Name: Wysokoprzepustowy test in vitro z wykorzystaniem organoidów nowotworowych pochodzących od pacjenta (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: Poznaj wysokoprzepustowy test in vitro z wykorzystaniem organoidów nowotworowych pochodzących od pacjenta do oceny leków przeciwnowotworowych. Ta metoda poprawia dokładność przewidywania odpowiedzi na leczenie w medycynie spersonalizowanej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować pacjentom, którzy dostarczyli próbki kliniczne wykorzystane w tym badaniu. Badania te są wspierane przez granty z Programu Badań Translacyjnych prefektury Fukushima.

Wszystkie eksperymenty z wykorzystaniem materiałów pochodzenia ludzkiego zostały przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską i zatwierdzone z wyprzedzeniem przez komisję etyki Uniwersytetu Medycznego w Fukushimie (numery zatwierdzenia 1953 i 2192; daty zatwierdzenia odpowiednio 18 marca 2020 r. i 26 maja 2016 r.). Pisemną świadomą zgodę uzyskano od wszystkich pacjentów, którzy dostarczyli próbki kliniczne wykorzystane w tym badaniu.
1. Kultura ChNP
UWAGA: F-PDO tworzą klastry komórek, które wykazują różnorodność heterogenicznych morfologii i rosną w kulturze zawiesinowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Co więcej, F-PDO mogą być hodowane przez ponad 6 miesięcy i mogą być kriokonserwowane do wykorzystania w przyszłości.
<ol>
	<li>Rozmrażanie przechowywanych ChNP (dzień 0)
	<ol>
		<li>Rozmrozić i wysadzić PDO (np. RLUN007, gruczolakorak płuc) w dniu 0 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Najpierw dodaj 15 ml pożywki do PDO (patrz tabela materiałów) zawierającej 1% suplementu B-27 i 30 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Po wyjęciu zamrożonej fiolki z magazynu ciekłego azotu, delikatnie mieszać ChNP w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 2 minuty. Następnie wyjąć fiolkę z łaźni wodnej, przetrzeć fiolkę 70% etanolem, a następnie przenieść fiolkę do szafki bezpieczeństwa biologicznego.</li>
		<li>Przenieść zawartość fiolki do probówki zawierającej 15 ml pożywki dla ChNP. Wymieszaj PDO i pożywkę, delikatnie pipetując pięć razy w górę i w dół za pomocą pipety transferowej o pojemności 3 ml. Odwirować probówkę o sile 200 x g przez 3 minuty w temperaturze ~25 °C i odrzucić supernatant. Zawiesić osad ChNP w 5 ml świeżej pożywki i przenieść do kolby o średnicy 25cm2 (patrz Tabela Materiałów) z delikatnym pipetowaniem. Na koniec należy wyhodować ChNP w inkubatorze w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmieniaj podłoże dwa razy w tygodniu (dni 3-7). Odwirować zawiesinę ChNP, aby wytrącić skupiska komórek, i zastąpić 4 ml pożywki (80% objętości). Ponownie zawiesić komórki w świeżej pożywce. 
	UWAGA: Większość z RLUN007 wygląda jak skupiska komórek o średnicy 100-500 μm. Gdy kolor czerwieni fenolowej w pożywce zmieni się na żółty, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 1A, wymieniaj podłoże częściej. Jeśli pożywka zmieni kolor na żółty następnego dnia po wymianie, a każde skupisko komórek połączy się, tworząc większe skupiska o średnicy >500 μm, przejdź w stosunku podziału 1:2.</li>
	<li>Subkultura (dni 8-28) ChNP 
	UWAGA: Biorąc pod uwagę trudność w faktycznym zmierzeniu liczby pojedynczych komórek, czas przejścia jest określany na podstawie odpowiedniej gęstości skupisk komórek i wielkości osadu PDO po odwirowaniu (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B). W przypadku RLUN007 objętość granulatu PDO osiąga 30 μL (gęstość nasycona w kolbach 25cm2) po około 2 tygodniach od rozmrożenia.
	<ol>
		<li>W celu przeniesienia z jednej kolby o średnicy 25cm2 do dwóch kolb o średnicy 25cm2 (P1), zawiesinę ChNP należy przenieść do probówki wirówkowej i odwirować przy 200 x g przez 2 minuty w temperaturze około 25 °C. Oszacować objętość osadu ChNP i odrzucić supernatant. Zawiesić osad ChNP za pomocą pipety o pojemności 5 ml w 5 ml świeżego podłoża. Delikatnie pipetować pięć razy w górę i w dół przy niskiej prędkości. Następnie przenieść połowę objętości zawiesiny ChNP (2,5 ml) do dwóch kolb i dodać 2,5 ml świeżej pożywki do każdej kolby. Hodować komórki w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .</li>
		<li>W celu przeniesienia z dwóch kolb o średnicy 2 cm do jednej kolby o średnicy 75cm2 (P2), należy przenieść zawiesinę ChNP z dwóch kolb do dwóch probówek wirówkowych i odwirować ChNP przy 200 x g przez 2 minuty w temperaturze około 25 °C. Następnie oszacuj objętość osadu PDO i ponownie zawieś osad w 2,5 ml świeżego podłoża (na probówkę). Następnie połączyć zawiesinę ChNP w jednej probówce z zawiesiną w drugiej probówce i przenieść ją do kolby o długości 75cm2 zawierającej 10 ml świeżej pożywki. Hodować komórki w temperaturze 37 °C w 5% CO2 . Przenieść subkulturowane PDO z dwóch kolb o średnicy 2 cm do jednej kolby o średnicy 2 cm2 około 1 tygodnia po pierwszym pasażu (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Hamowanie wzrostu HTS
UWAGA: Aktywność hamująca wzrost środków przeciwnowotworowych przeciwko PDO jest oceniana poprzez pomiar wewnątrzkomórkowej zawartości ATP, jak pokazano w <silna klasa="xfig">Rysunek 2. Ten etap jest wykonywany przy użyciu dostępnego na rynku zestawu do oznaczania żywotności komórek (patrz tabela materiałów).
<ol>
	<li>W dniu 0 należy przeprowadzić hodowlę ChNP (np. RLUN007) w kolbach do momentu, aż dostępna będzie odpowiednia liczba skupisk komórek do testu. Na jeden dzień przed wysiewem przenieść zawiesinę ChNP z kolby o średnicy 75cm2 do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 200 x g przez 2 minuty w celu zmierzenia objętości granulatu PDO. Następnie ponownie zawiesić granulki ChNP w 15 ml świeżej pożywki i przenieść je z powrotem do kolby o długości75 cm2. Hodowla komórek w temperaturze 37 °C w 5% CO2, 
	UWAGA: Wymagana objętość granulek PDO zależy od stopnia rozcieńczenia każdej ChNP i liczby 384-dołkowych płytek użytych do testu. W przypadku RLUN007 do wysiewu na dziesięć płytek 384-dołkowych niezbędne jest 200 μl objętości osadu komórkowego.</li>
	<li>W dniu 1 (24 godziny po zmianie pożywki) zmielić ChNP za pomocą sprzętu do fragmentacji i dyspersji komórek (patrz tabela materiałów) z uchwytem filtra zawierającym filtr siatkowy o wielkości 70 μm. Następnie rozcieńczyć 15 ml zawiesiny ChNP 10x. Wysiewać 40 μl zawiesiny ChNP na 384-dołkowe mikropłytki sferoidalne (okrągłodenne) o bardzo niskim przyleganiu (patrz Tabela materiałów) za pomocą dozownika zawiesiny komórek (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Do mielenia klastrów komórek zaleca się stosowanie dostępnych na rynku urządzeń do fragmentacji i dyspersji komórek (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Po 24 godzinach od wysiewu (dzień 2) należy potraktować PDO 0,04 μl roztworów badanego czynnika w końcowym zakresie stężeń od 20 μM do 1,0 nM (10 seryjnych rozcieńczeń) przy użyciu płynu (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>W dniu 8 (144 godziny po poddaniu działaniu substancji badanej) dodać wewnątrzkomórkowy odczynnik pomiarowy ATP do studzienek testowych. Wymieszać płytki za pomocą mieszadła i inkubować przez 10 minut w temperaturze 25 °C. Zmierzyć wewnątrzkomórkową zawartość ATP jako luminescencję za pomocą czytnika płytek (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Aby obliczyć żywotność komórek, należy podzielić ilość ATP w studzienkach testowych przez ilość w studzienkach kontrolnych zawierających nośnik, odejmując tło. Aby obliczyć szybkość wzrostu w ciągu 6 dni, należy podzielić ilość ATP w studzienkach kontrolnych pojazdu przez ilość w studzienkach kontrolnych pojazdu 24 godziny po wysiewie.</li>
	<li>Obliczyć 50% stężenie hamujące (IC50) i wartości pola pod krzywą (AUC) na podstawie krzywych dawka-odpowiedź, korzystając z oprogramowania do analizy danych biologicznych (patrz tabela materiałów). Współczynnik Z jest parametrem bezwymiarowym, który mieści się w zakresie od 1 (nieskończona separacja) do <0, zdefiniowanym jako Z = 1 - (3σc+ + 3σc-) / |μc+ - μc-|, gdzie σc+, σc-, μc+ i μc- są odchyleniami standardowymi (σ) i średnimi (μ) kontrolek wysokich (c+) i niskich (c−)<klasa sup="xref">14, odpowiednio.</li>
</ol>
3. HTS z systemem pobierania i obrazowania komórek do hamowania wzrostu
UWAGA: Jeśli występuje duże odchylenie (gdy współczynnik zmienności [CV] w teście jest większy niż 20%) w danych przy użyciu protokołu 2, PDO o wybranym rozmiarze mogą zostać wysiane na płytki 96-dołkowe lub 384-dołkowe za pomocą systemu pobierania i obrazowania komórek (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Protokół jest taki sam, jak opisany w krokach 2.1 i 2.2 w poprzedniej sekcji. Ten etap jest wykonywany przy użyciu dostępnego na rynku systemu pobierania i obrazowania komórek (patrz Tabela materiałów).
<ol>
	<li>W dniu 1 umieść 384-dołkową mikropłytkę sferoidalną o bardzo niskim przyczepie z 40 μl pożywki/dołka jako płytkę docelową w systemie pobierania i obrazowania komórek.</li>
	<li>Napełnić komorę pobierania (patrz Tabela Materiałów) 6 ml pożywki hodowlanej i odwirować przy 1 500 x g przez 2 minuty w celu usunięcia pęcherzyków powietrza. Dodać ChNP zawieszone w pożywce (objętość granulek PDO, 4 μL) do komory przebierczej i umieścić w systemie.</li>
	<li>Odstawić komorę na co najmniej 1 minutę, po czym nastąpi dyspersja, tak aby skupiska komórek osiadły na dnie komory; następnie wykonaj skanowanie komory.</li>
	<li>Ustaw rozmiar pobrania na 140-160 μm (obszar 15 386-20 000 μm2) w systemie, aby automatycznie wybierać klastry komórek. Następnie sprawdź jakość wybranych klastrów komórek na zeskanowanych obrazach i przenieś dziesięć klastrów komórek na studzienkę za pomocą wskazówek do pobierania (patrz Tabela materiałów) na płytkę docelową.</li>
	<li>Wykonaj kroki protokołu począwszy od kroku 2.3.</li>
</ol>
4. HTS dla cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał
UWAGA: Ten krok jest wykonywany za pomocą dostępnego na rynku systemu (patrz Tabela Materiałów), który jest przyrządem do pomiaru impedancji elektrycznej. Służy do oceny cytolizy PDO za pomocą cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC) z przeciwciałami monoklonalnymi i komórkami NK (<silna klasa="xfig">Rycina 3). Komórki NK są wytwarzane z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej przy użyciu zestawu do produkcji komórek NK (patrz tabela materiałów), zgodnie z instrukcjami producenta.
<ol>
	<li>Pomiar aktywności ADCC
	<ol>
		<li>W dniu 0 pokryć 96-dołkową płytkę (patrz Tabela materiałów) 50 μl 10 μg/ml roztworu fibronektyny (0,5 μg/basenik) w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
		<li>W pierwszym dniu, po usunięciu roztworu fibronektyny, dodaj 50 μl pożywki hodowlanej do każdego dołka, aby zmierzyć impedancję tła.</li>
		<li>Przed wysiewem dodać 5 ml odczynnika do dysocjacji kultur komórkowych (patrz tabela materiałów) do PDO (RLUN007: 100 μl osadu ChNP w kolbieo średnicy 75 cm2) i inkubować w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C przez 20 minut w celu rozproszenia PDO. Aby zatrzymać trypsynizację, dodaj 5 ml pożywki, odwiruj i usuń odczynnik dysocjacyjny. Przepłukać PDO świeżą pożywką i przefiltrować przez sitko o wielkości 40 μm (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Policz liczbę komórek za pomocą analizatora żywotności komórek (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Przenieść zawiesinę ChNP do zbiornika i wymieszać za pomocą pipetora wielokanałowego. Dodać zawiesinę PDO do studzienek o wymiarach 5 x 104 komórek/studzienkę na 96-dołkowej płytce. Każda studzienka zawiera końcową objętość 100 μl. Następnie umieścić płytkę w komorze bezpieczeństwa biologicznego w temperaturze około 25 °C na 30 minut.</li>
		<li>Przenieść płytkę do przyrządu w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C. Rejestruj zmiany w sygnałach impedancji co 15 minut jako indeks komórki.</li>
		<li>Rozmrozić komórki NK w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C tego samego dnia, w którym dokonano wysiewu PDO. Przenieść komórki z fiolki do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml pożywki dla komórek NK (patrz tabela materiałów) i odwirować przy stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze około 25 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 10 ml świeżej pożywki. Po zliczeniu komórek dostosować gęstość komórek do 1 x 106 komórek/ml i przenieść do kolby o średnicy 75cm2. Hodować komórki NK w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>W dniu 2 przygotuj roztwory przeciwciał (sól fizjologiczna buforowana fosforanami) o stężeniu 10-krotnym od końcowego na sterylnych 96-dołkowych płytkach z dnem w kształcie litery V.</li>
		<li>Usunąć 60 μl pożywki z każdej studzienki i dodać 10 μl roztworu trastuzumabu lub cetuksymabu (10 μg/ml, 1 μg/ml i 0,1 μg/ml) do PDO. Przenieś płytki z powrotem do urządzenia w inkubatorze i zapisuj indeks komórek przez 1 godzinę.</li>
		<li>Przenieś zawiesinę komórek NK do probówki o pojemności 50 ml i policz liczbę komórek. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut i dostosować gęstość komórek NK do 1 x 10 6 komórek/ml i 2 x 106 komórek/ml z pożywką dla PDO.</li>
		<li>Dodać 50 μl zawiesiny komórek NK do komórek efektorowych (NK) w stosunku komórek docelowych (RLUN007) 1:1 lub 2:1. Końcowe stężenia przeciwciał wynoszą 1 μg/ml, 0,1 μg/ml i 0,01 μg/ml. Utrzymuj płytkę w temperaturze około 25 °C przez 15 minut i włóż płytki z powrotem do urządzenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gromadzenie i analiza danych
	<ol>
		<li>Przelicz indeks komórki na procentowe wartości cytolizy za pomocą oprogramowania analitycznego (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Procentowa cytoliza odnosi się do procentu komórek docelowych zabitych przez komórki NK w porównaniu z samymi komórkami docelowymi (PDO) jako kontrolą. Odejmij indeksy komórkowe studzienek zawierających tylko komórki NK od indeksu studzienek na próbki w każdym punkcie czasowym. Znormalizuj każdą wartość do indeksu komórkowego bezpośrednio przed dodaniem przeciwciał. Przelicz znormalizowany indeks komórek na procentową cytolizę, używając następującego równania: % cytolizy = (1 - znormalizowany indeks komórek [dołki próbki]) / znormalizowany indeks komórek (dołki docelowe) x 100.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Sharma, S. V., Haber, D. A., Settleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+line-based+platforms+to+evaluate+the+therapeutic+efficacy+of+candidate+anticancer+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cell line-based platforms to evaluate the therapeutic efficacy of candidate anticancer agents.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (4), 241-253 (2010).</li>
<li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+organotypic+culture%3A+experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+technology+and+applications+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">Organoid technology and applications in cancer research.</a> Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 116(2018).</li>
<li>Palechor-Ceron, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+reprogramming+for+patient-derived+cancer+models+and+next-generation+living+biobanks%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Conditional reprogramming for patient-derived cancer models and next-generation living biobanks.</a> Cells. 8 (11), 1327(2019).</li>
<li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+primary+liver+cancer-derived+organoid+cultures+for+disease+modeling+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).</li>
<li>Du, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+miniaturized+3D+organoid+culture+platform+for+ultra-high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Development of a miniaturized 3D organoid culture platform for ultra-high-throughput screening.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 630-643 (2020).</li>
<li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+derivation+of+a+living+organoid+biobank+of+colorectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li>
<li>Meijer, T. G., Naipal, K. A., Jager, A., van Gent, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+tumor+culture+systems+for+functional+drug+testing+and+therapy+response+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Science+OA%22%5BJournal%5D)">Ex vivo tumor culture systems for functional drug testing and therapy response prediction.</a> Future Science OA. 3 (2), (2017).</li>
<li>Inoue, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+and+future+horizons+of+patient-derived+xenograft+models+in+colorectal+cancer+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Current and future horizons of patient-derived xenograft models in colorectal cancer translational research.</a> Cancers (Basel). 11 (9), 1321(2019).</li>
<li>Hum, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+molecular+analysis+of+cancer+behavior+cultured+in+vitro%2C+in+vivo%2C+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Comparative molecular analysis of cancer behavior cultured in vitro, in vivo, and ex vivo.</a> Cancers (Basel). 12 (3), 690(2020).</li>
<li>Tamura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+anticancer+agents+using+patient-derived+tumor+organoids+characteristically+similar+to+source+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">Evaluation of anticancer agents using patient-derived tumor organoids characteristically similar to source tissues.</a> Oncology Reports. 40 (2), 635-646 (2018).</li>
<li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+system+for+evaluating+molecular+targeted+drugs+using+lung+patient-derived+tumor+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">An in vitro system for evaluating molecular targeted drugs using lung patient-derived tumor organoids.</a> Cells. 8 (5), 481(2019).</li>
<li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+in+vitro+patient-derived+tumor+models+to+evaluate+anticancer+agents+and+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Letters%22%5BJournal%5D)">Construction of in vitro patient-derived tumor models to evaluate anticancer agents and cancer immunotherapy.</a> Oncology Letters. 21 (5), 406(2021).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
</ol>

Fujifilm Wako Bio Solutions Corporation jest spółką zależną Fujifilm Wako Pure Chemicals, komercyjnego właściciela nośników F-PDO i F-PDO na mocy przeniesienia licencji.

Unikalną cechą ChNP jest to, że nie są one enzymatycznie rozdzielane na pojedyncze komórki podczas hodowli lub testu i utrzymują klastry komórek w hodowli. Dlatego liczby komórek nie można dokładnie policzyć pod mikroskopem. Aby rozwiązać ten problem, liczbę komórek określa się wizualnie poprzez wyłożenie probówki wirówkowej zawierającej komórki probówkami oznaczonymi poziomami dla 50-200 μl (rysunek 1B). Ponadto, ponieważ trudno jest wizualnie zmierzyć objętość osadów w klastrach komórek hodowanych w kolbie o średnicy 25cm2, czas przejścia określono na podstawie zmiany koloru podłoża z czerwonego na żółty i zauważalnego wzrostu w pojedynczych komórkach lub szczątkach w porównaniu z czasem pasażowania jako wskaźników (Rysunek 1A,C). Taki jest sens passpassingu dla PDO. Ilość granulek PDO jest mierzona wizualnie po odwirowaniu przy każdej zmianie pożywki. Gdy objętość osadu przestaje się zwiększać, a podłoże żółknie następnego dnia po wymianie pożywki, uważa się, że podłoże jest nasycone gęstością i przeprowadza się pasażowanie. Objętość granulek jest definiowana dla każdej ChNP. Jeżeli ChNP nie rozprzestrzeniają się, ilość pożywki zmienia się z 80% do 50% w momencie wymiany pożywki, a gęstość ChNP w kulturze wzrasta.
Opracowano HTS odpowiedni dla PDO. Jego przepustowość wynosi co najmniej dziesięć do dwudziestu płytek 384-dołkowych wykonywanych przy użyciu jednej kolby ChNP o długości 75cm2 , a liczba płytek przetwarzanych dziennie wynosi co najmniej 50. Ponadto przedstawiono już wyniki oceny różnych leków przeciwnowotworowych przez HTS przy użyciu ChNP.
Podczas wykonywania HTS zatkanie filtra siatkowego spowodowane rozdrobnieniem F-PDO za pomocą sprzętu do fragmentacji i dyspersji komórek jest początkowo rozwiązywane poprzez zmianę rozmiaru siatki filtra na 100 μm. Kolejnym krokiem jest zmniejszenie objętości zawiesiny ChNP nakładanej na szklane naczynie. Podczas przygotowywania roztworów substancji badanych dla HTS, związki o niskiej masie cząsteczkowej są zwykle rozpuszczane w dimetylosulfotlenku, a przeciwciała rozpuszcza się w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami. Jako substancję badaną stosuje się odpowiedni rozpuszczalnik, a dane kontrolne uzyskuje się z użytego rozpuszczalnika.
Poniżej znajduje się opis sposobu radzenia sobie ze zmiennością danych testowych. Jeżeli występują duże różnice w danych w badaniu przy użyciu płytek 384-dołkowych, płytkę testową należy zmienić na formę płytki 96-dołkowej. Współczynnik rozcieńczenia PDO (liczba wysianych skupisk komórek) jest również badany po wysianiu płytki. Wreszcie, system pobierania i obrazowania komórek może być wykorzystany do wybrania rozmiaru PDO do testu. Przed dodaniem ChNP do komory, pojedyncze komórki i małe grupy komórek powinny zostać usunięte przez wirowanie na niskiej prędkości, aby móc prawidłowo rozpoznać ChNP. Jeśli po dodaniu PDO do komory widoczne są pojedyncze komórki lub małe skupiska komórek, można przeprowadzić wiele dyspersji w celu usunięcia pojedynczych komórek. Następnie, chociaż system pobierania i obrazowania komórek ma funkcję, która pozwala na utrzymanie ciepła płytki, funkcja ta nie jest używana ze względu na parowanie pożywki hodowlanej, gdy system pracuje przez długi czas. Wreszcie, objętość klastrów komórek jest nieznana, ponieważ jest rozpoznawana przez obraz płaski. Ponadto, jeżeli dwie lub więcej ChNP nakłada się na siebie, nie można prawidłowo rozpoznać pojedynczej ChNP. Możliwe jest jednak usunięcie niechcianych PDO za pomocą funkcji usuwania, sprawdzając je na zeskanowanym obrazie po przeniesieniu.
Przyrząd do pomiaru impedancji elektrycznej jest zwykle używany do przylegających docelowych komórek rakowych do monitorowania zmian impedancji podczas proliferacji komórek. W związku z tym nie wykrywa się zmiany indeksu komórkowego nieprzylegających PDO. Próbując rozwiązać ten problem, konieczne jest zbadanie warunków wysiewu, takich jak gęstość PDO i traktowanie enzymatyczne (enzym dysocjacji komórek i czas zabiegu) w zależności od rodzaju ChNP. Studzienki w płytce muszą być również pokryte odpowiednią macierzą zewnątrzkomórkową do wysiewu ChNP. ChNP wysiewa się bez obróbki enzymatycznej, w zależności od rodzaju ChNP. RLUN007 wykorzystano do pomiaru impedancji poprzez wysiewanie PDO na 96-dołkowej płytce po ich dyspersji przez obróbkę enzymatyczną. RLUN007 poddano działaniu odczynnika do dysocjacji kultur komórkowych przez 20 minut w temperaturze 37 °C w celu rozproszenia komórek i przyłączenia ich do studzienek płytki 96-dołkowej. Biorąc pod uwagę, że zdysocjowane komórki RLUN007 natychmiast tworzą agregaty, pożądane jest wysiewanie na płytkach zaraz po filtracji za pomocą sitka. Po przeniesieniu zawiesiny komórek z probówki do zbiornika, zbiornik był delikatnie przesuwany od prawej do lewej dwa do trzech razy i pipetowany w górę iw dół pięć razy przed wysiewem na płytkę. Zawiesina była również mieszana z każdym dodatkiem do studni. Płytkę umieszczono następnie w komorze bezpieczeństwa biologicznego na 30 minut (w przypadku PDO) lub 15 minut (w przypadku komórek NK), aby umożliwić równomierne rozprowadzenie komórek w studzience. Drugą ważną kwestią jest to, że leczenie przeciwciałami i komórkami NK powinno być zaplanowane tak, aby miało miejsce, zanim indeks komórkowy osiągnie plateau, a wartość nie będzie mniejsza niż 0,5. W przypadku RLUN007 optymalny czas na rozpoczęcie testu to 20-22 godziny po posiewie, a liczba komórek do wysiewu to 5 x 104 komórki/dołek.
Ogólnie rzecz biorąc, hodowla i testy organoidów nowotworowych wykorzystują matryce zewnątrzkomórkowe, takie jak Matrigel, do tworzenia rusztowań tkanki nowotworowej lub enzymów, takich jak trypsyna i kolagenaza, do rozbijania organoidów 3,4,5,6,7. Zaletą tej metody jest to, że podczas hodowli i oznaczania nie jest wymagana matryca zewnątrzkomórkowa ani obróbka enzymatyczna (z wyjątkiem testów z użyciem przyrządu do pomiaru impedancji elektrycznej), co znacznie zmniejsza zapotrzebowanie na pracę i koszty. Co więcej, metoda ta jest stosunkowo łatwa do dostosowania do systemów testowych HTS i różnych systemów pomiarowych. Jednak zastosowanie macierzy zewnątrzkomórkowej jest pożądane do niektórych celów badawczych, ponieważ może ona działać jako rusztowanie dla komórek i wpływać na morfogenezę, różnicowanie i homeostazę tkanek.
W tym badaniu do oceny inhibitorów EGFR wykorzystano PDO (RLUN007) z mutacją EGFR (L858R), która jest klinicznie wrażliwa na inhibitory EGFR i wysoką ekspresją genu EGFR (dane nie pokazane). Wykazano, że wrażliwość RLUN007 na inhibitory EGFR była wyższa niż w przypadku innych F-PDO pochodzących z raka płuc13 (Figura 4). W związku z tym HTS wykorzystujący PDO, które zachowują cechy tkanki nowotworowej, jest lepszy do oceny potencjalnych środków przeciwnowotworowych i stwarza możliwości oceny leków i postępów w medycynie spersonalizowanej. Chociaż HTS nadaje się do wstępnych badań przesiewowych środków, nie odtwarza mikrośrodowiska guza, a zatem nie może ocenić skuteczności leków in vivo. W związku z tym obecnie opracowywany jest system in vitro , który może naśladować ludzką tkankę nowotworową in vivo poprzez wspólną hodowlę z komórkami śródbłonka naczyń krwionośnych i innymi komórkami zrębu lub technologią narządów na chipie w przypadku braku modeli zwierzęcych.

Ludzkie linie komórkowe raka są powszechnie akceptowane do badania biologii raka i oceny środków przeciwnowotworowych. Jednak te linie komórkowe niekoniecznie zachowują oryginalne cechy swojej tkanki źródłowej, ponieważ ich morfologia, mutacja genów i profil ekspresji genów mogą zmieniać się podczas hodowli przez długi czas. Co więcej, większość z tych linii komórkowych jest hodowana w monowarstwie lub używana jako mysie ksenoprzeszczepy, z których żaden fizycznie nie reprezentuje tkanki nowotworowej1,2. W związku z tym skuteczność kliniczna środków przeciwnowotworowych może nie być taka sama, jak obserwowana w liniach komórek rakowych. W związku z tym opracowano systemy in vitro, takie jak testy ex vivo z wykorzystaniem ksenoprzeszczepów nowotworowych pochodzących od pacjenta lub organoidów nowotworowych pochodzących od pacjenta (PDO) oraz modeli sferoidalnych guza, które dokładnie odtwarzają strukturę i funkcję tkanek nowotworowych. Coraz więcej dowodów sugeruje, że modele te przewidują reakcję pacjentów na leki przeciwnowotworowe, ponieważ są bezpośrednio porównywalne z odpowiadającą im tkanką nowotworową. Te systemy in vitro zostały stworzone dla różnych typów tkanek nowotworowych, a także opracowano związane z nimi wysokoprzepustowe systemy testowe (HTS) do badań przesiewowych leków3,4,5,6,7. Heterogeniczne hodowle organoidowe ex vivo guzów pierwotnych uzyskanych od pacjentów lub ksenoprzeszczepów nowotworowych pochodzących od pacjentów zyskały w ostatnich latach znaczną popularność ze względu na łatwość hodowli i zdolność do utrzymania złożoności komórek w tkance zrębu8,9,10. Oczekuje się, że modele te przyczynią się do lepszego zrozumienia biologii nowotworów i ułatwią ocenę skuteczności leków in vitro.
Niedawno stworzono serię nowych PDO z różnych typów tkanek nowotworowych, oznaczonych jako F-PDO, w ramach Projektu Badań Translacyjnych w Fukushimie. ChNP tworzą duże skupiska komórek o morfologii podobnej do morfologii guza źródłowego i mogą być hodowane przez ponad sześć miesięcy11. Histologia porównawcza i kompleksowe analizy ekspresji genów wykazały, że cechy PDO są zbliżone do cech ich źródłowych tkanek nowotworowych, nawet po długotrwałym wzroście w warunkach hodowli. Ponadto ustalono odpowiedni HTS dla każdego rodzaju ChNP w płytkach 96-dołkowych i 384-dołkowych. Testy te wykorzystano do oceny kilku ukierunkowanych molekularnych środków i przeciwciał. W tym przypadku standardowe chemioterapeutyki (paklitaksel i karboplatyna) stosowane w raku endometrium oceniano przy użyciu F-PDO pochodzących od pacjentki, która nie zareagowała na paklitaksel i karboplatynę. W związku z tym działanie hamujące wzrost komórek paklitakselu i karboplatyny wobec tej PDO było słabe (IC50: >10 μM). Ponadto wcześniejsze badania wykazały, że wrażliwość niektórych F-PDO na chemioterapeutyki i molekularne środki ukierunkowane jest zgodna ze skutecznością kliniczną11,12,13. Na koniec, zmiany w strukturze wyższego rzędu PDO spowodowane przez czynniki przeciwnowotworowe analizowano za pomocą trójwymiarowego systemu analizy komórek12,13. Wyniki oceny leków przeciwnowotworowych przy użyciu HTS opartego na PDO są porównywalne z wynikami klinicznymi uzyskanymi dla tych leków. W tym miejscu przedstawiono protokół prostszego i dokładniejszego HTS, który można wykorzystać do oceny siły działania leków przeciwnowotworowych i immunoterapii przy użyciu modeli PDO.

<table><tbody><tr><td>384-dołkowa sferoidalna mikropłytka o bardzo niskim nasadce</td><td>Płytki Corning</td><td>4516</td><td>do HTS</td></tr><tr><td>40-&micro; m Sitko do komórek</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw AdoptCell-NK</td> Zestaw <td>Kohjin Bio</td><td>16030400</td><td>do produkcji komórek NK</td></tr><tr><td>Media do ekspansji komórek rakowych plus</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical</td><td>032-25745</td><td>Podłoże dla F-PDO</td></tr><tr><td>ALyS505N-175</td><td>Cell Science & Instytut Technologiczny</td><td>10217P10</td><td>Pożywka dla komórek NK</td></tr><tr><td>CELL HANDLER</td><td>Yamaha System</td> <td>pobierania i obrazowania</td> <td>Motor-Cell</td></tr> <tr><td>CellPet FT</td><td>JTEC-Sprzęt</td> do <td></td><td>fragmentacji i dyspersji komórek</td></tr><tr><td>Test żywotności komórek CellTiter-Glo 3D</td><td>Promega</td><td>G9683</td><td>Test luminescencyjny żywotności komórek, wewnątrzkomórkowy odczynnik do pomiaru ATP</td></tr><tr><td>Echo 555</td><td>Labcyte</td><td>-</td><td>Płyn do obsługi</td></tr><tr><td>EnSpire</td><td>PerkinElmer-Czytnik</td><td></td> <td>płytek</td></tr><tr><td>E-plate VIEW 96</td><td>Agilent</td><td>300601020</td><td>Płytki są specjalnie zaprojektowane do wykonywania testów komórkowych za pomocą systemu xCELLigence RTCA</td></tr><tr><td>Roztwór fibronektyny</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical</td><td>063-05591</td><td>Powłoka płytkowa do systemu xCELLigence RTCA</td></tr><tr><td>F-PDO</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical lub Summit Pharmaceuticals International</td> <td>-</td> <td>F-PDO można kupić w Fujifilm Wako Pure Chemicals lub Summit Pharmaceuticals International</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Morphit, wersja 6.0</td><td>The Edge Software Consultancy</td><td></td><td>Oprogramowanie do analizy danych biologicznych</td></tr><tr><td>Multidrop Combi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5840300</td><td>Dozownik zawiesiny komórek</td></tr><tr><td>Precision Chamber</td><td>Yamaha Motor</td><td>JLE9M65W230</td><td>Chamber do pobierania klastrów komórkowych za pomocą CELL HANDLER</td></tr><tr><td>Precision Tip</td><td>Yamaha Motor</td><td>JLE9M65W300</td><td>Micro końcówka do pobierania klastrów komórkowych za pomocą CELL HANDLER</td></tr><tr><td>RLUN007</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical lub Summit Pharmaceuticals International</td><td></td><td>Hodowla komórek F-PDO TrypLE Express</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12604021</td><td>Hodowla komórkowa odczynnik dysocjacyjny</td></tr><tr><td>Ultra-Low Attachment 25 cm&sup2; Kolba</td><td>Corning</td><td>4616</td><td>Kolba hodowlana do nasadki PDO</td></tr><tr><td>Ultra-Low 75 cm&sup2; Kolba</td><td>Corning</td><td>3814</td><td>Kolba hodowlana do</td></tr><tr><td>systemu analizatora żywotności komórek PDO Vi-CELL XR Analizator żywotności komórek</td><td>Beckman coulter-Cell</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Oprogramowanie do immunoterapii xCELLigence, wersja 2.3</td> Oprogramowanie <td>analityczne ACEA Bioscience</td><td></td> <td>dla systemu xCELLigence RTCA</td></tr><tr><td>System xCELLigence RTCA ACEA</td><td>Bioscience-Przyrząd</td><td></td> <td>do pomiaru impedancji elektrycznej dla cytoliza</td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowy test in vitro z wykorzystaniem organoidów nowotworowych pochodzących od pacjenta

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

Organoidy nowotworowe pochodzące od pacjentów (PDO) powinny być przedklinicznym modelem raka o lepszej odtwarzalności choroby niż tradycyjne modele hodowli komórkowych. PDO zostały z powodzeniem wygenerowane z różnych ludzkich nowotworów, aby dokładnie i skutecznie odtworzyć architekturę i funkcję tkanki nowotworowej. Jednak PDO nie nadają się do wysokoprzepustowego systemu testów in vitro (HTS) lub analizy komórek przy użyciu płytek 96-dołkowych lub 384-dołkowych podczas oceny leków przeciwnowotworowych, ponieważ są niejednorodne pod względem wielkości i tworzą duże skupiska w hodowli. Te hodowle i testy wykorzystują matryce zewnątrzkomórkowe, takie jak Matrigel, do tworzenia rusztowań tkanki nowotworowej. W związku z tym PDO charakteryzują się niską przepustowością i wysokimi kosztami, a opracowanie odpowiedniego systemu oznaczania było trudne. Aby rozwiązać ten problem, stworzono prostszy i dokładniejszy HTS przy użyciu PDO do oceny siły działania leków przeciwnowotworowych i immunoterapii. Stworzono HTS in vitro, który wykorzystuje PDO utworzone z guzów litych hodowanych na płytkach 384-dołkowych. Opracowano również HTS do oceny zależnej od przeciwciał aktywności cytotoksyczności komórkowej w celu odzwierciedlenia odpowiedzi immunologicznej przy użyciu PDO hodowanych na 96-dołkowych płytkach.

Opracowano wysoce dokładny system HTS z wykorzystaniem PDO oraz mikropłytek 384-dołkowych do oceny leków przeciwnowotworowych; opracowanie HTS dla każdego PDO zostało opisane we wcześniejszych doniesieniach10,11,12,13. Wydajność HTS oceniono poprzez obliczenie wartości CV oraz współczynnika Z'. Współczynnik Z' jest powszechnie akceptowaną metodą walidacji jakości i wydajności testu, a test uznaje się za odpowiedni do HTS, jeśli wartość ta jest &gt;0,514. Punkty danych kontrolnych w teście na płytce 384-dołkowej z użyciem RLUN007 wykazały niewielką zmienność, przy wartościach CV wynoszących 5,8% i obliczonych współczynnikach Z' równych 0,83, co przedstawiono na Rysunku 4. Wyniki te wskazują, że test ten charakteryzuje się wysoką wydajnością w zastosowaniach HTS. Aby zbadać wrażliwość PDO na leki przeciwnowotworowe za pomocą HTS, oceniono hamowanie wzrostu w RLUN007 traktowanym ośmioma lekami przeciwnowotworowymi, a konkretnie inhibitorami receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) (afatynibem, erlotynibem, gefitynibem, lapatynibem, ozymertynibem i rociletynibem) oraz paklitakselem, które stanowią standardowe leczenie kliniczne niedrobnokomórkowego raka płuca, oraz mitycyną C jako kontrolą pozytywną. Wartości IC50 i AUC leków przeciwnowotworowych dla każdego PDO przedstawiono na Rysunku 4. RLUN007 wykazał wysoką wrażliwość (IC50 &lt; 2 µM, AUC &lt; 282) na wszystkie inhibitory EGFR oraz pozostałe leki przeciwnowotworowe. Krzywe sigmoidalne obliczone dla wszystkich danych wskazały, że aktywność hamującą wzrost leków przeciwnowotworowych można było precyzyjnie zmierzyć.
System selekcji i obrazowania komórek jest wykorzystywany w przypadkach, gdy dane znacząco różnią się przy zastosowaniu powyższej metodologii. System selekcji i obrazowania komórek, który precyzyjnie wybiera skupiska komórek bez ich uszkadzania, umożliwia dokładne analizy HTS poprzez dostosowanie rozmiaru skupisk komórek w celu wyeliminowania z systemu analizy resztek komórkowych. Gdy system nie był używany, wartość CV wynosiła 26,0%, a wartość czynnika Z' wynosiła 0,23 (dane nie zostały przedstawione). Jednakże, przy zastosowaniu systemu wartości CV i czynnika Z' uległy poprawie, wynosząc odpowiednio 6,4% oraz 0,81.
Aby zbadać cytolizę PDO z aktywnością ADCC przy użyciu urządzenia do pomiaru impedancji elektrycznej, które monitoruje liczbę, morfologię i przywieranie komórek przez długi czas, oceniono zmiany sygnałów impedancji w przypadku RLUN007 traktowanych przeciwciałami (trastuzumabem i cetuksymabem) oraz komórkami NK jako komórkami efektorowymi w płytce 96-dołkowej. W porównaniu z kontrolą składającą się z samych komórek docelowych, procent cytolizy wzrastał wraz z czasem. Po 6 h osiągnął on 45% lub 75% przy stosunku E:T 1:1 (Rysunek 5A,C) lub 2:1 (Rysunek 5B,D) bez przeciwciał. Cytoliza pośredniczona przez komórki NK z użyciem trastuzumabu wyniosła odpowiednio około 60% i 90% przy stosunku 1:1 (Rysunek 5A, 1 µg/mL) i 2:1 (Rysunek 5B, 1 µg/mL) po 6 h. W przeciwieństwie do tego, cetuksymab miał zależny od dawki wpływ na cytolizę pośredniczoną przez komórki NK (Rysunek 5C,D). Przy najwyższym stężeniu cetuksymabu komórki RLUN007 zostały zniszczone w 90% i 100% przy stosunku 1:1 i 2:1, odpowiednio (Rysunek 5C,D). Efekt trastuzumabu był słabszy niż w przypadku cetuksymabu, wykazując jedynie 60% cytotoksyczności. Wyniki te wskazują, że system analizy PDO może służyć do oceny aktywności ADCC z wykorzystaniem technologii impedancyjnej w czasie rzeczywistym.
<img alt="Etapy pasażowania kultur komórkowych; schemat procesu wirowania; obrazy mikroskopowe wzrostu komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62668/62668fig1v5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Kluczowe punkty hodowli PDO. (A) Zmiana barwy medium. (B) Pomiar ilości PDO na podstawie wielkości osadu poprzez dopasowanie probówki wirówkowej zawierającej PDO do probówek z oznaczeniami poziomów 50-200 µL. (C) Gęstość PDO. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62668/62668fig1v5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat procesu od hodowli PDO do testu ATP; wirowanie, wysiew komórek, traktowanie związkami, analiza luminescencji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62668/62668fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Podsumowanie protokołu wykorzystanego do stworzenia wysokoprzepustowego systemu testowego z użyciem mikropłytek 384-dołkowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62668/62668fig02large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Schemat pomiaru impedancji elektrycznej; płytka 96-dołkowa; wysiew komórek; traktowanie przeciwciałami; analiza." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62668/62668fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Podsumowanie protokołu wysokoprzepustowego testu aktywności ADCC. ADCC, cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał; NK, komórki natural killer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62668/62668fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza żywotności komórek nowotworowych, wykresy odpowiedzi na stężenie leku dla siedmiu zabiegów z wartościami IC50." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62668/62668fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: System analizy wysokoprzepustowej w celu oceny hamowania wzrostu przez środki przeciwnowotworowe. Krzywa zależności odpowiedzi od dawki RLUN007 w odpowiedzi na środki przeciwnowotworowe. Rozdrobnione PDO wysiano na płytki 384-dołkowe. Przez 6 dni poddano je działaniu dziesięciu różnych stężeń środków przeciwnowotworowych (od 10 µM do 1,5 nM). Dane przedstawiają średnią ± odchylenie standardowe z trzech niezależnych eksperymentów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62668/62668fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykresy kinetyki cytolizy przy różnych stężeniach trastuzumabu i cetuksymabu; efekty działania przeciwciał." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62668/62668fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Wysokoprzepustowy test aktywności ADCC. (A,B) Trastuzumab. (C,D) Cetuksymab. (A,C) Stosunek komórek RLUN007 do komórek efektorowych 1:1. (B,D) Cytoliza przy stosunku komórek RLUN007 do komórek efektorowych 1:2. Aktywność zmierzono 12 h po dodaniu komórek efektorowych. Dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe z trzech próbek powtórzonych. ADCC, przeciwciałozależna cytotoksyczność komórkowa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62668/62668fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Wysoce dokładny system wysokoprzepustowych testów in vitro został opracowany do oceny leków przeciwnowotworowych przy użyciu organoidów nowotworowych pochodzących od pacjenta (PDO), podobnych do tkanek nowotworowych, ale nie nadaje się do wysokoprzepustowych systemów testów in vitro z płytkami 96-dołkowymi i 384-dołkowymi.

Wysokoprzepustowy test in vitro z wykorzystaniem organoidów nowotworowych pochodzących od pacjenta

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...

Organoidy nowotworowe pochodzące od pacjentów dokładnie podsumowują architekturę i funkcję tkanki nowotworowej z lepszą odtwarzalnością choroby. W związku z tym za pomocą tego modelu można dokładnie ocenić reakcję pacjenta na leki przeciwnowotworowe. Organoidy nowotworowe nie nadają się do wysokoprzepustowego systemu testów in vitro lub analizy komórek ze względu na tworzenie się dużych klastrów w hodowli.Korzystając z tej techniki, opracowano prosty i dokładniejszy HTS do oceny leków ukierunkowanych molekularnie. Ponieważ kultura organoidów bardzo różni się od kultury 2D, na początku można czuć się zdezorientowanym co do kultury, ale ważne jest, aby uważnie obserwować zmiany morfologiczne organoidów. Po wyjęciu zamrożonej substancji z magazynu ciekłego azotu, delikatnie mieszaj organoidy nowotworowe pochodzące od pacjenta w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną minutę.Usuń ohydę z łaźni wodnej i przetrzyj 70% etanolem. Następnie umieścić fiolkę w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Przenieś organoidy guza w 15-mililitrowej probówce zawierającej podłoże dla organoidów.Użyj trzymililitrowej pipety transferowej, aby delikatnie wymieszać organoidy nowotworowe i pożywkę, pipetując pięć razy w górę iw dół. Osadzać organoidy nowotworowe przez odwirowanie. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad organoidu guza w pięciu mililitrach świeżej pożywki.Przenieś zawiesinę organoidów nowotworowych do kolby T25 i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po tygodniu od pierwszego pasażu przenieś zawiesinę organoidów nowotworowych z dwóch kolb T25 do dwóch probówek wirówkowych i osadzaj organoidy guza przez odwirowanie. Oszacuj objętość osadu organoidu guza i ponownie zawieś osad w 2,5 mililitra świeżej pożywki na probówkę.Połącz zawiesinę organoidów nowotworowych w jednej probówce. Przenieść zbiorczą zawiesinę do kolby T75 zawierającej 10 mililitrów świeżej pożywki i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po 24 godzinach od zmiany pożywki zmielić organoidy nowotworowe za pomocą przyrządu do fragmentacji i dyspersji komórek wyposażonego w uchwyt filtra zawierający filtr siatkowy o grubości 70 mikrometrów.Rozcieńczyć 15 mililitrów zawiesiny organoidów nowotworowych 10 razy. Użyj dozownika zawiesiny komórkowej, aby wysiać 40 mikrolitrów rozcieńczonej zawiesiny organoidów nowotworowych w 384-dołkowej mikropłytce sferoidalnej o bardzo niskim przyczepie. Po 24 godzinach za pomocą urządzenia do obchodzenia się z cieczą dodać 0,04 mikrolitra roztworów czynnika testowego z 10 seryjnych rozcieńczeń w końcowych zakresach stężeń od 20 mikromolowych do 1,0 nanomolowych w studzienkach i inkubować płytkę przez sześć dni.Pod koniec inkubacji dodać wewnątrzkomórkowy odczynnik do pomiaru ATP do studzienek testowych. Za pomocą miksera wymieszaj zawartość płytki i inkubuj płytkę przez 10 minut w temperaturze około 25 stopni Celsjusza. Użyj czytnika płytek, aby zmierzyć wewnątrzkomórkową zawartość ATP jako luminescencję.Po 24 godzinach od trzeciego przejścia umieścić 384-dołkową mikropłytkę sferoidalną o bardzo niskim nakładzie z 40 mikrolitrami pożywki na studzienkę jako płytkę docelową w systemie pobierania i obrazowania komórek. Zbuduj komorę pobierania z sześcioma mililitrami pożywki hodowlanej i wiruj pod ciśnieniem 1500 razy G przez dwie minuty, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Dodaj cztery mikrolitry zawiesiny organoidów nowotworowych do komory pobierania i ustaw komorę pobierania w systemie.Pozwól skupiskom komórek osiąść na dnie komory przez jedną minutę po dyspersji, a następnie rozpocznij skanowanie komory. Ustaw rozmiar pobierania na 140 do 160 mikrometrów w systemie, aby automatycznie wybierać klastry komórek. Następnie sprawdź jakość wybranych klastrów komórek na zeskanowanych obrazach i przenieś 10 klastrów komórek na studzienkę za pomocą końcówek do pobierania na płytkę docelową.W obecnym badaniu oceniono wpływ środków przeciwnowotworowych na organoid guzowy pochodzący od pacjenta. Na wysoką czułość wszystkich leków przeciwnowotworowych wskazywały wartości połowy maksymalnego stężenia hamującego mniejsze niż dwa mikromole w obszarze pod krzywą o wartości mniejsze niż 282. W celu oceny cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał zmierzono procentową cytolizę organoidów nowotworowych w obecności dwóch różnych przeciwciał.Procent cytolizy wzrastał z czasem. Bez przeciwciał po sześciu godzinach ze stosunkiem efektora do komórki docelowej jeden do jednego, cytoliza osiągnęła 45%, podczas gdy w stosunku dwa do jednego, cytoliza osiągnęła 70%Cytoliza za pośrednictwem komórek NK przy użyciu trastuzumabu wynosiła około 60% w stosunku efektora do komórki docelowej jeden do jednego i 80% w stosunku dwa do jednego po sześciu godzinach. W przeciwieństwie do tego, cetuksymab miał zależny od dawki wpływ na cytolizę za pośrednictwem komórek NK.Przy najwyższym stężeniu cetuksymabu zaobserwowano 90% cytolizę w stosunku efektora do komórki docelowej jeden do jednego, a 100% cytolizę obserwowano w stosunku dwa do jednego, co wskazuje na wysoką skuteczność cetuksymabu. Wysokoprzepustowy system testowy wykorzystujący organoidy nowotworowe pochodzące od pacjenta jest lepszy od oceny potencjalnych środków przeciwnowotworowych i stwarza możliwości oceny leków oraz postępów w medycynie spersonalizowanej.

high-throughput-in-vitro-assay-using-patient-derived-tumor-organoids

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opisano metodę tworzenia organoidów przy użyciu ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjenta (PDX) do badań przesiewowych in vitro, co daje dopasowane pary modeli in vivo/in vitro. Guzy PDX zostały zebrane/przetworzone na małe kawałki mechanicznie lub enzymatycznie, a następnie metodą Cleversa do wyhodowania organoidów nowotworowych, które zostały pasażowane, kriokonserwowane i scharakteryzowane w stosunku do oryginalnego PDX.

Tworzenie dopasowanych par modeli in vivo/in vitro pochodzących od pacjentów PDX i organoidów pochodzących z PDX do badań farmakologicznych nad nowotworami

Ten protokół opisuje standaryzowaną ocenę wrażliwości leków na ukierunkowane inhibitory sygnalizacji w modelach organoidowych pochodzących od pacjentów z NSCLC.

Profilowanie wrażliwości na terapie celowane w organoidach pochodzących od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca z mutacją EGFR

Protokół ten opisuje półautomatyczną metodę średnioprzepustowych i wysokoprzepustowych badań leków organoidów oraz niezależne od mikroskopu, zautomatyzowane oprogramowanie do analizy obrazów służące do ilościowej i wizualizacji wieloparametrycznej, pojedynczej odpowiedzi lekowej w celu uchwycenia heterogeniczności wewnątrznowotworowej.

Wieloparametryczne badanie leków na leki w nowotworach organoidalnych z wykorzystaniem obrazowania szerokopolowego z użyciem żywych komórek do analizy objętości i pojedynczych organoidów

Szczegółowy protokół jest tutaj podany do ustalania ludzkich organoidów piersi na podstawie resekcji guza piersi pochodzących od pacjenta lub normalnej tkanki piersi. Protokół zawiera kompleksowe instrukcje krok po kroku dotyczące hodowli, zamrażania i rozmrażania organoidów piersi pochodzących od ludzkich pacjentów.

Tworzenie i hodowla organoidów piersi pochodzących od pacjentów

Przedstawiamy protokół, który może być wykorzystany do przeprowadzenia testów leków terapeutycznych z organoidami raka jajnika pochodzącymi od pacjentek.

Modele organoidowe pochodzące od pacjentek z rakiem jajnika do przedklinicznych testów leków

Organoidy nowotworowe zrewolucjonizowały badania nad rakiem i podejście do medycyny spersonalizowanej. Reprezentują one klinicznie istotny model guza, który pozwala naukowcom być o krok przed guzem w klinice. Protokół ten ustanawia organoidy nowotworowe ze świeżych próbek tkanki guza trzustki i ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów pochodzących od gruczolakoraka trzustki.

Tworzenie organoidów nowotworowych i fibroblastów pochodzących z raka trzustki ze świeżych tkanek

To badanie wprowadza zautomatyzowaną metodę generowania trójwymiarowych organoidów glejaka pochodzących od pacjenta za pomocą rozdrabniacza tkanek. Metoda zapewnia odpowiednie i skuteczne podejście do pozyskiwania takich organoidów do badań terapeutycznych.

Hodowla organoidów glejaka pochodzącego od pacjenta ex vivo za pomocą rozdrabniacza tkanek

Organoidy nowotworowe pochodzące od pacjentów są wyrafinowanym systemem modelowym do badań podstawowych i translacyjnych. Ten artykuł dotyczący metod szczegółowo opisuje zastosowanie multipleksowanego obrazowania fluorescencyjnego żywych komórek do jednoczesnej oceny kinetycznej różnych fenotypów organoidów.

Multipleksowane obrazowanie żywych komórek w celu uzyskania odpowiedzi na leki w organoidalnych modelach raka pochodzących od pacjenta

Protokół opisuje metodę tworzenia modelu organoidowego raka jelita grubego (CRC) pochodzącego od pacjenta, współhodowanego z limfocytami naciekającymi nowotwór (TIL) w celu zbadania ich interakcji i potencjału terapeutycznego. Model ten stanowi platformę przedkliniczną do badania odpowiedzi immunologicznych w mikrośrodowisku guza oraz do przewidywania skuteczności terapii opartej na TIL w spersonalizowanym leczeniu raka jelita grubego.

Ustanowienie systemu kohodowli organoidów i limfocytów naciekających nowotwór jelita grubego pochodzących od pacjentów

Aby umożliwić bardzo czułe wykrywanie komórek kolonizujących tkanki ludzkiego raka jelita grubego (CRC), pokazujemy protokół efektywnej transdukcji cząsteczek lentiwirusa z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) do komórek organoidowych CRC pochodzących z PDX przed ich wstrzyknięciem myszom biorcy, z obserwacją mikroskopową stereofluorescencji.

Wysoka czułość wykrywania mikroprzerzutów generowanych przez organoidy transdukowane przez GFP lentiwirus hodowane z guza jelita grubego pochodzącego od pacjenta

Poznaj wysokoprzepustowy test in vitro z wykorzystaniem organoidów nowotworowych pochodzących od pacjenta do oceny leków przeciwnowotworowych. Ta metoda poprawia dokładność przewidywania odpowiedzi na leczenie w medycynie spersonalizowanej.

Wysokoprzepustowy test in vitro z wykorzystaniem organoidów nowotworowych pochodzących od pacjenta

Przeglądaj więcej filmów