Name: Monitorowanie dynamiki interakcji białko-RNA in vivo w wysokiej rozdzielczości czasowej przy użyciu χCRAC (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Poznaj metodę χCRAC do badania interakcji białko-RNA in vivo z wysoką rozdzielczością czasową. Technika umożliwia monitorowanie dynamiki wiązań w komórkach drożdży i ssaczych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty od Wellcome Trust (091549 dla S.G i 109093/Z/15/A dla S.M.), Wellcome Trust Centre for Cell Biology core grant (092076) oraz Medical Research Council Non-Clinical Senior Research Fellowship (MR/R008205/1 to S.G.), Europejskiej Organizacji Biologii Molekularnej w ramach długoterminowego stypendium podoktorskiego (ALTF 1070-2017 do R.A.C.), oraz Niezależny Fundusz Badawczy Danii (T.H.J).

<ol><li>Ule, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLIP+identifies+Nova-regulated+RNA+networks+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain.</a> Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).</li>
<li>Granneman, S., Kudla, G., Petfalski, E., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protein+binding+sites+on+U3+snoRNA+and+pre-rRNA+by+UV+cross-linking+and+high-throughput+analysis+of+cDNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Identification of protein binding sites on U3 snoRNA and pre-rRNA by UV cross-linking and high-throughput analysis of cDNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (24), 9613-9618 (2009).</li>
<li>Licatalosi, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HITS-CLIP+yields+genome-wide+insights+into+brain+alternative+RNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing.</a> Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).</li>
<li>König, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iCLIP+reveals+the+function+of+hnRNP+particles+in+splicing+at+individual+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 17 (7), 909-915 (2010).</li>
<li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+Identification+of+RNA-Binding+Protein+and+MicroRNA+Target+Sites+by+PAR-CLIP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide Identification of RNA-Binding Protein and MicroRNA Target Sites by PAR-CLIP.</a> Cell. 141 (1), 129-141 (2010).</li>
<li>Aktaş, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DHX9+suppresses+RNA+processing+defects+originating+from+the+Alu+invasion+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DHX9 suppresses RNA processing defects originating from the Alu invasion of the human genome.</a> Nature. 544 (7648), 115-119 (2017).</li>
<li>Huppertz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iCLIP%3A+Protein%E2%80%93RNA+interactions+at+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">iCLIP: Protein–RNA interactions at nucleotide resolution.</a> Methods. 65 (3), 274-287 (2014).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+in+vivo+RNA-binding+site+analyses+reveal+a+role+of+Prp8+in+spliceosomal+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Comprehensive in vivo RNA-binding site analyses reveal a role of Prp8 in spliceosomal assembly.</a> Nucleic Acids Research. 41 (6), 3805-3818 (2013).</li>
<li>Rosenberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Denaturing+CLIP%2C+dCLIP%2C+Pipeline+Identifies+Discrete+RNA+Footprints+on+Chromatin-Associated+Proteins+and+Reveals+that+CBX7+Targets+3%E2%80%B2+UTRs+to+Regulate+mRNA+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Denaturing CLIP, dCLIP, Pipeline Identifies Discrete RNA Footprints on Chromatin-Associated Proteins and Reveals that CBX7 Targets 3′ UTRs to Regulate mRNA Expression.</a> Cell Systems. 5 (4), 368-385 (2017).</li>
<li>Zarnegar, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((irCLIP+platform+for+efficient+characterization+of+protein%E2%80%93RNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">irCLIP platform for efficient characterization of protein–RNA interactions.</a> Nature Methods. 13 (6), 489-492 (2016).</li>
<li>Kargapolova, Y., Levin, M., Lackner, K., Danckwardt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((sCLIP%E2%80%94an+integrated+platform+to+study+RNA%E2%80%93protein+interactomes+in+biomedical+research%3A+identification+of+CSTF2tau+in+alternative+processing+of+small+nuclear+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">sCLIP—an integrated platform to study RNA–protein interactomes in biomedical research: identification of CSTF2tau in alternative processing of small nuclear RNAs.</a> Nucleic Acids Research. 45 (10), 6074-6086 (2017).</li>
<li>Van Nostrand, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+transcriptome-wide+discovery+of+RNA-binding+protein+binding+sites+with+enhanced+CLIP+%28eCLIP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP).</a> Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).</li>
<li>Flynn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+noncoding+and+pathogen+RNA%E2%80%93protein+interactomes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Dissecting noncoding and pathogen RNA–protein interactomes.</a> RNA. 21 (1), 135-143 (2015).</li>
<li>Brugiolo, M., Botti, V., Liu, N., Müller-McNicoll, M., Neugebauer, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+iCLIP+detects+persistent+SR+protein+binding+to+conserved%2C+retained+introns+in+chromatin%2C+nucleoplasm+and+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Fractionation iCLIP detects persistent SR protein binding to conserved, retained introns in chromatin, nucleoplasm and cytoplasm.</a> Nucleic Acids Research. 45 (18), 10452-10465 (2017).</li>
<li>Sanford, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Nuclear+and+Cytoplasmic+mRNA+Targets+for+the+Shuttling+Protein+SF2%2FASF%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Identification of Nuclear and Cytoplasmic mRNA Targets for the Shuttling Protein SF2/ASF.</a> PLOS ONE. 3 (10), e3369(2008).</li>
<li>Garzia, A., Meyer, C., Morozov, P., Sajek, M., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+PAR-CLIP+for+transcriptome-wide+identification+of+binding+sites+of+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of PAR-CLIP for transcriptome-wide identification of binding sites of RNA-binding proteins.</a> Methods. 118-119, 24-40 (2017).</li>
<li>Windhager, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrashort+and+progressive+4sU-tagging+reveals+key+characteristics+of+RNA+processing+at+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution.</a> Genome Research. 22 (10), 2031-2042 (2012).</li>
<li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+N6-Methyladenosine+%28m6A%29+Map+Using+Photo-Crosslinking-Assisted+m6A+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">High-Resolution N6-Methyladenosine (m6A) Map Using Photo-Crosslinking-Assisted m6A Sequencing.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (5), 1587-1590 (2015).</li>
<li>Ke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+majority+of+m6A+residues+are+in+the+last+exons%2C+allowing+the+potential+for+3%E2%80%B2+UTR+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">A majority of m6A residues are in the last exons, allowing the potential for 3′ UTR regulation.</a> Genes & Development. 29 (19), 2037-2053 (2015).</li>
<li>Linder, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleotide-resolution+mapping+of+m6A+and+m6Am+throughout+the+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome.</a> Nature Methods. 12 (8), 767-772 (2015).</li>
<li>Kudla, G., Granneman, S., Hahn, D., Beggs, J. D., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-linking%2C+ligation%2C+and+sequencing+of+hybrids+reveals+RNA%E2%80%93RNA+interactions+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cross-linking, ligation, and sequencing of hybrids reveals RNA–RNA interactions in yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (24), 10010-10015 (2011).</li>
<li>Sugimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hiCLIP+reveals+the+in+vivo+atlas+of+mRNA+secondary+structures+recognized+by+Staufen+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">hiCLIP reveals the in vivo atlas of mRNA secondary structures recognized by Staufen 1.</a> Nature. 519 (7544), 491-494 (2015).</li>
<li>Hwang, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cTag-PAPERCLIP+Reveals+Alternative+Polyadenylation+Promotes+Cell-Type+Specific+Protein+Diversity+and+Shifts+Araf+Isoforms+with+Microglia+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">cTag-PAPERCLIP Reveals Alternative Polyadenylation Promotes Cell-Type Specific Protein Diversity and Shifts Araf Isoforms with Microglia Activation.</a> Neuron. 95 (6), 1334-1349 (2017).</li>
<li>Hwang, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAPERCLIP+Identifies+MicroRNA+Targets+and+a+Role+of+CstF64%2F64tau+in+Promoting+Non-canonical+poly%28A%29+Site+Usage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">PAPERCLIP Identifies MicroRNA Targets and a Role of CstF64/64tau in Promoting Non-canonical poly(A) Site Usage.</a> Cell Reports. 15 (2), 423-435 (2016).</li>
<li>Lee, F. C. Y., Ule, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+CLIP+Technologies+for+Studies+of+Protein-RNA+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Advances in CLIP Technologies for Studies of Protein-RNA Interactions.</a> Molecular Cell. 69 (3), 354-369 (2018).</li>
<li>Beckmann, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interactome+capture+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">RNA interactome capture in yeast.</a> Methods. 118-119, 82-92 (2017).</li>
<li>Granneman, S., Petfalski, E., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cluster+of+ribosome+synthesis+factors+regulate+pre-rRNA+folding+and+5.8S+rRNA+maturation+by+the+Rat1+exonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">A cluster of ribosome synthesis factors regulate pre-rRNA folding and 5.8S rRNA maturation by the Rat1 exonuclease.</a> The EMBO Journal. 30 (19), 4006-4019 (2011).</li>
<li>Schaughency, P., Merran, J., Corden, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Mapping+of+Yeast+RNA+Polymerase+II+Termination%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Mapping of Yeast RNA Polymerase II Termination.</a> PLOS Genetics. 10 (10), e1004632(2014).</li>
<li>Bernstein, J. A., Khodursky, A. B., Lin, P. H., Lin-Chao, S., Cohen, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+mRNA+decay+and+abundance+in+Escherichia+coli+at+single-gene+resolution+using+two-color+fluorescent+DNA+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Global analysis of mRNA decay and abundance in Escherichia coli at single-gene resolution using two-color fluorescent DNA microarrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (15), 9697-9702 (2002).</li>
<li>Kresnowati, M. T. A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+transcriptome+meets+metabolome%3A+fast+cellular+responses+of+yeast+to+sudden+relief+of+glucose+limitation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">When transcriptome meets metabolome: fast cellular responses of yeast to sudden relief of glucose limitation.</a> Molecular Systems Biology. 2, 49(2006).</li>
<li>Marguerat, S., Lawler, K., Brazma, A., Bähler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+transcription+and+mRNA+decay+to+gene+expression+dynamics+of+fission+yeast+in+response+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Contributions of transcription and mRNA decay to gene expression dynamics of fission yeast in response to oxidative stress.</a> RNA Biology. 11 (6), 702-714 (2014).</li>
<li>van Nues, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+CRAC+uncovers+a+role+for+Nab3+in+determining+gene+expression+profiles+during+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Kinetic CRAC uncovers a role for Nab3 in determining gene expression profiles during stress.</a> Nature Communications. 8 (1), 12(2017).</li>
<li>Selinger, D. W., Saxena, R. M., Cheung, K. J., Church, G. M., Rosenow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+RNA+Half-Life+Analysis+in+Escherichia+coli+Reveals+Positional+Patterns+of+Transcript+Degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Global RNA Half-Life Analysis in Escherichia coli Reveals Positional Patterns of Transcript Degradation.</a> Genome Research. 13 (2), 216-223 (2003).</li>
<li>Tudek, A., Candelli, T., Libri, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-coding+transcription+by+RNA+polymerase+II+in+yeast%3A+Hasard+or+n%C3%A9cessit%C3%A9%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Non-coding transcription by RNA polymerase II in yeast: Hasard or nécessité?</a> Biochimie. 117, 28-36 (2015).</li>
<li>Lingaraju, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MTR4+helicase+recruits+nuclear+adaptors+of+the+human+RNA+exosome+using+distinct+arch-interacting+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The MTR4 helicase recruits nuclear adaptors of the human RNA exosome using distinct arch-interacting motifs.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).</li>
<li>Lubas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+Profiling+Identifies+the+Human+Nuclear+Exosome+Targeting+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Interaction Profiling Identifies the Human Nuclear Exosome Targeting Complex.</a> Molecular Cell. 43 (4), 624-637 (2011).</li>
<li>Conrad, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+complex+associated+with+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A yeast heterogeneous nuclear ribonucleoprotein complex associated with RNA polymerase II.</a> Genetics. 154 (2), 557-571 (2000).</li>
<li>Darby, M. M., Serebreni, L., Pan, X., Boeke, J. D., Corden, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Saccharomyces+cerevisiae+Nrd1-Nab3+Transcription+Termination+Pathway+Acts+in+Opposition+to+Ras+Signaling+and+Mediates+Response+to+Nutrient+Depletion%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">The Saccharomyces cerevisiae Nrd1-Nab3 Transcription Termination Pathway Acts in Opposition to Ras Signaling and Mediates Response to Nutrient Depletion.</a> Molecular and Cellular Biology. 32 (10), 1762-1775 (2012).</li>
<li>Webb, S., Hector, R. D., Kudla, G., Granneman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAR-CLIP+data+indicate+that+Nrd1-Nab3-dependent+transcription+termination+regulates+expression+of+hundreds+of+protein+coding+genes+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">PAR-CLIP data indicate that Nrd1-Nab3-dependent transcription termination regulates expression of hundreds of protein coding genes in yeast.</a> Genome Biology. 15 (1), R8(2014).</li>
<li>Jensen, T. H., Jacquier, A., Libri, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dealing+with+Pervasive+Transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Dealing with Pervasive Transcription.</a> Molecular Cell. 52 (4), 473-484 (2013).</li>
<li>van Dijk, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XUTs+are+a+class+of+Xrn1-sensitive+antisense+regulatory+non-coding+RNA+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">XUTs are a class of Xrn1-sensitive antisense regulatory non-coding RNA in yeast.</a> Nature. 475 (7354), 114-117 (2011).</li>
<li>Thiebaut, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Futile+Cycle+of+Transcription+Initiation+and+Termination+Modulates+the+Response+to+Nucleotide+Shortage+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Futile Cycle of Transcription Initiation and Termination Modulates the Response to Nucleotide Shortage in S. cerevisiae.</a> Molecular Cell. 31 (5), 671-682 (2008).</li>
<li>Merran, J., Corden, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+RNA-Binding+Protein+Nab3+Regulates+Genes+Involved+in+Nitrogen+Metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Yeast RNA-Binding Protein Nab3 Regulates Genes Involved in Nitrogen Metabolism.</a> Molecular and Cellular Biology. 37 (18), e00154-e00117 (2017).</li>
<li>Bresson, S., Tuck, A., Staneva, D., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+RNA+Decay+Pathways+Aid+Rapid+Remodeling+of+Gene+Expression+in+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear RNA Decay Pathways Aid Rapid Remodeling of Gene Expression in Yeast.</a> Molecular Cell. 65 (5), 787-800 (2017).</li>
<li>Buchbender, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+library+preparation+with+the+new+iCLIP2+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Improved library preparation with the new iCLIP2 protocol.</a> Methods. , (2019).</li>
</ol>

A. Langford i W. Worboys są powiązani z firmą handlową UVO3. Nie odgrywali oni żadnej roli w projektowaniu badań, gromadzeniu i interpretacji danych ani w podejmowaniu decyzji o przesłaniu pracy do publikacji.

Metoda χCRAC, w połączeniu z nowymi urządzeniami do sieciowania i pobierania komórek, ma ogromny potencjał, ponieważ ma zastosowanie do szerokiego zakresu organizmów modelowych, a zatem powinna być przedmiotem ogólnego zainteresowania w dziedzinie RNA. Istnieje wiele obszarów, w których χCRAC może być wykorzystany. Na przykład metoda ta może być wykorzystana do pomiaru hierarchicznego składania białek w duże kompleksy makromolekularne, takie jak spliceosom i rybosom, co często wiąże się z dynamicznymi interakcjami między białkami a cząsteczkami RNA. Obecnie rutynowo używamy go również do monitorowania interakcji między czynnikami rozpadu RNA a ich substratami, gdy komórki są poddawane różnego rodzaju stresom. Dzięki temu możemy określić, na jakim etapie odpowiedzi adaptacyjnej czynniki te są najbardziej aktywne, z jakimi substratami się wiążą i jak dynamiczne są te interakcje. Takie dane powinny umożliwić naukowcom określenie względnego wkładu każdego czynnika w adaptację do zmian środowiskowych.
χCRAC wykorzystuje znaczniki oczyszczania o podwójnym powinowactwie (HTF lub HTP) do oczyszczania białka w bardzo rygorystycznych i denaturujących warunkach. Gwarantuje to, że oczyszczone RNA jest wysoce wzbogacone o RNA, które były kowalencyjnie usieciowane z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Jednak poleganie na tagach powinowactwa ma wady. Na przykład znacznik może zakłócać funkcję białka, co może powodować zniekształcony odczyt interaktomii wiążącego RNA. Ponadto w przypadku niektórych organizmów modelowych wykorzystanie znaczników może nie zawsze być możliwe, ponieważ narzędzia genetyczne do integracji fragmentów DNA z genomem lub przekształcania plazmidów ekspresyjnych nie są jeszcze dostępne. Jednak łatwo jest zmienić niektóre części protokołu χCRAC, aby był kompatybilny z protokołami opartymi na CLIP, które opierają się na przeciwciałach do oczyszczania RBP. Rzeczywiście, to badanie wykazało, że możliwe jest połączenie oczyszczania opartego na iCLIP z naszym środkiem sieciującym. Obecnie jesteśmy w trakcie opracowywania protokołów CLIP w celu zbadania czasowego związku ludzkich białek wiążących RNA z powstającymi transkryptami RNA.
Podczas wykonywania χCRAC na nowym białku należy zoptymalizować ekspozycję na promieniowanie UV, aby wywołać maksymalne sieciowanie. Jest to ważne, ponieważ wysoka ekspozycja na promieniowanie UV może zmniejszyć odzysk RNA na etapie oczyszczania. Komórki wykazujące ekspresję rekombinowanego RBP poddano działaniu różnych dawek UV, 100 mJ/cm2, 250 mJ/cm2, 500 mJ/cm2 i 1 J/cm2. RNP zostały następnie przechwycone, a RNA zostały rozdrobnione i znakowane radioizotopem. Następnie RNP zostały rozwiązane za pomocą SDS-PAGE i wykonano autoradiogram w celu wywnioskowania, która ekspozycja dała najbardziej intensywny sygnał (tj. maksymalne sieciowanie).
Po zoptymalizowaniu warunków eksperymentalnych zaleca się przeprowadzenie kilku eksperymentów kontrolnych podczas wykonywania χCRAC. Po pierwsze, naświetlana promieniami UV, nieoznakowana próbka może być użyta do monitorowania wiązania tła z kulkami oczyszczającymi. Po drugie, przy zastosowaniu χCRAC podczas eksperymentu przesunięciowego, drugi szereg czasowy, w którym komórki są przesuwane z powrotem do pierwotnego podłoża, umożliwia zbadanie, czy sama filtracja komórek indukuje zmiany w poziomach RNA lub interakcje białko-RNA.
Jak wspomniano we Wprowadzeniu, liczne ostatnio opublikowane artykuły sugerują szereg optymalizacji protokołu CLIP. Obejmuje to zastosowanie znakowanych fluorescencyjnie adapterów do wykrywania kompleksu białko-RNA poprzez skanowanie w podczerwieni10, a także optymalizacje różnych etapów oczyszczania kwasów nukleinowych i wyboru rozmiaru, które wykazano w celu zwiększenia złożoności powstałych bibliotek12,45. Obecnie wdrażamy niektóre z tych ulepszeń, aby jeszcze bardziej udoskonalić protokół χCRAC. Przedstawiony tutaj protokół zawiera już szereg ulepszeń w stosunku do oryginalnych protokołów CRAC i χCRAC, które zwiększają złożoność danych. Na przykład wcześniej, po rozpuszczeniu usieciowanych, radioaktywnych kompleksów białko-RNA na żelach SDS-PAGE, przeniesiono je do membrany nitrocelulozowej, a usieciowany RNA wyizolowano z plamy. Jednak przenoszenie RNP i późniejsza ekstrakcja RNA może być bardzo nieefektywna, szczególnie w przypadku dużych RBP, takich jak podjednostki polimerazy RNA. Może to spowodować znaczne zmniejszenie odzysku usieciowanego RNA. W obecnym protokole usieciowany RNA jest ekstrahowany bezpośrednio z plastrów żelu SDS-PAGE, jak pokazano na rysunku 1. Zwiększyło to odzyskiwanie usieciowanych RNA. Dodatkowo, po amplifikacji cDNA metodą PCR, produkt został pierwotnie rozdzielony na 3%, niskotopliwych żelach agarozowych, a następnie z żelu wyekstrahowano produkty PCR o gęstości 175–300 pz. Jednak żele te mogą być łatwo przeciążone, co skutkuje bardzo słabą separacją DNA. Zastąpienie żeli agarozowych prefabrykowanymi żelami TBE zaowocowało bardziej spójną separacją wielkości i lepszym odzyskiwaniem produktów PCR.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61027">Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC</a>. The Authors section was updated from:
Stuart W. McKellar1 
Ivayla Ivanova1 
Robert W. van Nues2 
Ross A. Cordiner3 
Will Worboys4 
Andrew Langford4 
Torben Heick Jensen3 
Sander Granneman1 
1Centre for Synthetic and Systems Biology, University of Edinburgh 
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.
to:
Stuart W. McKellar1 
Ivayla Ivanova1 
Robert W. van Nues2 
Ross A. Cordiner3 
Mehak Chauhan1 
Niki&#160;Christopoulou1 
Will Worboys4 
Andrew Langford4 
Torben Heick Jensen3 
Sander Granneman1 
1Centre for Engineering Biology, University of Edinburgh 
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61027">Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC

RNA często polegają na RBP, aby pełnić swoją funkcję, co doprowadziło do dużego zainteresowania zrozumieniem dynamiki między tymi cząsteczkami. Wiele RBP zidentyfikowano w wielu różnych organizmach. Jednak badanie interakcji RBP-RNA in vivo zawsze było niezwykle trudne. Duży przełom w badaniu takich interakcji nastąpił wraz z pojawieniem się CLIP1. Metoda ta wykorzystuje promieniowanie ultrafioletowe (UV, 254 nm) do indukowania wiązań kowalencyjnych między RBP a ich bezpośrednio związanymi RNA (tj. sieciowanie na zerową odległość). Następnie RBP będący przedmiotem zainteresowania jest oczyszczany immunologicznie w rygorystycznych warunkach, aby zapewnić, że identyfikowane są tylko RNA walencyjnie usieciowane z białkami. Związane RNA są następnie częściowo trawione przez RNazy, a następnie przekształcane w biblioteki cDNA w celu sekwencjonowania. Wysoka rygorystyczność oczyszczania jest ważna, ponieważ znacznie zwiększa specyficzność odzyskiwania białek i RNA, która jest również dodatkowo wzmacniana przez oczyszczanie SDS-PAGE z usieciowanego kompleksu rybonukleoproteiny (RNP). CLIP i pokrewne metody zapewniają również wgląd w rozdzielczość nukleotydów w miejscu wiązania białka, ponieważ podczas przygotowywania biblioteki sekwencjonowania aminokwasy, które usieciowały RNA, często przerywają odwrotną transkryptazę lub powodują, że enzym wprowadza mutacje w tym miejscu1,2,3.
Od momentu wprowadzenia, oryginalny protokół CLIP stworzył niezwykłą różnorodność metodologii pochodnych. Szczególnie ważnym przełomem było opracowanie HITS-CLIP (lub CLIP-seq), które łączy sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości z podejściem CLIP3. Od tego czasu zostało to przyjęte we wszystkich metodologiach opartych na CLIP. W ramach projektu iCLIP wprowadzono ulepszenia w technikach przycinania i ligacji adaptorowej za pośrednictwem RNazy, które ułatwiają dokładniejsze mapowanie miejsc wiązania RBP4. W ramach projektu PAR-CLIP połączono znakowanie 4tio-urydyny/uracylu z sieciowaniem w odległości 365 nm, co umożliwiło mapowanie miejsc sieciowania poprzez analizę podstawień T-C5. CRAC, urea-iCLIP, dCLIP i uvCLAP wprowadziły warunki denaturacji i etapy oczyszczania o podwójnym powinowactwie, które jeszcze bardziej zmniejszają wiązanie tła z żywicą powinowactwa i dodatkowo zwiększają swoistość wychwytywania białek2,6,7,8,9. Ponadto w ramach projektów CRAC, uvCLAP i dCLIP wprowadzono znakowanie RBP będącego przedmiotem zainteresowania znacznikiem powinowactwa, eliminując w ten sposób potrzebę generowania specyficznych przeciwciał.
Dokonano również kilku optymalizacji w celu przyspieszenia metodologii CLIP. Oryginalny protokół CLIP wykorzystywał znakowanie radioaktywne wychwyconych RNA w celu wizualizacji kompleksów RBP-RNA po SDS-PAGE. Jednak stosowanie promieniotwórczości może być problematyczne dla laboratoriów, które nie są przystosowane do takiej pracy. irCLIP zawiera adapter sprzężony z fluoroforem, który ułatwia wizualizację poprzez obrazowanie w podczerwieni10, a sCLIP wykorzystuje biotynylację wychwyconych RNA w celu ich wizualizacji za pomocą sprzężonej ze streptawidyną HRP11. Co więcej, eCLIP całkowicie rezygnuje z znakowania RNA; Zamiast tego białko jest wycinane wyłącznie na podstawie znanego rozmiaru12. Oczyszczanie oparte na streptawidynie zostało również wykorzystane do przyspieszenia procesu przygotowania biblioteki w FAST-iCLIP, gdzie biotynylowany adapter 3' jest ligowany na RNA i używany do umożliwienia oczyszczania po odwrotnej transkrypcji i cyrkularyzacji13. Dodatkowe ulepszenia protokołu iCLIP również znacznie zwiększyły złożoność bibliotek4.
Na koniec, CLIP został zmodyfikowany, aby umożliwić przechwytywanie RBP z różnych podprzedziałów komórkowych14,15, do wizualizacji nowo transkrybowanych RNA za pomocą pulsacyjnej indukcji fotoaktywowanych rybonukleozydów5,16,17, aby wychwycić metylowane RNAs18,19,20, do badania interakcji RNA-RNA21,22, oraz do mapowania 3' ends23,24.
Pomimo ogromnego wkładu technik opartych na CLIP w naszym zrozumieniu interakcji między RBP i RNA, zostało to ograniczone przez nieefektywność sieciowania UV. Chociaż komórki hodowlane hodowane w monowarstwie są na ogół stosunkowo łatwe do sieciowania, jest to znacznie trudniejsze w tkankach lub komórkach w roztworze. Tkanki mogą wymagać wielu rund ekspozycji na promieniowanie UV, aby przeniknąć do wymaganych warstw komórkowych, podczas gdy komórki drobnoustrojów są często hodowane w bogatych pożywkach, które zawierają aromatyczne związki pochłaniające promieniowanie UV25. Rzeczywiście, czasy naświetlania promieniami UV do 30 minut zostały wykorzystane do wygenerowania wystarczającego usieciowania między RBP a związanymi z nimi RNA dla takich próbek26,27,28. Ta przedłużona ekspozycja na promieniowanie UV wywołuje reakcje stresowe w komórce, takie jak uszkodzenia DNA wywołane promieniowaniem UV, które mogą zanieczyścić dane końcowe w niektórych zastosowaniach.
Większość badań CLIP skupia się na generowaniu pojedynczych "migawek" specyficznych interakcji białko-RNA w komórce. Jednak interakcje białko-RNA są z natury dynamiczne, szczególnie gdy komórki podlegają zmianom w swoim środowisku. Może to obejmować nagłe zmniejszenie dostępności niezbędnych składników odżywczych lub gwałtowne zmiany temperatury. W związku z tym, aby w pełni zrozumieć rolę RBP podczas stresu, najlepiej jest przeprowadzić analizy czasowo-rozdzielcze, ponieważ mogą one uchwycić pełne spektrum celów RBP podczas stresu i określić, na jakim etapie reakcji na stres wybrany RBP jest aktywny. W szczególności badania na drożdżach wykazały, że pierwsze kilka minut adaptacji jest absolutnie kluczowe dla przetrwania, a okres półtrwania RNA u bakterii może wahać się od minut do sekund29,30,31,32,33. Dlatego najlepiej byłoby, gdyby takie analizy czasowo-rozdzielcze były wykonywane w wysokiej rozdzielczości czasowej. Jednak długi czas sieciowania sprawia, że badanie reakcji adaptacyjnych na wczesnym etapie jest szczególnie trudne.
Aby przezwyciężyć te problemy, niedawno opracowaliśmy ulepszoną metodę, która jest w stanie sieciować i zbierać komórki w minutowych skalach czasowych. Nasza metoda χCRAC pozwala na ilościowy pomiar dynamicznych zmian w oddziaływaniach RBP-RNA w nieobserwowanej wcześniej rozdzielczości. Kluczowe znaczenie dla tej metody miało opracowanie nowatorskiego urządzenia do naświetlania promieniami UV32, które około 10-krotnie skraca wymagany czas sieciowania drożdży i bakterii w roztworze, skutecznie zamrażając interakcje RBP-RNA. Ponadto, w celu szybkiego zebrania komórek po naświetlaniu promieniami UV, opracowaliśmy urządzenie do filtracji próżniowej, które może zbierać gwałtownie rosnące drożdże w kulturze o pojemności 0,5 l w około 30 s32. Te innowacje technologiczne pozwalają na badanie dynamiki RBP-RNA w rozdzielczości minutowej. Dodatkowo wprowadziliśmy również kilka optymalizacji do oryginalnego protokołu CRAC2 w celu zwiększenia jego praktyczności.
Korzystając z χCRAC, niedawno badaliśmy cel drożdżowego jądrowego RBP, Nab3, w odpowiedzi na niedobór glukozy. U Saccharomyces cerevisiae Nab3 może tworzyć kompleks z Nrd1, RBP i helikazą RNA Sen1, tworząc kompleks NNS. Wiązanie NNS z polimerazą RNA i powstającym transkryptem może wywołać terminację transkrypcji34. Kompleks ten jest głównie zaangażowany w usuwanie tajemniczych niekodujących transkryptów RNA, ale wykazano również, że reguluje ekspresję genów kodujących białka. Badanie wykazało zróżnicowane ukierunkowanie Nab3 na transkrypty niekodujące i kodujące już po minucie stresu32. Wykazaliśmy, że kotranskrypcyjna terminacja przez Nab3 powoduje bardzo przejściową, pulsacyjną ekspresję genów retrotranspozonów, która byłaby trudna do wykrycia przy użyciu tradycyjnych podejść opartych na CLIP. Dodatkowo, krótkie czasy naświetlania promieniami UV w naszym sieciowniku UV również znacznie zwiększyły odzysk krótkożyciowych niekodujących RNAs32. χCRAC będzie prawdopodobnie kluczowym narzędziem w wyjaśnianiu nie tylko, w jaki sposób RBP kształtują reakcję na stres w bezpośrednich skalach czasowych, ale także ich zmieniających się ról w całym cyklu życia odpowiedzi. Niniejszy manuskrypt zawiera szczegółowy przegląd wszystkich etapów protokołu χCRAC. W celach ilustracyjnych metoda ta została wykorzystana do zbadania drożdżowego białka Nrd1, które bierze udział w terminacji transkrypcji i rozpadzie RNA35,36, oraz jego docelowego RNA w odpowiedzi na deprywację glukozy w wielu punktach czasowych. Na koniec wykazaliśmy również, że nasze urządzenie do naświetlania promieniami UV może szybko sieciować RBP z RNA w komórkach HeLa, umożliwiając również wykonywanie analiz czasowo-rozdzielczych o wysokiej rozdzielczości w komórkach przylegających.

<table><tbody><tr><td>1,4-ditioreitol</td><td>Merck</td><td>10708984001</td><td>Składnik buforowy w lizie komórek ssaków</td></tr><tr><td>1,5 ml probówki</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.086</td><td>Probówka do reakcji</td></tr><tr><td>ogólnej 2 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030 123.344</td><td>Do przechowywania kolumn i zbierania odpadów</td></tr><tr><td>32P-yATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG502Z-250</td><td>Do znakowania radioizotopem końca 5' RNA</td></tr><tr><td>4-12% Bis-Tris żel</td><td>Invitrogen</td><td>NP0321BOX</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>żel 4X bufor ładujący</td><td>Novex</td><td>NP0008</td><td>Koncentrat barwnika ładującego białko</td></tr><tr><td>50 pz drabinka</td><td>New England Biolabs</td><td>N3236</td><td>Drabinka referencyjna do wycinania obszaru zainteresowania z amplifikowanej biblioteki cDNA</td></tr><tr><td>50% PEG</td><td>NEB</td><td>B100045</td><td>Do podwiązania łącznika L5</td></tr><tr><td>6% żel TBE</td><td>Invitrogen</td><td>EC6265BOX</td><td>Do separacji i oczyszczania biblioteki cDNA</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>ACROS Organics</td><td>423245000</td><td>Mycie białek wytrąconych TCA</td></tr><tr><td>Koraliki anty-FLAG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8823-1ML</td><td>Do oczyszczania RBP znakowanych flagą</td></tr><tr><td>ATP (100 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0441</td><td>Do ligacji łącznika L5 na końcu 5' wychwyconych RNA</td></tr><tr><td>Beta-merkaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148-100ML</td><td>Składnik buforowy</td></tr><tr><td>Biomax MS ekran intensyfikujący</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z363162-1EA</td><td>Do intensyfikacji sygnału autoradiogramu</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1010219</td><td>Do ekstrakcji fenolowo-chloroformowej po oczyszczeniu RNA</td></tr><tr><td>cOmplete koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>Do hamowania proteaz komórkowych po lizie</td></tr><tr><td>Kompletna mieszanka suplementów -TRP</td><td>Formedium</td><td>DCS0149</td><td>Do przygotowania syntetycznego zdefiniowanego podłoża</td></tr><tr><td>Costar Spin-X 0,22 &micro; Filtry m</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS8160</td><td>Do izolowania wyciętych cDNA po ekstrakcji żelem</td></tr><tr><td>DNaza RQ1</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>Do trawienia DNA po lizie</td></tr><tr><td>komórek dNTP (10 mM)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>4638956001</td><td>Do odwrotnej transkrypcji i PCR</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10041814</td><td>Do ekstrakcji fenolowo-chloroformowej po oczyszczeniu RNA i DNA wytrącanie</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy</td><td>Invitrogen</td><td>AM9261</td><td>Do buforu proteazy K</td></tr><tr><td>Egzonukleaza I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0293</td><td>Do degradacji starterów po PCR</td></tr><tr><td>Filtry z mikrowłókna szklanego</td><td>Whatman</td><td>1823-010</td><td>Do izolowania wyciętych cDNA po ekstrakcji żelem</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Formedium</td><td>GLU03</td><td>Do przygotowania zawierającego glukozę, syntetycznego zdefiniowanego podłoża</td></tr><tr><td>glikogenu (20 mg/ml)</td><td>Roche</td><td>10901393001</td><td>Wytrącanie białek, RNA i DNA</td></tr><tr><td>GST-TEV</td><td>Protokół</td><td></td> domowej <td>konstrukcji i oczyszczania jest dostępny na żądanie</td></tr><tr><td>Hydrochlorodek guanidu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10071503</td><td>Wymagany do warunków denaturacji pulldown i buforu</td></tr> <tr>myjącego<td>Kulki IgG</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0969-01</td><td>Do oczyszczania białek RBP znakowanych A</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I2399-100G</td><td>Do elucji wychwyconych białek z kulek niklowych</td></tr><tr><td>Alkohol izoamylowy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A393-500</td><td>Do ekstrakcji fenolowo-chloroformowej po oczyszczeniu RNA</td></tr><tr><td>Luna Universal One-Step RT-qPCR</td><td>NEB</td><td>E3005S</td><td>Do qPCR cDNA w celu obliczenia wymaganej liczby cykli PCR</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Fluka Analytical</td><td>63020-1L</td><td>Do bufora PNK</td></tr><tr><td>Filtry membranowe</td><td>Millipore</td><td>AAWP09000 na drożdże lub HAWP09000 na bakterie</td><td>Do filtracji próżniowej komórek</td></tr><tr><td>Kolumny mikrobiospinowe</td><td>Biorad</td><td>732-6204</td><td>Do zbierania eluatu po ekstrakcji żelu</td></tr><tr><td>Kulki Ni-NTA</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td>Do wtórnego wychwytywania białek</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I8896-100ML</td><td>Składnik buforowy</td></tr><tr><td>Polimeraza</td><td>Pfu Promega</td><td>M7741</td><td>Do amplifikacji biblioteki cDNA</td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4682-400ML</td><td>Do ekstrakcji fenolowo-chloroformowej po oczyszczeniu RNA</td></tr><tr><td>Pierce Kolumny wirowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69725</td><td>Do nakolumnowych reakcji enzymatycznych</td></tr><tr><td>Proteaza K</td><td></td><td>Roche 3115887001</td><td>Do degradacji RBP po ekstrakcji żelem</td></tr><tr><td>Kwarcowa szalka Petriego</td><td>UVO3</td><td>N/A</td><td>Do sieciowania przylegających komórek. Dostępne od https://www.vari-x-link.com za 400 GBP</td></tr><tr><td>Filmy radiograficzne</td><td>Amersham</td><td>28906843</td><td>Do wizualizacji autoradiograficznej</td></tr><tr><td>Koraliki RNAClean XP</td><td>Beckmann</td><td>A63987</td><td>Koraliki SPRI do oczyszczania RNA i cDNA</td></tr><tr><td>RNaza H New</td><td>England Biolabs</td><td>M0297</td><td>Do degradacji RNA po odwrotnej transkrypcji</td></tr><tr><td>RNase-It</td><td>Agilent</td><td>400720</td><td>Do trawienia RNA</td></tr><tr><td>rRNasin</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td>Do hamowania wszelkich zanieczyszczających RNaz podczas reakcji enzymatycznej</td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889-1KG</td><td>Do ekstrakcji fenolowo-chloroformowej po oczyszczeniu RNA i wytrąceniu DNA</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td>Składnik buforowy</td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6750-100G</td><td>Składnik buforowy w lizie komórek ssaków</td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771-1KG</td><td>Do buforu proteazy K</td></tr><tr><td>SUPERase-In</td><td>Invitrogen</td><td>AM2694</td><td>Do hamowania komórkowych RNaz po lizie</td></tr><tr><td>SuperScript IV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18090010</td><td>Do odwrotnej transkrypcji</td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201</td><td>Do znakowania radioizotopem końca 5' RNA</td></tr><tr><td>Ligazy T4 RNA 1</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204</td><td>Do ligacji adaptera L5 na końcu RNA 5'</td></tr><tr><td>Ligaza RNazy T4 2, obcięta K222Q</td><td>NEB</td><td>M0351S</td><td>Do ligacji łącznika App_PE na końcu 3' wychwyconego RNA</td></tr><tr><td>Bufor TBE (10X)</td><td>Invitrogen</td><td>15581-028</td><td>Do uruchamiania żeli TBE</td></tr><tr><td>Proteaza TEV</td><td>Domowej roboty</td><td></td><td>Do elucji wychwyconych białek po wychwycie LGR</td></tr><tr><td>Termoczuła fosfataza alkaliczna</td><td>Promega</td><td>M9910</td><td>Do defosforylacji 5' i 3' RNA</td></tr><tr><td>Kwas trichlorooctowy (100%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0699-100ML</td><td>Do wytrącania kompleksów RBP-RNA</td></tr><tr><td>Chlorowodorek Tris</td><td>Invitrogen</td><td>15504-020</td><td>Składnik buforowy</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787-100ML</td><td>Składnik buforowy w lizie komórek ssaków</td></tr><tr><td>Vari Filter</td><td>UVO3</td><td>N/A</td><td>Urządzenie do próżniowego zbierania komórek. Dostępne od https://www.vari-x-link.com dla 100 GBP</td></tr><tr><td>Vari-X-Linker</td><td>UVO3</td><td>N/A</td><td>Cross-linker do ogniw sieciujących. Dostępne od https://www.vari-x-link.com za 16 000 GBP</td></tr><tr><td>Drożdżowa baza azotowa</td><td>Formedium</td><td>CYN0410</td><td>Do przygotowania syntetycznego zdefiniowanego podłoża</td></tr><tr><td>Kulki cyrkonowe</td><td>Thistle</td><td>11079105Z dla drożdży lub 11079101Z dla bakterii</td><td>Do lizy komórek poprzez ubijanie kulek</td></tr></tbody></table>

monitorowanie dynamiki interakcji białko-rna in vivo w wysokiej rozdzielczości czasowej przy użyciu χcrac

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Interakcja między białkami wiążącymi RNA (RBP) a ich substratami RNA wykazuje płynność i złożoność. W ciągu swojego życia pojedynczy RNA może być związany przez wiele różnych RBP, które będą regulować jego produkcję, stabilność, aktywność i degradację. W związku z tym zrobiono wiele, aby zrozumieć dynamikę, która istnieje między tymi dwoma typami cząsteczek. Szczególnie ważny przełom nastąpił wraz z pojawieniem się "cross-l inking and immunoprecipitation" (CLIP). Technika ta pozwoliła na rygorystyczne badanie, które RNA są związane przez określony RBP. Krótko mówiąc, interesujące białko jest sieciowane promieniami UV z jego substratami RNA in vivo, oczyszczane w bardzo rygorystycznych warunkach, a następnie RNA kowalencyjnie usieciowane z białkiem są przekształcane w biblioteki cDNA i sekwencjonowane. Od momentu powstania opracowano wiele technik pochodnych, aby CLIP był podatny na poszczególne kierunki nauki. Jednak sieciowanie za pomocą światła ultrafioletowego jest notorycznie nieefektywne. Powoduje to wydłużenie czasu ekspozycji, które uniemożliwia czasowe badanie interakcji RBP-RNA. Aby przezwyciężyć ten problem, niedawno zaprojektowaliśmy i zbudowaliśmy znacznie ulepszone urządzenia do naświetlania promieniowaniem UV i zbierania komórek. Korzystając z tych nowych narzędzi, opracowaliśmy protokół czasowo-rozdzielczych analiz interakcji RBP-RNA w żywych komórkach w wysokiej rozdzielczości czasowej: Kinetic CRoss-linking and Analysis of cDNAs (χCRAC). Niedawno wykorzystaliśmy tę technikę do zbadania roli drożdżowych RBP w adaptacji stresu pokarmowego. Niniejszy manuskrypt zawiera szczegółowy przegląd metody χCRAC i przedstawia najnowsze wyniki uzyskane za pomocą Nrd1 RBP.

Aby zademonstrować skuteczność metody χCRAC, przeprowadzono eksperyment z analizą przebiegu czasowego z użyciem szczepów drożdży eksponujących białko Nrd1 z etykietą HTP. Szczegółowy schemat przedstawiający zasadę działania tej metody znajduje się na Rysunku 1. Podobnie jak Nab3, białko Nrd1 bierze udział w jądrowej degradacji różnorodnych transkryptów RNA37. Wcześniejsze prace zespołu Corden sugerowały, że wiązanie Nrd1 z jego celami RNA zmienia się znacząco, gdy komórki są poddane głodzeniu glukozowemu28,38. W związku z tym komórki rosnące wykładniczo w medium zawierającym glukozę (SD-TRP) przeniesiono do tego samego medium bez glukozy (S-TRP) w określonych odstępach czasu, aby monitorować dynamiczne zmiany w oddziaływaniach Nrd1-RNA. Próbki pobrano i poddano sieciowaniu w komorze Vari-X-linker (Rysunek 3A) przed przeniesieniem, a następnie po 1, 2, 4, 8, 14 i 20 min. Medium stosowane do wzrostu komórek było celowo pozbawione tryptofanu, aby ograniczyć absorpcję promieniowania UV przez ten aminokwas aromatyczny. Należy pamiętać, że najlepiej stosować syntetyczne medium sterylizowane przez filtrację, ponieważ autoklawowanie medium może prowadzić do karmelizacji cukrów, co następnie obniża wydajność sieciowania.
Rysunek 4A przedstawia reprezentatywny autoradiogram z eksperymentu χCRAC. Należy zauważyć, że w tym przykładzie próbki nie zostały połączone. Zamiast tego każda z nich została poddana osobnej elektroforezie w żelu. Jest to zalecane podczas wstępnych testów eksperymentalnych, aby wykazać, że białko skutecznie sieciuje się z RNA we wszystkich badanych punktach czasowych. Szczególnie intensywny sygnał zaobserwowano przy spodziewanej masie cząsteczkowej RBP, co odpowiada białku związanemu z bardzo krótkimi, znakowanymi promieniotwórczo cząsteczkami RNA, które nie nadają się do sekwencjonowania. Dlatego wyizolowano rozmyty sygnał powyżej tego prążka, który reprezentuje białko sieciowane z dłuższymi fragmentami RNA. Fragment wycięto z obszaru tuż powyżej prążka białka, obejmując dodatkowo około 30 kDa. Rysunek 4B przedstawia autoradiogram po wycięciu, na którym białko sieciowane z krótkimi RNA pozostało w żelu, a wcześniej rozmyty sygnał został usunięty.
Po odwrotnej transkrypcji bibliotekę cDNA należy powielić za pomocą PCR. Należy jednak unikać nadmiernej amplifikacji biblioteki, ponieważ może to wprowadzić błąd w postaci preferencyjnego powielania niektórych sekwencji przez polimerazę oraz generować artefakty PCR. Nadmiernie powielone biblioteki zawierają również dużą liczbę sekwencji duplikowanych, co prowadzi do marnowania odczytów w sekwenatorze. Aby obliczyć optymalną liczbę cykli PCR dla amplifikacji końcowej biblioteki, alikwot cDNA powielono metodą qPCR z użyciem oligonukleotydów P5 i BC. Jako liczbę cykli PCR wybrano pierwszy cykl, w którym biblioteka osiągnęła szczyt fluorescencji. Rycina 4C przedstawia przykład qPCR z typowej biblioteki cDNA, w której szczytowa liczba cykli wyniosła 16. Wartość ta została następnie zastosowana w końcowej reakcji PCR dla χCRAC. W celu przetworzenia danych z sekwencjonowania wykorzystano oprogramowanie opracowane wcześniej w naszym laboratorium (pyCRAC) oraz odpowiadający mu rurociąg analityczny do analizy kinetycznych danych CRAC (Nues et al., 2017; https://git.ecdf.ed.ac.uk/sgrannem/pycrac, https://bitbucket.org/sgrann/kinetic_crac_pipeline/src/default/). Te narzędzia programistyczne typu open source umożliwiają demultipleksowanie i przycinanie danych, usuwanie duplikatów PCR, identyfikację statystycznie istotnych pików, grupowanie odczytów w sekwencje ciągłe oraz identyfikację motywów wiązania39. Dalsze szczegóły dotyczące działania tych narzędzi znajdują się na ich odpowiednich stronach internetowych.
Rozpoczęliśmy również opracowywanie protokołu χCRAC dla komórek ssaków. Większość linii komórkowych ssaków hodowana jest w monowarstwie, a taca w naszym urządzeniu do sieciowania z workiem przepuszczającym promienie UV nie nadaje się do eksperymentów z komórkami adherentnymi. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy platformę, która umożliwia naświetlanie UV 1–2 szalek Petriego (o średnicy 150 mm i głębokości 25 mm) z komórkami adherentnymi (Rycina 3B). W ramach pierwszego testu wydajność sieciowania dla komórek ssaków zmierzono poprzez sieciowanie i wychwytywanie stabilnie znakowanego białka GFP-RBM7 przy użyciu przeciwciał anty-GFP i tradycyjnej puryfikacji opartej na metodzie CLIP. Jak pokazano na Rycynie 5A, urządzenie do sieciowania pozwoliło na odzyskanie kompleksów białko-RNA z komórek ssaków hodowanych w monowarstwie przy użyciu promieniowania UV o długości 254 nm z wydajnością porównywalną do powszechnie stosowanego urządzenia do naświetlania UV. Jednak standardowe plastikowe naczynia do hodowli komórkowej, zwykle używane w eksperymentach z sieciowaniem UV, są nieprzepuszczalne dla promieniowania UV o długości 254 nm. W związku z tym, w naszym urządzeniu komórki otrzymywałyby naświetlanie tylko z górnego rzędu lamp UV. Aby temu zaradzić, opracowaliśmy przepuszczalną dla UV kwarcową szalkę Petriego do hodowli komórek i sieciowania. Zastosowanie kwarcowych naczyń hodowlanych wykazało skuteczne odzyskiwanie kompleksów białko-RNA już przy 2 s naświetlania UV (Rycina 5B). W połączeniu z metodami wychwytywania RBP dla komórek ssaków, takimi jak technologie CLIP, te krótkie czasy sieciowania są odpowiednie do badań kinetycznych w celu odzyskania spatiotemporalnych profili wiązania RNA przez RBP w odpowiedzi na stresy genotoksyczne lub szybką deplecję czynników białkowych, a także równolegle z synchronizacją transkrypcyjną lub cyklu komórkowego.
Rycina 6 przedstawia kilka przykładów danych Nrd1 przetworzonych za pomocą potoku χCRAC. Rycina ta została przygotowana przy użyciu plików bedgraph wygenerowanych przez potok oraz pakietu python GenomeBrowser (https://pypi.org/project/GenomeBrowser/1.6.3/), który zaprojektowaliśmy w celu uproszczenia tworzenia obrazów z przeglądarki genomu w jakości publikacyjnej. Szare prostokąty reprezentują regiony genomowe, w których ekspresowane są niekodujące RNA, takie jak kryptyczne niestabilne transkrypty (CUTs), stabilne niecharakteryzowane transkrypty (SUTs)40 oraz niestabilne transkrypty wrażliwe na Xrn1 (XUTs)41. Dane na Rycini 6 pokazują, że Nrd1 wiąże się z wieloma z tych niekodujących transkryptów RNA, co jest zgodne z tezą, że białko to uczestniczy w degradacji tej klasy transkryptów42. Rycina 6A przedstawia region o długości ~15 kb na chromosomie IV. Odnotowano tutaj znaczący wzrost wiązania Nrd1 do transkryptów kodujących wysokowydajne transportery glukozy HXT6 i HXT7, z których oba ulegają nadekspresji podczas głodzenia glukozowego. Prawdopodobnie terminacja transkrypcji przez kompleks NNS może wpływać na kinetykę indukcji tych genów podczas głodzenia glukozowego. Rycina 6B pokazuje przykład sieciowania Nrd1 z transkryptem Imd3, o którym wiadomo, że jest regulowany przez Nab343. W tym przypadku dane wykazały znaczną redukcję wiązania podczas głodzenia glukozowego. Wcześniejsze prace wykazały zmniejszone wiązanie Nab3 do transkryptu Tye7 podczas głodzenia glukozowego44. Zgodnie z tą obserwacją dane χCRAC sugerują, że wiązanie Nrd1 zmniejszyło się podczas głodzenia glukozowego, a sieciowanie Nrd1 z Tye7 było najniższe po 8 min stresu (Rycina 4C). Wydaje się jednak, że efekt ten był jedynie przejściowy, ponieważ po 14 min głodzenia glukozowego wiązanie Nrd1 powróciło do poziomów wyjściowych.
<img alt="Schemat sieciowania białko-RNA z etapami naświetlania UV, oczyszczania, Nu-PAGE i sekwencjonowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schematyczny przebieg protokołu χCRAC. Oznakowane szczepy hodowano do osiągnięcia pożądanej gęstości. RBP oznacza białko wiążące RNA. Następnie pobrano próbkę referencyjną i poddano ją sieciowaniu światłem UV o długości 254 nm. Pozostałe komórki zebrano poprzez filtrację, a następnie szybko przeniesiono do medium indukującego stres. W opisanym tutaj eksperymencie χCRAC próbki pobierano i sieciowano 1, 2, 4, 8, 14 i 20 min po przeniesieniu (1). Następnie oczyszczono interesujące RBP za pomocą wysokostringentnego dwuetapowego oczyszczania powinowactwa (2). Dalej, wychwycone sieciowane RNA poddano częściowemu trawieniu RNazami, znakowaniu radioaktywnym na końcu 5’ i ligacji adapterów (3). Adaptery 5’ zawierały unikalne sekwencje kodów kreskowych „in-read”, aby poszczególne próbki można było oddzielić bioinformatycznie po sekwencjonowaniu. Kompleksy RBP-RNA zostały następnie eluowane, połączone i wspólnie wytrącone (4), rozdzielone za pomocą SDS-PAGE i zwizualizowane poprzez autoradiografię (5). Następnie z żelu wycięto pojedynczy pasek zawierający sygnał radioaktywny tuż nad głównym prążkiem, zaznaczony czerwoną przerywaną ramką na obrazie autoradiograficznym (5). Paski żelu potraktowano proteazą K, a następnie wyekstrahowano RNA (6), przekształcono w cDNA i namnożono za pomocą PCR (7). Etap PCR wprowadził dodatkowe kody kreskowe (żółty blok wprowadzony przez oligo P7), dzięki czemu wiele bibliotek można było zmultipleksować w jednej ścieżce. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig1v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat układu naświetlania UV z systemem pompowym, filtrami zmiennymi i kontrolą przepływu do przetwarzania komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Sieciowanie i filtracja próżniowa. (A) Układ sieciujący. Zawiesinę komórkową wlewa się do lejka znajdującego się w prawym górnym rogu urządzenia (zob. również Rycina 3A dla zbliżenia), a następnie utrzymuje się ją w przezroczystym dla UV worku umieszczonym w środkowej tacy. Worek jest flankowany przez dwie przesłony, które pozostają zamknięte do momentu wydania przez użytkownika polecenia rozpoczęcia etapu naświetlania. Komórki są naświetlane światłem UV z tac znajdujących się zarówno powyżej, jak i poniżej. Urządzenie jest wyposażone w lampy UV o długości fali 254 nm i 365 nm, przy czym ta druga jest stosowana w eksperymentach PAR-CLIP. Obsługa urządzenia odbywa się za pomocą panelu dotykowego w prawym górnym rogu, który umożliwia kontrolę dawki UV lub czasu ekspozycji. (B) Po sieciowaniu komórki są odprowadzane z lewej strony urządzenia. Zawiesiny komórkowe są odzyskiwane za pomocą próżni i odprowadzane do kolby szklanej, z której mogą zostać następnie przelane do urządzenia do filtracji próżniowej w celu zbioru. (C) Urządzenia do filtracji próżniowej. Są one otwierane i zamykane za pomocą klipsa, pomiędzy który wkłada się filtr. W przypadku bardzo krótkich serii czasowych równolegle użyto czterech urządzeń filtrujących, aby nie tracić czasu na wymianę filtrów. (D) Po filtracji nadsącz pożywki był odprowadzany do kolb w celu późniejszej utylizacji. Poniżej urządzeń do filtracji próżniowej zainstalowano zawory, aby utrzymać próżnię w układzie po wyjęciu filtra. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig2v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Konfiguracja komory UV do naświetlania próbek; obejmuje wlot, tackę do hodowli oraz tackę na szalki Petriego do eksperymentów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Sieciowanie komórek w zawiesinie w porównaniu do komórek adherentnych. (A) Urządzenie do sieciowania z komorą Vari-X-linker dla komórek w zawiesinie. Hodowlę komórkową wlewa się do wlotu próbki (lejka) znajdującego się w prawym górnym rogu tacki. (B) Tacka, w której można umieścić plastikowe lub kwarcowe szalki Petriego do sieciowania komórek adherentnych lub małych objętości komórek w zawiesinie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig3v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza autoradiograficzna i qPCR; wyniki elektroforezy; ilościowe oznaczenie DNA; dane chromatogramu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Przygotowanie biblioteki. (A) Przykład autoradiogramu z eksperymentu Nrd1-HTP χCRAC. Silny, skoncentrowany sygnał reprezentuje białko sieciowane z bardzo krótkimi RNA, natomiast smuga powyżej reprezentuje białko sieciowane z RNA o długości wystarczającej do sekwencjonowania. (B) Smugę wycięto, co pokazano na autoradiogramie wykonanym po wycięciu fragmentu żelu. (C) Reprezentatywny wynik qPCR z biblioteki cDNA χCRAC. W tym przykładzie maksymalną amplifikację cDNA osiągnięto w 16 cyklach. Zatem do końcowej amplifikacji wykorzystano 16 cykli. Słupek błędu reprezentuje odchylenie standardowe trzech technicznych powtórzeń qPCR. (D) Przykład obrazu fosforowego biblioteki cDNA na żelu TBE 6%. (E) Analiza długości i jakości cDNA za pomocą kapilarnej elektroforezy na chipie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig4v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Elektroforeza żelowa i kwantyfikacja RBM7-GFP po ekspozycji na UV o różnej intensywności i czasie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig5v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Eksperyment iCLIP z wysoką aktywnością RNazy w celu przetestowania sieciowania w komórkach ssaków. Przedstawiono autoradiogramy z eksperymentów iCLIP GFP-RBM7, w których badano wydajność odzyskiwania RNP przy różnych energiach sieciowania. Immunoprecypitacje przeprowadzono z użyciem przeciwciał anty-GFP sprzężonych z kulkami magnetycznymi na sieciowanych komórkach stabilnie eksprimujących GFP-RBM7. Immunoprecypitaty inkubowano z wysokimi stężeniami RNazy I w celu przycięcia związanych RNA do krótkich, jednolitych długości. RNP wizualizowano poprzez znakowanie 32P i SDS-PAGE; migrują one jako wyraźny prążek, blisko poziomu migracji białka niesieciowanego. Kwantyfikacja przedstawia wyniki analiz densytometrycznych sygnału znakowanego promieniotwórczo RBM7-RNA znormalizowanego do sygnału western blot anty-GFP. (A) Kinetyka czasu sieciowania powszechnie stosowanego sieciowacza UVP w porównaniu z naszym sieciowaczem (Vari-X-linker; VxL). (B) Kinetyka czasu sieciowania naszego sieciowacza na naczyniach hodowlanych kwarcowych (lewo) i plastikowych (prawo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig5v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza ekspresji genów na chromosomach IV, XII, XV; wykresy RNA-seq pokazują czasowe rozkłady odczytów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig6v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Przykładowe wykresy z przeglądarki genomu pokazujące zdolność metody χCRAC do wykazania różnicowego i czasowego wiązania Nrd1 z jego celami. Każda ramka przedstawia wykresy dla poszczególnych regionów genomowych. Strzałki wskazują nić, na której zakodowane są geny (strzałka skierowana w lewo = nić minus; strzałka skierowana w prawo = nić plus). Punkty czasowe (min) są oznaczone jako t0, t1, t2 itd. na osiach y każdego wykresu pomocniczego. Podano rzymskie cyfry oznaczające chromosomy oraz współrzędne. (A) Po pozbawieniu glukozy Nrd1 wiąże dwa wysokopowinowate transportery glukozy, HXT6 i HXT7, które oba wykazują zwiększoną ekspresję w tych warunkach. (B) Zaobserwowano wiązanie Nrd1 z Imd3, który jest już zwalidowanym celem Nab344, przy czym intensywność wiązania maleje po głodzeniu glukozowym. (C) Wiązanie Tye7 przez Nrd1 ma charakter dynamiczny i przejściowy, zmniejszając się po głodzeniu glukozowym do minimum po 8 min stresu. Następnie jednak wiązanie powraca do poziomów podstawowych po 14 min. Odczyty zostały znormalizowane do „liczby odczytów na milion” (RPM; oś y). Szare pola oznaczają regiony kodujące niekodujące RNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig6v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Kinetyczne sieciowanie i analiza cDNA to metoda, która pozwala badać dynamikę interakcji białko-RNA w żywych komórkach w wysokiej rozdzielczości czasowej. Tutaj protokół jest szczegółowo opisany, w tym wzrost komórek drożdży, sieciowanie UV, zbieranie, oczyszczanie białek i etapy przygotowania biblioteki sekwencjonowania nowej generacji.

Monitorowanie dynamiki interakcji białko-RNA in vivo w wysokiej rozdzielczości czasowej przy użyciu χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Kinetic CRAC może być wykorzystany do badania czasowych powiązań między RNA i białkami wiążącymi RNA w niespotykanie krótkim czasie. W połączeniu z naszym środkiem sieciującym, kinetyczny CRAC jest w stanie usieciować żywe komórki w ciągu kilku sekund. Zmniejsza to reakcje na uszkodzenia spowodowane promieniowaniem UV i ułatwia badanie reakcji na stres w skali minutowej.Kinetic CRAC to bardzo długi protokół, który może być wyzwaniem dla nowych użytkowników. Dodatkowo, praca z RNA wiąże się z własnymi wyzwaniami. Aby zapobiec degradacji RNA, należy przefiltrować, wysterylizować wszystkie roztwory i upewnić się, że pipety i stół laboratoryjny są utrzymywane w czystości.Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ niektóre kroki nie są zbyt intuicyjne. Obejmuje to sieciowanie UV i pobieranie komórek, a także ekstrakcję usieciowanych RNA z żelu. Aby przeprowadzić sieciowanie UV na mikroorganizmach w roztworze, zaszczepij 3,5 litra pożądanej pożywki drożdżami do wyjściowego OD 600 0,05 i hoduj kulturę przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza z ciągłym wstrząsaniem przy 180 obr./min.Gdy komórki osiągną pożądaną średnicę zewnętrzną, wlej 500 mililitrów kultury bezpośrednio do środka sieciującego Vari-X-linker i naświetl ją 250 milidżulami promieniowania UV o długości 254 nanometrów. Po usieciowaniu użyj urządzenia do filtracji próżniowej, aby przefiltrować komórki. Zwiń membranę z przefiltrowanymi komórkami i umieść ją w 50-mililitrowej stożkowej rurce oznaczonej T0. Przefiltruj pozostałe komórki przez sześć różnych filtrów i wrzuć membrany do trzech litrów wstępnie podgrzanego podłoża wywołującego stres, mieszając je energicznie pipetą przez 50 sekund. Kontynuuj sieciowanie komórek w objętościach 500 mililitrów w żądanych punktach czasowych i przechowuj próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Aby usieciować przylegające komórki, przenieś kwarcową naczynie hodowlane z komórkami na specjalistyczną tacę i naświetl ją 300 milidżulami promieniowania UV o długości 254 nanometrów. Natychmiast umieść naczynie na lodzie. Usuń pożywkę wzrostową z naczynia i dodaj 10 mililitrów lodowatego PBS. Zbierz komórki przez skrobanie i przenieś je do 15-mililitrowej stożkowej probówki.Następnie granulować komórki przez odwirowanie w temperaturze 300 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po umyciu komórek PBS należy usunąć PBS i zatrzaskowo zamrozić granulki komórek na suchym lodzie. W razie potrzeby należy przechowywać próbkę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Ustaw wirówkę na cztery stopnie Celsjusza i przygotuj dwa rzędy probówek o pojemności 1,5 mililitra na próbkę do elucji. Szybko obróć kolumny za pomocą kulek niklowych, aby pozbyć się pustej objętości. Następnie umieść kolumny w pierwszym rzędzie probówek elucyjnych i napełnij je 200 mikrolitrami buforu elucyjnego.Po dwóch minutach szybko obróć kolumny i przenieś je do drugiego rzędu rurek. Następnie powtórzyć elucję, jak pokazano wcześniej. Po zakończeniu połącz wszystkie eluaty w pięciomililitrowej probówce i dodaj dwa mikrolitry po 20 miligramów na mililitr glikogenu.Następnie dodaj 100 mikrolitrów kwasu trójchlorooctowego do próbki i wiruj przez 30 sekund. Po umyciu próbki acetonem należy ją ponownie zawiesić w 30 mikrolitrach buforu ładującego białko. Następnie sprawdź radioaktywność za pomocą licznika Geigera.Podgrzewaj próbkę przez 10 minut w temperaturze 65 stopni Celsjusza i załaduj ją na jeden milimetr od czterech do 12% prefabrykowanego żelu Bis-Tris. Uruchom żel na 90 minut przy napięciu 125 V w buforze MOPS. Po zakończeniu owiń żel folią spożywczą i przymocuj go do wnętrza lekkiej, szczelnej kasety za pomocą taśmy.Po wystawieniu żelu na działanie automatycznej kliszy radiograficznej, wywołaj film, odcinając folię spożywczą pokrywającą żel, uważając, aby nie przesuwać żelu i nie przesuwać obrazu. Umieść folię na żelu i wytnij pasek, który Cię interesuje. Umieść plasterek żelu w dwumililitrowej tubce i zmiażdż go końcówką pipety P1000.Następnie dodać bufor proteinazy K i proteinazę K. Inkubować próbkę w temperaturze 55 stopni Celsjusza, energicznie wstrząsając. Uruchom cDNA na prefabrykowanym 6% żelu TBE o napięciu 100 woltów przez jedną godzinę, używając odpowiedniej drabinki do ilościowego oznaczania krótkich fragmentów DNA. Po zakończeniu umieść żel w płynnym pojemniku z wystarczającą ilością TBE, aby go przykryć, i dodaj odpowiednią ilość barwnika SYBR Safe.Plamić żel przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie zastąpić bufor zawierający SYBR świeżym KZM. Myj żel przez 10 minut, delikatnie wstrząsając.Odcedź KZM i umieść żel w przezroczystym folderze. Przytnij folder do odpowiedniego rozmiaru i zobrazuj żel za pomocą ilości obrazu. Wytnij fragmenty DNA od 175 do 400 par zasad i umieść kawałek żelu w tubce o pojemności 1,5 mililitra.Rozgnieć żel końcówką pipety P1000 i dodaj 400 mikrolitrów wody. Następnie inkubuj go przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając. Zamrażać próbkę na suchym lodzie przez 10 minut.Następnie powtórzyć inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Włóż dwa filtry z mikrowłókna szklanego do kolumny filtracyjnej umieszczonej w probówce. Następnie za pomocą przeciętej końcówki pipety P1000 przenieś zawiesinę żelu TBE do jednostki filtrującej i wiruj ją z prędkością 17 000 G przez 30 sekund.Protokół ten został wykorzystany do monitorowania interakcji Nrd1-RNA w komórkach drożdży poddanych działaniu środowiska pozbawionego glukozy. Próbki sieciowano przed przejściem na pożywkę bez glukozy, a także jedną, dwie, cztery, osiem, 14 i 20 minut po. Autoradiogramy z eksperymentu wykazały intensywny sygnał o oczekiwanej masie cząsteczkowej Nrd1, reprezentujący białko związane z krótkimi, znakowanymi radiowo RNA, które nie nadają się do sekwencjonowania.Sygnał powyżej tego pasma, który jest białkiem usieciowanym z dłuższymi fragmentami RNA, został wyizolowany. Aby zmienić protokół kinetyczny CRAC dla komórek ssaków, opracowano specjalny stopień, aby umożliwić naświetlanie promieniowaniem UV naczyń z przylegającymi komórkami. Wydajność tej konfiguracji mierzono poprzez sieciowanie i przechwytywanie stabilnie oznakowanego GFP RBM7.Środek sieciujący był w stanie odzyskać kompleksy białkowe RNA z komórek ssaków za pomocą promieniowania UV o długości 254 nanometrów z wydajnością porównywalną z powszechnie stosowanym urządzeniem do naświetlania promieniami UV. Opracowanie przepuszczającej promieniowanie UV kwarcowej płytki Petriego podczas sieciowania jeszcze bardziej przyczyniło się do odzyskania białkowych kompleksów RNA. Dane Nrd1 pokazują, że białko wiąże się z wieloma niekodującymi transkryptami RNA, co wskazuje, że bierze udział w degradacji tych transkryptów.Wykazano również wiązanie z transkryptami kodującymi HXT6 i HXT7, z których oba są regulowane w górę podczas głodu glukozy. Kinetic CRAC pozwala na pomiar dynamicznych interakcji między białkowymi RNA podczas rozwoju komórki, reakcji na stres i składania kompleksów wielkocząsteczkowych, takich jak rybosom lub spliceosom.

monitoring-protein-rna-interaction-dynamics-vivo-at-high-temporal

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ze względu na przejściowy charakter pre-mRNA, jego izolacja i badanie in vivo mogą być trudne. Przedstawiamy tutaj nowatorskie podejście in vitro do badania oddziaływań RNA-białko z wykorzystaniem syntetycznej puli oligonukleotydów, która pokrywa wybrane regiony pre-mRNA.

Szybka metoda wysokoprzepustowa mapowania rybonukleoprotein (RNP) na ludzkim pre-mRNA

Przestrzenne rozmieszczenie białek wiążących RNA na transkrypcie jest kluczowym czynnikiem regulacji potranskrypcyjnej. Opracowaliśmy zatem metodę sieciowania promieniami UV i immunoprecypitacji z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu (iCLIP), która umożliwia precyzyjne mapowanie w całym genomie miejsc wiązania białka wiążącego RNA.

iCLIP – Mapowanie oddziaływań białko-RNA w całym transkryptomie z rozdzielczością pojedynczych nukleotydów

Opisujemy metodę mikroskopii fluorescencyjnej, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), do obrazowania produkcji cząsteczek białka w żywych komórkach z precyzją pojedynczej cząsteczki bez zakłócania funkcjonalności białka. Metoda ta została wykorzystana do śledzenia stochastycznej dynamiki ekspresji czynnika transkrypcyjnego, represora λ CI 1.

Obrazowanie pojedynczej cząsteczki regulacji genów in vivo przy użyciu aktywacji kotranslacyjnej przez rozszczepienie (CoTrAC)

Ratiometryczne dwumolekularne latarnie (RBMB) mogą być używane do obrazowania pojedynczych transkryptów RNA w żywych komórkach. W tym miejscu opisujemy przygotowanie i oczyszczanie RBMB, dostarczanie RBMB do komórek za pomocą mikroporacji i obrazowanie fluorescencyjne pojedynczych transkryptów RNA w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym pojedynczych zmodyfikowanych transkryptów RNA w żywych komórkach przy użyciu ratiometrycznych latarni bimolekularnych

Tutaj prezentujemy protokół do wizualizacji, wykrywania, analizy i śledzenia endogennego transportu mRNA w żywej komorze jajowej Drosophila melanogaster za pomocą latarni molekularnych, mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem i oprogramowania do analizy open-source.

Wizualizacja i śledzenie endogennych mRNA w żywych komorach jajowych Drosophila melanogaster

Prezentujemy eksperymentalne podejścia do badania interakcji RNA dwuniciowych białek wiążących RNA, aktywowanych przez RNA (PKR) podczas cyklu komórkowego ssaków przy użyciu komórek HeLa. Metoda ta wykorzystuje formaldehyd do sieciowania kompleksów RNA-PKR i immunoprecypitacji w celu wzbogacenia RNA związanych z PKR. Te RNA mogą być dalej analizowane za pomocą sekwencjonowania o wysokiej przepustowości lub qRT-PCR.

Badanie interakcji RNA kinazy białkowej aktywowanej RNA podczas cyklu komórkowego ssaków

Ten protokół opisuje zastosowanie hybrydyzacji in situ fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFISH) do pomiaru kinetyki in vivo syntezy i degradacji mRNA.

Sondowanie kinetyki mRNA w czasie i przestrzeni u Escherichia coli przy użyciu dwukolorowej hybrydyzacji fluorescencji pojedynczej cząsteczki in situ

Śledzenie indywidualnych zdarzeń translacji pozwala na badania kinetyczne w wysokiej rozdzielczości mechanizmów translacji zależnych od czapek. Tutaj demonstrujemy test pojedynczej cząsteczki in vitro oparty na obrazowaniu interakcji między fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami a powstającymi peptydami znakowanymi epitopami. Metoda ta umożliwia jednocząsteczkową charakterystykę kinetyki inicjacji i wydłużania peptydów podczas aktywnej translacji in vitro zależnej od kapu.

Test obrazowania pojedynczych cząsteczek in vitro do analizy kinetyki translacji zależnej od czapeczki

Ten protokół opisuje konfigurację bioreaktora NMR w celu utrzymania żywotności zamkniętych komórek ludzkich przez okres do 72 godzin, po czym następuje czasowo-rozdzielcza akwizycja i analiza danych NMR w komórce. Metodologia ta jest stosowana do monitorowania wewnątrzkomórkowych oddziaływań białko-ligand w czasie rzeczywistym.

Monitorowanie interakcji białko-ligand w komórkach ludzkich za pomocą ilościowego NMR w komórce w czasie rzeczywistym przy użyciu bioreaktora o dużej gęstości komórek

Przedstawiamy tutaj protokół umożliwiający wychwycenie interakcji chromatyny DNA z RNA w celu mapowania trójwymiarowej organizacji genomu powiązanej z RNA.

Metoda interakcji chromatyny DNA z DNA związanej z RNA

Celem tego protokołu jest umożliwienie ilościowego pomiaru czasu życia fluorescencji sond Riboglow dla powtarzalnych przepływów pracy obrazowania RNA in vitro, w żywych komórkach ssaków i w trójwymiarowym modelu komórkowym. Przedstawiamy przykłady przygotowania próbek, dostarczania sond, pozyskiwania danych oraz przepływów pracy analizy ilościowej w celu pozyskania bezstronnego pomiaru czasu życia fluorescencji.

Charakteryzacja sond Riboglow in vitro jako podstawa dla fluorescencyjnego obrazowania czasu życia w żywych komórkach ssaków i trójwymiarowych modelach komórkowych

Poznaj metodę χCRAC do badania interakcji białko-RNA in vivo z wysoką rozdzielczością czasową. Technika umożliwia monitorowanie dynamiki wiązań w komórkach drożdży i ssaczych w czasie rzeczywistym.

Monitorowanie dynamiki interakcji białko-RNA in vivo w wysokiej rozdzielczości czasowej przy użyciu χCRAC

Przeglądaj więcej filmów