Monitorowanie dynamiki interakcji białko-RNA in vivo w wysokiej rozdzielczości czasowej przy użyciu χCRAC

Kinetic CRAC może być wykorzystany do badania czasowych powiązań między RNA i białkami wiążącymi RNA w niespotykanie krótkim czasie. W połączeniu z naszym środkiem sieciującym, kinetyczny CRAC jest w stanie usieciować żywe komórki w ciągu kilku sekund. Zmniejsza to reakcje na uszkodzenia spowodowane promieniowaniem UV i ułatwia badanie reakcji na stres w skali minutowej.

Kinetic CRAC to bardzo długi protokół, który może być wyzwaniem dla nowych użytkowników. Dodatkowo, praca z RNA wiąże się z własnymi wyzwaniami. Aby zapobiec degradacji RNA, należy przefiltrować, wysterylizować wszystkie roztwory i upewnić się, że pipety i stół laboratoryjny są utrzymywane w czystości.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ niektóre kroki nie są zbyt intuicyjne. Obejmuje to sieciowanie UV i pobieranie komórek, a także ekstrakcję usieciowanych RNA z żelu. Aby przeprowadzić sieciowanie UV na mikroorganizmach w roztworze, zaszczepij 3,5 litra pożądanej pożywki drożdżami do wyjściowego OD 600 0,05 i hoduj kulturę przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza z ciągłym wstrząsaniem przy 180 obr./min.

Gdy komórki osiągną pożądaną średnicę zewnętrzną, wlej 500 mililitrów kultury bezpośrednio do środka sieciującego Vari-X-linker i naświetl ją 250 milidżulami promieniowania UV o długości 254 nanometrów. Po usieciowaniu użyj urządzenia do filtracji próżniowej, aby przefiltrować komórki. Zwiń membranę z przefiltrowanymi komórkami i umieść ją w 50-mililitrowej stożkowej rurce oznaczonej T0. Przefiltruj pozostałe komórki przez sześć różnych filtrów i wrzuć membrany do trzech litrów wstępnie podgrzanego podłoża wywołującego stres, mieszając je energicznie pipetą przez 50 sekund. Kontynuuj sieciowanie komórek w objętościach 500 mililitrów w żądanych punktach czasowych i przechowuj próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Aby usieciować przylegające komórki, przenieś kwarcową naczynie hodowlane z komórkami na specjalistyczną tacę i naświetl ją 300 milidżulami promieniowania UV o długości 254 nanometrów. Natychmiast umieść naczynie na lodzie. Usuń pożywkę wzrostową z naczynia i dodaj 10 mililitrów lodowatego PBS. Zbierz komórki przez skrobanie i przenieś je do 15-mililitrowej stożkowej probówki.

Następnie granulować komórki przez odwirowanie w temperaturze 300 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po umyciu komórek PBS należy usunąć PBS i zatrzaskowo zamrozić granulki komórek na suchym lodzie. W razie potrzeby należy przechowywać próbkę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Ustaw wirówkę na cztery stopnie Celsjusza i przygotuj dwa rzędy probówek o pojemności 1,5 mililitra na próbkę do elucji. Szybko obróć kolumny za pomocą kulek niklowych, aby pozbyć się pustej objętości. Następnie umieść kolumny w pierwszym rzędzie probówek elucyjnych i napełnij je 200 mikrolitrami buforu elucyjnego.

Po dwóch minutach szybko obróć kolumny i przenieś je do drugiego rzędu rurek. Następnie powtórzyć elucję, jak pokazano wcześniej. Po zakończeniu połącz wszystkie eluaty w pięciomililitrowej probówce i dodaj dwa mikrolitry po 20 miligramów na mililitr glikogenu.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów kwasu trójchlorooctowego do próbki i wiruj przez 30 sekund. Po umyciu próbki acetonem należy ją ponownie zawiesić w 30 mikrolitrach buforu ładującego białko. Następnie sprawdź radioaktywność za pomocą licznika Geigera.

Podgrzewaj próbkę przez 10 minut w temperaturze 65 stopni Celsjusza i załaduj ją na jeden milimetr od czterech do 12% prefabrykowanego żelu Bis-Tris. Uruchom żel na 90 minut przy napięciu 125 V w buforze MOPS. Po zakończeniu owiń żel folią spożywczą i przymocuj go do wnętrza lekkiej, szczelnej kasety za pomocą taśmy.

Po wystawieniu żelu na działanie automatycznej kliszy radiograficznej, wywołaj film, odcinając folię spożywczą pokrywającą żel, uważając, aby nie przesuwać żelu i nie przesuwać obrazu. Umieść folię na żelu i wytnij pasek, który Cię interesuje. Umieść plasterek żelu w dwumililitrowej tubce i zmiażdż go końcówką pipety P1000.

Następnie dodać bufor proteinazy K i proteinazę K. Inkubować próbkę w temperaturze 55 stopni Celsjusza, energicznie wstrząsając. Uruchom cDNA na prefabrykowanym 6% żelu TBE o napięciu 100 woltów przez jedną godzinę, używając odpowiedniej drabinki do ilościowego oznaczania krótkich fragmentów DNA. Po zakończeniu umieść żel w płynnym pojemniku z wystarczającą ilością TBE, aby go przykryć, i dodaj odpowiednią ilość barwnika SYBR Safe.

Plamić żel przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie zastąpić bufor zawierający SYBR świeżym KZM. Myj żel przez 10 minut, delikatnie wstrząsając.

Odcedź KZM i umieść żel w przezroczystym folderze. Przytnij folder do odpowiedniego rozmiaru i zobrazuj żel za pomocą ilości obrazu. Wytnij fragmenty DNA od 175 do 400 par zasad i umieść kawałek żelu w tubce o pojemności 1,5 mililitra.

Rozgnieć żel końcówką pipety P1000 i dodaj 400 mikrolitrów wody. Następnie inkubuj go przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając. Zamrażać próbkę na suchym lodzie przez 10 minut.

Następnie powtórzyć inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Włóż dwa filtry z mikrowłókna szklanego do kolumny filtracyjnej umieszczonej w probówce. Następnie za pomocą przeciętej końcówki pipety P1000 przenieś zawiesinę żelu TBE do jednostki filtrującej i wiruj ją z prędkością 17 000 G przez 30 sekund.

Protokół ten został wykorzystany do monitorowania interakcji Nrd1-RNA w komórkach drożdży poddanych działaniu środowiska pozbawionego glukozy. Próbki sieciowano przed przejściem na pożywkę bez glukozy, a także jedną, dwie, cztery, osiem, 14 i 20 minut po. Autoradiogramy z eksperymentu wykazały intensywny sygnał o oczekiwanej masie cząsteczkowej Nrd1, reprezentujący białko związane z krótkimi, znakowanymi radiowo RNA, które nie nadają się do sekwencjonowania.

Sygnał powyżej tego pasma, który jest białkiem usieciowanym z dłuższymi fragmentami RNA, został wyizolowany. Aby zmienić protokół kinetyczny CRAC dla komórek ssaków, opracowano specjalny stopień, aby umożliwić naświetlanie promieniowaniem UV naczyń z przylegającymi komórkami. Wydajność tej konfiguracji mierzono poprzez sieciowanie i przechwytywanie stabilnie oznakowanego GFP RBM7.

Środek sieciujący był w stanie odzyskać kompleksy białkowe RNA z komórek ssaków za pomocą promieniowania UV o długości 254 nanometrów z wydajnością porównywalną z powszechnie stosowanym urządzeniem do naświetlania promieniami UV. Opracowanie przepuszczającej promieniowanie UV kwarcowej płytki Petriego podczas sieciowania jeszcze bardziej przyczyniło się do odzyskania białkowych kompleksów RNA. Dane Nrd1 pokazują, że białko wiąże się z wieloma niekodującymi transkryptami RNA, co wskazuje, że bierze udział w degradacji tych transkryptów.

Wykazano również wiązanie z transkryptami kodującymi HXT6 i HXT7, z których oba są regulowane w górę podczas głodu glukozy. Kinetic CRAC pozwala na pomiar dynamicznych interakcji między białkowymi RNA podczas rozwoju komórki, reakcji na stres i składania kompleksów wielkocząsteczkowych, takich jak rybosom lub spliceosom.