Podłużne obrazowanie przyżyciowe przez przezroczyste okienka silikonowe

Ta procedura odlewania i wstawiania okien silikonowych obniża bariery techniczne dla podłużnego obrazowania przyżyciowego. Nasz protokół zapewnia solidne, łatwe do adaptacji okna, które są dobrze tolerowane przez zwierzęta. Za pomocą tej techniki zobrazowaliśmy raka i komórki odpornościowe w wątrobie, trzustce i gruczole sutkowym.

Przy minimalnych dostosowaniach można go dostosować do wielu lokalizacji anatomicznych i kwestii biologicznych. Dla tych, którzy próbują tej techniki po raz pierwszy, poćwicz uwalnianie niewielkich ilości kleju ze strzykawki. Nałożenie zbyt dużej ilości kleju spowoduje zmętnienie pola obrazowania i utrudni pracę z obszarem operacyjnym.

Rozpocznij odlewanie okna silikonowego, umieszczając niewielką ilość świeżo przygotowanego polimeru silikonowego, polidimetylosiloksanu PDMS, na czystej, gładkiej powierzchni i dostosuj stosunek objętości do powierzchni, aby uzyskać pożądaną grubość. Gdy PDMS zostanie osadzony na żądanej powierzchni odlewu, delikatnie wciśnij siatkę ze stali nierdzewnej w silikon, aby zapewnić punkty orientacyjne do wielokrotnego obrazowania tych samych obszarów tkanki. Aby usunąć pęcherzyki powietrza i odgazować polimer silikonowy, należy umieścić pokrytą powierzchnię w eksykatorze próżniowym na 45 minut.

Po zakończeniu utwardź polimer w piekarniku w temperaturze od 75 do 80 stopni Celsjusza przez 45 minut. Naciąć polimer na krawędziach formy i za pomocą kleszczy delikatnie oderwać utwardzone okienka od powierzchni używanej do odlewania. Umieść mysz w lewej bocznej pozycji odleżynowa.

Przygotuj znieczuloną mysz do operacji, nakładając 10% objętościowo roztworu jodu powidonu i 70% objętościowo etanolu trzy razy z rzędu na ogolone miejsce operacji. Należy zadbać o utrzymanie sterylnego pola operacyjnego. Następnie za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy wykonaj 10-milimetrowe nacięcie na prawej flance na wysokości trzech milimetrów poniżej łuku żebrowego.

Usuń jednocentymetrowy fragment skóry i użyj drugiej pary sterylnych nożyczek i kleszczy, aby usunąć odcinek otrzewnej nieco mniejszy niż odcinek skóry. Umieść niewielką ilość kleju chirurgicznego na sterylnej płytce dołka i wyjmij go za pomocą strzykawki o rozmiarze 31, aby nałożyć na powierzchnię wątroby wokół krawędzi obszaru, który ma być obrazowany, a następnie umieść okienko na żądanym obszarze i mocno przyciśnij je do wątroby przez około dwie minuty, aż klej wyschnie. Po zagięciu krawędzi okna pod otrzewną nałóż niewielką ilość kleju chirurgicznego na krawędzie okna, które znajdują się teraz pod otrzewną, dociśnij otrzewną kleszczami, aby przymocować ją do okna.

Podobnie uszczelnij otrzewną, nakładając niewielką ilość kleju chirurgicznego przed dociśnięciem skóry, a następnie nałóż klej wokół krawędzi okna, aby stworzyć obrzeże, które zapobiegną odrastaniu skóry nad oknem. Aby wprowadzić okienko do trzustki, umieść mysz w prawej bocznej pozycji odleżynowej i wykonaj nacięcie na lewym boku przed usunięciem odcinka otrzewnej, jak pokazano wcześniej. Za pomocą sterylnych wacików nasączonych sterylną solą fizjologiczną delikatnie pociągnij śledzionę, aby uwidocznić trzustkę.

Zmień położenie trzustki za pomocą zwilżonych wacików, aby większa powierzchnia była widoczna przez nacięcie. Po uzyskaniu dostępu do trzustki włóż i uszczelnij okienko obrazowania w żądanym obszarze, jak wyjaśniono wcześniej. Aby uzyskać dostęp do gruczołu sutkowego, umieść mysz w pozycji leżącej na plecach i wykonaj 10-milimetrowe nacięcie przyśrodkowe do jednego z sutków pachwinowych za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy.

Usuń 0,5 centymetra kwadratowego odcinka skóry nad gruczołem sutkowym, a następnie delikatnie oddziel gruczoł sutkowy od skóry, rozkładając sterylne nożyczki między dwiema powierzchniami, aby zakłócić przyleganie. Użyj strzykawki o rozmiarze 31, aby nałożyć niewielką ilość kleju chirurgicznego na powierzchnię gruczołu sutkowego wokół krawędzi obszaru, który ma być obrazowany. Ustawić i mocno przytrzymać okno do gruczołu mlekowego, aż klej wyschnie.

Po zagięciu krawędzi okna pod skórą, nałóż niewielką ilość kleju chirurgicznego na krawędzie okna, które znajdują się teraz pod skórą, i dociśnij skórę kleszczami, aby przymocować skórę do okna. Nałóż klej wokół krawędzi okna, aby stworzyć obrzeże, które zapobiegnie odrastaniu skóry nad oknem. Przed rozpoczęciem sesji obrazowania oczyść okno z wszelkich resztek zanieczyszczeń, delikatnie przecierając je bawełnianym wacikiem zamoczonym w 70% etanolu.

Korzystając z soczewki zanurzonej w wodzie, nałóż żel ultradźwiękowy na okno, unikając pęcherzyków. Aby rozpocząć obrazowanie, zlokalizuj i umieść siatkę w ostrości przez okulary. Następnie określ przybliżoną głębokość obrazowania tkanki, ustawiając dolną część siatki na zero.

Informacje te pomogą w zlokalizowaniu odpowiedniej płaszczyzny Z w kolejnych sesjach obrazowania. Aby zidentyfikować tę samą lokalizację w wielu sesjach obrazowania, użyj kwadratów na siatce jako punktu odniesienia. Podczas sesji obrazowania zwróć uwagę na orientację siatki i położenie każdego pola widzenia zobrazowanego w siatce.

Siatka może być używana do nawigacji z powrotem do określonych obszarów siatki i pól obrazowania w celu powodzenia sesji obrazowania. Po każdej sesji obrazowania usuń wszelkie resztki medium zanurzeniowego w soczewce i zanieczyszczenia, delikatnie przecierając okienko bawełnianym wacikiem zamoczonym w 70% etanolu. Silikonowe okienko pozwala na uchwycenie dynamicznej infiltracji komórek odpornościowych w czasie.

Reprezentatywna analiza ilustruje naciek neutrofili w przebudowującej się tkance gruczołu sutkowego w drugim i czwartym dniu. Okienko silikonowe umożliwia wizualizację guzów w wielu punktach czasowych przez kilka tygodni po wstawieniu okienka. Okna odlane z 200 miligramami PDMS są generalnie lepsze do implantacji chirurgicznej, ponieważ wykazywały znacznie większą wytrzymałość niż okna odlewane z 150 miligramami.

Warto zauważyć, że okna PDMS nie były tak sztywne jak standardowe szkło, co było reprezentowane przez moduł Younga szklanych okien, który był znacznie większy niż PDMS. Wstawienie okienka w różnych narządach było dobrze tolerowane, ponieważ większość myszy z czasem nadal przybierała na wadze. Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać przy próbie tej procedury, jest całkowite uszczelnienie okna za pomocą kleju.

Zapobiega to infekcji, wysychaniu tkanki i przemieszczaniu się okna. Po zabiegu iniekcje ortotopowe można wykonać przez silikonowe okienko, co pozwala naukowcom badać szeroką gamę tematów, takich jak proliferacja komórek, interakcje komórka-komórka i skuteczność terapeutyczna.