Name: Protokół immunohistochemii i dystrybucji RNA in-situ we wczesnym zarodku Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 34 s
Description: Poznaj metody immunohistochemii i hybrydyzacji in situ RNA w zarodkach Drosophila melanogaster. Protokół poprawia przyczepność próbek do szkiełek i umożliwia wizualizację lokalizacji białek oraz RNA w biologii rozwoju.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (#31771377/ 31571273/31371256), Program dla Wybitnych Zagranicznych Naukowców z Narodowego Departamentu Edukacji (#MS2014SXSF038), Narodowy Departament Edukacji Central Universities Research Fund (#GK201301001/201701005/GERP-17-45), a XZ jest wspierany przez Fundusz Wybitnych Prac Doktorskich (#2019TS082 /2019TS079), Kluczowy Program Departamentu Edukacji Prowincji Shaanxi (#20JS138), Projekt Młodzieżowy Programu Badań Podstawowych Nauk Przyrodniczych Departamentu Nauki i Technologii Prowincji Shaanxi (#2020JQ-885).

1. Przygotowanie talerzy agarowych z sokiem winogronowym
<ol>
	<li>Dodać 5 g agaru i 5 g sacharozy do 150 ml wody destylowanej. Gotuj w kuchence mikrofalowej, aż agar i sacharoza całkowicie się rozpuszczą. Wymieszaj ze sobą 50 ml 100% soku winogronowego i roztwór.</li>
	<li>Dodaj 1 ml 100% kwasu propionowego, aby uzyskać końcowe stężenie do 0,5% kwasu propionowego. Wlej 25 ml przygotowanego roztworu do każdej płytki. Po zestaleniu się agaru przechowywać pożywkę w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Szkiełka do powlekania
<ol>
	<li>Wstępnie potraktuj szkiełka detergentem. Umyj szkiełka 3 razy wodą z kranu i raz wodą destylowaną. Następnie suszyć szkiełka w piekarniku o temperaturze 45 °C przez 2 godziny.</li>
	<li>Zanurz szkiełka w około 450 ml roztworu dichromianu potasu i kwasu siarkowego (20 g dichromianu potasu, 40 ml wody destylowanej i 400 ml stężonego kwasu siarkowego) na 24 godziny. Umyj szkiełka 3 razy wodą z kranu i raz wodą destylowaną.
	<ol>
		<li>Suszyć szkiełka w piekarniku o temperaturze 45 °C przez dwie godziny. Zanurz w 95% etanolu na ponad 2 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 0,5 g siarczanu chromowo-potasowego i 5 g żelatyny do 1 l wody destylowanej. Przed użyciem rozpuścić w łaźni wodnej o temperaturze 60 °C. Żelatyna chromowo-ałunowa może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez długi czas.</li>
	<li>Upuść 10 μl żelatyny chromowo-ałunowej na szkiełko podstawowe i całkowicie i równomiernie pokryj roztworem całą powierzchnię szkiełka. Umieścić szkiełko żelatynową stroną do góry w suszarce nagrzanej do 42 °C na 48 godzin. Tak przygotowane szkiełka można przechowywać w temperaturze 4 °C do późniejszego wykorzystania. 
	UWAGA: Jest to krytyczny krok. Konieczna jest pełna powłoka. W przypadku muszki owocowej i jej zarodka to podejście do powlekania szkiełkowego wydaje się bardziej skuteczne niż powlekanie polilizyną.</li>
</ol>
3. Osadzanie zarodków Drosophila
<ol>
	<li>Kolekcja zarodków Drosophila 
	UWAGA: Pobraliśmy zarodki Drosophila w czterech okresach 0-2 godzin (blastoderma syncytialna), 2-3 godzin (blastoderma komórkowa), 3-12 godzin (wczesna gastrula) i 12-24 godziny (późna gastrula)18. Proporcje głównych typów zarodków w każdym okresie przedstawiono w tabeli 1.
	<ol>
		<li>Umieść 400-500 much w plastikowej butelce do zbierania i przykryj butelkę talerzem agarowym z sokiem winogronowym zawierającym ekstrakt drożdżowy. Zarodki Drosophila układa się na agarze z sokiem winogronowym w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zebrać cztery okresy zarodków, delikatnie dodając 2 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCL, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) do każdej płytki, aby unosić zarodki. Przenieś około 200 zarodków do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i trzymaj ją na lodzie przez 2 minuty, aby uspokoić zarodki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstępne osadzanie
	<ol>
		<li>Przenieś 200 zarodków Drosophila do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Trzymaj probówkę na lodzie przez 2 minuty, aby uspokoić zarodki, a następnie ostrożnie wyrzuć supernatant pipetą. Dodaj 1 ml 50% wybielacza do probówki i delikatnie potrząsaj przez 2 min. 
		UWAGA: Wybielacz powinien być przygotowany na świeżo, a ilość wybielacza może się różnić w zależności od ilości zebranych zarodków.</li>
		<li>Delikatnie zbierz zarodki, wylewając je na bibułę filtracyjną i umyj je 3 razy 1 ml PBS za każdym razem.</li>
		<li>Przenieść zarodki za pomocą bibuły filtracyjnej do około 5 ml n-heptanu.</li>
		<li>Przenieść mieszaninę do świeżej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodaj 1 ml metanolu i delikatnie nim wstrząśnij. Zbieraj zarodki po sedymentacji.</li>
		<li>Usunąć supernatant i przemyć zarodki w 1 ml PBS 3-5 razy.</li>
		<li>Utrwalić zarodki 400 μl roztworu Bouina (71% nasyconego kwasu pikrynowego, 24% formaliny, 5% kwasu octowego) przez 30 minut. Utrwalone zarodki myć 3 razy w 1 ml PBS przez 5 minut za każdym razem.</li>
		<li>Aby zagregować zarodki, należy przenieść próbki do gumowego korka i usunąć PBS.</li>
		<li>Przygotować 1,2% roztwór agarozy-PBS i utrzymywać roztwór w temperaturze 60 °C. Dodać 200 μl 1,2% roztworu agarozy-PBS na zarodki, aby umieścić je w bloku agarowym.</li>
		<li>Wyjmij blok z korka i przechowuj go w PBS. 
		UWAGA: W przypadku podejścia pre-embedding, pro-ocieplenie ma kluczowe znaczenie dla sukcesu. Zdecydowanie zalecamy, aby probówki wirówkowe i końcówki do mikropipet, które będą używane na tym etapie, były całkowicie rozgrzane przed uruchomieniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zatapianie parafiny
	<ol>
		<li>Zanurz wstępnie osadzony blok agaru w 35% etanolu, 50% etanolu, 75% etanolu i 85% etanolu na 15 minut każdy. Następnie zanurz 2 razy w 95% etanolu i 100% etanolu. 
		UWAGI: W zależności od liczby zarodków w bloku konieczne jest około 5-10 razy większa objętość każdego bloku, a następnie stopniowany utrwalacz przez 15-30 minut.</li>
		<li>Zanurz blok zarodków w 100% roztworze etanolu i ksylenu (w stosunku 1:1) na 15 minut.</li>
		<li>Przenieś blok na ksylen na 1 minutę, aby tkanka zarodka była przezroczysta</li>.
		<li>Zanurz blok w ksylenie i parafinie (w stosunku 1:1) na 30 minut.</li>
		<li>Zanurz blok w parafinie I, parafinie II i parafinie III na 2 godziny za każdym razem.</li>
		<li>Wcześniej napełnij pudełko do zatapiania parafiną, a następnie delikatnie i poziomo przenieś blok na dno pudełka do zatapiania. Po naturalnym zestaleniu się parafiny, zestalony blok parafiny można przechowywać w temperaturze 4 °C. 
		UWAGI: Wstępnie osadzoną próbkę można użyć w kriosekcji, wykonując następujące czynności. Po wstępnym zanurzeniu zarodków w agarozie, jak opisano powyżej, próbki są po prostu zatopione w związku OCT. Następnie kriosekcję można przeprowadzić zgodnie z rutynowym protokołem kriosekcji. Następnie na sekcjach można zastosować regularne metody barwienia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Barwienie hematoksyliną-eozyną
<ol>
	<li>Przygotuj skrawki zarodków Drosophila. Przygotowane odcinki umieścić w piecu w temperaturze 60 °C na 15 minut, a następnie zanurzyć je 2 razy w ksylenie na 10 minut każdy. Zanurz sekcje raz w 100% etanolu i ksylenie (w stosunku 1:1) na 2 minuty.</li>
	<li>Uwodnić sekcje w 100% etanolu I, 100% etanolu II, 95% etanolu, 85% etanolu, 75% etanolu, 50% etanolu i w wodzie destylowanej przez 3 minuty.</li>
	<li>Wybarwić skrawki roztworem hematoksyliny przez 2 minuty. Zanurzyć szkiełka w 1% roztworze kwaśnego alkoholu (1 ml kwasu solnego, 100 ml 70% etanolu) i umyć szkiełka w wodzie destylowanej.</li>
	<li>Zanurz szkiełka kolejno w 50% etanolu, 75% etanolu, 85% etanolu i 95% etanolu.</li>
	<li>Zabarwić skrawki roztworem eozyny przez 1 min.</li>
	<li>Odwodnić szkiełka w 95% etanolu I, 95% etanolu II, 95% etanolu III, 100% etanolu I, 100% etanolu II i 100% etanolu III przez 1 minutę za każdym razem.</li>
	<li>Czyść szkiełka w 100% ksylenie I, 100% ksylenie II i 100% ksylenie III przez 5 minut za każdym razem.</li>
	<li>Zamontuj zjeżdżalnie z neutralnym balsamem zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>
5. Okresowe barwienie kwasem i srebrem metenaminą
<ol>
	<li>Odparafinować i uwodnić skrawki parafiny zarodka Drosophila do wody destylowanej.</li>
	<li>Utlenić skrawki w 1% kwasie okresowym przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Opłucz szkiełka w wodzie destylowanej 3 razy po 1 minutę każde.</li>
	<li>Inkubować szkiełka w około 40 ml świeżo przefiltrowanego roztworu roboczego metenaminy srebra (3% metenaminy, 5% azotanu srebra, 5% roztworu boranu sodu) przez 1 godzinę i 20 minut w temperaturze 60 °C. Następnie płucz szkiełka w wodzie destylowanej przez 1 minutę.</li>
	<li>Tonuj szkiełka w 0,2% chlorku złota przez 2 minuty, a następnie płucz szkiełka w wodzie destylowanej przez 1 minutę.</li>
	<li>Umieść szkiełka w 3% tiosiarczanie sodu na 3 minuty, a następnie płucz je w wodzie destylowanej przez 1 minutę.</li>
	<li>Przeciwbarwić szkiełka w hematoksylinie przez 30 s. Myć szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez 3-5 minut.</li>
	<li>Odwodnić szkiełka w 70% etanolu, 80% etanolu, 95% etanolu I, 95% etanolu II, 95% etanolu III, 100% etanolu I i 100% etanolu II przez 5 minut każda.</li>
	<li>Wyczyść szkiełka w 100% ksylenie I, 100% ksylenie II i 100% ksylenie III na 5 minut każda.</li>
	<li>Zamontuj zjeżdżalnie w neutralnym balsamie zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>
6. Immunohistochemia
<ol>
	<li>Deparafinować i ponownie uwodnić skrawki parafiny zarodka Drosophila do PBS zgodnie ze standardowym protokołem19.</li>
	<li>Traktować szkiełka z 0,3% H2O2 w metanolu przez 10 minut w temperaturze pokojowej i unikać światła.</li>
	<li>Podgrzej wstępnie odpowiedni bufor do odzyskiwania antygenu do około 100 °C w pojemniku ze szkiełkami w naczyniu do gotowania na parze do warzyw. Pojemnik powinien mieć również pokrywkę. Umieść szkiełka w pojemniku. Zamknij pokrywę parowaru.
	<ol>
		<li>Trzymaj pojemnik w parowarze przez 20 minut od tego momentu. Należy pamiętać, że pokrywka pojemnika na suwak nie powinna być całkowicie dokręcona, aby para wodna mogła dostać się podczas procesu gotowania na parze.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozwól szkiełkom powrócić do temperatury pokojowej, a następnie delikatnie przepłucz je w PBS-T (PBS z Tween-20, pH 7,2) 3 razy przez 5 minut każde, a następnie przepłucz szkiełka w PBS 3 razy po 1 minutę każde.</li>
	<li>Zablokować szkiełka z 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w PBS przez 60 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować szkiełka z przeciwciałem pierwszorzędowym (anty-FKBP12 w stosunku 1:1000) przez noc w temperaturze 4 °C lub w temperaturze pokojowej przez 4 godziny.</li>
	<li>Umyj szkiełka w PBS-T 4 razy po 5 minut każde.</li>
	<li>Nakładać szkiełka z polimerem znakowanym HRP sprzężonym z przeciwciałami drugorzędowymi (anty-Rabbit, 1:5 000) przez 90 minut w temperaturze pokojowej. Rób to w ciemności, aby uniknąć wybielania zdjęć.</li>
	<li>Umyj szkiełka w PBS-T 3 razy po 5 minut każde.</li>
	<li>Inkubować szkiełka z 5% tetrachlorowodorkiem 3,3'-diaminobenzydyny (DAB) przez 2-10 minut, aż kolor produktów reakcji będzie odpowiedni pod mikroskopem.</li>
	<li>Przeciwbarwić szkiełka w hematoksylinie przez 30 s i myć szkiełka w wodzie destylowanej 2 razy przez 5 minut każde</li>.
	<li>Odwodnić szkiełka w 50% etanolu, 70% etanolu, 90% etanolu, 95% etanolu i 100% etanolu przez 1 minutę każda.</li>
	<li>Wyczyść szkiełka w 100% ksylenie I, 100% ksylenie II i 100% ksylenie III na 5 minut każda.</li>
	<li>Zamontuj zjeżdżalnie w neutralnym balsamie zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>
7. Hybrydyzacja in-situ 
UWAGA: Sekcje zarodków Drosophila zostały przygotowane z 0,01% wody uzdatnionej pirowęglanem dietylu (DEPC). Wszystkie akcesoria używane do hybrydyzacji in situ z wyprzedzeniem stosują leczenie DEPC na noc.
<ol>
	<li>Przygotowanie rybosondy
	<ol>
		<li>Linearyzuj matrycę DNA, przecinając w miejscu enzymu restrykcyjnego za sklonowaną wstawką za pomocą enzymu restrykcyjnego, który tworzy zwisy 5'. Po linearyzacji należy oczyścić matrycę DNA poprzez ekstrakcję fenolem/chloroformem, a następnie wytrącanie etanolu. Korzystaj ze standardowych protokołów.</li>
		<li>Dodać 1 μg oczyszczonego DNA matrycy do probówki wirówkowej bez RNaz. Umieść probówkę wirówkową na lodzie. Dodać wystarczającą ilość wody uzdatnionej DEPC do całkowitej objętości 13 μl.
		<ol>
			<li>Następnie dodaj następujące odczynniki w kolejności: 2 μL 10x mieszaniny znakującej NTP, 2 μL 10x buforu transkrypcyjnego, 1 μL inhibitora RNazy ochronnej, 2 μL polimerazy RNA SP6 lub polimerazy RNA T7.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wymieszać reakcję przez pipetowanie i krótko odwirować. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. 
		UWAGA: Dłuższe inkubacje nie zwiększają wydajności znakowanego RNA. Krótkie wirowanie (~800 obr./min) zastosowane na rurce reakcyjnej jest niezbędne przed przejściem do następnego kroku. Ten wir pozwoli całej zawartości, która może powstać w wyniku inkubacji, dotrzeć na dno probówki.</li>
		<li>Dodać 2 μl DNazy I wolnej od RNaz w celu usunięcia matrycowego DNA i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Dodać 2 μl 200 mM EDTA (pH 8,0), aby zatrzymać reakcję. 
		UWAGA: Sondy RNA znakowane DIG mogą być przechowywane w etanolu w temperaturze od -15 do -25 °C przez jeden rok.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Prehybrydyzacja wycinka zarodka Drosophila
	<ol>
		<li>Umieścić skrawki zarodka Drosophila w piecu o temperaturze 42 °C na 48 godzin.</li>
		<li>Odparafinować szkiełka w 100% ksylenie przez 10 minut dwukrotnie.</li>
		<li>Uwodnić szkiełka, zanurzając kolejno w 100% etanolu, 95% etanolu, 90% etanolu, 70% etanolu i 50% etanolu na 5 minut.</li>
		<li>Inkubować szkiełka w PBS przez 5 minut 3 razy, aby usunąć roztwór utrwalający/roztwór Bouina z tkanki.</li>
		<li>Umyj szkiełka roztworem 100 mmol/l glicyny/PBS 2 razy po 5 minut.</li>
		<li>Umyj szkiełka PBS 2 razy po 5 minut każde.</li>
		<li>Inkubować szkiełka z 0,3% Triton X-100 w PBS przez 15 minut, aby przepuszczalność membran.</li>
		<li>Umyj szkiełka PBS 3 razy po 5 minut każde.</li>
		<li>Inkubować szkiełka w 15 μg/ml proteinazy K wolnej od RNaz przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Inkubuj szkiełka z 4% paraformaldehydem w PBS przez 3 minuty, aby zatrzymać trawienie.</li>
		<li>Umyj szkiełka PBS 2 razy po 5 minut każde.</li>
		<li>Inkubować szkiełka w 100 mM buforze trietanoloaminy (pH 8,0) z 0,25% (v/v) bezwodnikiem octowym 2 razy przez 5 minut każde.</li>
		<li>Dodaj wodę DEPC do komory wilgotnościowej szkiełka. Dodać 20 μl roztworu do wstępnej hybrydyzacji (zawierającego 100 μg/ml DNA plemników łososia) na szkiełka. Włóż szkiełka do komory wilgotnościowej szkiełka. Inkubować szkiełka w temperaturze 42 °C przez 4 godziny 
		UWAGA: Konieczne jest zapewnienie szczelności pokrywy mokrego pudełka i to, aby mokre pudełko było zawsze trzymane w pozycji poziomej, aby zapobiec ulatnianiu się i odchyleniu od tkanki roztworu przed hybrydyzacją i następującego po nim roztworu hybrydyzacyjnego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hybrydyzacja przekroju zarodka Drosophila
	<ol>
		<li>Usunąć roztwór do hybrydyzacji i umyć szkiełka 0,2x SSC (150 mM chlorku sodu, 15 mM cytrynianu sodu, pH 7,0) 3 razy po 5 minut każde. Zetrzyj nadmiar 0,2x SSC wokół próbek tkanek.</li>
		<li>Nanieść 30 μl roztworu hybrydyzacyjnego sondy (zawierającego 2-6 ng sondy RNA znakowanej digoksyną przez rozcieńczenie w roztworze przed hybrydyzacją) za pomocą pipety. Inkubować szkiełka w komorze wilgotnościowej szkiełka w temperaturze 42 °C przez około 20 h. 
		UWAGA: Upewnij się, że nakrętka jest szczelna, jak sugeruje ostatnia nuta. W przeciwnym razie wyschnięcie spowodowane wyciekiem przed hybrydyzacją lub przed hybrydyzacją spowoduje wygenerowanie brudnego tła, w tym pseudo-dodatniego na slajdach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>krzyżowanie
	<ol>
		<li>Usunąć roztwór hybrydyzacyjny i przemyć szkiełka 4 x roztworem SSC 4 razy przez 15 minut każde w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Umyć szkiełka w 2 x roztworze SSC z 20 μg/ml RNazy A przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Myć szkiełka w 1x roztworze SSC przez 15 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Myć szkiełka w 0,5 x roztworze SSC przez 15 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Myć szkiełka w 0,1x roztworze SSC przez 15 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Umyj szkiełka PBS 3 razy po 5 minut każde.</li>
		<li>Myć szkiełka w buforze myjącym (100 mM kwas maleinowy, 150 mM NaCl, 0,3% (v/v) Tween 20, pH 7,5) przez 1 min.</li>
		<li>Inkubować szkiełka w 100 ml świeżo przygotowanego roztworu blokującego (2% surowicy owczej w buforze kwasu maleinowego bez Tween 20) przez 30 minut.</li>
		<li>Inkubować szkiełka w 20 ml roztworu przeciwciał przez 45 minut.
		<ol>
			<li>Przed każdym użyciem odwirować przeciwciało przez 5 minut z prędkością 10 000 obr./min w oryginalnej fiolce i ostrożnie odpipetować niezbędną ilość z powierzchni. Rozcieńczyć anty-digoksygeninę-AP w stosunku 1:5000 (150 mU/ml) w roztworze blokującym.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przemyć szkiełka w 100 ml buforu płuczącego 2 razy po 15 minut w celu usunięcia niezwiązanego koniugatu przeciwciał.</li>
		<li>Równowaga szkiełek w 20 ml buforu detekcyjnego (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 9,5) przez 2-5 minut.</li>
		<li>Inkubować szkiełka z 10 ml świeżo przygotowanego roztworu podłoża barwnego w komorze wilgotnościowej szkiełka. Reakcja rozpoczyna się w ciągu kilku minut i kończy się po 16 godzinach. Nie potrząsaj ani nie mieszaj, gdy kolor się rozwija.</li>
		<li>Płukać szkiełka 50 ml wody destylowanej przez 5 minut, aby zatrzymać reakcję.</li>
		<li>Wysuszyć próbkę przez noc w ciemności.</li>
		<li>Odwodnić szkiełka w 70% etanolu, 80% etanolu, 90% etanolu, 95% etanolu, 100% etanolu I i 100% etanolu II przez 3 minuty każda.</li>
		<li>Wyczyść szkiełka w 100% ksylenie I, 100% ksylenie II i 100% ksylenie III przez 20 minut każdy.</li>
		<li>Zamontuj zjeżdżalnie za pomocą neutralnego balsamu.</li>
		<li>Dokumentuj obrazy i analizuj je za pomocą mikroskopii odwróconej i oprogramowania producenta. Przeprowadzić analizę dystrybucji za pomocą ImageJ w zależności od gęstości sygnału dodatniego wzdłuż osi podłużnej lub w strefie różnicowej zarodków. 
		UWAGA: Podczas inkubacji ze świeżo przygotowanym roztworem substratu barwnego w kroku 7.4.12 barwę reakcji można zobaczyć nawet gołym okiem. Ta obserwacja dotycząca tego, jak wywoływanie kolorów można sprawdzić pod stereoskopem. Gdy kolor reakcji jest rozsądny i można wykonać krok 7.4.13, aby zatrzymać reakcję.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Weisleder, N., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+Ca2%2B+sparks+in+aging+skeletal+and+cardiac+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Altered Ca2+ sparks in aging skeletal and cardiac muscle.</a> Ageing Research Reviews. 7 (3), 177-188 (2008).</li>
<li>Cheng, H., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Sparks%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Calcium Sparks.</a> Physiological Reviews. 88 (4), 1491-1545 (2008).</li>
<li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ryanodine+Receptors%3A+Functional+Structure+and+Their+Regulatory+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ryanodine Receptors: Functional Structure and Their Regulatory Factors.</a> Chinese Journal of Cell Biology. 37 (1), 6-15 (2015).</li>
<li>Xu, X., Balk, S. P., Isaacs, W., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling%3A+an+underlying+link+between+cardiac+disease+and+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+%26+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling: an underlying link between cardiac disease and carcinogenesis.</a> Cell & Bioscience. 8 (39), 1-2 (2018).</li>
<li>Xu, X., Bhat, M. B., Nishi, M., Takeshima, H., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+cDNA+encoding+a+Drosophila+ryanodine+receptor+and+functional+studies+of+the+carboxyl-terminal+calcium+Release+Channel%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of cDNA encoding a Drosophila ryanodine receptor and functional studies of the carboxyl-terminal calcium Release Channel.</a> Biophysical Journal. 78 (3), 1270-1281 (2000).</li>
<li>George, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+FKBP+family+protein%3A+evaluation%2C+structure%2C+and+function+in+mammals+and+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of FKBP family protein: evaluation, structure, and function in mammals and Drosophila melanogaster.</a> BMC Developmental Biology. 18 (1), 1-12 (2018).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syncytium+calcium+signaling+and+macrophage+function+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+%26+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Syncytium calcium signaling and macrophage function in the heart.</a> Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+CaSR%2FIP3R+in+prostate+cancer+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+%26+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Calcium and CaSR/IP3R in prostate cancer development.</a> Cell & Bioscience. 8 (1), 1-7 (2018).</li>
<li>Xu, M., Seas, A., Kiyani, M., Ji, K. S., Bell, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+temporal+examination+of+calcium+signaling+in+cancer-+from+tumorigenesis%2C+to+immune+evasion%2C+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+%26+Bioscience%22%5BJournal%5D)">A temporal examination of calcium signaling in cancer- from tumorigenesis, to immune evasion, and metastasis.</a> Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).</li>
<li>Shou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+defects+and+altered+ryanodine+receptor+function+in+mice+lacking+FKBP12%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cardiac defects and altered ryanodine receptor function in mice lacking FKBP12.</a> Nature. 391 (6666), 489-492 (1998).</li>
<li>Xin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oestrogen+protects+FKBP12.6+null+mice+from+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oestrogen protects FKBP12.6 null mice from cardiac hypertrophy.</a> Nature. 416 (6878), 334-337 (2002).</li>
<li>Zalk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+mammalian+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of a mammalian ryanodine receptor.</a> Nature. 517 (7532), 44-49 (2015).</li>
<li>Ridgway, E. B., Gilkey, J. C., Jaffe, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+calcium+increases+explosively+in+activating+medaka+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Free calcium increases explosively in activating medaka eggs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (2), 623-627 (1977).</li>
<li>Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+free+calcium+wave+traverses+the+activating+egg+of+the+medaka%2C+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes.</a> Journal of Cell Biology. 76 (2), 448-466 (1978).</li>
<li>Kreko-Pierce, T., Azpurua, J., Mahoney, R. E., Eaton, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extension+of+health+span+and+life+span+in+Drosophila+by+S107+requires+the+calstabin+homologue+FK506-BP2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Extension of health span and life span in Drosophila by S107 requires the calstabin homologue FK506-BP2.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (50), 26045-26055 (2016).</li>
<li>Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ryanodine+receptor+is+essential+for+larval+development+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 5942-5947 (2000).</li>
<li>Feng, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+expression+of+DmFKBP12%2FCalstabin+during+embryonic+early+development+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+%26+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Dynamics expression of DmFKBP12/Calstabin during embryonic early development of Drosophila melanogaster.</a> Cell & Bioscience. 9 (1), 1-16 (2019).</li>
<li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCampos-Ortega%2C+JA+%22The+embryonic+development+of+Drosophila+melanogaster%22">The embryonic development of Drosophila melanogaster</a>. , Springer. 633-645 (1958).</li>
<li>Xu, X., Dong, C., Vogel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemicentins+Assemble+on+Diverse+Epithelia+in+the+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Hemicentins Assemble on Diverse Epithelia in the Mouse.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (2), 119-126 (2007).</li>
<li>Wehrens, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FKBP12.6+deficiency+and+defective+calcium+release+channel+%28ryanodine+receptor%29+function+linked+to+exercise-induced+sudden+cardiac+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death.</a> Cell. 113 (7), 829-840 (2003).</li>
<li>Wehrens, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+from+cardiac+arrhythmia+through+ryanodine+receptor-stabilizing+protein+calstabin2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Protection from cardiac arrhythmia through ryanodine receptor-stabilizing protein calstabin2.</a> Science. 304 (5668), 292-296 (2004).</li>
<li>Bellinger, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+ryanodine+receptor+complex+causes+%26%2334%3Bleaky%26%2334%3B+channels%3A+a+molecular+mechanism+for+decreased+exercise+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Remodeling of ryanodine receptor complex causes &#34;leaky&#34; channels: a molecular mechanism for decreased exercise capacity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (6), 2198-2202 (2008).</li>
<li>Maruyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FKBP12+is+a+critical+regulator+of+the+heart+rhythm+and+the+cardiac+voltage-gated+sodium+current+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">FKBP12 is a critical regulator of the heart rhythm and the cardiac voltage-gated sodium current in mice.</a> Circulation Research. 108 (9), 1042-1052 (2011).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FKBP12+is+the+only+FK506+binding+protein+mediating+T-cell+inhibition+by+the+immunosuppressant+FK506%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">FKBP12 is the only FK506 binding protein mediating T-cell inhibition by the immunosuppressant FK506.</a> Transplantation. 73 (11), 1835-1838 (2002).</li>
<li>Zalk, R., Marks, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+release+channels+join+the+%27resolution+revolution%27%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Ca2+ release channels join the 'resolution revolution'.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 543-555 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Sygnalizacja wapniowa za pośrednictwem RyRs i IP3R jest podstawowym szlakiem w wielu procesach fizjologicznych i patologicznych zarówno kręgowców, jak i bezkręgowców 1,2,3,4. U ludzi mutacje punktowe, takie jak mutacja R4496C związana z CPVT, w genie RyR2 prowadzą do wycieku wapnia z retikulum sarkoplazmatycznego kardiomiocytów, powodując dysfunkcję serca. Mutacje te objawiają się jako arytmia ...

Sygnalizacja uwalniania wapnia indukowana wapniem (CICR) odgrywa kluczową rolę w wielu procesach biologicznych, takich jak funkcjonowanie mięśni szkieletowych/gładkich i naczyń sercowych, proliferacja i apoptoza komórek, rozwój, starzenie się, plastyczność synaptyczna neuronów i regeneracja1,2,3,4,5,6. Receptory ryanodyny (RyRs) i receptory 1,4,5-trifosforanu inozytolu (IP3Rs) są głównymi graczami w szlaku sygnałowym wapnia kontrolowanym przez ich regulatory: kinazę białkową A (PKA), kinazę białkową Ca2+/kinazę białkową zależną od kalmoduliny II (CaMKII), białka wiążące FK506 (FKBPs), kalsekwestrynę (CSQ), triadynę i junctin1,2,3,4,5,6. Nieprawidłowa ludzka ekspresja i mutacje w tych białkach mogą prowadzić do patologicznej fizjologii, takiej jak arytmie7 i proliferacja onkogenna8,9.
FKBPs regulują uwalnianie wapnia z siatkowatej komórki endoplazmatycznej (ER) przez RyRs. Proces ten jest niezbędny dla mechanizmu skurczu, a tym samym odpowiada za wszystkie ruchy mechaniczne generowane przez skurcz miozyny-aktyny poprzez indukowane wapniem uwalnianie wapnia wraz z embrionalnym RyRs1,2. W modelach mysich brak RyR2 i jego regulatora FKBP12/Calstabin jest niezmiennie śmiertelny, zarówno podczas rozwoju embrionalnego, jak i we wczesnym okresie poporodowym10,11,12. Myszy z nokautem FKBP12/Calstabin wykazują krytyczne wady serca z nieregularnym sprzężeniem pobudzenie-skurcz (EC) i obrzękiem mózgu podczas rozwoju embrionalnego. Wskazuje to, że FKBP12/Calstabin odgrywa istotną rolę w regulacji ekspresji kanału RyR2, co jest ważne zarówno dla rozwoju serca, jak i mózgu10.
RyR przewodzone iskry wapnia zostały początkowo odkryte w fazie tworzenia zygoty zapłodnionych jaj Medaka13,14. Przeprowadzono jednak niewiele badań nad funkcją sygnalizacji wapniowej we wczesnym rozwoju embrionalnym. U Drosophila melanogaster wyniki uzyskane z mutantów DmFKBP12 S107 dostarczają mocnych dowodów potwierdzających znaczenie tego genu dla rozwoju larw i zdrowej długości życia, co przypisuje się jego funkcji przeciwko stresowi oksydacyjnemu15,16. Niedawno zidentyfikowaliśmy dynamiczną lokalizację białka FKBP12/Calstabin i informacyjnego RNA podczas wczesnego rozwoju Drosophila melanogaster17. Korzystając z podejść opisanych w tej metodologii, byliśmy w stanie śledzić ekspresję FKBP12 / Calstabin w D. melanogaster podczas blastodermy syncytialnej (0-2 h), blastodermy komórkowej (2-3 h), wczesnej gastruli (3-12 h) i późnej gastruli (12-24 h). W tym artykule przedstawiamy szczegółowe protokoły każdego podejścia w poprzednim badaniu, w tym osadzanie pre-embrionu w celu klasycznego cięcia parafinowego, leczenie szkiełkami przed powlekaniem skrawków embrionalnych, barwienie histochemiczne i barwienie immunologiczne oraz hybrydyzację mRNA in-situ w celu identyfikacji ekspresji genów.

<table><tbody><tr><td>-20&stopni; C Lodówka</td><td>Meiling Biologia & Medyczny</td><td>DW-YL270</td><td>Używany do przechowywania regentów-80</td></tr><tr><td>&deg; C Lodówka niskotemperaturowa</td><td>Seria Thermo</td><td>Forma 90</td><td>Służy do przechowywania regentów</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WXBB6360V</td><td>Przygotowanie talerzy agarowych z sokiem winogronowym</td></tr><tr><td>Anty-Digoxigenin-AP, fragmenty Fab</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td>Do wykrywania związku znakowanego digoksygeniną</td></tr><tr><td>Inkubator biochemiczny</td><td>Shanghai Bluepard Instruments</td><td>LRH-250</td><td>In-situ Hybrydyzacja</td></tr><tr><td>Roztwór Bouina</td><td>Odczynnik chemiczny Sinopharm w Pekinie</td><td>69945460</td><td>Wirówka do osadzania zarodków Drosophila</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>540BH07808</td><td>In-situ</td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa</td> do hybrydyzacji <td>Denville</td><td>C-2170</td><td>Kolekcja zarodków Drosophila Odczynnik</td></tr><tr>chemiczny<td>Chrome Alum</td><td>Sinopharm w Beijing</td><td>10001018</td><td>Coating</td></tr><tr><td>Slides Kąpiel wodna o stałej temperaturze</td><td>Jintan Henfeng Instruments</td><td>KW-1000DC</td><td>Barwienie hematoksyliną-eozyną, immunohistochemia, hybrydyzacja in-situ i okresowe barwienie kwasem i srebrem Metenamina</td></tr><tr><td>Dako REAL System wykrywania EnVision</td><td>Dako</td><td>K5007</td><td>W reakcji immunohistochemicznej lub reakcji hybrydyzacji in situ wiąże się z pierwotnym przeciwciałem antygenowym, a cel jest znakowany przez barwienie.</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>Zestaw do znakowania RNA in-situ Zestaw</td></tr><tr><td>do znakowania RNA</td><td>11093274910 Roche</td><td>Znakowanie</td><td>RNA za pomocą diagooksygeniny-UTP metodą transkrypcji in vitro polimerazą RNA SP6 i T7</td></tr><tr><td>Drosophila melanogaster</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664</td><td>Stada Drosophila melanogaster mutant</td></tr><tr><td>Elektryczny piec do suszenia strumieniowego</td><td>Tianjin Taiste Instruments</td><td>101-0AB</td><td>Do powlekania szkiełek i zatapiania parafiny</td></tr><tr><td>Eozyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230251</td><td>Barwienie hematoksyliną-eozyną</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sinopharm Odczynnik chemiczny w Pekinie</td><td>100092680</td><td>Osadzanie parafiny, barwienie hematoksyliną-eozyną, immunohistochemia, hybrydyzacja in-situ i barwienie kwasem okresowym i srebrem Metenamina</td></tr><tr><td>Żelatynowy</td><td>odczynnik chemiczny Sinopharm w Pekinie</td><td>10010328</td><td>Szkiełka powlekające</td></tr><tr><td>Chlorek złota</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>379948</td><td>Kwas okresowy-Srebro Barwienie Metenaminą</td></tr><tr><td>Hematoksylina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3136</td><td>Barwienie Hematoksyliną-Eozyną</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania produktu PCR o wysokiej czystości</td><td>Roche</td><td>11732668001</td><td>Do oczyszczania produktów</td></tr> <tr><td>PCRInteligentna skrzynka na stałą temperaturę i wilgotność</td><td>Ningbo Jiangnan Instruments</td><td>HWS</td><td>Do konserwacji muchy</td></tr><tr><td>LE Agaroza</td><td>HyAgaroza</td><td>14190108029</td><td>Wstępne zatapianie</td></tr><tr><td>metanolu</td><td>Sinopharm Odczynnik chemiczny w Pekinie</td><td>10014108</td><td>Mikroskop do pobierania zarodków Drosophila</td></tr><tr><td></td><td>ZEISS</td><td>Observer.A1</td><td>Barwienie hematoksyliny-eozyny, immunohistochemia, hybrydyzacja in-situ i okresowe barwienie kwasowo-srebrne</td></tr><tr><td>preparaty mikroskopowe</td><td>Metenaminy Produkcja sprzętu laboratoryjnego MeVid</td><td>P105-2001</td><td>Szkiełka powlekające Neutralny</td></tr><tr><td>odczynnik chemiczny Guma Sinopharm w Pekinie</td><td>10004160</td><td>Barwienie hematoksyliny-eozyny</td><td></td></tr><tr><td>N-heptan</td><td>Sinopharm Odczynnik chemiczny w Pekinie</td><td>40026768</td><td>zarodek Drosophila Kolekcja</td></tr><tr><td>Krajalnica do parafiny</td><td>Przyrząd naukowy Huahai</td><td>HH-2508III</td><td>In-situ Hybrydyzacja</td></tr><tr><td>parafiny</td><td>Odczynnik chemiczny Sinopharm w Pekinie</td><td>69019461</td><td>Parafina do zatapiania</td></tr> miernika <tr><td>pH / mV</td><td>Sartorius</td><td>PB-10</td><td>Do określania wartości pH roztworu</td></tr><tr><td>Odczynnik chemiczny Sinopharm z</td><td>azotanu srebra</td> w Pekinie <td>10018461</td><td>Okresowe barwienie kwasem i srebrem Metenaminą</td></tr><tr><td>Ultraczysty wodomierz</td><td>Thermo</td><td>AFXI-0501-P</td><td>In-situ Hybrydyzacja</td></tr><tr><td>Odczynnik chemiczny Xylen-Sinopharm</td><td>w Pekinie</td><td>10023418</td><td>Osadzanie parafiny</td></tr></tbody></table>

protokół immunohistochemii i dystrybucji rna in-situ we wczesnym zarodku drosophila

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Sygnalizacja uwalniania wapnia indukowana przez wapń (CICR) odgrywa kluczową rolę w wielu procesach biologicznych. Każda aktywność komórkowa, od proliferacji i apoptozy komórek, rozwoju i starzenia się, po plastyczność i regenerację synaps neuronów, jest związana z receptorami Ryanodine (RyR). Pomimo znaczenia sygnalizacji wapniowej, dokładny mechanizm jej funkcji we wczesnym rozwoju jest niejasny. Jako organizm o krótkim okresie ciąży, zarodki Drosophila melanogaster są głównymi obiektami badań nad dystrybucją i lokalizacją białek związanych z CICR i ich regulatorów podczas rozwoju. Jednak ze względu na ich bogate w lipidy zarodki i bogatą w chitynę kosmówkę, ich użyteczność jest ograniczona przez trudność montażu zarodków na szklanych powierzchniach. W tej pracy przedstawiamy praktyczny protokół, który znacznie poprawia przyczepianie zarodka Drosophila do szkiełek i szczegółowe metody udanej histochemii, immunohistochemii i hybrydyzacji in situ. Metoda powlekania szkiełka z żelatyny chromowo-alumnowej i metoda wstępnego zatapiania zarodków znacznie zwiększa wydajność badania ekspresji białka zarodka Drosophila i RNA. Aby zademonstrować to podejście, zbadaliśmy DmFKBP12 / Calstabin, dobrze znany regulator RyR podczas wczesnego rozwoju embrionalnego Drosophila melanogaster. Zidentyfikowaliśmy DmFKBP12 już w stadium blastodermy syncytialnej i opisujemy dynamiczny wzorzec ekspresji DmFKBP12 podczas rozwoju: początkowo jako równomiernie rozmieszczone białko w blastodermie syncytialnej, następnie wstępnie lokalizujące się w warstwie podstawnej kory podczas blastodermy komórkowej, zanim rozprowadza się w prymitywnej architekturze neuronalnej i trawiennej podczas fazy warstwy trzech klejnotów we wczesnej gastrulacji. Ten rozkład może wyjaśniać krytyczną rolę, jaką RyR odgrywa w ważnych układach narządów, które wywodzą się z tych warstw: zwoju podprzełykowym i nadprzełykowym, brzusznym układzie nerwowym i układzie mięśniowo-szkieletowym.

Ryciny opisują protokoły stosowane w celu pokonania trudności z przytwierdzaniem embrionów Drosophila o chorionie o wysokiej zawartości lipidów i chityny (Tabela 1) do powierzchni szkiełka przedmiotowego w celu badania i przeprowadzania eksperymentów. Wykorzystując metodę powlekania szkiełek żelatyną z ałunem chromowym przedstawioną na Ryc. 1, poprawiliśmy przytwierdzanie embrionów Drosophila do powierzchni szkiełek, natomiast metoda wstępnego osadzania emb...

Tutaj opisujemy protokół wykrywania i lokalizacji białka zarodka Drosophila i RNA od pobrania do wstępnego osadzenia i osadzenia, barwienia immunologicznego i hybrydyzacji mRNA in situ.

Protokół immunohistochemii i dystrybucji RNA in-situ we wczesnym zarodku Drosophila

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and ...

Jako organizm o krótkim okresie ciąży, zarodki Drosophila melanogaster są głównymi obiektami badań nad dystrybucją i lokalizacją białek i ich regulatorów podczas rozwoju. Jednak ze względu na ich bogate w lipidy zarodki i bogatą w chitynę kosmówkę, ich użyteczność jest ograniczona przez trudność montażu zarodków na szklanych powierzchniach. W tej pracy przedstawiamy praktyczną metodę, która znacznie poprawia przyczepianie zarodka Drosophila do szkiełek i szczegółowo opisujemy nasze metody udanej histochemii, immunohistochemii i hybrydyzacji in situ.Przed wykonaniem przedstawionych tutaj czynności szkiełka należy umyć detergentem, a następnie wypłukać w wodzie z kranu i wodzie destylowanej przed włożeniem do piekarnika do wyschnięcia. Suche szkiełka należy delikatnie moczyć w dwuchromianie potasu przez 24 godziny, a następnie ponownie spłukać i wysuszyć, a następnie umieścić w 95% etanolu na co najmniej dwie godziny. Na tym etapie możesz przygotować kolejne szkiełka lub ałunowo-żelatynę chromową zgodnie z naszymi metodami.Żelatynę można następnie przechowywać w kąpieli o temperaturze 60 stopni przed użyciem. Aby pokryć szkiełka, upuść niewielką ilość żelatyny na jedną krawędź szkiełka. Następnie użyj kolejnego szkiełka, aby powoli i równomiernie przeciągnąć żelatynę po powierzchni szkiełka, które ma być pokryte.W ten sposób powstaje cienka, równa warstwa. Przed umieszczeniem na ruszcie lub urządzeniu do suszenia w celu przechowywania w piekarniku, aby umożliwić pełne wyschnięcie przez kolejną noc lub 48 godzin. Zarodki zbiera się za pomocą płytki agarowej z sokiem winogronowym, a gdy są gotowe, można następnie usunąć płytkę z sokiem winogronowym.Zalej płytkę PBS i delikatnie wyszczotkuj miękką szczoteczką w celu usunięcia przyczepionych zarodków. Usunąć zarodek zawierający PBS do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra i pozostawić na lodzie. Gdy zarodki osiądą na lodzie, delikatnie usunąć supernatant PBS.Uważaj, aby nie naruszyć zarodka na dnie probówki. Dodaj 1 ml 50% wybielacza do próbki i delikatnie wstrząsaj przez dwie minuty. Usunąć wybielacz przez filtrację i trzykrotnie umyć zarodki w PBS.Przygotuj n-heptan. Po przygotowaniu umyj zarodki z bibuły filtracyjnej do n-heptanu, delikatnie potrząsając bibułą filtracyjną w roztworze. Pozwól zarodkom osiąść na dnie płytki n-heptanu i zbierz ten n-heptan do nowej 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej.Dodaj jeden mililitr metanolu do probówki, pozwól roztworowi się wytrącić, a następnie odessaj metanol n-heptan. Umyj zarodek w PBS trzy do pięciu razy, aby usunąć resztki metanolu. Usuń ten dodatkowy PBS i dodaj utrwalacz Bouina i pozostaw na 30 do 60 minut w celu utrwalenia zarodków.Usuń utrwalacz Bouina i ponownie umyj zarodki w PBS trzy razy. Przygotuj 1,2% agarozy w PBS i trzymaj w cieple w łaźni wodnej o temperaturze 60 stopni, a następnie przygotuj zarodki do osadzenia, delikatnie odsysając dodatkowy PBS, w którym były przechowywane. Uważaj, aby nie naruszyć zarodków na dnie, a następnie odessać zatyczkę zarodkową na dnie roztworu i delikatnie umieścić w formie na nakrętki do butelek.Odessać dodatkowy PBS z tej formy przed dodaniem 1,2% żelu agarozowego. Przygotować roztwór PBS w celu przechowywania tych zatyczek agarozowych. Gdy agaroza zastygnie, poszczególne korki można następnie przenieść do tego PBS w celu przechowywania.Tutaj pokazujemy sekwencyjny proces odwadniania. Za każdym razem należy odczekać 15 minut na inkubację. Następnie wyjmij ze 100% etanolu i utrwal w roztworze etanolu i ksylenu jeden do jednego na kolejne 15 minut.Po wyjęciu z tego roztworu jeden do jednego, usuń czysty ksylen na jedną minutę. Teraz próbka tkanki jest gotowa do przeniesienia do podgrzanego roztworu parafiny ksylenowej jeden do jednego. Pozostaw na 30 minut przed ostatecznym zanurzeniem w 100% parafinie.Przejdź do pierwszej ze 100% parafiny i odpoczywaj przez dwie godziny. Powtórz ten proces w dwóch i trzech parafinach. Próbka jest teraz gotowa do przeniesienia do formy, a forma wypełniona woskiem, aby zakończyć proces zatapiania.Osadzanie zarodków Drosophila. Przygotowane skrawki parafiny zarodków Drosophila umieścić w piekarniku o temperaturze 60 stopni na 15 minut. Umieść je w 100% roztworze ksylenu.Następnie rozpoczynamy nawadnianie. Umieść szkiełka w każdym z tych roztworów na trzy minuty każde. Gdy szkiełko znajdzie się w wodzie destylowanej, umieść je w roztworze hematoksyliny na dwie minuty.Po zakończeniu upewnij się, że spuściłeś jak najwięcej roztworu ze szkiełka. Po umyciu szkiełka w wodzie destylowanej, zabarwić szkiełko w eozynie przez jedną minutę. Na koniec wyjmij szkiełko z eozyny i umyj w wodzie destylowanej.Gdy ta zjeżdżalnia jest czysta, rozpoczynamy ostateczny proces odwadniania. Na koniec umieszcza się w 100% ksylenie na pięć minut. Proces ten powtarza się w dwóch nowych roztworach 100% ksylenu i upuszcza niewielką ilość neutralnej gumy wzdłuż jednej krawędzi szkiełka.Weź to szkiełko nakrywkowe i delikatnie umieść na jednej krawędzi szkiełka. Najpierw odparafinować szkiełka, umieszczając je w 100% ksylenie. Po wyjęciu szkiełek z wody destylowanej należy je zalać 1% roztworem kwasu okresowego.Następnie wylewamy nadmiar roztworu i spłukujemy w wodzie destylowanej. Umieszczając szkiełko bezpośrednio w podgrzanym roztworze. Po zakończeniu płuczemy szkiełko w wodzie destylowanej, a następnie zabarwiamy roztwór 0,2% chlorkiem złota przez jedną do dwóch minut.Następnie utrwalamy tkankę 3% tiosiarczanem sodu przez trzy minuty za pomocą wody destylowanej. A następnie przeciwbarwić hematoksyliną. Po barwieniu przeciwstawnym plamę można zmyć dowolną tubką wody destylowanej, jak pokazano tutaj.Następnie przechodzimy do procesu odwodnienia. Następnie umieść szkiełka bezpośrednio w 100% ksylenie, a następnie nałóż niewielką ilość neutralnej gumy na róg szkiełka. Delikatnie przykryj szkiełkiem nakrywkowym.Rozpocznij przygotowanie szkiełek tak jak poprzednio, od deparafinowania i ksylenu. A potem w etanolu ksyleno-jednym jeden do jednego. Po odparafinizowaniu szkiełek zaczynamy ponownie nawadniać ich tkankę, a następnie w PBS.Umieść szkiełka w 0,3% nadtlenku wodoru wytwarzanym w metanolu na 10 minut. Następnie szkiełka przykrywa się 20 ml roztworu do pobierania celu. Szkiełka można następnie umieścić w pudełku do barwienia.Umieść pojemnik na barwnik w parowarze, upewniając się, że żaden roztwór nie wydostaje się na zewnątrz, a szkiełka są nadal całkowicie zakryte. Należy pamiętać, że pokrywka pojemnika na plamy nie powinna być całkowicie zamknięta, aby para wodna mogła uciekać podczas procesu gotowania na parze. A następnie trzykrotnie delikatnie spłukując w PBS-T.Wyrzuć nadmiar roztworu i powtórz proces, tym razem z PBS. Następnie inkubujemy szkiełka w bloku nadtlenkowym przez pięć do 10 minut, a następnie kilkakrotnie spłukujemy ponownie w PBS-T, a następnie w PBS. Przygotuj przeciwciało i upuść je bezpośrednio na tkankę.Tkanki te można następnie inkubować lub w temperaturze pokojowej przez cztery godziny. Przeciwciało drugorzędowe należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 90 minut, czyli barwić 5% DAB przez dwie do 10 minut. Po uzyskaniu odpowiedniego koloru należy spłukać w wodzie destylowanej, a następnie przeciwbarwić w hematoksylinie.Po tym barwieniu hematoksyną szkiełka mogą być sekwencyjnie odwadniane. Umieść szkiełka w 100% ksylenie i pozostaw do namoczenia na trzy minuty. Następnie upuść niewielkie ilości neutralnej gumy na jedną krawędź szkiełka.Po umieszczeniu gumy weź szkiełkową osłonę i delikatnie przyłóż ją do jednej krawędzi szkiełka. Dodać jeden mikrogram oczyszczonego, zlinearyzowanego matrycowego DNA do sterylnej fiolki reakcyjnej wolnej od RNazy. Następnie dodaj wystarczającą ilość sterylnej, wolnej od RNaz podwójnie destylowanej wody destylowanej DEPC, aby uzyskać całkowitą objętość próbki 13 mikrolitrów.Następnie krótko odwirować i inkubować przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. W przypadku eksperymentów z ochroną przed RNazą zalecamy inkubację przez 15 minut z dwoma mikrolitrami Dnazy-1, wolnej od RNaz w celu usunięcia matrycowego DNA. Po zakończeniu etapu inkubacji zatrzymaj reakcję, dodając dwa mikrolitry 0,2 molowego EDTA o pH ośmiu.Przed przedstawionymi tutaj krokami szkiełka zostały odparafinowane i ponownie uwodnione, zgodnie z naszym wcześniej zademonstrowanym protokołem. Po ponownym nawodnieniu inkubować szkiełka w 0,01 mola na litr PBS przy pH 7,4 przez pięć minut każda, aby usunąć roztwór utrwalający z tkanki. Po wypłukaniu w PBS, następnie spłukujemy 100 milimolowym roztworem glicyny na litr przez pięć minut dwa razy, aby usunąć wolne grupy aldehydowe z tkanki.Po tym kroku płucz szkiełka PBS przez pięć minut. Następnie inkubować w PBS zawierającym 0,3% trytonu X-100 przez 15 minut przed płukaniem, a następnie ponownie inkubować z jednym mikrogramem na mikrolitr proteinazy K. Następnie utrwalić szkiełka z 4% paraformaldehydem i PBS o pH 7,2 przez trzy minuty. Następnie umyć szkiełka przed inkubacją z 0,1 molowym buforem trietanoloaminy o pH 8, zawierającym 0,25% bezwodnika octowego.Na tym etapie możesz zdecydować się na przechylenie pudełka, aby zapewnić pełne pokrycie roztworem. Pudełko przygotowuje się przez dodanie 20% glicerolu lub wody DEPC na dno suchego pudełka do hybrydyzacji. Następnie przykryj szkiełka w 20 mikrolitrach roztworu przed hybrydyzacją.DNA plemników łososia w stężeniu 100 mikrogramów na mililitr na każde szkiełko. A następnie inkubować w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez cztery godziny. Odbywa się to w przygotowanym nawilżonym pudełku, aby zapewnić, że roztwór nie wyschnie podczas tego procesu.Na etapie po hybrydyzacji bardzo ważne jest, aby roztwór do hybrydyzacji został całkowicie wypłukany z próbek. Można to zrobić w kolejnych płukaniach trwających 15 minut w temperaturze 37 stopni, używając roztworu SSC o czterokrotnym stężeniu, dwukrotnie stężeniu jednokrotnym stężenia, 0,5-krotności stężenia i 0,1-krotności stężenia. Każdy inkubuje się przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po wykonaniu tej czynności przemyj PBS trzy razy przez pięć minut każdy przed dodaniem buforu myjącego. Bufor myjący należy płukać przez minutę przed kolejnymi krokami Upewnij się, że bufor myjący jest całkowicie suchy od szkiełek przed dodaniem następnego roztworu. Dodaj 100 mililitrów roztworu blokującego do każdego szkiełka i inkubuj szkiełko przez 30 minut.Najlepiej zrobić to w środowisku wolnym od światła, aby zapewnić dobre barwienie. Następnie ponownie inkubować szkiełka przez 30 minut w 20 ml roztworu przeciwciała. Nałóż roztwór przeciwciała bezpośrednio na szkiełka, aby uzyskać pełne pokrycie tkanki.Po zakończeniu inkubacji nałóż 100 mililitrów buforu do mycia. Inkubować przez 15 minut w lekkich warunkach wolnych od zanieczyszczeń, aby usunąć niezwiązane koniugaty przeciwciał. Usuń bufor myjący.Następnie nanieść 20 mililitrów buforu detekcyjnego i pozostawić do inkubacji na około cztery minuty. Po czterech minutach usuń bufor wykrywania. Wysuszyć szkiełka, aby upewnić się, że nie ma dodatkowego roztworu i dodać 10 mililitrów świeżo przygotowanego roztworu podłoża barwnego.Ta reakcja rozpoczyna się w ciągu kilku minut, ale kończy się po 16 godzinach. Pozwól więc inkubować przez ten okres czasu w stanie wolnym od światła. Po znalezieniu pożądanych miejsc, w których wykryte zostaną prążki, umyj szkiełko 50 mililitrami buforu TE, aby zatrzymać reakcję.A następnie zakończ nasz wcześniej pokazany proces odwadniania i proces montażu dla neutralnej gumy. Ryciny pierwszy i drugi pokazują metodę powlekania glinowo-żelatynowego chromem skrawków parafiny oraz metodę osadzania profilu ekspresji FKBP12 i DmFKBP12 w rozwijających się zarodkach Drosophila. Rycina trzecia przedstawia rozkład białek wykrytego przeciwciała FKBP12 na etapach blastodermy syncytialnej komórkowej.Z tych wyników histochemicznych można zauważyć, że ekspresja FKBP12 jest mniej spolaryzowana w blastodermie syncytialnej, a następnie zaczyna lokalizować się w błonie podstawnej pod nabłonkiem trofektodermy, informując gradient z większą ekspresją występującą w biegunie przednim i tylnym. Rycina czwarta, która śledzi wczesne i późne etapy relacji gazowej zarodka Drosophila, pokazuje, że białko FKBP12 zostaje ograniczone do pewnych składników architektonicznych prymitywnej tkanki embrionalnej. Z mniejszą dystrybucją zewnątrzkomórkową niż obserwowana we wczesnych i późnych stadiach zarodkowych.Co ciekawe, opisanej powyżej dynamicznej dystrybucji białek nie towarzyszą odpowiadające jej zmiany w poziomach MRI FKBP12, jak widać na rycinie piątej. Wskazuje to na ekspresję białek jako wynik wciąż nieznanego potranskrypcyjnego mechanizmu molekularnego. Sygnalizacja wapniowa za pośrednictwem receptora Ryanodine jest podstawowym szlakiem w wielu procesach fizjologicznych i patologicznych zarówno kręgowców, jak i bezkręgowców.Wiadomo, że mutacje w tym genie powodują wiele zaburzeń fizjologicznych prowadzących do choroby lub przedwczesnej śmierci sercowej. Jednak rola, jaką ten gen odgrywa we wczesnym rozwoju Drosophila, była trudna do zbadania. Jako składnik tranzytowy zarodka, bogaty w lipidy zarodek i bogata w chitynę kosmówka, utrudniają badania nad ekspresją białka i embrionu we wczesnym rozwoju Drosophila.Powlekanie szkiełka, osadzanie zarodków i techniki immunohistochemiczne opisane w tym artykule pozwoliły nam szczegółowo zbadać dynamiczną dystrybucję białka receptora ryanodine i mRNA. Dzielimy się tymi technikami i mamy nadzieję, że pozwolą one innym badać inne białka we wczesnych stadiach rozwoju Drosophila.

a-protocol-for-immunohistochemistry-rna-situ-distribution-within

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejszy protokół demonstruje sposób wykonania immunohistochemii na wypreparowanych larwach Drosophila.

Immunohistochemia NMJ larw Drosophila

Opisujemy procedurę przygotowania zarodków Drosophila na różnych etapach rozwoju w celu wizualizacji embrionalnego układu nerwowego podczas embriogenezy.

Wizualizacja embrionalnego układu nerwowego w całych zarodkach Drosophila

Barwienie przeciwciałami poczwerek Drosophila może usprawnić analizy genetyczne rozwoju odwłoka osobników dorosłych. Przedstawiamy nasz protokół sekcji, utrwalania i barwienia przeciwciałami odwłoka poczwarek Drosophila w określonych stadiach rozwojowych.

Immunohistochemia odwłoka poczwarki Drosophila

Tutaj opisujemy protokół hybrydyzacji in situ (FISH) do określania właściwości ekspresji i lokalizacji RNA wyrażanych podczas embriogenezy u muszki owocowej, Drosophila melanogaster.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ zarodków Drosophila z całą górą RNA

Barwienie immunologiczne jest skuteczną techniką wizualizacji określonych typów komórek i białek w tkankach. Wykorzystując sonikację, opisany tutaj protokół łagodzi potrzebę preparowania tkanek Drosophila melanogaster z zarodków i larw w późnym stadium przed barwieniem immunologicznym. Zapewniamy skuteczną metodologię barwienia immunologicznego całych larw utrwalonych formaldehydem.

Wspomagane sonikacją barwienie immunofluorescencyjne tkanek drobnoustrojowych i larwalnych drobnoustrojowych i larwalnych Drosophila in situ

Opisujemy wielozadaniową procedurę chromogenicznej hybrydyzacji in situ (MC-WISH) w nienaruszonych zarodkach Drosophila, pozwalającą na jednoczesne i specyficzne wykrywanie trzech różnych wzorców dystrybucji mRNA poprzez kontrastujące kolorowe osady.

Wielozadaniowa chromogenna hybrydyzacja in situ w całości do porównania domen ekspresji genów w zarodkach Drosophila

Opisany protokół hybrydyzacji RNA in situ pozwala na wykrycie RNA w całych zarodkach Drosophila lub wypreparowanych tkankach. Korzystając z 96-dołkowych płytek mikromiareczkowych i wzmocnienia sygnału tyramidu, transkrypty mogą być wykrywane z wysoką rozdzielczością, czułością i przepustowością oraz przy stosunkowo niskich kosztach.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ o wysokiej rozdzielczości w zarodkach i tkankach Drosophila przy użyciu wzmocnienia sygnału tyramidowego

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji i jednoczesnego obrazowania wielu zarodków Drosophila podczas rozwoju embrionalnego za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości na płytce.

Przygotowanie zarodków Drosophila i mikroiniekcja do mikroskopii żywych komórek wykonana przy użyciu automatycznego analizatora o wysokiej zawartości

To badanie przedstawia uproszczony protokół przetwarzania tkanek obejmujący dekapitację, fiksację, kriosekcję, barwienie fluorescencyjne, barwienie immunologiczne i obrazowanie, który może być rozszerzony na obrazowanie konfokalne i wielofotonowe. Metoda zachowuje skuteczność porównywalną ze skomplikowanymi sekcjami, omijając potrzebę zaawansowanych umiejętności motorycznych. Ilościowa analiza obrazu daje szeroki potencjał badawczy.

Bezpośrednia kriosekcja głów Drosophila w celu wzmocnienia barwienia fluorescencyjnego mózgu i barwienia immunologicznego

Protokoły te określają, jak scharakteryzować organizację i funkcję zakrywającą złączeń przegrody plisowanej u nabłonka embrionalnego kontrolnego oraz mutacyjnego nabłonka embrionalnego Drosophila.

Eksperymenty immunobarwienia i penetracji barwnika w celu określenia białek styku przegrody w nabłonku embrionalnym Drosophila

Poznaj metody immunohistochemii i hybrydyzacji in situ RNA w zarodkach Drosophila melanogaster. Protokół poprawia przyczepność próbek do szkiełek i umożliwia wizualizację lokalizacji białek oraz RNA w biologii rozwoju.

Protokół immunohistochemii i dystrybucji RNA in-situ we wczesnym zarodku Drosophila

Przeglądaj więcej filmów