Name: Organoidy jelitowe psów w dwukomorowym przepuszczalnym systemie nośnym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Poznaj metodę hodowli organoidów jelitowych psów w dwukomorowym systemie nośnym. Technologia ta poprawia niezawodność prognozowania przepuszczalności leków w badaniach biomedycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy wyrazić wdzięczność pracownikom Weterynaryjnego Laboratorium Diagnostycznego Uniwersytetu Stanowego Iowa, a mianowicie Haley Lambert, Emily Rahe, Rosalyn Branaman, Victorii Green i Jennifer Groeltz-Thrush, za terminowe przetwarzanie próbek. Chcielibyśmy również podziękować Jodi Smith i Bethann Valentine za dostarczenie materiału do eksperymentów z przepuszczalnością. Chcemy również podziękować Davidowi Diazowi-Reganonowi za jego pomoc przy rysunku 9. Z wyjątkiem rysunku 6, wszystkie figury zostały stworzone w BioRender.com. Autorzy pragną podziękować za wsparcie ze strony Faculty Startup, ISU VPR Miller Award, ISU VPR Miller Award oraz podnagrody NSF SBIR dla ISU # 1912948.

K. Allenspach jest współzałożycielem LifEngine Animal Health i 3D Health Solutions. Pełni funkcję konsultanta w Ceva Animal Health, Bioiberica, LifeDiagnostics, Antech Diagnostics, Deerland Probiotics i Mars. J.P. Mochel jest współzałożycielem LifEngine Animal Health i 3D Health Solutions oraz pełni funkcję konsultanta w Ceva Animal Health i Ethos Animal Health. Ten artykuł odzwierciedla poglądy autorów i nie powinien być interpretowany jako reprezentujący poparcie, pogląd lub politykę Agencji ds. Żywności i Leków. Pozostali autorzy nie mają do zadeklarowania żadnego konfliktu interesów.

Kultury organoidów jelitowych psów w aparaturze z przepuszczalnym podłożem stanowią unikalną koncepcję łączącą tradycyjne testy przepuszczalności leków40 z nowatorskim modelem psim in vitro41. W zależności od celu eksperymentu można stosować i oceniać różne typy organoidów jelitowych psów, wprowadzając minimalne korekty. Zaleca się testowanie wielu stężeń badanego leku w 3-4 dołkach na grupę. Stężenia mogą być oparte na przewidywanym stężeniu leku w jelitach. Ponadto wykorzystanie wcześniejszych badań może pomóc w ustaleniu odpowiednich punktów czasowych dla projektu badania. Należy sporządzić właściwą dokumentację projektu badania, aby zwiększyć powtarzalność i ułatwić rozwiązywanie problemów.
Ta technologia posiada kilka ograniczeń wynikających z nowości metody42, głównie ze względu na brak standaryzacji w projekcie eksperymentalnym i wykonaniu protokołu w różnych laboratoriach. Brak standaryzacji został odnotowany przez inne grupy43, a Protokoły Monowarstw 3D Organoidów Psa pozwolą na uzyskanie odtwarzalności międzylaboratoryjnej i wprowadzą standaryzację do tego systemu. Ustandaryzowane podejścia do analizy danych poprawiają powtarzalność i mogą wzmocnić wyniki wstępnych testów leków z użyciem organoidów psich w systemie podpór przepuszczalnych w różnych laboratoriach. W psim modelu 3D organoidów brakuje również zestawów danych porównujących wartości in vitro Papp leków modelowych z ich znanym ludzkim lub psim wchłanianiem jelitowym in vivo, podobnie jak w przypadku komórek Caco-244,45,46. Po wygenerowaniu takich danych ten psi model organoidowy może zostać wykorzystany do oceny przepuszczalności jelitowej podczas opracowywania leków.
Kluczowe jest zachowanie ostrożności podczas wysiewania organoidów na przepuszczalny system podparcia, aby zapewnić wystarczająco wysoką gęstość odpowiednio dysocjowanych komórek. Wartości TEER systemu są bardziej wiarygodne i powtarzalne, gdy hodowla odbywa się w ścisłych monowarstwach. Przedłużona hodowla monowarstw może prowadzić do wykładniczego wzrostu wartości TEER, które oddalają się od fizjologicznych wartości jelita. Przekroje H&amp;E takich struktur 3D wykazują wówczas obecność kilku warstw komórek ułożonych jedna nad drugą, z przekształconą strukturą enterocytów w pobliżu błony.
Po pomyślnej ekspansji monowarstwy organoidów jelitowych psa, wyniki można analizować w ten sam sposób, co w tradycyjnych testach komórkowych 2D, obliczając współczynnik pozornej przepuszczalności leku (Papp) według wzoru44. Wartość Papp (patrz. równanie (2)) opisuje szybkość transportu przez monowarstwę komórkową47.
<img alt="Równanie Pappa dla przepuszczalności, przedstawiające tempo zmian i stężenie na symbolu matematycznym." src="/files/ftp_upload/63612/63612eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 2"> (2)
Wzór <img alt="Pochodna ładunku względem czasu, formuła: dQ/dt, koncepcja: analiza prądu elektrycznego." src="/files/ftp_upload/63612/63612eq03.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 3"> przedstawia początkowe nachylenie krzywej zależności stężenia od czasu (np. nmol/s). A to powierzchnia wkładki (cm2), a C0 to stężenie początkowe leku lub związku w komorze dawcy37. Wiarygodne rozpoznanie integralności monowarstwy jest kluczowym elementem testu przepuszczalności, który wymaga standaryzacji. Aby ocenić organoidy psie w systemie wsparcia przepuszczalnego i pomóc w ustaleniu właściwego czasu przeprowadzenia eksperymentu, zaleca się zastosowanie mikroskopii świetlnej oraz pomiarów TEER. Dodatkowo, do funkcjonalnej oceny integralności monowarstwy organoidów można wykorzystać markery o zerowej przepuszczalności molekularnej (np. FITC-dextran, Lucifer yellow, PEG-400). Należy zachować ostrożność, jeśli testowany związek jest substratem dla transportera. Jako powszechny przykład pompy efluksowej wykorzystuje się glikoproteinę P (P-gp). Należy wyznaczyć współczynnik efluksu (Papp,BL-AP/Papp,AP-BL) i porównać go z dobrze znanym substratem sondy P-gp.
Mikroskopia świetlna (zwykła lub wzmocniona kontrastem fazowym) jest nieocenioną metodą sprawdzania integralności monowarstwy 2D lub 3D oraz wkładki filtra, przy jednoczesnej ocenie ewentualnego nadmiernego rozrostu komórek. Rysunek 7 może służyć jako pomoc w rozpoznawaniu zdrowych kultur komórek organoidów jelitowych psa. Wartości TEER stanowią istotny miernik tworzenia się połączeń międzykomórkowych oraz różnicowania kultur organoidów w nienaruszone nabłonki jelitowe. Psie organoidy jelitowe różnicują się w enterocyty i komórki kubkowe (Rysunek 6). Te komórki produkujące śluz umożliwiają badanie interakcji leków ze śluzem, co było trudne do osiągnięcia przy użyciu tradycyjnych kultur komórkowych 2D48. Obecność komórek enteroendokrynnych w psich organoidach jelitowych została wcześniej potwierdzona przez zespół Chandry i wsp.33.
Przedstawiono dalszą charakterystykę monowarstw organoidów psich pochodzących z organoidów jelita czczego, krętego i grubego z wykorzystaniem TEM. Obrazy TEM ukazują mikroarchitekturę komórkową, w tym tworzenie się połączeń ścisłych i mikrokosmków, co dodatkowo ilustruje złożoność i użyteczność tych modeli organoidowych w medycynie translacyjnej. Na podstawie wyników eksperymentalnych kultury organoidów na wsporniku przepuszczalnym były gotowe do eksperymentów między 11. a 13. dniem po wysiewaniu (Rysunek 9). Wartości TEER w tym punkcie czasowym mieściły się w zakresie od 1 500 do 2 500 Ω.cm2. Faza plateau wartości TEER trwa w bardzo ograniczonym oknie czasowym, w którym eksperyment musi zostać rozpoczęty przed powolnym spadkiem wartości TEER. Wartości TEER mogą być również kluczowym elementem prezentacji istotnych wyników eksperymentalnych, ponieważ niektóre leki lub substancje pomocnicze produktów leczniczych mogą oddziaływać na monowarstwę (np. na połączenia ścisłe), co może znacząco wpłynąć na odczyty wartości TEER. Sam ten parametr może służyć jako dane eksperymentalne.
Psie organoidy jelitowe w dwukomorowym aparacie do hodowli komórkowej mogą być stosowane w dziedzinach innych niż badanie przenikalności leków drogą doustną, dzięki unikalnej architekturze powstałej monowarstwy komórek. Mogą one być wykorzystywane na przykład w badaniach mikrobiologicznych (np. wpływ modyfikacji flory mikrobiologicznej przewodu pokarmowego), badaniach nad pobieraniem wirusów, interakcjach lek-lek oraz mechanizmami transportu leków49. Komorę dawczą wypełnia się zazwyczaj badanym lekiem lub wybranym związkiem, a z komory odbiorczej pobiera się aliquoty w różnych punktach czasowych. Alikwoty te można analizować za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej, spektrometrii mas, testu ELISA lub innych technik, aby określić ilość i szybkość przenikania substancji rozpuszczonej przez monowarstwę.
Badania te wymagają nienaruszonej warstwy jednowarstwowej w celu dokładnej oceny przepuszczalności leku. Zazwyczaj wiąże się to z hodowlą większej liczby warstw jednowarstwowych niż jest to konieczne, aby uwzględnić studzienki nieprzydatne do analizy. Jednowarstwy komórek organoidowych mogą być również wykorzystywane do pomiaru poboru wirusów z powierzchni apikalnej lub bazalnej, a odczyty obejmują testy immunofluorescencyjne z wykorzystaniem przeciwciał do wykrywania wewnątrzkomórkowego poboru wirusa. Wreszcie, do komory donora można wprowadzić wiele leków (np. substrat i inhibitor), aby zidentyfikować interakcje lek-lek oparte na transporterach.
Na podstawie aktualnych obserwacji metody te będą możliwe do zastosowania nie tylko w przypadku psich organoidów w insertach hodowlanych, ale będą również odpowiednie dla innych gatunków zwierząt weterynaryjnych i układów narządowych, przy niewielkich modyfikacjach niezbędnych do optymalnego dopasowania do wybranego gatunku lub modelu narządu. Protokoły wzrostu psich organoidów jelitowych musiały zostać dostosowane do unikalnych właściwości hodowli. W związku z tym protokół można dostosować do innego gatunku, co jednak będzie wymagało subtelnych zmian w procedurze. Modyfikacje mogą rozpocząć się od zmian gęstości wysiewu komórek i obejmować zmiany w składzie pożywki w celu prawidłowego zróżnicowania interesujących nas organoidów.
Standaryzacja, szczegółowa dokumentacja procedur eksperymentalnych oraz konsekwentne monitorowanie monowarstw komórkowych są kluczowymi praktykami niezbędnymi we wszystkich testach na podporach przepuszczalnych i nie ograniczają się jedynie do układu psiego. Dokumentowanie i raportowanie tych potencjalnych modyfikacji gatunkowych lub organowych jest krytyczne dla dalszego postępu w tej dziedzinie. Model ten posiada kilka ograniczeń, na przykład wymagania kosztowe, zmienność międzylaboratoryjną oraz ograniczone dane dotyczące zdolności do przewidywania wchłaniania jelitowego in vivo. Psy w niektórych przypadkach posiadają inne transportery leków i enzymy metabolizujące niż ludzie50.
Ponadto system organoidów psich musi zostać przetestowany na różnych innych aparatach dwukomorowych od innych producentów, aby określić przydatność takiego modelu (np. należy określić przydatność różnych składów membran filtracyjnych). Kolejną wadą jest to, że część rękopisu dotycząca eksperymentu nad przepuszczalnością leków jest mniej opisowa niż poprzednie części. Jest to spowodowane nadmiarem informacji w tej dziedzinie. Celem tej części rękopisu było opisanie tych metod w sposób modyfikowalny, bez pomijania kluczowych elementów tych eksperymentów. Bardziej szczegółowe informacje na temat eksperymentów nad przepuszczalnością zostały zebrane przez Hubatsch i wsp.37. Dodatkowo wkładki przepuszczalne mogą być stosowane w eksperymentach z kokulturą, migracją komórek oraz testach inwazji4.
Podsumowując, psie organoidy jelitowe w dwukomorowych układach hodowlanych mają potencjał do zastosowania w szerokim zakresie obszarów, w tym m.in. w biomedycynie i medycynie translacyjnej. Przedstawione protokoły oferują kilka strategii planowania eksperymentów oraz sprzyjają powtarzalności danych między laboratoriami w przypadku modeli organoidowych w całej dziedzinie biologii.

Systemy przepuszczalnych podpór są zazwyczaj stosowane do wyznaczania pozornej przepuszczalności kandydatów na leki terapeutyczne przez barierę nabłonkową jelit1,2. Mogą być one również wykorzystywane do oceny sekrecji komórkowej3, migracji komórek4 oraz toksyczności leków5. Analizy przepuszczalności leków podawanych doustnie in vitro są kluczowym etapem procesu odkrywania i opracowywania leków2, przy czym poszczególni kandydaci na leki są testowani na wczesnym etapie cyklu życia badań i rozwoju (R&amp;D) leku6. System przepuszczalnej podpory to dwukomorowy aparat do hodowli komórkowej, składający się z insertu z błoną półprzepuszczalną umieszczonego w płytce wielodołkowej. System ten umożliwia bezpośredni dostęp do strony apikalnej i basolateralnej monowarstwy komórek hodowanej w insercie7. Monowarstwa stosowana w tych systemach pochodzi zazwyczaj z komórek nabłonkowych przewodu pokarmowego (np. ludzka linia komórkowa raka gruczołowego jelita grubego Caco-2)8. Hodowle komórkowe rosną w stanie spolaryzowanym, naśladując naturalną mikroarchitekturę komórek nabłonkowych jelit, co umożliwia dalszą różnicację komórkową oraz uzyskanie podobnej mikroanatomii i funkcji7. Szczegóły dotyczące insertu przepuszczalnej podpory znajdują się na Rysunku 1. Zasiewanie insertów 2D hodowlami komórkowymi, tradycyjnie stosowanymi do oceny przepuszczalności leków w jelitach, jest stosunkowo niedrogie i łatwe do prowadzenia9. Systemy te wykazują jednak kilka istotnych ograniczeń, w tym ograniczoną zdolność do przewidywania metabolizmu jelitowego kandydatów na leki terapeutyczne10,11. Dotyczy to wszystkich mechanizmów wchłaniania leków, niezależnie od tego, czy jest to wchłanianie pasywne przez połączenia ścisłe między komórkami nabłonkowymi, aktywny transport transepitelialny poprzez mechanizmy efleksu lub transportery pobierające (np. P-glikoproteina, transporter monokarboksylanowy 1), a także leków metabolizowanych przez enterocyty.
Psy dzielą z ludźmi wspólne środowisko i dietę12. Anatomia jelit oraz skład mikrobiomu psów ściśle przypominają te u ludzi13, co przypisuje się udomowieniu i wspólnemu żywieniu na przestrzeni ostatnich 36 000 lat14. Niestety, podobieństwa te mogą być również wspólnymi przyczynami lub wyzwalaczami rozwoju chorób. U psów rozwijają się chroniczne schorzenia podobne do tych u ludzi, takie jak otyłość15, nieswoiste zapalenia jelit16, gruczolakowaty rak jelita grubego17, guzy stromalne przewodu pokarmowego (GIST)18 oraz różne inne patologie związane z ich względną długowiecznością19. W związku z tym organoidy psie mogą być z powodzeniem wykorzystywane w badaniach translacyjnych w kierunku odwrotnym (reverse translational research) nad tymi przewlekłymi chorobami wieloczynnikowymi, zgodnie z ideą inicjatywy One Health20.
Komórki Caco-2 są najczęściej stosowanymi liniami komórkowymi w badaniach absorpcji doustnej leków21. Komórki te są obecnie uważane za model „złotego standardu” w badaniach przepuszczalności jelitowej in vitro2,22,23. Linia komórkowa Caco-2 wykazuje ekspresję transporterów wysyłających i pobierających występujących w ludzkim przewodzie pokarmowym, choć na różnych poziomach ekspresji24,25,26. Komórki Caco-2 są również szeroko stosowane jako modele do określania, czy dany lek jest substratem lub inhibitorem jelitowych transporterów wysyłających22,27. Mimo że komórki Caco-2 mają pochodzenie okrężnicze, naśladują one enterocyt. Niestety, komórki Caco-2 reprezentują tylko jeden typ komórek warstwy nabłonkowej jelita cienkiego9, co sprawia, że nie odzwierciedlają one dokładnie złożonego składu typów komórek nabłonka jelitowego. Na przykład w hodowlach Caco-2 brakuje komórek kubkowych odpowiedzialnych za produkcję śluzu, przez co interakcje między śluzem a lekiem nie mogą być oceniane bez kokultury z innymi liniami komórkowymi28. Ponadto hodowle Caco-2 nie wykazują ekspresji kilku ważnych receptorów jądrowych typowo obecnych w jelitach, takich jak receptor pregnanowy X (PXR), receptor steroidowy X (SXR) oraz konstytutywny receptor androgenowy (CAR)29. W konsekwencji hodowle Caco-2 nie pozwalają na modelowanie indukcji transporterów leków i enzymów przez niektóre leki, które są induktorami tych receptorów (np. ryfampicyna)30.
Technologia trójwymiarowych (3D) organoidów jelitowych pozwala na rozwiązanie niektórych z tych ograniczeń19. Organoidy są samoorganizującymi się konstrukcjami pochodzącymi z dorosłych komórek macierzystych, które mogą być hodowane z próbek tkanek pobranych za pomocą technik mikroinwazyjnych20. W modelach przepuszczalności jelitowej wykorzystuje się ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste31,32. Organoidy psie stanowią odpowiednią alternatywę dla organoidów ludzkich, ponieważ badania nad ludzkimi komórkami macierzystymi są ograniczone kwestiami etycznymi33. Co więcej, organoidy psie zapewniają system in vitro do badania przepuszczalności leków, metabolizmu, transportu aktywnego oraz interakcji lek-lek u psów. Aby wypełnić tę lukę technologiczną, opisano metodę spójnego i niezawodnego wzrostu psich organoidów jelitowych w systemie z przepuszczalnym podłożem34. Test przepuszczalności z wykorzystaniem psich organoidów jelitowych może potencjalnie lepiej przewidywać przepuszczalność jelitową i metabolizm małych cząsteczek leków u psów w porównaniu do obecnie stosowanych testów (Caco-2). Potwierdzenie tych kluczowych cech sprawia, że ten nowy system in vitro może zostać wykorzystany w przyszłych badaniach nad potencjalnym wpływem induktorów na metabolizm wewnątrzkomórkowy i transport aktywny.
Organoidy psie składają się ze wszystkich typów komórek zazwyczaj obecnych w warstwie nabłonkowej jelita. Z punktu widzenia funkcjonalnego i mikroanatomicznego wiarygodnie odwzorowują one środowisko warstwy nabłonkowej jelit psów19,35. Ponadto obecność śluzu, specyficznych dla psów transporterów leków i enzymów oraz ogólne różnicowanie komórkowe w jelitowych organoidach psich jest porównywalne z tym, co obserwuje się in vivo u psów34. Zatem organoidy mogą być izolowane od chorych pacjentów weterynaryjnych i wykorzystywane do modelowania wpływu różnych procesów chorobowych (np. przewlekłego zapalenia jelit) na doustną przepuszczalność leków u psów19,36. System jelitowych organoidów psich może być stosowany również w innych zastosowaniach niż eksperymenty dotyczące przepuszczalności leków. Te struktury 3D mogą być również izolowane od chorych pacjentów, jak opisano wcześniej przez zespół Chandry i współpracowników w przypadku nieswoistych zapalń jelit, gruczolakoraka jelita grubego oraz guzów podśluzówkowych przewodu pokarmowego19.
Protokół wysiewania na podłoże przepuszczalne opisuje metody tworzenia hodowli organoidów jelitowych psa w insertach. Ten pierwszy protokół przedstawia metody dysocjacji ugruntowanych hodowli organoidów psich wysiewanych w macierzy zewnątrzkomórkowej błony śluzowej. Ponadto w protokole omówiono wstępne pokrywanie insertów kolagenem I oraz macierzą zewnątrzkomórkową błony śluzowej. Szczegółowo opisano również osadzanie organoidów psich w przepuszczalnych insertach.
Drugim protokołem jest Protokół Utrzymania Monowarstwy, który obejmuje ogólną pielęgnację psich organoidów 3D wysianych w insercie. W tym drugim protokole przedstawiono częstotliwość i objętości pożywek dla organoidów używanych do odświeżania hodowli oraz sposoby zapobiegania uszkodzeniom hodowli komórkowej, wraz z metodami eksperymentalnymi służącymi do oceny konfluencji monowarstwy nabłonkowej.
Wreszcie, Protokół Badawczy Przepuszczalności skupia się na sposobach określenia, czy psie trójwymiarowe organoidy jelitowe w teście przepuszczalności są gotowe do zastosowania eksperymentalnego, oraz na krokach weryfikacyjnych niezbędnych przed przeprowadzeniem każdego doświadczenia. W tej sekcji opisano również konfigurację i pomyślne przeprowadzenie eksperymentu przepuszczalności, wraz z inkubacją i pobieraniem próbek kandydatów na leki terapeutyczne w komorach hodowli単warstwowej. Omówiono także zastosowanie niskoprzepuszczalnej fluoresceiny izotiocyjanianowej (FITC-dekstranu) w celu monitorowania integralności warstwy jednokomórkowej. Na koniec opisano metodę oceny in vitro służącą do walidacji wyników po zakończeniu eksperymentu. Eksperymenty dotyczące przepuszczalności stanowią niezwykle obszerny temat, który został bardzo dobrze podsumowany przez Hubatscha i wsp.37. Schemat blokowy protokołów przedstawiono na Rysunku 2.
<img alt="Psie organoidy jelitowe na podłożu przepuszczalnym, schemat procesów transportu w płytce 24-dołkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Psie organoidy jelitowe w systemie z podłożem przepuszczalnym. Wkład z podłożem przepuszczalnym jest umieszczony w dołku płytki 24-dołkowej. Membrana mikroporowata umożliwia wysiew rozproszonych psich organoidów jelitowych, a komórki te ostatecznie tworzą dwuwymiarową monowarstwę organoidową. Technologia ta zapewnia dostęp do strony AP oraz BL monowarstwy. Pożywka dla organoidów jest wprowadzana do obu komór podłoża przepuszczalnego: AP i BL. Przedstawiono absorpcję (AP→BL) i sekrecję (BL→AP) kandydata na lek, a także dwa możliwe mechanizmy transportu leku. Skróty: AP = apikalna; BL = bazolateralna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat protokołu organoidów psich; wysiewanie, utrzymywanie, eksperyment, pomiar TEER, różnicowanie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Schemat blokowy protokołów z wykorzystaniem wstawek przepuszczalnych dla organoidów psich. Wstawka przepuszczalna jest wstępnie powlekana mieszaniną macierzy zewnątrzkomórkowej i kolagenu I, a następnie inkubowana przez 1 h. W czasie inkubacji hodowla organoidów jest dysocjowana. Pojedyncze komórki organoidów są wysiewane do wstawki; po wysiewaniu niezwłocznie dodaje się pożywkę do komory basolateralnej, natomiast pożywkę do komory apikalnej dodaje się 24 h po zakończeniu procesu wysiewania. Utrzymywanie i monitorowanie organoidów obejmuje regularne zmiany pożywki, pomiary wartości TEER oraz badanie w mikroskopii świetlnej w celu oceny integralności monowarstwy. Przed eksperymentem organoidy muszą zostać zróżnicowane poprzez usunięcie z pożywek inhibitora ROCK i GSKiβ. Wartości TEER są mierzone w dniu eksperymentu, a monowarstwa organoidów jest sprawdzana pod mikroskopem świetlnym pod kątem uszkodzeń komórek. Następnie pożywkę wymienia się na odpowiedni bufor i inkubuje przed rozpoczęciem eksperymentu. Test z FITC-dekstranem jest stosowany podczas eksperymentów nad przepuszczalnością jelitową39 jako marker integralności monowarstwy. Pomiary TEER są wykonywane po eksperymencie, a wyniki są weryfikowane za pomocą mikroskopii świetlnej po 24 h. Skróty: TEER = transepithelial electrical resistance (transepitelialna oporność elektryczna); ROCK = rho-associated kinase; GSKiβ = glycogen synthase kinase beta; F = fluorescencja. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>Organoid media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Inhibitor ROCK (Y-27632)</td><td>EMD Millipore Corp.</td><td>SCM 075</td><td></td></tr><tr><td>[Leu15]-Gastrin I człowiek</td><td>Sigma</td><td>G9145-.5MG</td><td></td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>PeproTech</td><td>9094360</td><td></td></tr><tr><td>Zaawansowany DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplement</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>substytut glutaminy</td></tr><tr><td>HEPES VWR</td><td>Life Science</td><td>J848-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka R-Spondyna-1</td><td>PeproTech</td><td>120-38-500UG</td><td></td></tr><tr><td>Mysz EGF</td><td>PeproTech</td><td>315-09-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Mysz Noggin</td><td>PeproTech</td><td>250-38-250UG</td><td></td></tr><tr><td>Mysz Wnt-3a</td><td>PeproTech</td><td>315-20-10UG</td><td></td></tr><tr><td>N2 suplement</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylo-L-cysteina</td><td>Sigma</td><td>A9165-25G</td><td></td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Sigma</td><td>N0636-100G</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td></td></tr><tr><td>SB202190 (inhibitor P38)</td><td>Sigma</td><td>S7067-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Stemolekula CHIR99021 (GSK3&beta;)</td><td>Reprocell</td><td>04-0004-base</td><td></td></tr><tr><td>TMS (siarczan trimetoprimu)</td> <td>Sigma</td><td>T7883-5G</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>kwas octowy, lodowaty</td><td>Fisher Chemical</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>alfa-D(+)-glukoza, 99+%, bezwodny</td><td>Acros Organics</td><td>170080010</td><td></td></tr><tr><td>roztwór do odzyskiwania komórek</td><td>Corning</td><td></td><td></td>354253</tr><tr><td>Kolagen I, Ogon Szczura 3 mg / ml</td><td>Gibco</td><td>A10483-01</td><td></td></tr><tr><td>FITC-CM-Dekstran</td><td>Millipore Sigma</td><td>68059-1G</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd (37%)</td><td>Fisher Chemical</td><td>F79P-4</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór aldehydu glutarowego</td><td>Sigma</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (1x)</td><td>Gibco</td><td>14025-076</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix Do Kultura organoidów</td><td>Corning</td><td>356255</td><td>Matryca błony zewnątrzkomórkowej</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, 97%</td> <td>Alfa Aesar</td><td>A11313</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td>Proteaza trypsyna podobna</td></tr> <tr><td><silna>Materiały i sprzęt</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa 15 ml</td><td>Corning</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>9-calowe pipety Pasteura</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Corning Transwell 6,5 mm Wkładki z membraną poliestrową wstępnie załadowane na 24-dołkowe płytki hodowlane, wielkość porów: 0,4 i mikro; m, Sterylne</td><td>Corning</td><td>3470</td><td>Przepuszczalne wsparcie</td></tr><tr><td>Millicell ERS (sondy)</td><td>Millipore Sigma</td><td>MERSSTX01</td><td></td></tr><tr><td>Millicell ERS-2 Woltoomomierz Millipore</td><td>Sigma</td><td>MERS00002</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator Panasonic</td><td></td><td>Panasonic MCO-170ML-PA</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M Folia do pakowania</td><td>Bemis Company Inc</td><td>PM996/EMD</td><td>Elastyczna folia laboratoryjna</td></tr><tr><td>Płytka do hodowli tkankowych 24 dołki</td><td>Fisherbrand</td><td>FB012929</td><td></td></tr></tbody></table>

organoidy jelitowe psów w dwukomorowym przepuszczalnym systemie nośnym

Canine Intestinal Organoids in a Dual-Chamber Permeable Support System

System przepuszczalnego wsparcia jest zazwyczaj używany w połączeniu z tradycyjnymi dwuwymiarowymi (2D) liniami komórkowymi jako narzędzie in vitro do oceny przepuszczalności doustnej nowych kandydatów na leki terapeutyczne. Jednak zastosowanie tych konwencjonalnych linii komórkowych ma ograniczenia, takie jak zmieniona ekspresja ścisłych połączeń, częściowe różnicowanie komórek i brak kluczowych receptorów jądrowych. Pomimo tych niedociągnięć, modele Caco-2 i MDCK są powszechnie akceptowane i walidowane do przewidywania przepuszczalności jamy ustnej u ludzi in vivo.
Psy są istotnym modelem translacyjnym dla badań biomedycznych ze względu na ich podobieństwa w anatomii przewodu pokarmowego i mikroflorze jelitowej do ludzi. W związku z tym, a także w celu wsparcia równoległego opracowywania leków, wysoce pożądane jest opracowanie skutecznego i dokładnego narzędzia in vitro do przewidywania charakterystyki przepuszczalności leków in vivo zarówno u psów, jak i u ludzi. Takim narzędziem może być układ organoidów jelitowych psów, charakteryzujący się trójwymiarowymi (3D), samoorganizującymi się strukturami nabłonkowymi pochodzącymi z dorosłych komórek macierzystych.
Protokół (1) Siewu Przepuszczalnego Wsparcia opisuje eksperymentalne metody dysocjacji i rozsiewania psich organoidów we wstawkach. Izolacja, hodowla i odławianie organoidów psów zostały wcześniej opisane w osobnym zestawie protokołów w tym wydaniu specjalnym. Metody ogólnego utrzymania monowarstwy organoidów jelitowych psów są dokładnie omówione w (2) Protokole konserwacji jednowarstwowej. Ponadto w protokole tym opisano metody oceny integralności strukturalnej monowarstwy za pomocą pomiarów transepitelialnego oporu elektrycznego (TEER) i mikroskopii świetlnej. Wreszcie, (3) Eksperymentalny Protokół Przepuszczalności opisuje zadania bezpośrednio poprzedzające eksperyment, w tym walidację wyników eksperymentalnych in vitro.
Ogólnie rzecz biorąc, model organoidu psów, w połączeniu z technologią dwukomorowej hodowli komórek, pokonuje ograniczenia związane z eksperymentalnymi modelami 2D, poprawiając tym samym wiarygodność przewidywań pozornej przepuszczalności doustnej kandydatów na leki terapeutyczne zarówno u psa, jak i u człowieka.

Standardowe procedury operacyjne dotyczące hodowli organoidów psich zostały opisane wcześniej33, a protokół hodowli organoidów psich został również szczegółowo omówiony w tym wydaniu specjalnym38. Jelitowe organoidy psie hodowane na podporach przepuszczalnych zostały utrwalone i zatopione w parafinie w celu zbadania mikroanatomii monowarstwy oraz populacji komórek. Proces zatapiania w parafinie został wcześniej omówiony przez Gabriela i współpracowników38. Wykonano rutynowe barwienie (hematoksyliną i eozyną), a technika barwienia błękitem Alciana została zastosowana do wykrycia komórek kubkowych w monowarstwie organoidów psich (patrz Rycina 7).
<img alt="Barwienie organoidów jelita psa, H&amp;E i AB, obrazy mikroskopowe, analiza histologiczna, 40x, 60x." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig07.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Barwienie monowarstwy organoidów jelita psa. Organoidy jelita psa pochodzenia okrężniczego na podłożu przepuszczalnym zostały zatopione w parafinie i zabarwione H&amp;E oraz AB. Reprezentatywne obrazy wykonano za pomocą mikroskopii świetlnej przy powiększeniu 40x (A) i 60x (B). Barwienie H&amp;E ujawnia kolumnowy nabłonek jednowarstwowy, a mikrokosmki w części apikalnej komórek są widoczne przy powiększeniu 60x. Barwienie AB dodatkowo wykazuje obecność komórek kubkowych (ciemnoniebieskie) w monowarstwie organoidów jelita psa. Paski skali = 20 µm (A), 50 µm (B). Skróty: H&amp;E = hematoksylina i eozyna; AB = błękit alkianowy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Kulturę organoidów na przepuszczalnym podłożu należy hodować od 10 do 14 dni, aby była gotowa do eksperymentu z przepuszczalnością. Mikroskopia świetlna jest stosowana wraz z pomiarami wartości TEER w celu potwierdzenia gotowości kultury organoidów do badania przepuszczalności potencjalnych leków. Reprezentatywne obrazy mikroskopowe warstw jednowarstwowych organoidów jelita psiego od zwierząt zdrowych i chorych przedstawiono na Rysunku 8.
<img alt="Schemat mikroskopowy monowarstw organoidów jelitowych psów i linii komórkowych 2D przy różnych powiększeniach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig08.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 8"> 
Rysunek 8: Mikroskopia monowarstw organoidów jelitowych psów. Zdjęcia rosnących monowarstw wykonane za pomocą mikroskopii świetlnej. Monowarstwy organoidów pochodzące od zdrowych dawców są reprezentowane przez hodowle enteroidów jelita cienkiego (10x; 40x) oraz kolonoidów (20x; 40x). Monowarstwy organoidów od dawców chorych są reprezentowane przez enteroidy dwunastnicze (5x; 10x) i jelita krętego (5x; 10x) pochodzące od psa zdiagnozowanego z PLE. Obie hodowle organoidów PLE są przykładami nieprawidłowej izolacji komórek podczas wysiewania organoidów; hodowle te nie mogły zostać użyte do testów przepuszczalności leków ze względu na obecność organoidów 3D. Przykłady odchyleń od prawidłowego tworzenia monowarstwy, takie jak przerwania monowarstwy (5x), są spowodowane nieostrożną manipulacją próbkami biologicznymi. Przedłużona hodowla organoidów (10x; 20x) wynika z długiego utrzymywania organoidów na wkładce, kiedy organoidy zaczynają przypominać swoją pierwotną strukturę 3D. Dla porównania przedstawiono zdjęcia tradycyjnych linii komórkowych 2D na wspornikach przepuszczalnych, powszechnie stosowanych w badaniach przepuszczalności leków (MDCK-10x; 40x oraz Caco-2-10x; 20x). Skróty: PLE = enteropatia z utratą białka; MDCK = Madin-Darby canine kidney. Paski skali = 500 µm (5x), 200 µm (10x), 100 µm (20x), 50 µm (40x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig08large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Monowarstwy organoidów utrwalono również w 3% Paraformaldehydzie i 3% Glutaraldehydzie w soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS). Do charakteryzacji ultrastruktury hodowli organoidów na podporach przepuszczalnych wykorzystano transmisyjną mikroskopię elektronową (TEM). Mikroanatomiczne struktury mikrokosmków i połączeń ścisłych widoczne są na Rysunku 9.
<img alt="TEM organoidów jelitowych psa; monowarstwy jelita czczego, kątnicy i okrężnicy; mikrokosmki, połączenia, membrana." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig09.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 9"> 
Rysunek 9: Obrazy TEM zdrowych monowarstw organoidów jelitowych psa. TEM wykorzystano do ukazania mikroarchitektury komórkowej monowarstw organoidów jelita czczego (A), kątnicy (B) oraz okrężnicy (C). Mikroporowata membrana wkładki z przepuszczalnym wsparciem zaznaczona jest żółtą strzałką. Na obrazach zaznaczono obecność mikrokosmków (niebieska strzałka) i połączeń ścisłych (czerwona strzałka). Skrót: TEM = transmisyjna mikroskopia elektronowa. Paski skali = 5 µm (A), 2 µm (B, C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig09large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
Zarówno pomiary TEER, jak i mikroskopia świetlna powinny zostać przeprowadzone, aby upewnić się, że system jest gotowy do testów przepuszczalności. Analiza jest gotowa do użycia, gdy TEER osiągnie stan stacjonarny, natomiast mikroskopia świetlna pomoże wykluczyć uszkodzenia lub nadmierny rozrost organoidów. Podsumowanie typowych pomiarów TEER dla pięciu grup składających się z enteroidów jelita czczego i kolonoidów psów przedstawiono na Rysunku 6.
Tabela 1: Skład mediów do organoidów i FAA. Pełny skład CMGF+, CMGF+ R/G oraz FAA został podsumowany w tej tabeli. Skróty: ROCK = kinaza związana z rho; GSKiβ = inhibitor kinazy syntazy glikogenu beta; CMGF + R/G = podłoże kompletne z czynnikami wzrostu, wzbogacone o inhibitor ROCK i GSKiβ; CMGF+ = podłoże kompletne z czynnikami wzrostu, ale bez inhibitora ROCK lub GSKiβ; FAA = formalina-kwas octowy-alkohol; EGF = epidermalny czynnik wzrostu. Tabela została opracowana na podstawie 38. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/Table%201%20(8).xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela uzupełniająca 1: Tabela do sporządzania notatek dotyczących systemu podpory przepuszczalnej dla organoidów psich. Skróty: TEER = transepithelial electrical resistance; ROCK = rho-associated kinase; GSKiβ = glycogen synthase kinase beta; CMGF + R/G = pożywka kompletna z czynnikami wzrostu wzbogacona o inhibitor ROCK i GSKiβ; CMGF+ = pożywka kompletna z czynnikami wzrostu, ale bez inhibitora ROCK lub GSKiβ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/Supplementary%20Table%201%20(1).xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Tutaj prezentujemy protokół opisujący hodowlę organoidów jelitowych psów w dwukomorowym, przepuszczalnym systemie wsparcia. Opisano wysiewanie organoidów w przepuszczalnych podporach, utrzymanie monowarstwy i późniejsze eksperymenty z przepuszczalnością leków.

Organoidy jelitowe psów w dwukomorowym przepuszczalnym systemie nośnym

The permeable support system is typically used in conjunction with traditional two-dimensional (2D) cell lines as an in vitro tool for evaluating the oral ...

Połączenie technologii organoidów psich i dwukomorowego, przepuszczalnego systemu nośnego przezwycięża ograniczenia eksperymentalnych linii komórkowych 2D tradycyjnie stosowanych w biomedycznych modelach badawczych. Technologia ta może zwiększyć wiarygodność przewidywań pozornej przepuszczalności doustnej potencjalnych leków terapeutycznych zarówno u psów, jak i u ludzi. System może być stosowany w innych dziedzinach badań biomedycznych, w tym w badaniach mikrobiologicznych, badaniach wychwytu wirusa, interakcjach między lekami i mechanizmach transportu leków. Standaryzacja , szczegółowa dokumentacja procedur eksperymentalnych i konsekwentne monitorowanie monowarstw komórek są kluczowymi praktykami potrzebnymi do przeprowadzenia testów z przepuszczalnym nośnikiem. Umieść macierz błony zewnątrzkomórkowej na lodzie, aby rozpocząć rozmrażanie. Zanurz go w lodzie, aby uchronić go przed szybkim rozmrożeniem i uniknąć zestalenia. Wstępnie schłodzić wirówkę z chłodzeniem do 4

canine-intestinal-organoids-in-a-dual-chamber-permeable-support-system

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano eksperymentalne metody pobierania dorosłych komórek macierzystych z tkanek jelitowych i wątrobowych psów w celu stworzenia kultur organoidowych 3D. Ponadto omówiono techniki laboratoryjne zapewniające stały wzrost i standardowe procedury operacyjne w celu zbioru, biobanku i ożywienia kultur organoidów jelitowych i wątrobowych psów.

Standaryzacja i utrzymanie 3D kultur organoidowych wątroby i jelit psów do wykorzystania w badaniach biomedycznych

Organoidy jelitowe pochodzące z biopsji oraz technologie organ-on-a-chips są połączone w platformę mikrofizjologiczną, aby podsumować funkcjonalność jelit specyficzną dla regionu.

Połączenie ludzkich organoidów i technologii Organ-on-A-Chip w celu modelowania funkcjonalności specyficznej dla regionu jelitowego

Integracja organoidów jelitowych psów i systemu mikroprzepływowego Gut-on-a-Chip oferuje odpowiednie modele translacyjne dla chorób jelit u ludzi. Przedstawione protokoły pozwalają na morfogenezę 3D i dynamiczne modelowanie jelit in vitro, pomagając w opracowaniu skutecznych metod leczenia chorób jelit u psów i ludzi z One Health.

Trójwymiarowa morfogeneza w psich jelitach na chipie przy użyciu organoidów jelitowych pochodzących od pacjentów z nieswoistymi zapaleniami jelit

To badanie przedstawia protokół generowania monowarstw 2D jelit bydlęcych z organoidów, oferując lepszy dostęp do badania interakcji gospodarz-patogen. Obejmuje on metody oceny integralności i funkcjonalności błony, rozwijając modele in vitro, które naśladują fizjologię przewodu pokarmowego bydła. Podejście to obiecuje znaczące korzyści biomedyczne i rolnicze, w tym ulepszone strategie leczenia.

Postępy w technologii organoidów bydlęcych z wykorzystaniem jednowarstwowych interfejsów jelita cienkiego i grubego

To badanie przedstawia protokół generowania monowarstw 2D organoidów wieprzowych pochodzących z jelita cienkiego i grubego. Wzrost tych monowarstw charakteryzuje się rosnącymi wartościami TEER, co wskazuje na solidną integralność nabłonka. Dodatkowo, te monowarstwy wykazują fizjologiczne reakcje wydzielnicze w eksperymentach w komorze Ussing po zastosowaniu forskoliny.

Dwuwymiarowe organoidy jelitowe świń odzwierciedlające fizjologiczne właściwości rodzimego jelita

Opisujemy opracowanie systemu selekcji negatywnej w E. histolytica opartego na transgenicznej ekspresji białka chimerycznego (FCU1) i selekcji przy użyciu proleku 5-fluorocytosyny. Białko FCU1 jest fuzją drożdżowej cytozynowej deaminazy i uracylu fosforobozylotransferazy. Ekspresja FCU1 doprowadziła do zwiększenia wrażliwości E. histolytica na 5-fluorocytosynę.

Opracowanie markeru selekcji negatywnej dla Entamoeba histolytica

Przedstawiamy metody efektywnej i szybkiej izolacji/hodowli żywotnego mikrogleju z kory mózgowej noworodka i dorosłego rdzenia kręgowego.  Sekcja i posiew mikrogleju korowego może być przeprowadzona w ciągu 90 minut, a późniejsze zbieranie mikrogleju odbywa się ~ 10 dni po początkowym rozbiorze.

Hodowla mikrogleju z ośrodkowego układu nerwowego noworodków i dorosłych

Tutaj opisany jest protokół zbierania, utrzymywania i leczenia organoidów jelita cienkiego myszy z wzorcami molekularnymi związanymi z patogenami (PAMP) i Listeria monocytogenes, a także nacisk na ekspresję genów i właściwe techniki normalizacji białka.

Hodowla ex vivo i stymulacja receptorów rozpoznawania wzorców organoidów jelitowych myszy

Tutaj opisana jest metoda wykorzystująca system infekcji oparty na wkładce membranowej do badania wpływu Streptolizyny S, wydzielanej toksyny wytwarzanej przez Streptococcus grupy A, na keratynocyty. System ten może być z łatwością zastosowany do badania innych wydzielanych białek bakteryjnych na różnych typach komórek gospodarza podczas infekcji.

Wdrożenie systemu infekcji opartego na wkładce membrany przepuszczalnej w celu zbadania wpływu wydzielanych toksyn bakteryjnych na komórki gospodarza ssaków

Pułapki zewnątrzkomórkowe (NET) to sieci DNA, histonów i białek neutrofilowych. Chociaż jest to składnik wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, NET są zaangażowane w autoimmunizację i zakrzepicę. Protokół ten opisuje prostą metodę izolacji neutrofili u psów i ilościowego oznaczania NET za pomocą testu fluorescencji mikropłytek.

Prosty test fluorescencyjny do ilościowego oznaczania uwalniania zewnątrzkomórkowej pułapki neutrofili u psów

Poznaj metodę hodowli organoidów jelitowych psów w dwukomorowym systemie nośnym. Technologia ta poprawia niezawodność prognozowania przepuszczalności leków w badaniach biomedycznych.

Organoidy jelitowe psów w dwukomorowym przepuszczalnym systemie nośnym

Przeglądaj więcej filmów