Name: Uprawa, wzrost i żywotność bakterii kwasu mlekowego: perspektywa kontroli jakości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T12:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 40 s
Description: Poznaj protokół uprawy bakterii kwasu mlekowego w celu kontroli jakości i zwiększenia żywotności komórek. Ta metoda poprawia wydajność fermentacji mikroorganizmów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta publikacja była możliwa dzięki grantowi numer NC. X-267-5-12-170-1 z Narodowego Instytutu Żywności i Rolnictwa (NIFA) oraz częściowo przez NIZO Food Research BV, Holandia, Jarrow Formulas, USA oraz Departament Nauk o Rodzinie i Konsumpcji oraz Stacja Badań Rolniczych na Uniwersytecie Stanowym Rolnictwa i Techniki Karoliny Północnej (Greensboro, NC, USA 27411). Prace te były również częściowo wspierane przez dotację z 1890 r. w ramach Programu Budowania Zdolności (Capacity Building Program) z 1890 r. (2020-38821-31113/Nr przystąpienia do projektu 021765). Prace te były również częściowo wspierane przez bułgarskie Ministerstwo Edukacji i Nauki w ramach Narodowego Programu Badawczego "Zdrowa żywność dla silnej biogospodarki i jakości życia" zatwierdzonego przez DCM # 577 / 17.08.2018.

1. Ogólne materiały i metody
<ol>
	<li>Źródło Lactobacillus delbrueckii podgat. bulgaricus
	<ol>
		<li>Uzyskać *L. bulgaricus* szczepy z wiarygodnych źródeł. 
		UWAGA: W niniejszym badaniu łącznie pięć (5) L. bulgaricus w badaniu kontroli jakości wykorzystano szczepy (Tabela 1). Dwa szczepy liofilizowanych L. bulgaricus do przemysłowej produkcji fermentowanych produktów mlecznych zostały dostarczone przez dr. Alberta Krastanova z Katedry Biotechnologii Uniwersytetu Technologii Żywności w Płowdiwie w Bułgarii. Dwa szczepy wyizolowane z komercyjnych produktów jogurtowych dostępnych na rynku USA otrzymano z -80 °C zasoby laboratorium Mikrobiologii Żywności i Biotechnologii na North Carolina A&amp;Uniwersytet Stanowy T, a jeden liofilizowany szczep został dostarczony przez dostawcę C. Wszystkie szczepy LAB przechowywano w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia. Inny szczep bakteryjny (Limosilactobacillus reuteri) uzyskano z -80 °C zasoby laboratorium Mikrobiologii Żywności i Biotechnologii na North Carolina A&amp;Poddano również ocenie T State University.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Standardowa pożywka fermentacyjna L. MRS
	<ol>
		<li>Przygotować pożywkę deMana, Rogosy i Sharpe’a (MRS), całkowicie rozpuszczając 55 g MRS oraz 0,5 g L-cysteiny w 1 l wody dejonizowanej (DW).</li>
		<li>Do probówek odmierzyć odpowiednio 7 ml i 2 ml przygotowanego roztworu MRS, a następnie wysterylizować w autoklawie przy 121 °C przez 15 min, a następnie schłodzić w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>pożywka agarowa MRS
	<ol>
		<li>Przygotować podłoże agarowe MRS, całkowicie rozpuszczając 55 g MRS oraz 0,5 g L-cysteiny w 1 l wody destylowanej (DW). Dodać agar w proszku (15 g) i wysterylizować podłoże agarowe w 121 °C przez 15 min, a następnie schłodzić w kąpieli wodnej.</li>
		<li>Wlać wszystkie świeżo przygotowane pożywki do sterylnych szalek Petriego i przechowywać je w temperaturze 4 °C do czasu dalszego zapotrzebowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>modyfikowane wzbogacone podłoże klostrydyjne z pirogronianem (mRCM-PYR)
	<ol>
		<li>Optymalizacja wzbogaconej pożywki dla bakterii rodzaju Clostridium zgodnie z metodą Oyeniran i współpracowników.13 oraz Nwamaioha i Ibrahim18, w celu selektywnego i dokładnego zliczania L. bulgaricus poprzez rozpuszczenie 10 g peptonu nr 3, 10 g ekstraktu wołowego, 5 g ekstraktu drożdżowego, 5 g chlorku sodu, 3 g octanu sodu oraz 2 g fosforanu potasu dwuzasadowego, 0,1 g uracylu, 0,25 g chlorku wapnia, 5 g dekstrozy, 5 g fruktozy, 10 g maltozy, 2 g pirogronianu sodu, 0,2% Tween 80 oraz 0,5 g L-cysteiny w 1 l wody destylowanej.</li>
		<li>Przed dodaniem 0,008% błękitu anilinowego i 15 g agaru, skoryguj końcowe pH roztworu do wartości 6,0 ± 0,2, używając 6 N HCl. Autoklawuj pożywkę w 121 °C przez 15 min schładzać w łaźni wodnej, a następnie przelać do sterylnych szalek Petriego. Wszystkie świeżo przygotowane pożywki przechowywać w sterylnych szalkach Petriego w 4 °C do czasu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kriokonserwacja kultur bakterii kwasu mlekowego w glicerolu
	<ol>
		<li>Przygotować zapasy w glicerolu (50% glicerol), rozcieńczając 100% glicerol w takiej samej objętości wody destylowanej (DW) i wysterylizować w 100 °C przez 30 min, stosując cykl sterylizacji suchej. Schodzić próbki glicerolu do temperatury pokojowej i przechowywać je aseptycznie do późniejszego użycia.</li>
		<li>Wykorzystaj wzrost bakterii (pojedynczą kolonię L. bulgaricus uzyskanego z nocnych kultur (zgodnie z opracowanym protokołem kontroli jakości).</li>
		<li>Pipeta 500 µL nocnych kultur do 50% glicerolu w probówce do wirowania o pojemności 2 ml i delikatnie wymieszać. Zamrozić i przechowywać banki glicerolowe zawierające kultury LAB w temperaturze ultraniskiej wynoszącej -80 °C do czasu użycia. 
		UWAGA: Graficzny schemat protokołu kontroli jakości i aktywacji kultur LAB przedstawiono w Rycina 1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nie</td>
			<td>Kod produktu</td>
			<td>Próbka</td>
			<td>Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.</td>
			<td>Skład bakteryjny zgodnie z oznaczeniami1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>S9</td>
			<td>Czysty szczep przemysłowy</td>
			<td>Bułgaria</td>
			<td>*Lb. bulgaricus*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>LB6</td>
			<td>Czysty szczep przemysłowy</td>
			<td>Bułgaria</td>
			<td>Lb. bulgaricus,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>ATCC 11842</td>
			<td>Czysty szczep przemysłowy</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>*Lb. bulgaricus*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>cyfrowa stacja robocza dźwięku</td>
			<td>Jogurt</td>
			<td>USA</td>
			<td>*Lb. bulgaricus*, inne hodowle żywe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>E22</td>
			<td>Jogurt</td>
			<td>USA</td>
			<td>Lb. bulgaricus, inne żywe kultury</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>Reuteri</td>
			<td>Jogurt</td>
			<td>USA</td>
			<td>Limosilactobacillus reuteri</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">1Lb. = Lactobacillus</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Szczepy probiotyczne.W tabeli wymieniono szczepy probiotyczne wykorzystane w niniejszym badaniu.
2. Protokół aktywacji i kontroli jakości kultur LAB
<ol>
	<li>Wyjmij przygotowane zapasy glicerolowe szczepów LAB (w probówkach do wirówki o pojemności 2 mL) z zamrażarki ultra-low o temperaturze -80 °C i nie dopuszczaj do ich rozmrożenia przed użyciem.</li>
	<li>Oczyść i zdezynfekuj otwór probówek do wirówki 70% alkoholem, a następnie delikatnie wymieszaj na wortexie przed użyciem.</li>
	<li>Pipetuj około 250 µL (0,25 mL) kultury zapasowej LAB z probówek do wirówki do świeżych probówek MRS o pojemności 2 mL.</li>
	<li>Delikatnie wymieszaj na wortexie, zabezpiecz probówki parafilmem i inkubuj beztlenowo przez noc w temperaturze 42 °C przez 12-16 h.</li>
	<li>Przenieś około 500 µL (0,5 mL) z kultur hodowanych przez noc z probówek MRS 2 mL do świeżych probówek MRS 7 mL, wymieszaj na wortexie i inkubuj beztlenowo przez noc w temperaturze 42 °C przez 12-16 h.</li>
	<li>Oceń wzrost mikroorganizmów, mierząc gęstość optyczną (OD) lub przyrost kultur przy 610 nm za pomocą spektrofotometru UV-Vis i zapisz akceptowalne wyniki w zakresie od 0,7 do 0,9.</li>
	<li>Wysej kultury nocne z probówek MRS 7 mL na płytki agarowe MRS oraz MRCM-PYR i inkubuj je beztlenowo przez 72 h w temperaturze 42 °C.</li>
	<li>Wybierz izolowane kolonie z płytek agarowych, przenieś je do świeżych probówek MRS 7 mL, delikatnie wymieszaj na wortexie i inkubuj beztlenowo przez noc w temperaturze 42 °C przez 12-16 h.</li>
	<li>Przechowuj płytki agarowe zawierające izolowane szczepy w lodówce w temperaturze 4 °C przez tydzień.</li>
	<li>Zmierz i potwierdź OD (między 0,7 a 0,9) kultur LAB izolowanych z wysejanych płytek w probówkach MRS 7 mL przy 610 nm i wykorzystaj je jako kultury robocze we wszystkich powiązanych eksperymentach.</li>
	<li>Wykonaj dziesięciokrotne rozcieńczenia (rozcieńczenia seryjne) wyhodowanych kultur LAB z końcowych probówek MRS 7 mL, używając 9 mL wody peptonowej (buforu fizjologicznego), aby uzyskać stosunek 1:10.</li>
	<li>Na koniec pobierz około 250 µL (0,25 mL) z odpowiednich rozcieńczeń seryjnych do wszystkich eksperymentów fermentacyjnych.</li>
	<li>Aktywuj pożywkę zawierającą szczepy (250 µL) z kroku 2.12, przenosząc je do świeżej pożywki MRS 7 mL i inkubując beztlenowo w temperaturze 42 °C przez 16 h.</li>
	<li>Kontynuuj, powtarzając kroki 2.6-2.12, aby zapewnić żywotność i optymalny wzrost komórek kultur LAB. 
	UWAGA: Wszystkie szczepy L. bulgaricus aktywowano w świeżo przygotowanej pożywce MRS, a następnie inkubowano beztlenowo w temperaturze 42 °C przez 16 h, aby osiągnąć gęstość optyczną (OD610 nm) wzrostu bakterii w zakresie od 0,7 do 0,9. Wzrost bakterii mierzono spektrofotometrem UV-Vis przy 610 nm. Wartości pH kultur nocnych mieściły się w zakresie od 3,5 do 5,3 w wyniku produkcji kwasu mlekowego, organicznego produktu końcowego fermentacji LAB. Przestrzegano procedur bezpieczeństwa, takich jak właściwa cyrkulacja powietrza w dygestorium biologicznym oraz unikanie oparzeń podczas korzystania z palnika Bunsena.</li>
</ol>
<img alt="Schemat procesu hodowli bakterii kwasu mlekowego, obejmujący inkubację, rozcieńczanie i pomiar gęstości optycznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63314/63314fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat graficzny protokołu aktywacji kultur bakterii kwasu mlekowego (LAB). Schemat przedstawia szczegóły oraz podstawowe instrumenty niezbędne do obsługi i aktywacji szczepów kultur LAB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63314/63314fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<ol><li>Karakas-Sen, A., Karakas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+identification+and+technological+properties+of+lactic+acid+bacteria+from+raw+cow+milk%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Journal%22%5BJournal%5D)">Isolation, identification and technological properties of lactic acid bacteria from raw cow milk.</a> Bioscience Journal. 34 (2), 385-399 (2018).</li>
<li>Martin, R., Langella, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+health+concepts+in+the+probiotics+field%3A+Streamlining+the+definitions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Emerging health concepts in the probiotics field: Streamlining the definitions.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1047(2019).</li>
<li>Sadishkumar, V., Jeevaratnam, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+probiotic+evaluation+of+potential+antioxidant+lactic+acid+bacteria+isolated+from+idli+batter+fermented+with+Piper+betle+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Food+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">In vitro probiotic evaluation of potential antioxidant lactic acid bacteria isolated from idli batter fermented with Piper betle leaves.</a> International Journal of Food Science & Technology. 52 (2), 329-340 (2017).</li>
<li>Ayivi, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactic+acid+bacteria%3A+Food+safety+and+human+health+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Dairy%22%5BJournal%5D)">Lactic acid bacteria: Food safety and human health applications.</a> Dairy. 1 (3), 202-232 (2020).</li>
<li>Quinto, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotic+lactic+acid+bacteria%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Nutrition+Sciences%22%5BJournal%5D)">Probiotic lactic acid bacteria: A review.</a> Food and Nutrition Sciences. 5 (18), 1765-1775 (2014).</li>
<li>Hayek, S. A., Gyawali, R., Aljaloud, S. O., Krastanov, A., Ibrahim, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+media+for+lactic+acid+bacteria+used+in+dairy+products%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Research%22%5BJournal%5D)">Cultivation media for lactic acid bacteria used in dairy products.</a> Journal of Dairy Research. 86 (4), 490-502 (2019).</li>
<li>Bintsis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactic+acid+bacteria+as+starter+cultures%3A+An+update+in+their+metabolism+and+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Aims+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Lactic acid bacteria as starter cultures: An update in their metabolism and genetics.</a> Aims Microbiology. 4, 665-684 (2018).</li>
<li>Shao, Y., Gao, S., Guo, H., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+culture+conditions+and+preconditioning+on+survival+of+Lactobacillus+delbrueckii+subspecies+bulgaricus+ND02+during+lyophilization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Influence of culture conditions and preconditioning on survival of Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus ND02 during lyophilization.</a> Journal of Dairy Science. 97 (3), 1270-1280 (2014).</li>
<li>Aryana, K. J., Olson, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+100-year+review%3A+Yogurt+and+other+cultured+dairy+products%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">A 100-year review: Yogurt and other cultured dairy products.</a> Journal of Dairy Science. 100 (12), 9987-10013 (2017).</li>
<li>Kandil, S., El Soda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+freezing+and+freeze-drying+on+intracellular+enzymatic+activity+and+autolytic+properties+of+some+lactic+acid+bacterial+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Influence of freezing and freeze-drying on intracellular enzymatic activity and autolytic properties of some lactic acid bacterial strains.</a> Advances in Microbiology. 5 (6), 371-382 (2015).</li>
<li>Malairuang, K., Krajang, M., Sukna, J., Rattanapradit, K., Chamsart, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+cell+density+cultivation+of+Saccharomyces+cerevisiae+with+intensive+multiple+sequential+batches+together+with+a+novel+technique+of+fed-batch+at+cell+level+%28FBC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Processes%22%5BJournal%5D)">High cell density cultivation of Saccharomyces cerevisiae with intensive multiple sequential batches together with a novel technique of fed-batch at cell level (FBC).</a> Processes. 8 (10), 1321(2020).</li>
<li>Jeanson, S., Floury, J., Gagnaire, V., Lortal, S., Thierry, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+colonies+in+solid+media+and+foods%3A+A+review+on+their+growth+and+interactions+with+the+micro-environment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial colonies in solid media and foods: A review on their growth and interactions with the micro-environment.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 1284(2015).</li>
<li>Oyeniran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+reinforced+clostridial+medium+for+the+isolation+and+enumeration+of+Lactobacillus+delbrueckii+ssp.+bulgaricus+in+a+mixed+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">A modified reinforced clostridial medium for the isolation and enumeration of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus in a mixed culture.</a> Journal of Dairy Science. 103, 5030-5042 (2020).</li>
<li>Iguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+repeated+subculturing+and+prolonged+storage+at+room+temperature+of+Enterohemorrhagic+Escherichia+coli+O157%3A+H7+on+pulsed-field+gel+electrophoresis+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Effects of repeated subculturing and prolonged storage at room temperature of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157: H7 on pulsed-field gel electrophoresis profiles.</a> Journal of Clinical Microbiology. 40 (8), 3079-3081 (2002).</li>
<li>Hayek, S. A., Ibrahim, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+limitations+and+challenges+with+lactic+acid+bacteria%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Nutrition+Sciences%22%5BJournal%5D)">Current limitations and challenges with lactic acid bacteria: a review.</a> Food and Nutrition Sciences. 4 (11), 73-87 (2013).</li>
<li>Ahmed, S. A., Ibrahim, S. A., Kim, C., Shahbazi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+bile+salt+tolerant+Lactobacillus+reuteri%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+2007+National+Conference+on+Environmental+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Significance of bile salt tolerant Lactobacillus reuteri.</a> Proceedings of the 2007 National Conference on Environmental Science and Technology. , Springr, NY. 17-23 (2009).</li>
<li>Gyawali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+extraction+techniques+for+maximum+recovery+of+%CE%B2-galactosidase+from+the+yogurt+bacterium+Lactobacillus+delbrueckii+ssp.+bulgaricus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Research%22%5BJournal%5D)">A comparative study of extraction techniques for maximum recovery of β-galactosidase from the yogurt bacterium Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus.</a> Journal of Dairy Research. 87 (1), 123-126 (2020).</li>
<li>Nwamaioha, N. O., Ibrahim, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+selective+medium+for+the+enumeration+and+differentiation+of+Lactobacillus+delbrueckii+ssp.+bulgaricus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">A selective medium for the enumeration and differentiation of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus.</a> Journal of Dairy Science. 101 (6), 4953-4961 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wyniki wszystkich szczepów ocenianych za pomocą protokołu kontroli jakości i bez użycia protokołu były takie same, w związku z czym przedstawiono wyniki powiązane tylko ze szczepami (S9 i LB6). Aktywowane szczepy LAB miały lepszy wzrost komórek, który charakteryzował się wysoką intensywnością biomasy komórkowej, powodując w ten sposób mętny wygląd bulionu fermentacyjnego MRS w probówce11. Obserwowany wzrost komórek po aktywacji hodowli był widoczny między 12 a 16 godzinami w temperaturze fermentac...

Bakterie kwasu mlekowego (LAB) to grupa wyjątkowo zróżnicowanych bakterii, które mają potencjał przemysłowy. Szczepy należące do Lactobacillus delbreuckii subsp. bulgaricus i Streptococcus thermophilus są najczęściej używane jako mleczne kultury starterowe dla fermentowanych produktów mlecznych, takich jak jogurt1. Wybrane szczepy LAB są również klasyfikowane jako probiotyki, ponieważ przynoszą korzyści zdrowotne ludziom, gdy dawki są odpowiednio podawane2. Bakterie kwasu mlekowego są również mikroorganizmami Gram-dodatnimi, nietworzącymi przetrwalników, nieoddychającymi, ale tolerancyjnymi aerotolerancyjnie, które ogólnie charakteryzują się wytwarzaniem kwasu mlekowego jako kluczowego produktu fermentacji. LAB syntetyzuje również niezbędne metabolity, na przykład kwasy organiczne, bakteriocyny i inne związki przeciwdrobnoustrojowe3, które mogą hamować szerokie spektrum patogenów przenoszonych przez żywność4. Kwas mlekowy, główny produkt końcowy katabolizmu węglowodanów i produkt uboczny fermentacji LAB, jest metabolitem organicznym, który ma właściwości przeciwdrobnoustrojowe i jest potencjalnie przydatny do zastosowań związanych z biologiczną konserwacją żywności3,5,6. Ponadto kwasy organiczne wytwarzane przez LAB nadają smak, konsystencję i aromat żywności, zwiększając w ten sposób jej ogólne właściwości organoleptyczne5,6. Odmienne wymagania żywieniowe LAB w połączeniu z ich wszechobecną naturą ostatecznie umożliwiają bakteriom łatwy rozwój w różnych środowiskach, takich jak żywność na bazie nabiału, żywność fermentowana, warzywa, a także w ludzkim gut7.
Istnieje rosnące zapotrzebowanie na kultury starterowe od LAB do produkcji jogurtów i wielu różnorodnych zastosowań w mleczarstwie8,9, dlatego należy przestrzegać krytycznej uwagi i ustalonych technik naukowych, zarówno w hodowli szczepów LAB, jak również w aktywacji zarówno liofilizowanych, jak i izolowanych szczepów, ponieważ ta aktywność jest niezbędna dla zwiększenia wydajności fermentacji. W związku z tym Laboratorium Mikrobiologii i Biotechnologii Żywności aktywnie angażuje się w odpowiedni rozwój technologii ukierunkowanej na aktywację, lepszy wzrost i fermentację charakterystyczną dla szczepów LAB wyizolowanych ze sfermentowanych produktów mlecznych, a także z przemysłowych kultur starterowych stosowanych do produkcji jogurtów. Ponadto warto zauważyć, że szczepy hodowlane LAB produkowane przemysłowo poddawane są czynnościom konserwującym, takim jak liofilizacja i przechowywanie w zamrażarce, powodując stres i uszkodzenie komórek w wyniku procesu szoku zimna, któremu są poddawane 10. W celu ograniczenia wyzwań związanych z żywotnością i poprawy funkcjonalności szczepów LAB uzyskanych zarówno z izolowanych produktów spożywczych, jak i produktów liofilizowanych, ważne jest, aby odpowiednio aktywować te kultury jako formę kontroli jakości w celu zwiększenia ich charakterystyki fermentacyjnej8. Celem tego badania było opracowanie wewnętrznego protokołu kontroli jakości dla aktywacji i wzrostu szczepów hodowlanych L. delbrueckii subsp. bulgaricus, który ostatecznie promował żywotny wzrost LAB, a także poprawiał wydajność fermentacji i funkcjonalność metaboliczną szczepów LAB. Protokół ten może ostatecznie zostać dostosowany (przy użyciu optymalnych pożywek wzrostowych i odpowiednich warunków hodowli) do uprawy innych szczepów LAB do badań fermentacyjnych, a także do celów przemysłowych lub operacji bioprzetwarzania. Ten protokół aktywacji i kontroli jakości LAB zapewni zatem uzyskanie doskonałych, żywotnych kultur starterowych bydła mlecznego, które będą potencjalnie funkcjonalne dla różnych zastosowań w globalnym przemyśle mleczarskim i spożywczym.

<table><tbody><tr><td>Aniline Blue</td><td>Thermo Scientific</td><td>R21526</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Ekstrakt z wołowiny</td><td>Research Products International</td><td>50-197-7509</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Dekstroza bezwodna</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP350500</td><td>500 gramów</td></tr><tr><td>D-fruktoza</td><td>ACROS Organics</td><td>AC161355000</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Agar Difco w proszku Difco</td><td></td><td>DF0812-07-1</td><td>2 kg</td></tr><tr><td>agaru TPY</td><td>Difco</td><td>211921</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek Eppendorf (Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-12</td><td>2 mL</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI17904</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Inkubator CO2 na podczerwień</td><td>Forma Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus</td><td>Kolekcja kultur typu amerykańskiego (ATCC)</td><td>ATCC 11842</td><td></td></tr><tr><td>Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus</td><td>Bułgaria</td><td>S9</td><td></td></tr><tr><td>Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus</td><td>Bułgaria</td><td>LB6</td><td></td></tr><tr><td>Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus</td><td>Laboratorium Mikrobiologii i Biotechnologii Żywności (NCATSU)</td><td>DAW</td><td></td></tr><tr><td>Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus</td><td>Laboratorium Mikrobiologii i Biotechnologii Żywności (NCATSU)</td><td>E22</td><td></td></tr><tr><td>Limosilactobacillus reuteri</td><td>Biogai, Raleigh / Laboratorium Mikrobiologii i Biotechnologii Żywności (NCATSU)</td><td>RD2</td><td></td></tr><tr><td>Jednowodny chlorowodorek L-cysteiny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6852-25G</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Monohydrat maltozy</td><td>Fisher Scientific</td><td>M75-100</td><td>100 g</td></tr><tr><td>bulion MRS</td><td>Neogen</td><td>50-201-5691</td><td>5 kg</td></tr><tr><td>Pepton nr 3</td><td>Hach</td><td>50-199-6719</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy (K2HPO4)</td><td>Research Products International</td><td>50-712-761</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Octan sodu trójwodny</td><td>Fisher Scientific</td><td>S220-1</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP356-100</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Probówki z gumowymi nakrętkami</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB70125150</td><td>25 x 150 mm</td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Fisher Scientific</td><td>T164-500</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Ultra niska zamrażarka</td><td>So-Low</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>ACROS Organics</td><td>AC157301000</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV w zakresie widzialnym</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Evolution 201</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>T08204K7</td><td>4 L</td></tr><tr><td>Kwas solny (6N (certyfikowany), Fisher Chemical)</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; SA56-500</td><td>500 ml</td></tr></tbody></table>

uprawa, wzrost i żywotność bakterii kwasu mlekowego: perspektywa kontroli jakości

The Cultivation, Growth, and Viability of Lactic Acid Bacteria: A Quality Control Perspective

Bakterie kwasu mlekowego (LAB) są niezbędnymi kulturami starterowymi bydła mlecznego, które są wykorzystywane do produkcji fermentowanych produktów mlecznych, takich jak jogurt i ser. LAB wytwarza głównie kwas mlekowy jako główny produkt końcowy fermentacji i syntetyzuje ważne metabolity, które nadają właściwości organoleptyczne fermentowanym produktom spożywczym. LAB to wybredne bakterie, które rozwijają się w wielu środowiskach, gdy spełnione są odpowiednie wymagania żywieniowe. Zapotrzebowanie na najwyższej jakości mleczne kultury starterowe LAB do zastosowań fermentacyjnych w przemyśle spożywczym i mleczarskim spowodowało potrzebę zapewnienia żywotnych i aktywnych kultur dla wszystkich operacji bioprzetwórczych. Opracowanie standardowego protokołu zapewniającego rentowność i zwiększoną funkcjonalność kultur laboratoryjnych w środowisku laboratoryjnym, a także w środowisku przetwórstwa mleczarskiego ma zatem bardzo duże znaczenie. W rozwiązywaniu problemów związanych z reanimacją słabych, zestresowanych i uszkodzonych komórek hodowlanych LAB, niezwykle ważny jest protokół, który w żywy sposób przedstawia istotne kroki w celu odzyskania zdrowia, poprawy regeneracji komórek i poprawy funkcjonalności metabolicznej szczepów LAB. Utrzymanie czystości, funkcjonalności i żywotności kultur starterowych LAB jest również krytyczne. W związku z tym, przestrzeganie unikalnych wytycznych protokołu spowoduje promowanie wydajności fermentacji dla wielu szczepów LAB dedykowanych do fermentacji i procesów biotechnologicznych. W rezultacie, Laboratorium Mikrobiologii i Biotechnologii Żywności na Uniwersytecie Stanowym Rolnictwa i Techniki Północnej Karoliny opracowało standardowy protokół aktywacji i kontroli jakości wybranych szczepów LAB, który zaowocował wysoce funkcjonalnymi i żywotnymi szczepami hodowlanymi LAB stosowanymi do badań nad fermentacją. Adaptacja i zalecenie takiego protokołu do stosowania w przemyśle mleczarskim i spożywczym pomoże zapewnić żywotność i funkcjonalność LAB w wielu zastosowaniach.

Wzrost komórkowy ocenianych szczepów LAB hodowanych zgodnie z protokołem kontroli jakości różnił się znacząco (P &lt; 0,05) od wzrostu szczepów hodowanych bez zastosowania tego standardowego protokołu. Protokół QC dla obu gatunków, L. bulgaricus oraz L. reuteri, wykorzystywał podejście wielokrotnego pasażowania (trzykrotne pasażowanie przed wysianiem na płytki agarowe), podczas gdy w procedurze kontrolnej pasażowanie wykonano tylko raz, przy zachowaniu wszystkich pozostałych warunków jako stałych. Wzros...

Ocena jakości kultur bakterii kwasu mlekowego (LAB) została potwierdzona jako skuteczny sposób na zwiększenie żywotności i funkcjonalności szczepów LAB do procedur fermentacji. Aby poprzeć to twierdzenie, opracowaliśmy protokół, który wyjaśnia, w jaki sposób kultury LAB są aktywowane i hodowane do procesów fermentacji i bioprzetwarzania.

Uprawa, wzrost i żywotność bakterii kwasu mlekowego: perspektywa kontroli jakości

Lactic acid bacteria (LAB) are essential dairy starter cultures that are significantly employed for the manufacture of fermented dairy products such as ...

Nasz protokół jest istotny, ponieważ zapewnia czystość jako kontrolę jakości. Sprzyja również ciężkiej wydajności fermentacji i spójności plonu w fermentacji bakterii kwasu mlekowego. Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona zwiększyć wydajność fermentacji bakterii kwasu mlekowego poprzez czystość komórek, żywotność i funkcjonalność.Ta technika jest przyjazna dla użytkownika i może być łatwo wykonana przez każdą osobę dzięki użyciu tylko podstawowego sprzętu bez wielu wymagań technicznych. Philip Yeboah jest naszym asystentem naukowym i zademonstruje procedurę. Na początek weź przygotowany zapas glicerolu bakterii kwasu mlekowego lub szczepów LAB w dwóch mililitrowych probówkach wirówkowych z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Nie pozwól im się rozmrozić przed użyciem. Wyczyść i zdezynfekuj otwór probówek wirówkowych 70% alkoholem i delikatnie przemieszaj przed użyciem. Odpipetować około 250 mikrolitrów podstawowej kultury laboratoryjnej z probówek wirówkowych do świeżych dwumililitrowych probówek MRS.Delikatnie zawiruj probówki, sfoliuj je i inkubuj beztlenowo przez noc w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 12 do 16 godzin. Następnie weź około 500 mikrolitrów z kultur wyhodowanych przez noc z dwóch mililitrowych probówek MRS do świeżych siedmiomililitrowych probówek MRS, wiruj je i inkubuj beztlenowo przez noc w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 12 do 16 godzin. Ocenić wzrost drobnoustrojów, mierząc gęstość optyczną lub wzrost kultur przy 610 nanometrach za pomocą spektrofotometru UV i zapisać akceptowalne wyniki w zakresie od 0,7 do 0,9.Przenieś nocne kultury z siedmiomililitrowych probówek MRS na płytki agarowe MRS i MRCMPYR i inkubuj je beztlenowo przez 72 godziny w temperaturze 42 stopni Celsjusza. Wybierz izolowane kolonie z płytek agarowych, przenieś je do świeżych siedmiomililitrowych probówek MRS, delikatnie wiruj i inkubuj beztlenowo przez noc w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 12 do 16 godzin. Przechowuj płytki agarowe zawierające wyizolowane szczepy w temperaturze czterech stopni Celsjusza w lodówce przez tydzień.Następnie zmierz i potwierdź gęstość optyczną z siedmiomililitrowych probówek MRS kultur LAB wyizolowanych z płytek smugowych o długości 610 nanometrów i użyj ich jako kultur roboczych we wszystkich powiązanych eksperymentach. Użyj dziewięciu mililitrów wody peptonowej, aby wykonać dziesięciokrotne zanieczyszczenie wyhodowanych kultur LAB z ostatnich siedmiu mililitrowych probówek MRS, aby uzyskać stosunek 1 do 10. Weź około 250 mikrolitrów z odpowiednich urojeń seryjnych do wszystkich eksperymentów fermentacyjnych i aktywuj bulion zawierający szczepy, przenosząc je do świeżego siedmiomililitrowego bulionu MRS i inkubując je beztlenowo w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 16 godzin.Powtórz kroki, aby zapewnić żywotny i doskonały wzrost komórek z kultur LAB. Przedstawiono morfologię wzrostu komórek szczepów S9 i LB6 Lactobacillus bulgaricus hodowanych zgodnie z protokołem kontroli jakości oraz szczepów S9 lactobacillus bulgaricus hodowanych bez protokołu kontroli jakości. Szczepy przeprowadzono w trzech powtórzeniach i inkubowano beztlenowo w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 72 godziny.Próbując wykonać tę procedurę, należy zdezynfekować probówki z kulturami wyjściowymi z zamrażarki 70% alkoholem, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu. Pomiar gęstości optycznej kultur wzrostu powinien zawsze mieścić się w zakresie od 0,7 do 0,9. Zgodnie z tym protokołem można osiągnąć wydajne fermentacje LAB lub operacje bioprzetwarzania z doskonałym wykorzystaniem kultur.

the-cultivation-growth-viability-lactic-acid-bacteria-quality-control

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Źródło: Ayivi, R. i in., Uprawa, wzrost i żywotność bakterii kwasu mlekowego: perspektywa kontroli jakości. J. Vis. Exp. (2022)Ten film przedstawia metodę odzyskiwania bakterii kwasu mlekowego zestresowanych zimnem z zamrożonego zapasu glicerolu, przywracania żywotności bakterii poprzez inkubację beztlenową i izolowania aktywnych kolonii w celu ekspansji kultur.

Odrodzenie i wzrost bakterii kwasu mlekowego

Opisano protokół produkcji na małą skalę probiotycznego fermentowanego napoju mlecznego z pomocą nowatorskiej bakteryjnej kultury starterowej.

Nowoczesny protokół produkcji w celu małoskalowego wytwarzania fermentowanych żywności probiotycznej

Ilościowa ocena wzrostu bakterii jest niezbędna do zrozumienia fizjologii drobnoustrojów jako zjawiska na poziomie systemu. Wprowadzono protokół manipulacji eksperymentalnej i podejście analityczne, pozwalające na precyzyjną, wysokoprzepustową analizę wzrostu bakterii, który jest kluczowym przedmiotem zainteresowania biologii systemów.

Precyzyjna, wysokoprzepustowa analiza wzrostu bakterii

Ponieważ organizmy beztlenowe nie są w stanie rosnąć po ekspozycji na tlen, niezbędne jest stosowanie technik hodowli beztlenowej. W tym miejscu demonstrujemy prostą i skuteczną metodę uprawy mieszanej kultury pochodzącej z biogazowni, od przygotowania pożywki do ilościowego oznaczania gazu i lotnych kwasów tłuszczowych.

Pożywka Preparat do hodowli mikroorganizmów w warunkach ściśle beztlenowych/beztlenowych

Ten protokół szczegółowo opisuje etapy związane z produkcją i charakterystyką fizykochemiczną suszonego rozpyłowo produktu probiotycznego.

Opracowanie procesu suszenia rozpyłowego bakterii probiotycznych i ocena jakości produktu

Protokół przedstawia dwie metodologie poprawy izolacji beztlenowych bakterii jelitowych. Pierwszy z nich koncentruje się na izolacji różnych bakterii przy użyciu różnych pożywek hodowlanych. Drugi koncentruje się na etapach uprawy określonej grupy drobnoustrojów, ewentualnie asymilując mio-inozytol, aby w pełni zrozumieć jego znaczenie ekologiczne.

Strategie mające na celu poprawę hodowli bakterii beztlenowych z przewodu pokarmowego kurczaka

Ten protokół przedstawia standardowy przepływ wysokowydajnego przesiewania dla mikroorganizmów przemysłowych. Obejmuje ono konstruowanie biblioteki mutantów poprzez mutagenezę ARTP, przeprowadzanie pozytywnego przesiewania kropel za pomocą zautomatyzowanych mikrofluidów i następnie weryfikację wyników. Niezawodność przepływu została zweryfikowana poprzez przesiewanie wysokowydajnych szczepów B. coagulans.

Przesiewowe badanie wysokowydajne mutantów Bacillus coagulans hiperprodukujących kwas L-mlekowy za pomocą zautomatyzowanej platformy mikrofluidycznej kroplowej

Oznaczanie liczby komórek w hodowli jest istotne dla standaryzacji warunków hodowli oraz przeprowadzania dokładnych eksperymentów ilościowych. W tym filmie demonstrujemy sposób zliczania komórek przy użyciu hemacytometru.

Liczenie i określanie żywotności hodowli komórkowych

Prezentujemy zastosowanie mikromacierzy DNA w profilowaniu ekspresji układu nerwowego. Opisujemy kontrolę jakości RNA, znakowanie próbek oraz hybrydyzację i skanowanie macierzy.

Mikromacierze DNA: kontrola jakości próbek, hybrydyzacja i skanowanie macierzy

Niniejszy protokół opisuje sposób wykonywania testów żywotności komórek oraz ekspresji fluorescencji przy użyciu cytometru obrazowego Tali.

Ocena ekspresji GFP i żywotności z wykorzystaniem cytometru obrazowego Tali

Poznaj protokół uprawy bakterii kwasu mlekowego w celu kontroli jakości i zwiększenia żywotności komórek. Ta metoda poprawia wydajność fermentacji mikroorganizmów.

Uprawa, wzrost i żywotność bakterii kwasu mlekowego: perspektywa kontroli jakości

Przeglądaj więcej filmów