Name: Generowanie organoidów ludzkiego mózgu do modelowania chorób mitochondrialnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Poznaj metodę generowania organoidów mózgu z ludzkich komórek iPSC do modelowania chorób mitochondrialnych. Protokół umożliwia ocenę właściwości mitochondriów bez kosztownych bioreaktorów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Miriam Bünning za wsparcie techniczne. Dziękujemy za wsparcie ze strony Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 do A.P.), Spark i Berlińskiego Instytutu Zdrowia (BIH) (fundusze walidacyjne BIH dla A.P.), United Mitochondrial Disease Foundation (UMDF) (grant Leigh Syndrome International Consortium dla A.P.), Szpitala Uniwersyteckiego w Düsseldorfie (Forschungskommission UKD to A.P.) oraz niemieckiego Federalnego Ministerstwa Edukacji i Badań Naukowych (BMBF) (e: Grant dla młodego badacza AZ 031L0211 dla A.P.). Prace w laboratorium C.R.R. były wspierane przez DFG (FOR 2795 "Synapsy w stresie", Ro 2327/13-1).

<ol><li>Koopman, W. J., Willems, P. H., Smeitink, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monogenic+mitochondrial+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Monogenic mitochondrial disorders.</a> New England Journal of Medicine. 366 (12), 1132-1141 (2012).</li>
<li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial diseases.</a> Nature Review Disease Primers. 2, 16080(2016).</li>
<li>Vafai, S. B., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+disorders+as+windows+into+an+ancient+organelle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle.</a> Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).</li>
<li>Carelli, V., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA%3A+impacting+central+and+peripheral+nervous+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA: impacting central and peripheral nervous systems.</a> Neuron. 84 (6), 1126-1142 (2014).</li>
<li>Russell, O. M., Gorman, G. S., Lightowlers, R. N., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+diseases%3A+hope+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial diseases: hope for the future.</a> Cell. 181 (1), 168-188 (2020).</li>
<li>Weissig, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+development+for+the+therapy+of+mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Drug development for the therapy of mitochondrial diseases.</a> Trends in Molecular Medicine. 26 (1), 40-57 (2020).</li>
<li>Tyynismaa, H., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+mitochondrial+DNA+defects+and+their+relevance+for+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Mouse models of mitochondrial DNA defects and their relevance for human disease.</a> EMBO Reports. 10 (2), 137-143 (2009).</li>
<li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+rescue+in+pluripotent+cells+from+patients+with+mtDNA+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metabolic rescue in pluripotent cells from patients with mtDNA disease.</a> Nature. 524 (7564), 234-238 (2015).</li>
<li>Galera-Monge, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+calcium+dysregulation+in+Leigh+syndrome+induced+pluripotent+stem+cell+derived+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and calcium dysregulation in Leigh syndrome induced pluripotent stem cell derived neurons.</a> International Journal of Molecular Science. 21 (9), 3191(2020).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alleviation+of+neuronal+energy+deficiency+by+mTOR+inhibition+as+a+treatment+for+mitochondria-related+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Alleviation of neuronal energy deficiency by mTOR inhibition as a treatment for mitochondria-related neurodegeneration.</a> Elife. 5, 13378(2016).</li>
<li>Lorenz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPSC-derived+neural+progenitors+are+an+effective+drug+discovery+model+for+neurological+mtDNA+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human iPSC-derived neural progenitors are an effective drug discovery model for neurological mtDNA disorders.</a> Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).</li>
<li>Inak, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+induced+pluripotent+stem+cell-based+drug+discovery+for+mitochondrial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: induced pluripotent stem cell-based drug discovery for mitochondrial disease.</a> Stem Cells. 35 (7), 1655-1662 (2017).</li>
<li>Chiaradia, I., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+organoids+for+the+study+of+human+neurobiology+at+the+interface+of+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Brain organoids for the study of human neurobiology at the interface of in vitro and in vivo.</a> Nature Neuroscience. 23 (12), 1496-1508 (2020).</li>
<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cerebral+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocol. 9 (10), 2329-2340 (2014).</li>
<li>Liput, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+and+approaches+for+analyzing+the+role+of+mitochondria+in+health%2C+development+and+disease+using+human+cerebral+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Tools and approaches for analyzing the role of mitochondria in health, development and disease using human cerebral organoids.</a> Developmental Neurobiology. , (2021).</li>
<li>Winanto, K. Z. J., Soh, B. S., Fan, Y., Ng, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+cultures+of+MELAS+neural+cells+reveal+hyperactive+Notch+signaling+that+impacts+neurodevelopment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Organoid cultures of MELAS neural cells reveal hyperactive Notch signaling that impacts neurodevelopment.</a> Cell Death and Disease. 11 (3), 182(2020).</li>
<li>Romero-Morales, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPSC-derived+cerebral+organoids+model+features+of+Leigh+Syndrome+and+reveal+abnormal+corticogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Human iPSC-derived cerebral organoids model features of Leigh Syndrome and reveal abnormal corticogenesis.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Inak, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+metabolic+programming+impairs+early+neuronal+morphogenesis+in+neural+cultures+and+an+organoid+model+of+Leigh+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome.</a> Nature Communications. 12 (1), 1929(2021).</li>
<li>Falk, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodevelopmental+manifestations+of+mitochondrial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Developmental+%26+Behavioral+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Neurodevelopmental manifestations of mitochondrial disease.</a> Journal of Developmental & Behavioral Pediatrics. 31 (7), 610-621 (2010).</li>
<li>Velasco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+brain+organoids+reproducibly+form+cell+diversity+of+the+human+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex.</a> Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).</li>
<li>Pfiffer, V., Prigione, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+bioenergetic+profile+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Assessing the bioenergetic profile of human pluripotent stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1264, 279-288 (2015).</li>
<li>Ludikhuize, M. C., Meerlo, M., Burgering, B. M. T., Colman, R. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+to+profile+the+bioenergetics+of+organoids+using+Seahorse%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol to profile the bioenergetics of organoids using Seahorse.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100386(2021).</li>
<li>Menacho, C., Prigione, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tackling+mitochondrial+diversity+in+brain+function%3A+from+animal+models+to+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biochemestry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tackling mitochondrial diversity in brain function: from animal models to human brain organoids.</a> International Journal of Biochemestry & Cell Biology. 123, 105760(2020).</li>
<li>Del Dosso, A., Urenda, J. P., Nguyen, T., Quadrato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upgrading+the+physiological+relevance+of+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Upgrading the physiological relevance of human brain organoids.</a> Neuron. 107 (6), 1014-1028 (2020).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych lub niefinansowych.

W artykule opisano powtarzalne wytwarzanie ludzkich organoidów mózgowych pochodzących z iPSC i ich zastosowanie do modelowania chorób mitochondrialnych. Opisany tu protokół jest modyfikowany na podstawie wcześniej opublikowanej pracy20. Jedną z głównych zalet obecnego protokołu jest to, że nie wymaga on ręcznego osadzania każdego organoidu w matrycy rusztowania. W rzeczywistości roztwór matrycy jest po prostu rozpuszczany w pożywce do hodowli komórkowych. Co więcej, nie ma potrzeby stosowania drog...

Choroby mitochondrialne reprezentują największą klasę wrodzonych wad metabolizmu1. Są one spowodowane mutacjami genetycznymi zakłócającymi różne procesy mitochondrialne, w tym fosforylację oksydacyjną (OXPHOS)2, tworzenie łańcucha oddechowego, dynamikę mitochondriów oraz transkrypcję lub replikację mitochondrialnego DNA3. Tkanki o zapotrzebowaniu na energię są szczególnie dotknięte dysfunkcją mitochondriów4. W związku z tym u pacjentów z chorobami mitochondrialnymi zazwyczaj rozwijają się wczesne objawy neurologiczne.
Obecnie nie ma dostępnych metod leczenia dla dzieci dotkniętych chorobami mitochondrialnymi5. Główną przeszkodą w opracowywaniu leków na choroby mitochondrialne jest brak skutecznych modeli podsumowujących przebieg choroby u ludzi6. Kilka z obecnie badanych modeli zwierzęcych nie wykazuje wad neurologicznych obecnych u pacjentów7. W związku z tym mechanizmy leżące u podstaw patologii neuronalnej chorób mitochondrialnych nadal nie są w pełni poznane.
Ostatnie badania wygenerowały iPSC od pacjentów dotkniętych chorobami mitochondrialnymi i wykorzystały te komórki do uzyskania komórek neuronalnych specyficznych dla pacjenta. Na przykład stwierdzono, że defekty genetyczne związane z chorobą mitochondrialną, zespołem Leigha, powodują aberracje w bioenergetyce komórkowej8,9, synteza białek10 i homeostaza wapnia9,11. Raporty te dostarczyły ważnych wskazówek mechanistycznych na temat upośledzenia neuronów występującego w chorobach mitochondrialnych, torując drogę do odkrycia leków na te nieuleczalne choroby12.
Dwuwymiarowe (2D) kultury jednak nie umożliwiają badania złożoności architektonicznej i regionalnej organizacji organów 3D13. W tym celu wykorzystanie trójwymiarowych organoidów mózgowych pochodzących z specyficznych dla pacjenta iPSCs14 może pozwolić naukowcom na uzyskanie dodatkowych ważnych informacji, a tym samym pomóc w zrozumieniu, w jaki sposób choroby mitochondrialne wpływają na rozwój i funkcję układu nerwowego15. Badania wykorzystujące organoidy mózgowe pochodzące z iPSC do badania chorób mitochondrialnych zaczynają odkrywać neurorozwojowe komponenty chorób mitochondrialnych. 
Organoidy rdzenia kręgowego przenoszące mutacje związane z chorobą mitochondrialną, encefalopatią mitochondrialną, kwasicą mleczanową i zespołem epizodów podobnych do udaru (MELAS), wykazywały wadliwą neurogenezę i opóźnione różnicowanie neuronów ruchowych16. Organoidy korowe pochodzące od pacjentów z chorobą mitochondrialną, zespołem Leigha, wykazywały zmniejszony rozmiar, defekty w wytwarzaniu pączków nabłonka nerwowego i utratę architektury korowej17. Organoidy mózgowe od pacjentów z zespołem Leigha wykazały, że defekty choroby rozpoczynają się na poziomie nerwowych komórek progenitorowych, które nie mogą zaangażować się w metabolizm mitochondrialny, powodując nieprawidłowe rozgałęzienia neuronów i morfogenezę18. W związku z tym neuronalne komórki progenitorowe mogą stanowić komórkowy cel terapeutyczny dla chorób mitochondrialnych, a strategie promujące ich funkcję mitochondrialną mogą wspierać funkcjonalny rozwój układu nerwowego.
Użycie organoidów mózgowych może pomóc odkryć neurorozwojowe składniki chorób mitochondrialnych. Choroby mitochondrialne są głównie uważane za neurodegenerację o wczesnym początku5. Jednak wady neurorozwojowe występują również u pacjentów dotkniętych chorobami mitochondrialnymi, w tym opóźnieniem rozwoju i upośledzeniem funkcji poznawczych19. Specyficzne dla pacjenta organoidy mózgowe mogą pomóc w rozwiązaniu tych aspektów i wyjaśnić, w jaki sposób choroby mitochondrialne mogą wpływać na rozwój ludzkiego mózgu. Dysfunkcja mitochondriów może również odgrywać rolę patogenetyczną w innych, bardziej powszechnych chorobach neurologicznych, takich jak choroba Alzheimera, choroba Parkinsona i choroba Huntingtona4. W związku z tym wyjaśnienie wpływu defektów mitochondrialnych na rozwój neurologiczny za pomocą organoidów mózgowych może być również pomocne w badaniu tych chorób. W artykule opisano szczegółowy protokół generowania powtarzalnych organoidów mózgowych, które można wykorzystać do prowadzenia modelowania chorób mitochondrialnych.

<table><tbody><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Affinity Designer</td><td>Serif (Europe) Ltd</td><td></td><td>Oprogramowanie do układu; Edytor grafiki wektorowej</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 osioł anty-świnka</td><td>morska Sigma Aldrich</td><td>SAB4600033-250UL</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 osioł anty-myszy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-31571</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Antymycyna A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1397-94-0</td><td></td></tr><tr><td>Anty-&beta;-Tubulina III (TUJ-1)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8578</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>Laser argonowy</td><td>Melles Griot</td><td></td><td>Każdy inny laser, np. lasery diodowe emitujące 488 też jest w porządku</td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Sigma</td><td>A92902</td><td></td></tr><tr><td>B-27 z witaminą A</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>3% w PBS, przechowuj roztwór w temperaturze -20 & stopni; C</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-0811</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma</td><td>D0627</td><td></td></tr><tr><td>Cell Star hodowla komórkowa 6-dołkowa płytka</td><td>Greiner-Bio-One</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Chemicznie zdefiniowany koncentrat lipidowy</td><td>Gibco</td><td>11905031</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy C1</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td>Modułowy mikroskop konfokalny System</td></tr><tr><td>Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Matryca membrany podstawnej, bez czerwieni fenolu, bez LDEV</td><td>Składnik Corning</td><td>356231</td><td>Matrix</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania proliferacji komórek</td><td>CyQUANT Thermo Fisher</td><td>C7026</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>ThermoFisher</td><td>31330038</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2660-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Anty-kozy Cy3</td><td>Merck Millipore</td><td>AP180C</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Osioł anty-mysz Cy3</td><td>Merck Millipore</td><td>AP192C</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Osioł anty-królik Cy3</td><td>Merck Millipore</td><td>AP182C</td><td>1:300</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>DS-Q1Mc</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pionowy mikroskop szerokokątny Eclipse 90i</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop pionowy Eclipse E 600FN</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Eclipse Ts2</td><td>Nikon Microsope Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZ-C1 Silver Version 3.91</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td>Oprogramowanie do obrazowania do mikroskopu konfokalnego</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>370-86-5</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td> płodu<td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-291</td><td></td></tr><tr><td>Glasgow MEM</td><td>Gibco</td><td>11710-035</td><td></td></tr><tr><td>Szklana pipeta Pasteura</td><td>Marka</td><td>747715</td><td>Odwrócony</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Laser helowo-neonowy</td><td>Melles Griot</td><td></td><td>Każdy inny laser, np. lasery diodowe emitujące 594 jest w porządku, też</td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Merck</td><td>H3149-25KU</td><td></td></tr><tr><td>HERACell 240i CO2 Inkubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026331</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>1:2500</td></tr><tr><td>Obraz J 1.53c</td><td>Wayne Rasband National Institute of Health</td><td></td><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazu</td></tr><tr><td>Injekt Solo 10 mL/ Luer</td><td>Braun</td><td>4606108V</td><td></td></tr><tr><td>Zamiennik serum do nokautu</td><td>Gibco</td><td>10828010</td><td></td></tr><tr><td>Laser (407 nm)</td><td>Koherentny</td><td></td><td>Każdy inny laser, np. lasery diodowe emitujące 407 też jest w porządku</td></tr><tr><td>Systemy synaptyczne</td><td>Map2</td><td>nr 188004</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Maxisafe 2030i</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR Plus</td><td>Stemcell Technology</td><td>85850</td><td>iPSC medium</td></tr><tr><td>Multifuge X3R Wirówka</td><td>Thermo Scientific</td><td>10325804</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do wykrywania MycoAlert MycoAlert</td><td>Lonza</td><td># LT07-218</td><td></td></tr><tr><td>Suplement N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Igła do jednorazowego użytku (23G x 1" TW)</td><td>Neoject</td><td>10016</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements Aadvanced Research 3.2</td><td>Nikon</td><td></td><td>Oprogramowanie do obrazowania</td></tr><tr><td>Oligomycyna A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna Heidolph Unimax 1010</td><td>Heidolph</td><td>543-12310-00</td><td></td></tr><tr><td>PAP Pen</td><td>Sigma</td><td>Z377821-1EA</td><td>Do rysowania bariery hydrofobowej na szkiełkach.</td></tr><tr><td>Zestaw systemu dysocjacji papainy</td><td>Worthington</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Merck</td><td>818715</td><td>4% w PBS, roztwór do przechowywania w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteura 7 ml</td><td>VWR</td><td>612-1681</td><td>z podziałką do 3 ml</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Plan Apo VC 20x / 0,75 air DIC N2&nbsp; &infin;/0,17 WD 1.0</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td>Suchy mikroskop</td></tr><tr><td>Obiektyw Plan Apo VC 60x / 1,40 olej DIC N2 &infin;/0,17 WD 0,13</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td>Mikroskop immersyjny olejowy Obiektyw</td></tr><tr><td>Polistyrenowa szalka Petriego (100 mm)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664161</td><td></td></tr><tr><td>Polistyrenowa rurka okrągłodenna z nasadką sitkową (5 ml)</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Glass Antifade Moutant</td><td>Invitrogen</td><td>P36980</td><td></td></tr><tr><td>Jakościowa bibuła filtracyjna</td><td>VWR</td><td>516-0813</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor skał</td><td>Merck</td><td>SCM075</td><td></td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma</td><td>83-794</td><td></td></tr><tr><td>S100&beta;</td><td>Abcam</td><td>Ab11178</td><td>1:600</td></tr><tr><td>SB-431542</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>13031</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza skalpela</td><td>Heinz Herenz Hamburq</td><td>1110918</td><td></td></tr><tr><td>SMI312</td><td>Biolegend</td><td>837904</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Merck/Sigma</td><td>31437-1kg-M</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Roth</td><td>3957</td><td></td></tr><tr><td>Sód Podanie diwodorofosforanu</td><td></td><td>131965</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>SOX2</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc-17320</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Odczynnik do dysocjacji komórek StemPro Accutase</td><td>Odczynnik do A1110501 Gibco/StemPro</td><td></td><td></td></tr> Super <tr><td>Glue Gel</td><td>UHU</td><td>63261</td><td>żel adhezyjny</td></tr><tr><td>SuperFrost Plus</td><td>VWR</td><td>631-0108</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka jednorazowego użytku (1 ml)</td><td>BD Plastipak</td><td>300015</td><td></td></tr><tr><td>TB2 Thermoblock</td><td>Biometra</td> TC Plate 24-dołkowa Sarstedt 83.3922 TC Płytka <td></td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa</td><td>Sarstedt</td><td>83.392</td><td></td></tr><tr><td>TGFbeta3</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-007</td><td></td></tr> Kaptur <tr><td></td><td></td><td></td> do hodowli tkankowych <td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher</td><td>51032711</td><td></td></tr><tr><td>TOM20</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-11415</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Merck</td><td>X100-5ML</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0,5M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome Microm HM 650 V</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Produkcja zakończona, każdy inny regulowany mikrotom też jest w porządku.</td></tr><tr><td>Vibratome Wilkinson Klasyczna żyletka</td><td>Wilkinson Miecz Wilkinsona</td><td>70517470</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Benchkote</td><td>Merck/Sigma</td><td>28418852</td><td></td></tr><tr><td>Wnt Antagonist I</td><td>EMD Millipore Corp</td><td>3378738</td><td></td></tr><tr><td>XF 96 analizator strumienia zewnątrzkomórkowego</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100737-101</td><td></td></tr><tr><td>Test XF DMEM Medium</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>103680-100</td><td></td></tr><tr><td>XF Calibrant Solution</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100840-000</td><td></td></tr><tr><td>XFe96 FluxPak (96-dołkowa mikropłytka)</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102416-100</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie organoidów ludzkiego mózgu do modelowania chorób mitochondrialnych

Generation of Human Brain Organoids for Mitochondrial Disease Modeling

Choroby mitochondrialne stanowią największą klasę wrodzonych wad metabolizmu i są obecnie nieuleczalne. Choroby te powodują wady neurorozwojowe, których mechanizmy leżące u podstaw pozostają do wyjaśnienia. Główną przeszkodą jest brak skutecznych modeli podsumowujących wczesne upośledzenie neuronów obserwowane u pacjentów. Postępy w technologii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) umożliwiają generowanie trójwymiarowych (3D) organoidów mózgowych, które można wykorzystać do badania wpływu chorób na rozwój i organizację układu nerwowego. Naukowcy, w tym ci autorzy, wprowadzili niedawno organoidy ludzkiego mózgu do modelowania zaburzeń mitochondrialnych. W artykule przedstawiono szczegółowy protokół solidnego generowania ludzkich organoidów mózgowych pochodzących z iPSC i ich wykorzystania w mitochondrialnym profilowaniu bioenergetycznym i analizach obrazowych. Eksperymenty te pozwolą na wykorzystanie organoidów mózgowych do badania dysfunkcji metabolicznych i rozwojowych oraz mogą dostarczyć kluczowych informacji do analizy patologii neuronalnej chorób mitochondrialnych.

Protokół opisany w niniejszym opracowaniu umożliwia stabilną generację okrągłych organoidów (Rysunek 1A). Wygenerowane organoidy zawierają dojrzałe neurony, które można zwizualizować przy użyciu markerów białkowych specyficznych dla aksonów (SMI312) i dendrytów (białko MAP2 - microtubule-associated protein 2) (Rysunek 1B). Dojrzałe organoidy zawierają nie tylko komórki neuronalne (MAP2-dodatnie), ale również kom...

Opisujemy szczegółowy protokół generowania ludzkich organoidów mózgowych pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych i ich wykorzystania w modelowaniu chorób mitochondrialnych.

Generowanie organoidów ludzkiego mózgu do modelowania chorób mitochondrialnych

Mitochondrial diseases represent the largest class of inborn errors of metabolism and are currently incurable. These diseases cause neurodevelopmental ...

Protokół ten ma na celu wykorzystanie organoidów mózgowych do badania chorób mitochondrialnych. Został opracowany do generowania powtarzalnych organoidów mózgowych w ocenie ich właściwości mitochondrialnych. Metoda ta nie wymaga drogich bioreaktorów i czasochłonnych procedur zatapiania.Dlatego jest łatwy do wdrożenia i skalowania. Protokół ten umożliwia generowanie powtarzalnych organoidów mózgowych i testowanie ich właściwości mitochondrialnych. Może to prowadzić do identyfikacji celów interwencyjnych dla nieuleczalnych chorób mitochondriów.Na początek należy wyhodować ludzkie iPSC w warunkach wolnych od karmowego w pożywce iPSC na powlekanych płytkach sześciodołkowych i umieścić je w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Przejście iPSC przy 80% konfluencji przy użyciu bezenzymatycznego podłoża odłączającego w proporcjach od jednego na cztery do jednego na 12. Aby zwiększyć przeżywalność komórek, po każdym rozszczepieniu dodaj 10 mikromolowych kinaz białkowych związanych z rho lub inhibitora ROCK.Oddziel 80% iPSC w dniu zero. Przygotuj pożywkę do różnicowania korowego lub CDM1 i podgrzej ją w temperaturze pokojowej przed dodaniem do komórek. Umyj studzienki zawierające iPSC PBS, aby usunąć martwe komórki i zanieczyszczenia.Dodaj 500 mikrolitrów wstępnie podgrzanego odczynnika A do każdej studzienki i inkubuj przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Sprawdź pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórka jest odłączona. Dodaj jeden mililitr pożywki iPSC do rozcieńczenia odczynnika A, aby zneutralizować jego aktywność.Użyj pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów, aby oddzielić komórki przez przepychanie rurami w górę iw dół, a następnie przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Delikatnie odwirować iPSC w temperaturze 125 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie ostrożnie zassać supernatant, aby uniknąć naruszenia osadu komórkowego. Ponownie zawiesić osad z jednym mililitrem CDM1, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki i policzyć liczbę komórek.Przygotuj podłoże wysiewające z 9 000 iPSC na 100 mikrolitrów w CDM1 uzupełnionym 20 mikromolowym inhibitorem ROCK, trzema mikromolowymi inhibitorami kateniny WNT lub IWR-1 i pięcioma mikromolowymi SB-431542. Dodaj 100 mikrolitrów podłoża wysiewającego na dołek do 96-dołkowej płytki dolnej w kształcie litery V. Przechowywać płytkę w nawilżonym inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Aby wygenerować neurosfery, pierwszego dnia obserwuj, że tworzą się okrągłe agregaty komórkowe z określonymi gładkimi granicami. Zwróć uwagę na martwe komórki wokół agregatów. Kontynuuj hodowlę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Trzeciego dnia porusz płytkę, stukając trzykrotnie w boki, aby oderwać martwe komórki, a następnie dodaj 100 mikrolitrów CDM1 uzupełnionego 20 mikromolowym inhibitorem ROCK, trzema mikromolowymi IWR-1 i pięcioma mikromolowymi SB-431542 do każdej studzienki. Trzymaj płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Szóstego dnia ostrożnie usunąć 80 mikrolitrów pożywki sklarowanej nad osadem z każdej studzienki.Unikaj dotykania dna studni. Dodać 100 mikrolitrów CDM1 uzupełnionych trzema mikromolowymi IWR-1 i pięcioma mikromolowymi SB-431542 do każdej studzienki i inkubować płytkę. Powtarzaj poprzedni krok co trzy dni aż do 18 dnia.W 18 dniu, aby przenieść neurosfery, przygotuj CDM2 i dodaj 10 mililitrów do 100-milimetrowej płytki do hodowli komórek o bardzo niskim przyczepie. Użyj pipety o pojemności 200 mikrolitrów z odciętą końcówką, aby przenieść okrągłe neurosfery z 96-dołkowej płytki na 100-milimetrową płytkę do hodowli komórkowej o bardzo niskim mocowaniu. Usunąć pięć mililitrów pożywki z płytki zawierającej neurosfery i dodać pięć mililitrów świeżego CDM2.Umieść płytkę na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 70 obrotów na minutę w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Co trzy dni ostrożnie odsysać pożywkę sklarowaną nad osadem i zastąpić ją świeżą CDM2. Pozostaw niewielką ilość podłoża, aby zapobiec wysychaniu neurosfer.W 35 dniu przygotuj CDM3. Odessać pożywkę z płytki i dodać 10 mililitrów zimnego CDM3. Po zmianie pożywki umieść płytkę z powrotem na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 70 obrotów na minutę w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Zmieniaj podłoże co trzy do pięciu dni w zależności od tempa wzrostu, na co wskazuje kolor podłoża. W 70 dniu przygotuj CDM4. Używaj pożywki CDM4 aż do osiągnięcia pożądanego wieku organoidów.W tym okresie należy trzymać płytkę na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 70 obrotów na minutę w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Zmieniaj podłoże co trzy do pięciu dni w zależności od tempa wzrostu. Przygotuj 4% roztwór PFA i umieść go pod maską bezpieczeństwa.Zbierz organoidy mózgowe i delikatnie przenieś je końcówką trzymililitrowej plastikowej pipety Pasteura na sześciodołkową płytkę wypełnioną PFA. Przechowywać organoidy w roztworze PFA przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć PFA za pomocą trzymililitrowej plastikowej pipety Pasteura i trzykrotnie umyć utrwalone organoidy za pomocą PBS.Utrwalone organoidy należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza w PBS do czasu dalszego użycia. Organoidy wygenerowane przy użyciu tego protokołu zawierają dojrzałe neurony, które można uwidocznić za pomocą markerów białkowych specyficznych dla aksonów i dendrytów. Dojrzałe organoidy zawierają nie tylko komórki neuronalne, ale także komórki glejowe.Korzystając z analizy pokrojonych organoidów mózgowych, możliwe jest monitorowanie aksonów dodatnich SMI 312 i dendrytów dodatnich MAP2 lub komórek glejowych beta S100. Ponadto obrazy konfokalne pomagają w badaniu szczegółowej dystrybucji i organizacji neuronalnych komórek progenitorowych SOX2 dodatnich w odniesieniu do neuronów beta-3 tubulinowo-dodatnich. Organoidy mózgowe wybarwiono pod kątem markerów specyficznych dla mitochondriów, takich jak translokaza błony zewnętrznej lub TOM20.Profilowanie bioenergetyczne organoidów mózgowych przeprowadzono poprzez pomiar zarówno metabolizmu mitochondrialnego za pomocą wskaźnika zużycia tlenu (OCR), jak i metabolizmu glikolitycznego za pomocą wskaźnika zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR). Oligomycyna powoduje spadek profilu OCR i dlatego identyfikuje OCR potrzebny do produkcji ATP. Po leczeniu oligomycyną może również wystąpić kompensacyjny wzrost ECAR, co sugeruje, że komórki mogą regulować glikolizę w górę, aby zapobiec stresowi metabolicznemu.Podczas przenoszenia neurosfer z płytki 96-dołkowej na płytkę hodowlaną lub podczas procedury utrwalania, ważne jest, aby delikatnie obchodzić się z organoidami, aby uniknąć ich uszkodzenia. Po wygenerowaniu organoidów mózgowych, matryca wieloelektrodowa lub obrazowanie wapnia byłyby idealnymi metodami testowania funkcjonalności organoidów.

generation-of-human-brain-organoids-for-mitochondrial-disease-modeling

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Film demonstruje metodę generowania organoidów ludzkiego mózgu z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Pokazuje, w jaki sposób neurosfera tworzy warstwę neuroektodermalną, która hamuje tworzenie się innych listków zarodkowych. Neurosfery są osadzone w matrycy żelowej 3D i tworzą zawiązki neuronabłonkowe. Podczas inkubacji z pożywkami organoidowymi te pąki neuroepitelialne różnicują się w określone obszary mózgu, co powoduje tworzenie dojrzałych organoidów mózgowych.

Metoda in vitro do generowania organoidów ludzkiego mózgu

Modelowanie rozwoju ludzkiego mózgu zostało utrudnione z powodu bezprecedensowej złożoności tkanki nabłonka nerwowego. W tym artykule opisano metodę wytwarzania organoidów mózgowych w celu wyznaczenia wczesnych zdarzeń rozwoju ludzkiego mózgu i modelowania małogłowia in vitro.

Generowanie organoidów ludzkiego mózgu pochodzących z iPSC w celu modelowania wczesnych zaburzeń neurorozwojowych

Organoidy mózgowe reprezentują nowy system modelowy do badania wczesnego rozwoju ludzkiego mózgu in vitro. Niniejszy artykuł zawiera szczegółową metodologię wydajnego generowania jednorodnych organoidów typu grzbietowego przodomózgowia z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, w tym krytyczne etapy charakterystyki i walidacji.

Generowanie standaryzowanych i powtarzalnych organoidów mózgowych typu przodomózgowia z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

To badanie przedstawia i opisuje protokoły do uzyskania dwóch specyficznych ludzkich organoidów nerwowych jako odpowiedniego i dokładnego modelu do badania: 1) rozwoju glejaka u człowieka w obrębie ludzkich organoidów nerwowych wyłącznie u ludzi oraz 2) różnicowania dopaminergicznego neuronów generującego trójwymiarowy organoid.

Ludzkie organoidy nerwowe do badania raka mózgu i chorób neurodegeneracyjnych

Ten protokół został stworzony jako sposób na produkcję organoidów mózgowych w uproszczony, tani sposób, bez egzogennych czynników wzrostu lub macierzy błony podstawnej, przy jednoczesnym zachowaniu różnorodności typów komórek mózgowych i wielu cech organizacji komórkowej.

Statyczna, samosterowna metoda generowania organoidów mózgowych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

W tym badaniu przedstawiamy szczegółową technikę prostego, ale solidnego systemu hodowli organoidów korowych przy użyciu standardowych kultur hPSC bez karmienia. Jest to szybki, wydajny i powtarzalny protokół generowania organoidów, które modelują aspekty starzenia się mózgu in vitro.

Solidna i wysoce odtwarzalna generacja organoidów korowych mózgu do modelowania starzenia się neuronów mózgu in vitro

Elektroporacja organoidów mózgowych naczelnych zapewnia precyzyjne i skuteczne podejście do wprowadzania przejściowych modyfikacji genetycznych do różnych typów progenitorów i neuronów w systemie modelowym zbliżonym do rozwoju (pato)fizjologicznej kory nowej naczelnych. Pozwala to na badanie procesów neurorozwojowych i ewolucyjnych, a także może być stosowane do modelowania chorób.

Ukierunkowana mikroiniekcja i elektroporacja organoidów mózgowych naczelnych w celu modyfikacji genetycznej

Ten protokół ma na celu stabilne umieszczanie grzbietowo-brzusznych zrośniętych asembloidów na wieloelektrodowych układach do modelowania padaczki in vitro.

Wieloelektrodowa platforma matrycowa do modelowania padaczki przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych zespołów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych

Organoidy mózgowe stanowią cenny model dla badań nad encefalomiopatią mitochondrialną, kwasicą mlekową oraz epizodami podobnymi do udaru (MELAS), oferując wgląd w ich podstawową patofizjologię i stanowiąc platformę do badań przesiewowych leków. Organoidy pochodzące z linii komórkowych o różnym poziomie heteroplazmy genów wywołujących chorobę wykazują istotne różnice fenotypowe.

Modelowanie chorób mitochondrialnych za pomocą organoidów mózgowych: Skupienie się na encefalomiopatii mitochondrialnej, kwasicy mlekowej oraz epizodach podobnych do udaru

Ten protokół ma na celu opisanie metody badania krok po kroku zdolności zatrzymywania Ca2+ i wywołanego przez Ca2+ obrzęku mitochondriów izolowanych mitochondriów komórek SH-SY5Y.

Test zdolności retencyjnej mitochondriów Ca2+ i test obrzęku mitochondriów wywołany Ca2+

Poznaj metodę generowania organoidów mózgu z ludzkich komórek iPSC do modelowania chorób mitochondrialnych. Protokół umożliwia ocenę właściwości mitochondriów bez kosztownych bioreaktorów.

Generowanie organoidów ludzkiego mózgu do modelowania chorób mitochondrialnych

Przeglądaj więcej filmów