Name: Eksplant tkanki rogówki świni w celu zbadania skuteczności leków przeciwwirusowych przeciwko wirusowi opryszczki pospolitej-1 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Poznaj metodę eksplantu rogówki świni do oceny skuteczności leków przeciwwirusowych przeciwko HSV-1. To podejście ex vivo stanowi ekonomiczną alternatywę dla tradycyjnych modeli zwierzęcych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie było wspierane przez granty NIH (R01 EY024710, RO1 AI139768 i RO1 EY029426) dla D.S. A.A. było wspierane przez grant F30EY025981 od National Eye Institute, NIH. Badanie przeprowadzono przy użyciu rogówek wieprzowych uzyskanych z firmy Park Packing, 4107 Ashland Avenue, New City, Chicago, IL-60609

Wszystkie tkanki świńskie użyte w tym badaniu zostały dostarczone przez prywatną organizację zewnętrzną, a żadna z czynności związanych ze zwierzętami nie została wykonana przez personel Uniwersytetu Illinois w Chicago.
1. Materiały
<ol>
	<li>Odczynniki
	<ol>
		<li>Do testu płytki nazębnej należy użyć następujących odczynników: metyloceluloza w proszku, zmodyfikowana pożywka orła Dulbecco (DMEM), płodowa surowica bydlęca (FBS), penicylina i streptomycyna (P / S) do testu płytki nazębnej.</li>
		<li>Użyj tabletek z fioletem krystalicznym i etanolu (klasa biologii molekularnej) do przygotowania roztworu fioletu krystalicznego do testu płytki nazębnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pożywki do wzrostu komórek Vero - całe pożywki DMEM
	<ol>
		<li>Otwórz butelkę z pożywką DMEM wewnątrz kaptura do hodowli tkankowych. Usunąć 55 ml pożywki z butelki za pomocą pipety serologicznej i wyrzucić. Dodaj 50 ml FBS P/S do DMEM. Przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pożywki do oznaczania płytek nazębnych - Zapas 5% pożywek metylocelulozowych
	<ol>
		<li>Odmierz 2,5 g proszku metylocelulozy za pomocą magnesu mieszającego w szklanej butelce o pojemności 500 ml i przeprowadź w autoklawie. Po ostygnięciu butelki do temperatury pokojowej należy pobrać 500 ml całej pożywki DMEM zawierającej 50 ml FBS i 5 ml roztworu P/S i dodać ją do szklanej butelki zawierającej metylocelulozę.</li>
		<li>Mieszać w temperaturze 4 °C przez 2 dni za pomocą mieszadła magnetycznego. Przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie podłoża dla wyciętej rogówki świńskiej
	<ol>
		<li>Otwórz butelkę z minimalną ilością niezbędnych pożywek (MEM) wewnątrz kaptura do hodowli tkankowych. Wylać 10 ml MEM z butelki za pomocą pipety serologicznej.</li>
		<li>Dodać 5 ml insuliny-transferyny-selenu (ITS) i 5 ml antybiotyku przeciwgrzybiczego (AA) do pożywki i przechowywać w lodówce w temperaturze 4°C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Główny i roboczy zapas fioletu krystalicznego:
	<ol>
		<li>Aby przygotować roztwór podstawowy fioletu krystalicznego, dodaj 1 g proszku fioletu krystalicznego do 100 ml 20% etanolu w wodzie. Ten bulion (1% w/v fioletu krystalicznego) może być przechowywany i używany przez okres do roku, jeśli jest przechowywany w ciemnym miejscu.</li>
		<li>Aby zrobić z tego zapas roboczy, dodaj 50 ml oryginalnego roztworu podstawowego do 350 ml wody. Dodaj 100 ml etanolu do tego roztworu, aby uzyskać 500 ml roboczego roztworu fioletu krystalicznego (0,1% w/v fioletu krystalicznego). 
		UWAGA: Oba te roztwory należy przechowywać w ciemności.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Procedura
<ol>
	<li>Izolacja rogówek świń od całych oczu17
	<ol>
		<li>Po otrzymaniu świńskich oczu od odpowiedniego sprzedawcy, przechowuj je na lodzie, jeśli wystąpi opóźnienie w przetwarzaniu tkanek, jak pokazano na rysunku <silna klasa="xfig">Rysunek 1.</li>
		<li>Upewnij się, że podczas tej procedury używane i noszone są środki ochrony osobistej, aby uniknąć zanieczyszczenia, a także wypadków spowodowanych rozlaniem ciała szklistego.</li>
		<li>Spryskaj obszar roboczy 70% etanolem w celu oczyszczenia i dezynfekcji. Aby upewnić się, że przestrzeń robocza jest stabilna, rozłóż pokrowiec na ławkę i bezpiecznie przyklej boki, jak pokazano na rysunku <silna klasa="xfig">Rysunek 2.</li>
		<li>Umieść oczy świni na gazie (<silna klasa="xfig">Rysunek 3). Używając gazy 50 mm, przytrzymaj jedną ręką tylną część (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A) oczu świni, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 4B.</li>
		<li>Za pomocą igły o wadze 30 G delikatnie wykonaj pojedyncze ukłucie w przybliżeniu na środku powierzchni nabłonka oka i upewnij się, że nie ma uszkodzenia zrębu (<silna klasa = "xfig">Ryc. 5). Szturchanie powinno być ograniczone do nabłonka (~100-200 μm), aby uniknąć zajęcia zrębu.</li>
		<li>Za pomocą ostrego, wysterylizowanego ostrza wykonaj małe nacięcie na twardówce w odległości 1 mm od rogówki. Przeciąć krawędź rogówki, upewniając się, że ciało szkliste nie przecieka, wykonując szybkie i płynne obracanie ręki (<silna klasa="xfig">Rysunek 6A). Przytrzymując rogówkę na krawędzi rogówki-twardówki płaską pęsetą, odetnij pozostałe błony spętujące oko za pomocą ostrza (<silna klasa = "xfig">Rysunek 6B).</li>
		<li>Weź rogówkę i umieść ją na 12-dołkowej płytce pokrytej 2 ml pożywki rogówkowej. Rogówka powinna być skierowana do góry, co pokazano w serii kroków na rysunkach 7A-D, <silna klasa="xfig">Rysunek 8).</li>
		<li>Dodać 5 μl roztworu wirusa zawierającego 5 x 105 jednostek tworzących płytkę nazębną (PFU) 17 GFP do oczyszczonego miejsca na powierzchni rogówki. Umieścić 12-dołkową płytkę zawierającą zakażone rogówki świń w inkubatorze z 5% stężeniem CO2 przez 72 godziny.</li>
		<li>Spryskaj wszelkie dodatkowe oczy, które nie były używane w eksperymencie, 10% wybielaczem i bezpiecznie wyrzuć je do worków na zagrożenia biologiczne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wizualizacja 
	UWAGA: Wirus powinien być wizualizowany codziennie przed dodaniem leków.
	<ol>
		<li>Włącz mikroskop stereoskopowy i źródło światła LED i poczekaj, aż lampa urządzenia rozgrzeje się przed obrazowaniem rogówki. Ostrożnie przenieś płytkę rogówki do instrumentu, nie naruszając roztworu. Zmień filtr tak, aby GFP (380-460 nm) był używany do oglądania próbek. Ustaw czas naświetlania na 500 ms, aby robić zdjęcia.</li>
		<li>Najpierw umieść płytkę rogówki pod stereoskopem i uchwyć obrazy w najmniejszym powiększeniu 7,5x. Następnie wykonaj serię obrazów w rosnącym powiększeniu (np. 15x, 25x, 35x), tak aby całe rozprzestrzenianie się wirusa i tworzenie dendrytów było wyraźnie widoczne</li>
		<li>Upewnij się, że zainfekowane rogówki wróciły z powrotem do inkubatora do hodowli tkankowych i zapisz wszystkie wykonane obrazy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwantyfikacja infekcji wirusem 
	UWAGA: Miana wirusa z rogówki świń powinny być oceniane codziennie w celu analizy wpływu leczenia farmakologicznego.
	<ol>
		<li>Aby określić ilościowo wirusa, wysiewaj komórki Vero o gęstości 5 x 105 komórek na studzienkę, jeśli używasz płytki 6-dołkowej, jak to miało miejsce w tym eksperymencie. Zrób to dzień przed infekcją. Inkubuj posiałe komórki przez noc, aby upewnić się, że zlewają się w celu ilościowego określenia wirusa.</li>
		<li>Porcję 500 μl pożywki wolnej od surowicy do wielu probówek do mikrowirówek. Włóż sterylny wacik z bawełnianą końcówką zanurzony w probówkach wypełnionych pożywką bez surowicy. Waciki bawełniane należy zanurzyć i zwilżyć przez co najmniej 5 minut przed użyciem.</li>
		<li>Nie naruszając podłoża, należy przetransportować zakażoną płytkę rogówki świni do komory bezpieczeństwa biologicznego. Za pomocą mokrych wacików bawełnianych wykonaj 3 obroty zgodnie z ruchem wskazówek zegara i 3 obroty przeciwnie do ruchu wskazówek zegara o średnicy 5 mm od środka zainfekowanej rogówki świni bez wywierania nadmiernego nacisku.</li>
		<li>Włóż bawełniany wacik z powrotem do probówki mikrowirówkowej wypełnionej pożywką bez surowicy i obróć ją 5 razy zgodnie z ruchem wskazówek zegara i przeciwnie do ruchu wskazówek zegara. Metalową końcówkę bawełnianego wacika należy przyciąć na krótko, aby całkowicie zmieściła się w probówce do mikrowirówki, a pokrywkę można było zamknąć.</li>
		<li>Umieść probówkę mikrowirówki zawierającą wacikową końcówkę na maszynie do wirowania i wiruj z dużą prędkością przez 1 minutę.</li>
		<li>Przeprowadzić kwantyfikację wirusa za pomocą testu płytkiowego na tych próbkach. 
		UWAGA: Ten etap oznaczania ilościowego należy przeprowadzić w 2., 4. i opcjonalnie 6 dni po zakażeniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwantyfikacja wirusa za pomocą testu płytki nazębnej 
	UWAGA: Aby wykonać test płytki nazębnej, wyhoduj i płytkuj komórki Vero na 6-dołkowej płytce i upewnij się, że 90% zbiegu komórek przed rozpoczęciem testu. Użyj zlewającej się kolby o długości 75cm2 tych komórek. Wszystkie poniższe czynności należy wykonać w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
	<ol>
		<li>Przepłukać zlewającą się monowarstwę komórek Vero w kolbie 10 ml świeżego buforu fosforanowego soli fizjologicznej (PBS) po zaaspirowaniu pożywki hodowlanej. Powtórz etap płukania jeszcze raz z PBS po zassaniu pierwszego zestawu roztworu myjącego.</li>
		<li>Dodaj 1 ml 0,05% trypsyny do monowarstwy komórek. Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Gołym okiem upewnić się, że komórki są odłączone od wewnętrznej powierzchni kolby. Jeśli nie, odczekać kolejne 5 minut przed ponownym zbadaniem kolby. Gdy wydaje się, że komórki są odłączone, dodać 9 ml całej pożywki do monowarstwy, aby upewnić się, że komórki całkowicie odsuną się od powierzchni kolby.</li>
		<li>Zebrać wszystkie komórki z kolby wraz z całą pożywką i umieścić je w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Na każdą studzienkę z 6 dołków, które są używane do oznaczania płytki nazębnej, użyj 300 μl z probówki wirówkowej. Uzupełnić każdą studzienkę płytki 6-dołkowej 2 ml całego podłoża. Pozostaw płytki w inkubatorze na noc, aby mogły rosnąć i utworzyć zlewającą się monowarstwę w każdym dołku.</li>
		<li>Aby przeprowadzić test płytki nazębnej, należy przeprowadzić seryjne rozcieńczanie próbek przed określeniem ilościowym wirusa.</li>
		<li>Wykonać log101-krotne rozcieńczenie wirusa w probówkach do mikrowirówek, używając pożywki wolnej od surowicy, aż do osiągnięcia rozcieńczenia 10-8. W rozcieńczeniu 10-3 przenieś 1 ml rozcieńczenia do monowarstwy posianych komórek po zaessaniu pożywki wzrostowej na komórkach z płytki 6-dołkowej, będzie to etap infekcji. Inkubować zakażoną płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 2 godziny.</li>
		<li>Odessać istniejącą pożywkę infekcyjną, dwukrotnie delikatnie przemyć PBS, aby pokryć komórki i dodać 2 ml pożywki z metylocelulozą na studzienkę do wszystkich 6 studzienek. Inkubować przez 72 godziny lub do momentu, gdy będzie można zobaczyć tworzenie się blaszek. Blaszki miażdżycowe można zidentyfikować po tworzeniu się małych przerw między komórkami w monowarstwie komórki.</li>
		<li>Powoli dodawaj 1 ml metanolu do rogu każdej studzienki, używając ścianki jako końcówki prowadzącej. Inkubować 6-dołkową płytkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Powoli odsysać zawartość każdej studzienki z płytki, nie naruszając ani nie mieszając monowarstwy komórek.</li>
		<li>Dodaj 1 ml roztworu roboczego fioletu krystalicznego do każdej studzienki z 6-dołkową płytką, upewniając się, że wszystkie komórki są pokryte. Inkubować 6-dołkową płytkę w ciemności przez 30 minut. Wyrzuć roztwór fioletu krystalicznego przez zasysanie go i wysusz studzienki na arkuszu chłonnego papieru.</li>
		<li>Policz liczbę blaszek w basenie o najwyższym rozcieńczeniu, aby określić ilościowo całkowitą zawartość wirusa w roztworze wyjściowym. Powtórz proces dwukrotnie, aby potwierdzić miano wirusa.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Liesegang, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+epidemiology+and+ocular+importance%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus epidemiology and ocular importance.</a> Cornea. 20 (1), 1-13 (2001).</li>
<li>Farooq, A. V., Valyi-Nagy, T., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mediators+and+mechanisms+of+herpes+simplex+virus+entry+into+ocular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Mediators and mechanisms of herpes simplex virus entry into ocular cells.</a> Current Eye Research. 35 (6), 445-450 (2010).</li>
<li>Farooq, A. V., Shah, A., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+herpesviruses+in+ocular+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Adaptation+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">The role of herpesviruses in ocular infections.</a> Virus Adaptation and Treatment. 2 (1), 115-123 (2010).</li>
<li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seroprevalence+and+coinfection+with+herpes+simplex+virus+type+1+and+type+2+in+the+United+States%2C+1988-1994%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Seroprevalence and coinfection with herpes simplex virus type 1 and type 2 in the United States, 1988-1994.</a> Journal of Infectious Diseases. 185 (8), 1019-1024 (2002).</li>
<li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+herpes+simplex+virus+type+1+and+type+2+seroprevalence+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Trends in herpes simplex virus type 1 and type 2 seroprevalence in the United States.</a> Journal of the American Medical Association. 296 (8), 964-973 (2006).</li>
<li>Koganti, R., Yadavalli, T., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+and+emerging+therapies+for+ocular+herpes+simplex+virus+type-1+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Current and emerging therapies for ocular herpes simplex virus type-1 infections.</a> Microorganisms. 7 (10), (2019).</li>
<li>Lobo, A. -, Agelidis, A. M., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+herpes+simplex+keratitis%3A+The+host+cell+response+and+ocular+surface+sequelae+to+infection+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of herpes simplex keratitis: The host cell response and ocular surface sequelae to infection and inflammation.</a> Ocular Surface. 17 (1), 40-49 (2019).</li>
<li>Koujah, L., Suryawanshi, R. K., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+processes+activated+by+herpes+simplex+virus-1+%28HSV-1%29+infection+in+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pathological processes activated by herpes simplex virus-1 (HSV-1) infection in the cornea.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (3), 405-419 (2019).</li>
<li>Lass, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiviral+medications+and+corneal+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Antiviral medications and corneal wound healing.</a> Antiviral Research. 4 (3), 143-157 (1984).</li>
<li>Burns, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterisation+of+resistant+Herpes+simplex+virus+after+acyclovir+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterisation of resistant Herpes simplex virus after acyclovir therapy.</a> Lancet. 1 (8269), 421-423 (1982).</li>
<li>Crumpacker, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+antiviral+drugs+of+herpes+simplex+virus+isolated+from+a+patient+treated+with+Acyclovir%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Resistance to antiviral drugs of herpes simplex virus isolated from a patient treated with Acyclovir.</a> New England Journal of Medicine. 306 (6), 343-346 (2010).</li>
<li>Yildiz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+kidney+injury+due+to+acyclovir%5BTitle%5D)+AND+%22CEN+Case+Report%22%5BJournal%5D)">Acute kidney injury due to acyclovir.</a> CEN Case Report. 2 (1), 38-40 (2013).</li>
<li>Fleischer, R., Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acyclovir+nephrotoxicity%3A+a+case+report+highlighting+the+importance+of+prevention%2C+detection%2C+and+treatment+of+acyclovir-induced+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Case+Rep+Med%22%5BJournal%5D)">Acyclovir nephrotoxicity: a case report highlighting the importance of prevention, detection, and treatment of acyclovir-induced nephropathy.</a> Case Rep Med. 2010, 1-3 (2010).</li>
<li>Thakkar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+corneas+show+dendritic+spread+and+restrict+herpes+simplex+virus+infection+that+is+not+observed+with+cultured+corneal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Report%22%5BJournal%5D)">Cultured corneas show dendritic spread and restrict herpes simplex virus infection that is not observed with cultured corneal cells.</a> Science Report. 7, 42559(2017).</li>
<li>Pescina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al+Development+of+a+convenient+ex+vivo+model+for+the+study+of+the+transcorneal+permeation+of+drugs%3A+Histological+and+permeability+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">et al Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: Histological and permeability evaluation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104, 63-71 (2015).</li>
<li>Jaishankar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+off-target+effect+of+BX795+blocks+herpes+simplex+virus+type+1+infection+of+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">An off-target effect of BX795 blocks herpes simplex virus type 1 infection of the eye.</a> Science Translational Medicine. 10, 5861(2018).</li>
<li>Duggal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+oxide+tetrapods+inhibit+herpes+simplex+virus+infection+of+cultured+corneas%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas.</a> Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów i konkurujących interesów finansowych.

Wcześniejsze badania wykazały, że BX795 ma obiecującą rolę jako środek przeciwwirusowy przeciwko zakażeniu HSV-1; poprzez hamowanie kinazy wiążącej TANK 1 (TBK1)16. Zarówno TBK1, jak i autofagia odegrały rolę w hamowaniu infekcji HSV-1, jak wykazano na ludzkich komórkach nabłonka rogówki. Wykazano, że BX795 jest maksymalnie skuteczny w działaniu przeciwwirusowym w stężeniu 10 μM, a przy użyciu zarówno analizy western blot, jak i analizy płytki wirusowej kluczowych białek wirusowych, wykazano, że B...

Osoby cierpiące na infekcje oczu często doświadczają utraty wzroku1. Ze względu na wysoką seroprewalencję na całym świecie, osoby zakażone HSV cierpią na nawracające infekcje oczu, które prowadzą do bliznowacenia rogówki, zapalenia rogówki podścieliska i neowaskularyzacji2,3,4,5. Wykazano również, że zakażenia HSV rzadziej powodują szereg poważnych schorzeń wśród nieleczonych pacjentów z obniżoną odpornością, takich jak zapalenie mózgu i zachorowalność ogólnoustrojowa6,7,8. Leki takie jak acyklowir (ACV) i jego analogi nukleozydowe wykazały stały sukces w ograniczaniu zakażenia HSV-1, a nawet kontrolowaniu reaktywacji, jednak długotrwałe stosowanie tych leków wiąże się z niewydolnością nerek, nieprawidłowościami płodu i brakiem ograniczenia pojawiania się oporności na ewoluujące szczepy wirusa9,10,11,12,13. Złożoność związana z infekcjami oka HSV-1 była wcześniej badana in vitro przy użyciu monowarstw i hodowli 3D ludzkich komórek rogówki oraz in vivo przy użyciu zakażeń oka myszy lub królika. Chociaż te modele in vitro dostarczają istotnych danych na temat komórkowych składników biologicznych zakażeń HSV-1, nie naśladują one skomplikowanej złożoności tkanki rogówki i niewiele robią, aby rzucić światło na dendrytyczne rozprzestrzenianie się wirusa14. W przeciwieństwie do tego, chociaż systemy in vivo są bardziej wnikliwe w pokazywaniu rozprzestrzeniania się infekcji w rogówce i odpowiedzi aktywacji immunologicznej podczas infekcji HSV-1, wiążą się z zastrzeżeniem, że wymagają wyszkolonych badaczy i dużych obiektów opieki nad zwierzętami, aby przeoczyć eksperymenty.
Tutaj używamy rogówek świń jako modelu ex vivo do zbadania systemu ran wywołanych infekcją HSV-1. Zarówno potencjalna farmakologia niektórych leków, jak i biologia komórkowa i molekularna systemu ran spowodowanych zakażeniem mogą być badane za pomocą kultur eksplantatów tkankowych. Model ten może być również zmieniony do stosowania w przypadku innych infekcji wirusowych i bakteryjnych. W tym badaniu rogówki świń wykorzystano do przetestowania skuteczności przeciwwirusowej przedklinicznej małej cząsteczki BX795. Preferowano stosowanie rogówek wieprzowych ze względu na łatwość dostępu i opłacalność. Dodatkowo, modele rogówki świń są dobrymi modelami ludzkich oczu, przy czym rogówki są łatwe do wyizolowania, odpowiednio zwymiarowane do infekcji i wizualizacji oraz wytrzymałe w obsłudze15. Rogówki świń są również porównywalne ze złożonością ludzkich modeli rogówki zarówno pod względem przepuszczalności transrogówki, jak i wchłaniania ogólnoustrojowego15. Wykorzystując ten model do badania, byliśmy w stanie wyjaśnić, w jaki sposób BX795 jest wart dalszych badań jako kompetentny inhibitor infekcji wirusem HSV-1 i dodaje do literatury klasyfikowanie go jako potencjalnego małocząsteczkowego związku przeciwwirusowego16.

<table><tbody><tr><td>Igły podskórne 30 G.</td><td>BD</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>szklana butelka o pojemności 500 ml.</td><td>Thomas Scientific</td><td>844027</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk i Antybiotyk (AA)</td><td>GIBCO</td><td>15240096</td><td>Podwielokrotność do probówek o pojemności 5 ml i przechowywać w stanie zamrożonym do czasu użycia</td></tr><tr><td>wirownika laboratoryjnego.</td><td>Szafa</td> bezpieczeństwa biologicznego <td>BioDot BDVM-3200</td><td></td></tr><tr><td>z certyfikatem bezpieczeństwa biologicznego Level-2 (BSL-2).</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Herasafe 2030i</td><td></td></tr><tr><td>Calgiswab 6" Sterylne standardowe waciki z alginianu wapnia.</td><td>Puritan</td><td>22029501</td><td></td></tr><tr><td>Skrobak do komórek - 25 cm</td><td>Biologix BE</td><td>70-1180 70-1250</td><td></td></tr><tr><td>Crystal violet</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6158</td><td>Przechowuj proszek w ciemnym miejscu</td></tr><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium - DMEM</td><td>GIBCO</td><td>41966029</td><td>Przechowywać w 4 & st.; C do czasu użycia</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca -FBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td>Podwielokrotność do probówek 50 ml i przechowywać w stanie zamrożonym do czasu użycia</td></tr><tr><td>Pęseta o płaskich krawędziach &ndash; 2.</td> <td>Harward Instruments</td><td>72-8595</td><td></td></tr><tr><td>Zamrażarki --80 &deg;C. -</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>13 100 790</td><td></td></tr><tr><td>Świeże pudełko ostrzy.</td><td>Thomas Scientific</td><td>TE05091</td><td></td></tr><tr><td>Guaze</td><td>Johnson & Folder Johnson</td><td></td><td>108 cali kwadratowych 12-warstwowy</td></tr><tr><td>HSV-1 17GFP</td><td>uprawiany w domowym</td><td></td> <td>oryginalnym szczepie od dr Patricii Spears, Northwestern University. GFP eksprymujący HSV-1 szczep 17</td></tr><tr><td>Insulina, transferyna, selen - ITS</td><td>GIBCO</td><td>41400045</td><td>Aliquot do probówek o pojemności 5 ml i przechowywać w stanie zamrożonym do czasu użycia</td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne.</td>Nożyczki metalowe <td>Thomas Scientific</td><td>H3710-HS</td><td></td></tr><tr><td>.</td><td>Harward Instruments</td><td>72-8400</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipety o pojemności od 1 do 1000 i mikrolitrów.</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159M37</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium - MEM</td><td>GIBCO</td><td>11095080</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 & st.; C do czasu użycia</td></tr><tr><td>OptiMEM&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>31985047</td><td>Sklep pod adresem 4 &deg; C do czasu użycia</td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna.</td><td>GIBCO</td><td>15140148</td><td>Porcję rozlać do probówek o pojemności 5 ml i przechowywać w stanie zamrożonym do czasu użycia</td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy Sól fizjologiczna -PBS</td><td>GIBCO</td><td>10010072</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Porcine Corneas</td><td>Park Packaging Co., Chicago, IL</td><td></td><td>Specjalne zamówienie na życzenie</td></tr><tr><td>Pokrowce na ławki zabiegowe - w razie potrzeby.</td>Pipety serologiczne <td>Thermofisher</td><td>Scientific S42400</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thomas Scientific</td><td>P7132, P7127, P7128, P7129, P7137</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt do pipetowania serologicznego.</td><td>Thomas Scientific</td><td>Ezpette Pro</td><td></td></tr><tr><td>Stereoscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>SteREO Discovery V20</td><td></td></tr><tr><td>Magnes mieszający.</td><td>Thomas Scientific</td><td>F37120</td><td></td></tr><tr><td>Kolby do hodowli tkankowych, T175 cm2.</td><td>Thomas Scientific</td><td>T1275</td><td></td></tr><tr><td>Inkubatory do hodowli tkankowych, które mogą utrzymać 5% CO2 i 37 & Temperatura C.</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Forma 50145523</td><td></td></tr><tr><td>Płytki poddane działaniu kultur tkankowych (6-dołkowe).</td><td>Thomas Scientific</td><td>T1006</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa</td><td>GIBCO</td><td>25-300-062</td><td>Podwielokrotność do probówek o pojemności 10 ml i przechowywać w stanie zamrożonym do czasu użycia</td></tr><tr><td>Komórki Vero Kolekcja</td><td>kultur typu amerykańskiego</td><td>ATCC CRL-1586</td><td></td></tr></tbody></table>

eksplant tkanki rogówki świni w celu zbadania skuteczności leków przeciwwirusowych przeciwko wirusowi opryszczki pospolitej-1

Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals

Wirusy i bakterie mogą powodować różnego rodzaju defekty powierzchni oka i zwyrodnienia, takie jak rany i wrzody poprzez infekcję rogówki. Wirus opryszczki pospolitej typu 1 (HSV-1), którego częstość występowania waha się od 60 do 90% na całym świecie, często powoduje zmiany śluzówkowo-skórne w okolicy ustno-twarzowej, które objawiają się również zmianami chorobowymi i ślepotą związaną z infekcją. Podczas gdy obecne leki przeciwwirusowe są skuteczne, pojawienie się oporności i utrzymywanie się toksycznych skutków ubocznych wymaga opracowania nowych leków przeciwwirusowych przeciwko temu wszechobecnemu patogenowi. Chociaż ocena in vitro dostarcza pewnych danych funkcjonalnych dotyczących pojawiającego się leku przeciwwirusowego, nie pokazuje złożoności tkanki oka in vivo. Jednak badania in vivo są drogie i wymagają przeszkolonego personelu, zwłaszcza w przypadku pracy z czynnikami wirusowymi. W związku z tym modele ex vivo są skutecznymi, ale niedrogimi krokami do testowania przeciwwirusowego. W tym miejscu omawiamy protokół badania zakażenia HSV-1 za pomocą rogówek świń ex vivo oraz metodę leczenia ich miejscowo przy użyciu istniejących i nowych leków przeciwwirusowych. Demonstrujemy również metodę wykonywania testu płytki nazębnej przy użyciu HSV-1. Opisane metody mogą być wykorzystane do przeprowadzenia podobnych eksperymentów w celu zbadania zakażeń przypominających patogen HSV-1.

Aby zrozumieć skuteczność eksperymentalnych leków przeciwwirusowych, muszą one zostać poddane szerokim testom przed przekazaniem do badań klinicznych in vivo u ludzi. W związku z tym należy wyznaczyć grupy kontrolne dodatnie, ujemne oraz grupy badawcze. Trifluorotymidyna (TFT) od dawna jest stosowana jako preferowana metoda miejscowego leczenia zapalenia rogówki wywołanego przez wirusy opryszczki16. W roli kontroli dodatniej grupy rogówek traktowane TFT wykazują mniejszy rozprzestrzenianie się inf...

Opisujemy użycie rogówki świni do testowania skuteczności przeciwwirusowej eksperymentalnych leków.

Eksplant tkanki rogówki świni w celu zbadania skuteczności leków przeciwwirusowych przeciwko wirusowi opryszczki pospolitej-1

Viruses and bacteria can cause a variety of ocular surface defects and degeneration such as wounds and ulcers through corneal infection. With a ...

Zrozumienie skuteczności leków w modelach zwierzęcych jest kosztowne i pracochłonne. Nasz protokół, który wykorzystuje model eksplantacji tkanek ex vivo, jest znacznie niższy zarówno pod względem kosztów, jak i personelu naukowego wymaganego do przeprowadzenia badania. Główną zaletą tej techniki jest wykorzystanie oczu świni, które mają anatomię i fizjologię bardzo podobną do oczu ludzkich, w przeciwieństwie do niektórych innych małych modeli zwierzęcych.Kiedy testujemy leki in vitro, mogą one wykazywać skuteczność, której może brakować w modelach zwierzęcych lub ludzkich. Systemy tkankowe ex vivo są najlepszym sposobem na zrozumienie, czy nasze systemy in vitro można przełożyć na badania na zwierzętach i ludziach. System rogówki świni, choć mniej pracochłonny, wymaga umiejętności w zakresie izolacji, utrzymania, zakażenia i leczenia lekami, zwłaszcza proces izolacji rogówki od całego oka świni jest trudny do wyrażenia słowami, ale wymaga wizualnej demonstracji.Po otrzymaniu świńskich oczu od odpowiedniego sprzedawcy, należy przechowywać chusteczki na lodzie do czasu przetworzenia i założyć odpowiednie środki ochrony osobistej. Zdezynfekuj miejsce pracy 70% etanolem i przymocuj pok

porcine-corneal-tissue-explant-to-study-efficacy-herpes-simplex-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszym artykule wideo opisujemy zastosowanie nowego modelu ex vivo ostrej infekcji nabłonka rogówki wirusem prostego typu I.

Ex Vivo organotypowy model rogówki w ostrym zakażeniu nabłonka wirusem opryszczki prostym typu I

Większość badań nad opryszczkowym zapaleniem rogówki wykorzystuje model infekcji pierwotnej. Jednakże infekcja pierwotna HSV-1 zazwyczaj nie prowadzi do rozwoju choroby u ludzi. W niniejszej pracy opisujemy model nawrotowy opryszczkowej choroby rogówki, który dokładniej naśladuje przebieg choroby u ludzi.

Nawracające opłykowe zapalenie stromy rogówki u myszy jako model do badania ludzkiego HSK

Ten film opisuje protokół tworzenia modelu ex vivo dla bakteryjnego zapalenia rogówki za pomocą guzika korneo-twardówkowego wypreparowanego z oka świni. Zaszczepione bakterie przechodzą przez nacięcia nabłonka rogówki, aby zaatakować leżące poniżej zrąb i wywołać infekcję w tkankach rogówki, która naśladuje infekcję in vivo.

Model rogówki ex vivo świńskiego bakteryjnego zapalenia rogówki: technika ustalania infekcji bakteryjnej w komórkach nabłonka rogówki

Ten film pokazuje nieinwazyjną procedurę wspomaganą laserem, która selektywnie uszkadza komórki śródbłonka rogówki w oku świni. Opracowany ex vivo model uszkodzenia komórek śródbłonka może być wykorzystany do badania chorób śródbłonka rogówki.

Selektywna ablacja wspomagana laserowo komórek śródbłonka rogówki świń: technika wywoływania skoncentrowanego uszkodzenia śródbłonka rogówki świni do badań ex vivo

Ten film demonstruje metodę przeprowadzania testu płytki nazębnej przy użyciu wirusa uzyskanego z zakażonej rogówki świni. Rogówka świni służy do testowania skuteczności przeciwwirusowej leków eksperymentalnych.

Określanie skuteczności przeciwwirusowej leków eksperymentalnych za pomocą testu płytki nazębnej

Skóra jest jednym z celów ludzkiego patogenu wirusa opryszczki pospolitej typu 1 (HSV-1). Aby zbadać drogę inwazji HSV-1 do tkanki, ustaliliśmy model infekcji ex vivo mysich arkuszy naskórka, które reprezentują najbardziej zewnętrzną warstwę skóry.

Ex vivo Zakażenie mysiego naskórka wirusem opryszczki pospolitej typu 1

Ten artykuł opisuje krok po kroku procedurę tworzenia modelu ex vivo świńskiego zapalenia bakteryjnego rogówki. Pseudomonas aeruginosa jest używany jako organizm prototypowy. Ten innowacyjny model naśladuje infekcję in vivo, ponieważ namnażanie się bakterii zależy od zdolności bakterii do uszkadzania tkanki rogówki.

Ustanowienie modelu rogówki ex vivo świni do badania leczenia farmakologicznego przeciwko bakteryjnemu zapaleniu rogówki

Opracowaliśmy szczurzy model ciężkiego zapalenia rogówki poprzez łyżeczkowanie nabłonka rogówki w połączeniu ze szwami rogówkowymi. W badaniu oceniano wzorce zapalenia rogówki, proliferację nabłonka i zmiany w rąbkowych komórkach macierzystych w stanach zapalnych.

Ustalenie modelu ciężkiego zapalenia rogówki u szczurów na podstawie łyżeczkowania nabłonka rogówki w połączeniu ze szwami rogówkowymi

Hodowla narządów ex vivo rogówki świń i gojenie ran nabłonkowych dostarczają ekonomicznego, etycznego, powtarzalnego i ilościowego sposobu testowania toksyczności ocznej chemikaliów. Pomagają również w wyjaśnieniu mechanizmów leżących u podstaw regulacji nabłonka i naprawy tkanek oraz w ocenie terapii stosowanych w leczeniu keratopatii cukrzycowej i opóźnionego gojenia się ran.

Ocena toksyczności terapeutycznej i chemicznej przy użyciu rogówek świń z hodowli narządowych i gojenie się ran nabłonkowych

System genetyki odwrotnej dla szczepionkowego szczepu MP-12 wirusa gorączki Doliny Rift jest użytecznym narzędziem do tworzenia dodatkowych mutantów MP-12 o zwiększonej atenuacji i immunogenności. Opisujemy protokół generowania i charakteryzacji szczepów mutantów NSs.

Wykorzystanie genetyki odwrotnej do manipulacji genem NSs szczepu MP-12 wirusa gorączki doliny Rift w celu poprawy bezpieczeństwa i skuteczności szczepionki

Poznaj metodę eksplantu rogówki świni do oceny skuteczności leków przeciwwirusowych przeciwko HSV-1. To podejście ex vivo stanowi ekonomiczną alternatywę dla tradycyjnych modeli zwierzęcych.

Eksplant tkanki rogówki świni w celu zbadania skuteczności leków przeciwwirusowych przeciwko wirusowi opryszczki pospolitej-1

Przeglądaj więcej filmów