowe, takie jak proliferacja, migracja i rozrost neurytów, są często zaburzone w chorobach neuropsychiatrycznych. W związku z tym przedstawiamy protokoły szybkiej i powtarzalnej oceny tych procesów neurorozwojowych u ludzkich NPC pochodzących z iPSC. Protokoły te pozwalają również na ocenę wpływu odpowiednich czynników wzrostu i terapii na rozwój NPC.

Szybkie wykrywanie fenotypów neurorozwojowych w ludzkich neuronalnych komórkach prekursorowych (NPC)

Ten protokół opisuje szczegółową procedurę ponownego zawieszania i hodowli neuronów pochodzących z ludzkich komórek macierzystych, które wcześniej były odróżniane od progenitorów nerwowych in vitro przez wiele tygodni. Procedura ułatwia oparte na obrazowaniu testy neurytów, synaps i markerów neuronalnych o późnej ekspresji w formacie zgodnym z mikroskopią świetlną i badaniami przesiewowymi o wysokiej zawartości.

Powtórzenie po różnicowaniu ludzkich neuronów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych w celu przeprowadzenia badań przesiewowych neurytogenezy i dojrzewania synaps o wysokiej zawartości

W tym raporcie opisujemy prosty protokół badania wzrostu neurytów w embrionalnych neuronach korowych szczurów poprzez jednoczesną transfekcję z EGFP i interesującym nas białkiem.

Ulepszony test oparty na białku zielonej fluorescencji do badania wzrostu neurytów w neuronach pierwotnych

Naucz się testu wzrostu neurytów i oceny neurotoksyczności z wykorzystaniem ludzkich neuronów pochodzących z komórek progenitorowych. Ta metoda umożliwia badanie wpływu małych cząsteczek na rozwój neuronalny.

Test wzrostu neurytów i ocena neurotoksyczności z ludzkimi neuronami pochodzącymi z neuronów progenitorowych

Przeglądaj więcej filmów