Name: Obrazowanie i analiza zmian całej aorty barwionych czerwienią olejową O w mysim modelu hiperlipidemii tętniaka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Naucz się analizy zmian miażdżycowych w mysim modelu hiperlipidemii z użyciem barwienia czerwienią olejową O. Ta metoda umożliwia ilościową i jakościową ocenę obciążenia miażdżycowego w badaniach genetycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była częściowo wspierana przez Mikrogrant Joint Biology Consortium udzielony w ramach grantu NIH P30AR070253 (P.-Y.C.) i HL135582 (M.S.). Jesteśmy wdzięczni R. Webberowi i L. Coonowi za utrzymanie myszy wykorzystanych w tym badaniu.

mT/mG (nr magazynowy 007676) i myszy Apoe-/- (nr stockowy 002052) zostały zakupione w Jackson Laboratory. Myszy Myh11-CreERT2 były prezentem od Stefana Offermannsa (dostępne w Jackson Laboratory pod numerem 019079). Myszy Tgfbr2fl / fl uzyskano od Harolda L. Mosesa (Vanderbilt University). Wszystkie zabiegi na zwierzętach zostały przeprowadzone przy użyciu protokołów zatwierdzonych przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Yale.
1. Myszy
<ol>
	<li>Wyprodukuj MYH11-CreERT2; mT/mGf/f; Apoe-/- oraz MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f; mT/mGf/f; Myszy Apoe-/- zgodnie z wcześniejszym opisem7. Hoduj zmutowane szczepy na tle C57BL/6J przez ponad dziesięć pokoleń. 
	UWAGA: Linia myszy Myh11-CreERT2 Cre stanowi potężne narzędzie do badania roli komórek mięśni gładkich w homeostazie naczyń i patologii naczyniowej. Allel Cre jest wprowadzany do chromosomu Y; Tak więc samice myszy nie wyrażają tego konstruktu.</li>
</ol>
2. Genotypowanie myszy, indukcja tamoksyfenu i karmienie dietą wysokotłuszczową o wysokiej zawartości cholesterolu
<ol>
	<li>Wykonaj genotypowanie myszy za pomocą analizy DNA ucha myszy i PCR. DNA ucha myszy należy wyizolować za pomocą zestawu do izolacji DNA krwi i tkanek (tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta. Startery PCR są wymienione w Tabeli 1.</li>
	<li>Indukować rekombinację Cre-Lox przez wstrzyknięcie tamoksyfenu w dawce 1 mg/dobę i.p. przez 5 dni u 6-tygodniowego MYH11-CreERT2; mT/mGf/f; Apoe-/- oraz MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f; mT/mGf/f; Samce myszy Apoe-/-.</li>
	<li>Wywołać miażdżycę, umieszczając 8 tygodniowych samców myszy (2 tygodnie po leczeniu tamoksyfenem) na diecie HCHF (40% tłuszczu kcal, 1,25% cholesterolu, 0% kwasu cholowego) przez 16 tygodni.</li>
</ol>
3. Przygotowanie odczynników i narzędzi do preparacji
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu czerwonej czerwieni olejowej O: rozpuścić 1 g czerwonego oleju O w 100 ml alkoholu izopropylowego.</li>
	<li>Przygotowanie roztworu czerwonej czerwieni olejowej O: zmieszać 24 ml roztworu wyjściowej czerwieni olejowej z 16 mldH2O. Przefiltrować rozcieńczony roztwór czerwieni olejowej O za pomocą sterylnych filtrów strzykawkowych 0,45 μm (roztwór jest dobry tylko na 1-2 godziny).</li>
	<li>Preparat 60% alkoholu izopropylowego: zmieszać 60 ml alkoholu izopropylowego z 40 mldH2O.</li>
	<li>4% formaldehydu w 1x preparat DPBS: rozcieńczyć 10 ml 16% formaldehydu w 30 ml 1x DPBS.</li>
	<li>Wyczyść wszystkie narzędzia do preparowania 70% etanolem (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1).</li>
</ol>
4. Eutanazja (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A)
<ol>
	<li>Zmierz wagę myszy przed eutanazją.</li>
	<li>Poddaj mysz eutanazji przez dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy i ksylazyny (każdy mililitr zawiera 10 mg/ml ketaminy i 2 mg/ml ksylazyny).</li>
	<li>Umieść mysz w pozycji leżącej (brzuchem do góry).</li>
</ol>
5. Otwarcie klatki piersiowej i jamy brzusznej oraz perfuzja serca (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B)
<ol>
	<li>Przygotować strzykawkę o pojemności 10 ml z 10 ml 1x DPBS. Nakrętka z igłą 25 G. Strzykawka zostanie użyta do przepłukania serca.</li>
	<li>Przytrzymaj skórę pęsetą (styl 5) i przetnij cienkimi nożyczkami od podstawy brzucha do górnej części szyi.</li>
	<li>Otwórz ścianę brzucha poniżej klatki piersiowej.</li>
	<li>Podnieś mostek pęsetą (styl 5) i odetnij przeponę, a następnie odetnij klatkę piersiową, aby odsłonić klatkę piersiową.</li>
	<li>Wykonaj małe nacięcie w prawym przedsionku serca.</li>
	<li>Wykonać fuzję przez wierzchołkowe nakłucie lewej komory, powoli wstrzykując 10 ml 1x DPBS. Po dokładnym perfuzji wątroba i nerki stają się jasnobrązowe.</li>
	<li>Oczyść klatkę piersiową z obcej krwi i płynu za pomocą gąbki z włókniny do wchłonięcia materiału.</li>
</ol>
6. Izolacja aorty i gałęzi (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C)
<ol>
	<li>Usuń narządy (tj. płuca, wątrobę, śledzionę oraz narządy żołądkowo-jelitowe i rozrodcze) i przetnij obojczyk za pomocą pęsety (styl 5) i cienkich nożyczek, pozostawiając serce, nerki i aortę nienaruszone in situ. 
	UWAGA: Upewnij się, że nie zranisz serca ani żadnych głównych naczyń krwionośnych.</li>
	<li>Umieść mysz pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
	<li>Wypreparuj aortę i gałęzie aorty, w tym tętnicę ramienno-głowową, tętnice szyjne, tętnice podobojczykowe, tętnice nerkowe, tętnice biodrowe wspólne i tętnice udowe za pomocą pęsety (styl 4) i nożyczek sprężynowych. 
	UWAGA: Przykryj aortę mokrą, włókninową gąbką, aby uniknąć odwodnienia podczas wycinania gałęzi aorty.</li>
	<li>Ostrożnie wypreparuj i usuń tkankę tłuszczową i łączną wokół aorty i odgałęzień aorty za pomocą pęsety (styl 4) i nożyczek sprężynowych. 
	UWAGA: Ponieważ stan zapalny jest widoczny u myszy z hiperlipidemią tętniaka, trudno jest usunąć przydankę. Uważaj, aby nie rozerwać ani nie naciąć aorty i gałęzi aorty. Ten krok wymaga praktyki i cierpliwości.</li>
</ol>
7. Mocowanie serca i aorty (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D,E)
<ol>
	<li>Przygotuj strzykawkę o pojemności 10 ml z 10 ml 4% formaldehydu w 1x DPBS. Nakrętka z igłą 25 G. 
	UWAGA: Formaldehyd jest niebezpieczny. Przeczytaj kartę charakterystyki przed rozpoczęciem pracy z tą substancją chemiczną. Nosić rękawice i okulary ochronne oraz sporządzać roztwory rozcieńczające wewnątrz dygestoria. 
	UWAGA: 4% roztwór formaldehydu ulega degradacji z czasem. Ważne jest, aby do utrwalenia używać świeżo przygotowanego 4% formaldehydu.</li>
	<li>Przymocuj drzewo naczyniowe przez wierzchołkowe nakłucie lewej komory, powoli wstrzykując 10 ml 4% formaldehydu. 
	UWAGA: Utrwalanie formaldehydu zakłóca kilka dalszych zastosowań, takich jak hodowla komórkowa, analiza FACS i analiza sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki. Pomiń ten krok, jeśli aorta będzie używana do któregokolwiek z tych zastosowań.</li>
	<li>Oczyść jamę klatki piersiowej z wszelkich obcych płynów za pomocą gąbki z włókniny, aby wchłonąć materiał.</li>
	<li>Oddziel serce od aorty, przytrzymując serce pęsetą (styl 4) i używając nożyczek sprężynowych do mikropreparowania. 
	UWAGA: Aby wykonać barwienie en face olejem czerwonym O po tym kroku, zaleca się rozcięcie aorty in situ zamiast ex vivo i przejście do sekcji 8. Ułatwia to ułożenie aorty en face płasko.</li>
	<li>Odizoluj i wytnij aortę i jej większą od 1 mm powyżej tętnicy szyjnej do końca tętnicy udowej za pomocą pęsety (styl 4) i nożyczek sprężynowych.</li>
	<li>Przenieść naczynie na woskową szalkę Petriego lub probówkę do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i napełnić 1x DPBS, aż pokryje aortę. 
	UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.</li>
</ol>
8. Barwienie krwią olejną O i obrazowanie nieotwartej całej aorty (<silna klasa="xfig">Rysunek 3)
<ol>
	<li>Przypnij naczynie do woskowej szalki Petriego za pomocą maleńkich szpilek (<silna klasa="xfig">Ryc. 3A).</li>
	<li>Wypłucz naczynie raz za pomocą 1x DPBS.</li>
	<li>Wlej 25 ml świeżego roztworu czerwonego oleju O na szalkę Petriego (<klasa silna="xfig">Rysunek 3B). 
	UWAGA: (1) Izopropanol jest niebezpieczną i łatwopalną cieczą. Używaj odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej. (2) Roztwór czerwonego oleju O może łatwo się wytrącać. Wytrącone cząstki mogą zakłócać późniejsze barwienie. Ważne jest, aby przed użyciem usunąć osad poprzez przefiltrowanie roztworu czerwieni olejowej O przez filtr 0,45 μm. (3) Najlepiej jest przygotować świeży roztwór Oil Red O i wyrzucić wszelkie niewykorzystane resztki roztworu. (4) Oprócz Oil Red O, Sudan IV jest innym związkiem chemicznym używanym do barwienia lipidów, trójglicerydów i lipoprotein. Jednak czerwień olejowa O stopniowo zastąpiła Sudan IV, ponieważ czerwony kolor wytwarzany przez czerwień olejową O jest bardziej intensywny i dzięki temu tłuszcz jest znacznie łatwiejszy do zobaczenia.</li>
	<li>Barwić aortę przez 60 minut w temperaturze pokojowej (RT). Czerwień olejowa O zabarwi płytkę nazębną bogatą w lipidy na czerwono, pozostawiając inne obszary niezawierające płytki nazębnej blady kolor.</li>
	<li>Umyć raz przez 20 minut 60% izopropanolem w RT. 
	UWAGA: Nadmierne spłukiwanie może spowodować plamienie płytki nazębnej.</li>
	<li>Przepłucz aortę 3xdH2O przez 5 minut, aby usunąć izopropanol.</li>
	<li>Pod mikroskopem stereoskopowym delikatnie oczyść całą okołonaczyniową tkankę tłuszczową wokół aorty za pomocą pęsety (styl 4) i nożyczek sprężynowych (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3C,D). 
	UWAGA: Ważne jest, aby po barwieniu oczyścić całą okołonaczyniową tkankę tłuszczową wokół aorty i jej gałęzi, ponieważ okołonaczyniowa tkanka tłuszczowa zabarwiona czerwienią olejową może dawać fałszywe tło i zakłócać morfometrię płytki nazębnej i kwantyfikację obszaru płytki. Upewnij się, że nie usunąłeś części ściany aorty. Napełnij naczynie woskowe dH2O, aż zakryje poplamioną aortę podczas czyszczenia. Ten krok wymaga praktyki i cierpliwości.</li>
	<li>Przenieść naczynie do czystego, szklanego szkiełka mikroskopowego.</li>
	<li>Uzyskaj mikrofotografie cyfrowe za pomocą kamery podłączonej do mikroskopu świetlnego. Zapisuj obrazy w wysokiej rozdzielczości, najlepiej w formacie tagged image file (TIFF) (Rysunek 3E). 
	UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Aby zapobiec wysuszeniu aorty, przenieś naczynie do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i napełnij 1x DPBS, aż pokryje aortę. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
9. Montaż aorty en face (<silna klasa="xfig">Rysunek 4, <silna klasa="xfig">Rysunek 5)
<ol>
	<li>Przenieś naczynie na woskową szalkę Petriego i napełnij 1x DPBS, aż pokryje aortę.</li>
	<li>Przeciąć tętnice szyjne, podobojczykowe łuku aorty i tętnice biodrowe w aorcie brzusznej 1–2 mm po rozwidleniu. Przeciąć tętnice nerkowe. (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A)</li>
	<li>Wzdłużnie rozciąć preparat aorty wzdłuż wewnętrznej krzywizny (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 4B1) i same tętnice biodrowe (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 4B2) za pomocą mikropreparujących nożyczek sprężynowych.</li>
	<li>Rozetnij trzy gałęzie łuku aorty (tj. bezimienne, lewa tętnica szyjna wspólna, lewa tętnica podobojczykowa) wzdłuż większej krzywizny aż do podstawowego poziomu krzywizny wewnętrznej (znak x) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4B3–B8) za pomocą nożyczek sprężynowych do mikropreparowania.</li>
	<li>Przypnij aortę płasko (stroną światła skierowaną do góry) w naczyniu woskowym za pomocą maleńkich szpilek i nałóż 1x DPBS, aż pokryje aortę, aby zapobiec jej wyschnięciu (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4C). 
	UWAGA: (1) Ważne jest, aby zwinięta aorta była płaska i przypinała ją do przodu bez rozciągania. Ten krok zajmie kilka dni w zależności od nasilenia miażdżycy. (2) W przypadku aort od zwierząt z grupy Apoe-/- lub Ldlr-/--, zaleca się przypięcie aorty do płasko na 24 godziny. (3) W tym miejscu protokół można wstrzymać.</li>
	<li>Wyczyść szklane szkiełka mikroskopu 70% etanolem i delikatnymi wycieraczkami (<silna klasa="xfig">Rysunek 5A).</li>
	<li>Przenieś aortę do czystego szklanego szkiełka mikroskopowego i umieść 15 kropli związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) na innym czystym szkiełku mikroskopowym (<silna klasa = "xfig">Rysunek 5B).</li>
	<li>Ostrożnie umieść szklane szkiełko mikroskopowe ze związkiem OCT na aorcie i unikaj uwięzienia pęcherzyków powietrza na szkiełku (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 5C).</li>
	<li>Oznacz slajdy przykładowymi nazwami (<silna klasa="xfig">Rysunek 5D). 
	UWAGA: Zamontowane szkiełka aorty en face można przechowywać w komorze wilgotnościowej w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy.</li>
</ol>
10. Obrazowanie i kwantyfikacja zmian w aorcie en face (<silna klasa="xfig">Rysunek 6)
<ol>
	<li>Uzyskaj mikrofotografie cyfrowe za pomocą kamery podłączonej do mikroskopu świetlnego. Zapisuj obrazy w wysokiej rozdzielczości, najlepiej w formacie TIFF (tagged image file format) (Rysunek 6A).</li>
	<li>Przenieś obrazy całej aorty wybarwionej en face do komputera wyposażonego w oprogramowanie ImageJ.</li>
	<li>W ImageJ wybierz narzędzie "Zaznaczanie odręczne" i ręcznie zakreśl wszystkie poplamione olejem czerwoną płytkę nazębną typu O (intensywne czerwone plamy), naciskając "Alt" (dla komputerów z systemem Windows) lub "Shift" (dla komputerów Mac). Następnie kliknij "Zmierz" w menu "Analizuj", aby wyświetlić obszary zmian w oknie wyników (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 6B po lewej). 
	UWAGA: Istnieje kilka pułapek związanych z kwantyfikacją zmian miażdżycowych: (1) wszelkie małe kawałki barwionego tłuszczu przybyszowego, które pozostały przyczepione do aorty z kroku 8.7, mogą dawać fałszywe tło i zakłócać kwantyfikację płytki miażdżycowej; (2) usunięcie części ściany aorty lub uszkodzenie aorty z kroków 6.4 i 8.7 może zakłócać kwantyfikację płytki nazębnej; (3) pęcherzyki i fałdy utworzone w aorcie po zamontowaniu (krok 9.8) mogą zakłócać kwantyfikację płytki nazębnej; oraz (4) blaszka miażdżycowa jest zjawiskiem 3D, a pomiary wykonane w płaszczyźnie 2D mogą nie odzwierciedlać prawdziwego zasięgu blaszki miażdżycowej. Oprócz analizy obszaru blaszki miażdżycowej aorty en face, zaleca się osobną analizę wielkości blaszki miażdżycowej w korzeniu aorty, tętnicy ramienno-głowowej, aorcie wstępującej i aorcie brzusznej8.</li>
	<li>Zakreśl zewnętrzną linię obramowania aorty i kliknij "Zmierz" w menu "Analizuj", aby wyświetlić obszar aorty w oknie wyników (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 6B po prawej).</li>
	<li>Eksportuj wszystkie pomiary do pliku Excel.</li>
	<li>Oblicz stosunek powierzchni płytki nazębnej do całkowitej powierzchni aorty i znormalizuj wartość jako procent całkowitej powierzchni czerwieni olejowej O.</li>
	<li>Oblicz stosunek powierzchni płytki nazębnej u myszy 8–10 Apoe-/- i 8–10 TGFβR2iSMC-Apoe. Przedstaw dane jako średnią ± SEM (<silna klasa="xfig">Rysunek 6C).</li>
	<li>Wykonaj niesparowany test t-Studenta w celu analizy statystycznej stosunku danych dotyczących obszaru płytki nazębnej w porównaniu z inną grupą myszy. Różnice w średnich wartościach należy uznać za istotne przy p < 0,05.</li>
</ol>

<ol><li>Lusis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis.</a> Nature. 407, 233-241 (2000).</li>
<li>Emini Veseli, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Animal models of atherosclerosis.</a> European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).</li>
<li>Plump, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+hypercholesterolemia+and+atherosclerosis+in+apolipoprotein+E-deficient+mice+created+by+homologous+recombination+in+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells.</a> Cell. 71, 343-353 (1992).</li>
<li>Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+hypercholesterolemia+and+arterial+lesions+in+mice+lacking+apolipoprotein+E%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E.</a> Science. 258, 468-471 (1992).</li>
<li>Ishibashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypercholesterolemia+in+low+density+lipoprotein+receptor+knockout+mice+and+its+reversal+by+adenovirus-mediated+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery.</a> Journal of Clinical Investigation. 92, 883-893 (1993).</li>
<li>Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ApoE-deficient+mice+develop+lesions+of+all+phases+of+atherosclerosis+throughout+the+arterial+tree%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis+Thrombosis%22%5BJournal%5D)">ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree.</a> Arteriosclerosis Thrombosis. 14, 133-140 (1994).</li>
<li>Chen, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smooth+muscle+cell+reprogramming+in+aortic+aneurysms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Smooth muscle cell reprogramming in aortic aneurysms.</a> Cell Stem Cell. 26, 542-557 (2020).</li>
<li>Andres-Manzano, M. J., Andres, V., Dorado, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oil+Red+O+and+Hematoxylin+and+Eosin+Staining+for+Quantification+of+Atherosclerosis+Burden+in+Mouse+Aorta+and+Aortic+Root%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Oil Red O and Hematoxylin and Eosin Staining for Quantification of Atherosclerosis Burden in Mouse Aorta and Aortic Root.</a> Methods in Molecular Biology. 1339, 85-99 (2015).</li>
<li>Chen, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+TGF-beta+signalling+drives+vascular+inflammation+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Endothelial TGF-beta signalling drives vascular inflammation and atherosclerosis.</a> Nature Metabolism. 1, 912-926 (2019).</li>
<li>Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+neutral+lipids+by+oil+red+O+for+analyzing+the+metabolic+status+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease.</a> Nature Protocols. 8, 1149-1154 (2013).</li>
<li>Ferruzzi, J., Madziva, D., Caulk, A. W., Tellides, G., Humphrey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compromised+mechanical+homeostasis+in+arterial+aging+and+associated+cardiovascular+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biomechanics+and+Modeling+Mechanobiology%22%5BJournal%5D)">Compromised mechanical homeostasis in arterial aging and associated cardiovascular consequences.</a> Biomechanics and Modeling Mechanobiology. 17, 1281-1295 (2018).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Myszy z niedoborem apolipoproteiny E (Apoe) i receptora lipoprotein o niskiej gęstości (Ldlr) są przydatne do badania rozwoju i leczenia miażdżycy. Badacze mogą ocenić wpływ manipulacji genetycznych i terapeutycznych na inicjację, progresję i regresję chorób związanych z miażdżycą za pomocą barwienia całą aorty czerwienią olejową9. Barwienie olejem aortowym Red O i kwantyfikacja zmian jest złotym standardem w badaniach nad miażdżycą. Ta technika jest niedroga i nie wymaga specjal...

Choroba wieńcowa, główna przyczyna śmiertelności w USA, jest zwykle spowodowana miażdżycą, procesem, który prowadzi do gromadzenia się blaszki miażdżycowej wewnątrz ścian tętnic1. Myszy z niedoborem Apoe i Ldlr podatne na hiperlipidemię odgrywają kluczową rolę w badaniach miażdżycy i jej powikłań oraz opracowywaniu terapii2,3,4,5. Kwantyfikacja zmian miażdżycowych z aorty en face jest ważną analizą końcową dla oceny wpływu manipulacji genetycznych na różne typy komórek. Pomaga również w badaniu nowych terapii mających wpływ na inicjację, progresję i regresję choroby miażdżycowej. Zmiany miażdżycowe mogą powstawać w dowolnym miejscu aorty i jej odgałęzień (tj. tętnice ramienno-głowowe, szyjne i podobojczykowe w klatce piersiowej, a także tętnice nerkowe, biodrowe wspólne i udowe poniżej przepony)6. Kompleksowa ocena obciążenia miażdżycą i odpowiednia terapia wymaga oceny obciążenia chorobą w różnych lokalizacjach, co jest wyzwaniem, które często jest pomijane.
Ten protokół opisuje, jak przeprowadzić kompleksową analizę zmian miażdżycowych, zaczynając od nieotwartej całej aorty i przechodząc do przygotowania en face, za pomocą jednej myszy. Barwienie krwią O nieotwartej całej aorty umożliwia szybką, jakościową ocenę blaszek lipidowych w całej aorcie i jej odgałęzieniach, podczas gdy przygotowanie en face zapewnia ilościową ocenę rozmieszczenia zmian miażdżycowych w aorcie myszy.
Technika wykorzystuje 8-tygodniowe myszy z delecją TGFβR2 specyficzną dla komórek mięśni gładkich na tle hiperlipidemicznym Apoe-/- (MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f; mT/mGf/f; Apoe-/-; zwane dalej myszami TGFβR2iSMC-Apoe) i kontrolami Apoe-/- z miotu (MYH11-CreERT2; mT/mGf/f; Apoe-/-; zwane dalej myszami Apoe-/-). Zwierzęta są trzymane przez 16 tygodni na diecie wysokotłuszczowej (HCHFD) jako materiały do nauki7. Po zakończeniu badania nieotwarte całe aorty są barwione i obrazowane (w tym wszystkie główne gałęzie) czerwienią olejową O w celu jakościowej oceny blaszek zawierających lipidy. Aorty są rozcinane poprzez przygotowanie en face, a wszystkie zmiany miażdżycowe są obrazowane i oznaczane ilościowo. Protokół ten może być wykorzystany do badania rozwoju zmian miażdżycowych w modelach hiperlipidemii Apoe-/- lub Ldlr-/- i rozszerzony na ogólne zastosowania biologii naczyniowej związanej z aortą.

<table><tbody><tr><td>1,5 ml probówka Eppendorfa</td><td>DENVILLE</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>10 ml strzykawka</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>16% Formaldehyd</td><td>Polysciences</td><td>18814-10</td><td></td></tr><tr><td>70% etanol</td><td>VWR</td><td>RC2546.70-5</td><td>Do czyszczenia narzędzi preparacyjnych</td></tr><tr><td>wosk preparacyjny</td><td>CR Scientific</td><td>C3541</td><td></td></tr><tr><td>Olej kukurydziany</td><td>Sigma</td><td>C8267</td><td>Rozpuszczalnik do tamoksyfenu</td></tr><tr><td>DNeasy Blood & Zestaw tkanek</td><td>QIAGEN</td><td>69506</td><td>Do izolacji DNA z ucha myszy</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (1X DPBS), pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Drobne nożyczki</td><td>Fine Science Tools</td><td>14059-11</td><td>Aby przeciąć skórę myszy i otworzyć klatkę piersiową</td></tr><tr><td>Fisherbrand Economy Szkiełka mikroskopowe ze zwykłego szkła</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td></td></tr><tr><td>Dieta wysokotłuszczowa</td><td>Diety badawcze</td><td>D12108</td><td>Aby wywołać miażdżycę</td></tr><tr><td>Obrazowanie oprogramowanie</td><td>National Institutes of Health</td><td>Image J</td><td>Kwantyfikacja zmian w aorcie</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>VWR</td><td>JT9079-5</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td>Do czyszczenia szklanych szkiełek mikroskopowych</td></tr><tr><td>McPherson-Vannas Micro Nożyczki sprężynowe do preparowania</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5602</td><td>Aby oddzielić serce i aortę oraz rozciąć aortę i gałęzie</td></tr> <tr><td>aortyOprogramowanie sterujące mikroskopem</td><td>Olympus</td><td>DP Controller</td><td>Do obrazowania aorty</td></tr><tr><td>Szpilki</td><td>Minutien Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Igła-25G</td><td>BD</td><td>305124</td><td></td></tr><tr><td>Gąbka włókninowa</td><td>McKesson</td><td>94442000</td><td></td></tr><tr><td>Olej Czerwony O</td><td>Sigma</td><td>O-0625</td><td>Do barwienia zmian miażdżycowych</td></tr><tr><td>Sterylna strzykawka Pall Acrodisc Filtry z membraną Super Membrane</td><td>VWR</td><td>28143-312</td><td>Do filtrowania roboczego roztworu oleju Red O</td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej</td><td>15021-15</td><td>Do preparowania i czyszczenia aorty</td></tr><tr><td>Oprogramowanie statystyczne</td><td>GraphPad</td><td>Prism 8</td><td>Analiza statyczna</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Nikon</td><td>SMZ1000</td><td>Do rozwarstwienia aorty</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td>Do obrazowania aorty</td></tr><tr><td>Tamoxifen</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td>Aby wywołać rekombinację Cre-loxP</td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT Compound, Sakura Finetek</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta Styl 4</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>0302-4-PO</td><td>Aby przeciąć skórę myszy i otworzyć klatkę piersiową</td></tr><tr><td>Pęseta Styl 5</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>0302-5-PO</td><td>Do preparowania i czyszczenia aorta</td></tr></tbody></table>

obrazowanie i analiza zmian całej aorty barwionych czerwienią olejową o w mysim modelu hiperlipidemii tętniaka

Imaging and Analysis of Oil Red O-Stained Whole Aorta Lesions in an Aneurysm Hyperlipidemia Mouse Model

Myszy hiperlipidemiczne z niedoborem apolipoproteiny E (Apoe) lub receptora lipoprotein o niskiej gęstości (Ldlr) to dwa najczęściej używane modele do badań nad miażdżycą. Służą one do badania wpływu różnych czynników genetycznych i różnych typów komórek na powstawanie zmian miażdżycowych, a także do testowania rozwoju nowych terapii. Izolacja, wycięcie całej aorty i kwantyfikacja zmian miażdżycowych barwionych czerwienią olejową O są podstawowymi metodami morfometrycznymi stosowanymi do oceny obciążenia miażdżycowego. Celem tego protokołu jest opisanie zoptymalizowanej, krok po kroku metody chirurgicznej do preparowania, perfuzji, izolacji, barwienia, obrazowania i analizy zmian miażdżycowych w aorcie myszy za pomocą Oil Red O. Ponieważ zmianyteryskalerotyczne mogą tworzyć się w dowolnym miejscu na całym drzewie aorty, ta cała metoda barwienia aorty czerwonym olejem ma tę zaletę, że ocenia blaszki zawierające lipidy w całej aorcie i wszystkich gałęziach u jednej myszy. Oprócz barwienia czerwienią olejową O, świeże izolowane całe aorty mogą być używane do różnych eksperymentów in vitro i in vivo oraz izolacji komórek.

W tym protokole, zmiany miażdżycowe w TGFβR2iSMC-Apoe myszy analizowano po 4 miesiącach stosowania diety o wysokiej zawartości tłuszczu i cukru (HCHF)7. Oprócz rozległego miażdżycy, myszy te rozwijały tętniaki aorty piersiowej i brzusznej, jak wcześniej opisano. W porównaniu do Apoe-/- myszy, TGFβR2iSMC-Apoe ściany aorty u myszy wykazywały ciężki miażdżyca, co utrudniało wycięcie zmian (Rycina 2C, D, EDodatkowo, tętnia...

Ten protokół krok po kroku przeprowadza procedurę analizy obciążenia miażdżycowego u myszy. Badacze mogą użyć tego protokołu do porównania obfitości, lokalizacji i wielkości zmian miażdżycowych u różnych zwierząt.

Obrazowanie i analiza zmian całej aorty barwionych czerwienią olejową O w mysim modelu hiperlipidemii tętniaka

Apolipoprotein E (Apoe)- or low density lipoprotein receptor (Ldlr)-deficient hyperlipidemic mice are the two most commonly used models for ...

Kwantyfikacja zmian miażdżycowych u myszy z apoE i innymi typami myszy hiperlipidemicznych ma kluczowe znaczenie dla oceny różnych czynników genetycznych i nowych terapii. Nasz protokół zawiera instrukcje krok po kroku dotyczące analizy obciążenia miażdżycowego w sposób jakościowy i ilościowy za pomocą jednej myszy. 16 tygodni po wywołaniu miażdżycy, przed perfuzją serca, załaduj 10-mililitrową strzykawkę 10 mililitrami DPBS i przymocuj igłę o rozmiarze 25.Podnieś skórę brzucha eksperymentalnej myszy za pomocą pęsety i użyj cienkich nożyczek, aby przeciąć skórę od podstawy brzucha do górnej części szyi. Otwórz ścianę brzucha poniżej klatki piersiowej i użyj pęsety, aby podnieść mostek, aby uzyskać dostęp do przepony. Przetnij przeponę i odetnij klatkę piersiową, aby odsłonić klatkę piersiową.Następnie wykonaj małe nacięcie w prawym przedsionku serca i powoli wstrzyknij całą objętość DPBS do wierzchołkowego nakłucia lewej komory. Wątroba i nerki zmienią kolor na jasnobrązowy. Gdy cała sól fizjologiczna zostanie przetopiona, użyj gąbki z włókniny, aby oczyścić jamę klatki piersiowej z obcej krwi i płynu.Po wytarciu jamy klatki piersiowej usuń nieeksperymentalne narządy i przetnij obo

imaging-analysis-oil-red-o-stained-whole-aorta-lesions-an-aneurysm

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Analiza ex vivo zmian w tętnicach z modeli zwierzęcych chorób sercowo-naczyniowych klasycznie opiera się na technikach histologicznych i immunohistochemicznych. Zapewniają one 2-wymiarowe pomiary w 3-wymiarowych zmianach. W artykule opisano generowanie zmian tętniczych do analizy ilościowej w 3 wymiarach z wykorzystaniem optycznej tomografii projekcyjnej.

Generowanie i 3-wymiarowa ocena ilościowa zmian w tętnicach u myszy za pomocą optycznej tomografii projekcyjnej

Opisujemy procedury ilościowego określania i charakteryzowania zmian miażdżycowych w modelach mysich, wykorzystując precyzyjne przekroje zatoki aortalnej aorty i aorty wstępującej w połączeniu z analizą histochemiczną i immunohistochemiczną.

Analiza ilościowa i charakterystyka zmian miażdżycowych w mysiej zatoce aortalnej

Ten film pokazuje dwa modele rozwoju blaszki miażdżycowej w tętnicach mysich i podkreśla różnice w przeroscie mięśniowo-brzuszkowym i miażdżycy.

Wywoływanie przerostu mięśniowo-wewnętrznego, a miażdżyca u myszy: wprowadzenie dwóch prawidłowych modeli

Modele zwierzęce okazały się nieocenionymi narzędziami w definiowaniu mechanizmów specyficznych dla gospodarza i patogenu, które przyczyniają się do rozwoju przewlekłego stanu zapalnego. W tym miejscu opisujemy mysi model zakażenia jamy ustnej ludzkim patogenem Porphyromonas gingivalis i szczegółowo opisujemy metodologie oceny postępu stanu zapalnego w miejscach miejscowych i ogólnoustrojowych.

Mysi model przewlekłego stanu zapalnego wywołanego przez patogeny w miejscach lokalnych i ogólnoustrojowych

Opisujemy protokół indukowania miażdżycy w korzeniu aorty myszy ApoE-/- karmionych dietą aterogenną, poprzez ciągłe uwalnianie aldosteronu. Opisano również metody charakteryzowania składu płytki nazębnej.

Indukcja blaszek miażdżycowych poprzez aktywację receptorów mineralokortykoidowych u myszy z niedoborem apolipoproteiny E

Proponujemy ustandaryzowany protokół do scharakteryzowania składu komórkowego późnych zmian miażdżycowych u myszy, w tym systematyczne metody preparacji zwierząt, osadzania tkanek, cięcia, barwienia i analizy tętnic ramienno-głowowych od myszy śledzących linię komórek mięśni gładkich w atheroprone.

Analiza ilościowa składu komórkowego w zaawansowanych zmianach miażdżycowych myszy śledzących linię komórek mięśni gładkich

Mysie modele miażdżycy są użytecznymi narzędziami do badania szlaków patogennych na poziomie molekularnym, ale wymagają standaryzowanej kwantyfikacji rozwoju zmian. Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę określania wielkości zmiany w głównych naczyniach tętniczych, w tym w korzeniu aorty, łuku aortalnym i tętnicy ramienno-głowowej.

Kwantyfikacja miażdżycy u myszy

Tutaj prezentujemy zoptymalizowane protokoły oczyszczania tkanek do obrazowania mysiej aorty w trzech wymiarach (3D). Opisujemy najnowocześniejsze procedury barwienia immunologicznego, oczyszczania optycznego i obrazowania z zamiarem określenia anatomicznej bliskości obwodowego układu nerwowego z blaszkami miażdżycowymi i przydanką w miażdżycy.

Trójwymiarowe obrazowanie tkanek aorty w miażdżycy

Ten protokół dostarcza kompleksową metodologię analizy ilościowej blaszek miażdżycowych, aby ułatwić bardziej dogłębne badania nad mechanizmami i postępem miażdżycy.

Izolacja i analiza zmian łuku aorty i korzeni w mysim modelu miażdżycowym

Eksperymentalny model przerzutów do kości u myszy został ustanowiony po dokardialnym podaniu komórek guza piersi wykazujących ekspresję lucyferazy. Rozwój guza oraz powstałe zmiany osteolityczne monitorowano podłużnie za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego oraz mikro-CT.

Monitorowanie przerzutów nowotworowych i zmian osteolitycznych za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego i mikro-tomografii komputerowej

Naucz się analizy zmian miażdżycowych w mysim modelu hiperlipidemii z użyciem barwienia czerwienią olejową O. Ta metoda umożliwia ilościową i jakościową ocenę obciążenia miażdżycowego w badaniach genetycznych.

Obrazowanie i analiza zmian całej aorty barwionych czerwienią olejową O w mysim modelu hiperlipidemii tętniaka

Przeglądaj więcej filmów