Protokół immunohistochemii i dystrybucji RNA in-situ we wczesnym zarodku Drosophila

Jako organizm o krótkim okresie ciąży, zarodki Drosophila melanogaster są głównymi obiektami badań nad dystrybucją i lokalizacją białek i ich regulatorów podczas rozwoju. Jednak ze względu na ich bogate w lipidy zarodki i bogatą w chitynę kosmówkę, ich użyteczność jest ograniczona przez trudność montażu zarodków na szklanych powierzchniach. W tej pracy przedstawiamy praktyczną metodę, która znacznie poprawia przyczepianie zarodka Drosophila do szkiełek i szczegółowo opisujemy nasze metody udanej histochemii, immunohistochemii i hybrydyzacji in situ.

Przed wykonaniem przedstawionych tutaj czynności szkiełka należy umyć detergentem, a następnie wypłukać w wodzie z kranu i wodzie destylowanej przed włożeniem do piekarnika do wyschnięcia. Suche szkiełka należy delikatnie moczyć w dwuchromianie potasu przez 24 godziny, a następnie ponownie spłukać i wysuszyć, a następnie umieścić w 95% etanolu na co najmniej dwie godziny. Na tym etapie możesz przygotować kolejne szkiełka lub ałunowo-żelatynę chromową zgodnie z naszymi metodami.

Żelatynę można następnie przechowywać w kąpieli o temperaturze 60 stopni przed użyciem. Aby pokryć szkiełka, upuść niewielką ilość żelatyny na jedną krawędź szkiełka. Następnie użyj kolejnego szkiełka, aby powoli i równomiernie przeciągnąć żelatynę po powierzchni szkiełka, które ma być pokryte.

W ten sposób powstaje cienka, równa warstwa. Przed umieszczeniem na ruszcie lub urządzeniu do suszenia w celu przechowywania w piekarniku, aby umożliwić pełne wyschnięcie przez kolejną noc lub 48 godzin. Zarodki zbiera się za pomocą płytki agarowej z sokiem winogronowym, a gdy są gotowe, można następnie usunąć płytkę z sokiem winogronowym.

Zalej płytkę PBS i delikatnie wyszczotkuj miękką szczoteczką w celu usunięcia przyczepionych zarodków. Usunąć zarodek zawierający PBS do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra i pozostawić na lodzie. Gdy zarodki osiądą na lodzie, delikatnie usunąć supernatant PBS.

Uważaj, aby nie naruszyć zarodka na dnie probówki. Dodaj 1 ml 50% wybielacza do próbki i delikatnie wstrząsaj przez dwie minuty. Usunąć wybielacz przez filtrację i trzykrotnie umyć zarodki w PBS.

Przygotuj n-heptan. Po przygotowaniu umyj zarodki z bibuły filtracyjnej do n-heptanu, delikatnie potrząsając bibułą filtracyjną w roztworze. Pozwól zarodkom osiąść na dnie płytki n-heptanu i zbierz ten n-heptan do nowej 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej.

Dodaj jeden mililitr metanolu do probówki, pozwól roztworowi się wytrącić, a następnie odessaj metanol n-heptan. Umyj zarodek w PBS trzy do pięciu razy, aby usunąć resztki metanolu. Usuń ten dodatkowy PBS i dodaj utrwalacz Bouina i pozostaw na 30 do 60 minut w celu utrwalenia zarodków.

Usuń utrwalacz Bouina i ponownie umyj zarodki w PBS trzy razy. Przygotuj 1,2% agarozy w PBS i trzymaj w cieple w łaźni wodnej o temperaturze 60 stopni, a następnie przygotuj zarodki do osadzenia, delikatnie odsysając dodatkowy PBS, w którym były przechowywane. Uważaj, aby nie naruszyć zarodków na dnie, a następnie odessać zatyczkę zarodkową na dnie roztworu i delikatnie umieścić w formie na nakrętki do butelek.

Odessać dodatkowy PBS z tej formy przed dodaniem 1,2% żelu agarozowego. Przygotować roztwór PBS w celu przechowywania tych zatyczek agarozowych. Gdy agaroza zastygnie, poszczególne korki można następnie przenieść do tego PBS w celu przechowywania.

Tutaj pokazujemy sekwencyjny proces odwadniania. Za każdym razem należy odczekać 15 minut na inkubację. Następnie wyjmij ze 100% etanolu i utrwal w roztworze etanolu i ksylenu jeden do jednego na kolejne 15 minut.

Po wyjęciu z tego roztworu jeden do jednego, usuń czysty ksylen na jedną minutę. Teraz próbka tkanki jest gotowa do przeniesienia do podgrzanego roztworu parafiny ksylenowej jeden do jednego. Pozostaw na 30 minut przed ostatecznym zanurzeniem w 100% parafinie.

Przejdź do pierwszej ze 100% parafiny i odpoczywaj przez dwie godziny. Powtórz ten proces w dwóch i trzech parafinach. Próbka jest teraz gotowa do przeniesienia do formy, a forma wypełniona woskiem, aby zakończyć proces zatapiania.

Osadzanie zarodków Drosophila. Przygotowane skrawki parafiny zarodków Drosophila umieścić w piekarniku o temperaturze 60 stopni na 15 minut. Umieść je w 100% roztworze ksylenu.

Następnie rozpoczynamy nawadnianie. Umieść szkiełka w każdym z tych roztworów na trzy minuty każde. Gdy szkiełko znajdzie się w wodzie destylowanej, umieść je w roztworze hematoksyliny na dwie minuty.

Po zakończeniu upewnij się, że spuściłeś jak najwięcej roztworu ze szkiełka. Po umyciu szkiełka w wodzie destylowanej, zabarwić szkiełko w eozynie przez jedną minutę. Na koniec wyjmij szkiełko z eozyny i umyj w wodzie destylowanej.

Gdy ta zjeżdżalnia jest czysta, rozpoczynamy ostateczny proces odwadniania. Na koniec umieszcza się w 100% ksylenie na pięć minut. Proces ten powtarza się w dwóch nowych roztworach 100% ksylenu i upuszcza niewielką ilość neutralnej gumy wzdłuż jednej krawędzi szkiełka.

Weź to szkiełko nakrywkowe i delikatnie umieść na jednej krawędzi szkiełka. Najpierw odparafinować szkiełka, umieszczając je w 100% ksylenie. Po wyjęciu szkiełek z wody destylowanej należy je zalać 1% roztworem kwasu okresowego.

Następnie wylewamy nadmiar roztworu i spłukujemy w wodzie destylowanej. Umieszczając szkiełko bezpośrednio w podgrzanym roztworze. Po zakończeniu płuczemy szkiełko w wodzie destylowanej, a następnie zabarwiamy roztwór 0,2% chlorkiem złota przez jedną do dwóch minut.

Następnie utrwalamy tkankę 3% tiosiarczanem sodu przez trzy minuty za pomocą wody destylowanej. A następnie przeciwbarwić hematoksyliną. Po barwieniu przeciwstawnym plamę można zmyć dowolną tubką wody destylowanej, jak pokazano tutaj.

Następnie przechodzimy do procesu odwodnienia. Następnie umieść szkiełka bezpośrednio w 100% ksylenie, a następnie nałóż niewielką ilość neutralnej gumy na róg szkiełka. Delikatnie przykryj szkiełkiem nakrywkowym.

Rozpocznij przygotowanie szkiełek tak jak poprzednio, od deparafinowania i ksylenu. A potem w etanolu ksyleno-jednym jeden do jednego. Po odparafinizowaniu szkiełek zaczynamy ponownie nawadniać ich tkankę, a następnie w PBS.

Umieść szkiełka w 0,3% nadtlenku wodoru wytwarzanym w metanolu na 10 minut. Następnie szkiełka przykrywa się 20 ml roztworu do pobierania celu. Szkiełka można następnie umieścić w pudełku do barwienia.

Umieść pojemnik na barwnik w parowarze, upewniając się, że żaden roztwór nie wydostaje się na zewnątrz, a szkiełka są nadal całkowicie zakryte. Należy pamiętać, że pokrywka pojemnika na plamy nie powinna być całkowicie zamknięta, aby para wodna mogła uciekać podczas procesu gotowania na parze. A następnie trzykrotnie delikatnie spłukując w PBS-T.

Wyrzuć nadmiar roztworu i powtórz proces, tym razem z PBS. Następnie inkubujemy szkiełka w bloku nadtlenkowym przez pięć do 10 minut, a następnie kilkakrotnie spłukujemy ponownie w PBS-T, a następnie w PBS. Przygotuj przeciwciało i upuść je bezpośrednio na tkankę.

Tkanki te można następnie inkubować lub w temperaturze pokojowej przez cztery godziny. Przeciwciało drugorzędowe należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 90 minut, czyli barwić 5% DAB przez dwie do 10 minut. Po uzyskaniu odpowiedniego koloru należy spłukać w wodzie destylowanej, a następnie przeciwbarwić w hematoksylinie.

Po tym barwieniu hematoksyną szkiełka mogą być sekwencyjnie odwadniane. Umieść szkiełka w 100% ksylenie i pozostaw do namoczenia na trzy minuty. Następnie upuść niewielkie ilości neutralnej gumy na jedną krawędź szkiełka.

Po umieszczeniu gumy weź szkiełkową osłonę i delikatnie przyłóż ją do jednej krawędzi szkiełka. Dodać jeden mikrogram oczyszczonego, zlinearyzowanego matrycowego DNA do sterylnej fiolki reakcyjnej wolnej od RNazy. Następnie dodaj wystarczającą ilość sterylnej, wolnej od RNaz podwójnie destylowanej wody destylowanej DEPC, aby uzyskać całkowitą objętość próbki 13 mikrolitrów.

Następnie krótko odwirować i inkubować przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. W przypadku eksperymentów z ochroną przed RNazą zalecamy inkubację przez 15 minut z dwoma mikrolitrami Dnazy-1, wolnej od RNaz w celu usunięcia matrycowego DNA. Po zakończeniu etapu inkubacji zatrzymaj reakcję, dodając dwa mikrolitry 0,2 molowego EDTA o pH ośmiu.

Przed przedstawionymi tutaj krokami szkiełka zostały odparafinowane i ponownie uwodnione, zgodnie z naszym wcześniej zademonstrowanym protokołem. Po ponownym nawodnieniu inkubować szkiełka w 0,01 mola na litr PBS przy pH 7,4 przez pięć minut każda, aby usunąć roztwór utrwalający z tkanki. Po wypłukaniu w PBS, następnie spłukujemy 100 milimolowym roztworem glicyny na litr przez pięć minut dwa razy, aby usunąć wolne grupy aldehydowe z tkanki.

Po tym kroku płucz szkiełka PBS przez pięć minut. Następnie inkubować w PBS zawierającym 0,3% trytonu X-100 przez 15 minut przed płukaniem, a następnie ponownie inkubować z jednym mikrogramem na mikrolitr proteinazy K. Następnie utrwalić szkiełka z 4% paraformaldehydem i PBS o pH 7,2 przez trzy minuty. Następnie umyć szkiełka przed inkubacją z 0,1 molowym buforem trietanoloaminy o pH 8, zawierającym 0,25% bezwodnika octowego.

Na tym etapie możesz zdecydować się na przechylenie pudełka, aby zapewnić pełne pokrycie roztworem. Pudełko przygotowuje się przez dodanie 20% glicerolu lub wody DEPC na dno suchego pudełka do hybrydyzacji. Następnie przykryj szkiełka w 20 mikrolitrach roztworu przed hybrydyzacją.

DNA plemników łososia w stężeniu 100 mikrogramów na mililitr na każde szkiełko. A następnie inkubować w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez cztery godziny. Odbywa się to w przygotowanym nawilżonym pudełku, aby zapewnić, że roztwór nie wyschnie podczas tego procesu.

Na etapie po hybrydyzacji bardzo ważne jest, aby roztwór do hybrydyzacji został całkowicie wypłukany z próbek. Można to zrobić w kolejnych płukaniach trwających 15 minut w temperaturze 37 stopni, używając roztworu SSC o czterokrotnym stężeniu, dwukrotnie stężeniu jednokrotnym stężenia, 0,5-krotności stężenia i 0,1-krotności stężenia. Każdy inkubuje się przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po wykonaniu tej czynności przemyj PBS trzy razy przez pięć minut każdy przed dodaniem buforu myjącego. Bufor myjący należy płukać przez minutę przed kolejnymi krokami Upewnij się, że bufor myjący jest całkowicie suchy od szkiełek przed dodaniem następnego roztworu. Dodaj 100 mililitrów roztworu blokującego do każdego szkiełka i inkubuj szkiełko przez 30 minut.

Najlepiej zrobić to w środowisku wolnym od światła, aby zapewnić dobre barwienie. Następnie ponownie inkubować szkiełka przez 30 minut w 20 ml roztworu przeciwciała. Nałóż roztwór przeciwciała bezpośrednio na szkiełka, aby uzyskać pełne pokrycie tkanki.

Po zakończeniu inkubacji nałóż 100 mililitrów buforu do mycia. Inkubować przez 15 minut w lekkich warunkach wolnych od zanieczyszczeń, aby usunąć niezwiązane koniugaty przeciwciał. Usuń bufor myjący.

Następnie nanieść 20 mililitrów buforu detekcyjnego i pozostawić do inkubacji na około cztery minuty. Po czterech minutach usuń bufor wykrywania. Wysuszyć szkiełka, aby upewnić się, że nie ma dodatkowego roztworu i dodać 10 mililitrów świeżo przygotowanego roztworu podłoża barwnego.

Ta reakcja rozpoczyna się w ciągu kilku minut, ale kończy się po 16 godzinach. Pozwól więc inkubować przez ten okres czasu w stanie wolnym od światła. Po znalezieniu pożądanych miejsc, w których wykryte zostaną prążki, umyj szkiełko 50 mililitrami buforu TE, aby zatrzymać reakcję.

A następnie zakończ nasz wcześniej pokazany proces odwadniania i proces montażu dla neutralnej gumy. Ryciny pierwszy i drugi pokazują metodę powlekania glinowo-żelatynowego chromem skrawków parafiny oraz metodę osadzania profilu ekspresji FKBP12 i DmFKBP12 w rozwijających się zarodkach Drosophila. Rycina trzecia przedstawia rozkład białek wykrytego przeciwciała FKBP12 na etapach blastodermy syncytialnej komórkowej.

Z tych wyników histochemicznych można zauważyć, że ekspresja FKBP12 jest mniej spolaryzowana w blastodermie syncytialnej, a następnie zaczyna lokalizować się w błonie podstawnej pod nabłonkiem trofektodermy, informując gradient z większą ekspresją występującą w biegunie przednim i tylnym. Rycina czwarta, która śledzi wczesne i późne etapy relacji gazowej zarodka Drosophila, pokazuje, że białko FKBP12 zostaje ograniczone do pewnych składników architektonicznych prymitywnej tkanki embrionalnej. Z mniejszą dystrybucją zewnątrzkomórkową niż obserwowana we wczesnych i późnych stadiach zarodkowych.

Co ciekawe, opisanej powyżej dynamicznej dystrybucji białek nie towarzyszą odpowiadające jej zmiany w poziomach MRI FKBP12, jak widać na rycinie piątej. Wskazuje to na ekspresję białek jako wynik wciąż nieznanego potranskrypcyjnego mechanizmu molekularnego. Sygnalizacja wapniowa za pośrednictwem receptora Ryanodine jest podstawowym szlakiem w wielu procesach fizjologicznych i patologicznych zarówno kręgowców, jak i bezkręgowców.

Wiadomo, że mutacje w tym genie powodują wiele zaburzeń fizjologicznych prowadzących do choroby lub przedwczesnej śmierci sercowej. Jednak rola, jaką ten gen odgrywa we wczesnym rozwoju Drosophila, była trudna do zbadania. Jako składnik tranzytowy zarodka, bogaty w lipidy zarodek i bogata w chitynę kosmówka, utrudniają badania nad ekspresją białka i embrionu we wczesnym rozwoju Drosophila.

Powlekanie szkiełka, osadzanie zarodków i techniki immunohistochemiczne opisane w tym artykule pozwoliły nam szczegółowo zbadać dynamiczną dystrybucję białka receptora ryanodine i mRNA. Dzielimy się tymi technikami i mamy nadzieję, że pozwolą one innym badać inne białka we wczesnych stadiach rozwoju Drosophila.