Wdrożenie minimalnie inwazyjnej resekcji guza mózgu u gryzoni w celu pobrania tkanek o wysokiej żywotności
9 maja 2022
Obecny protokół opisuje standaryzowaną resekcję guzów mózgu u gryzoni za pomocą minimalnie inwazyjnego podejścia ze zintegrowanym systemem konserwacji tkanek. Technika ta ma implikacje dla dokładnego odzwierciedlenia standardu opieki w modelach gryzoni i innych zwierząt.
Jest to paradygmat resekcji guza mózgu, który jest bardzo potrzebny w badaniach przedklinicznych nad terapiami guzów mózgu. Pozwala na standaryzowaną resekcję dzięki minimalnie inwazyjnemu podejściu, a jednocześnie jest sprzężony z automatycznym systemem konserwacji tkanek. Protokół ten pozwala zwierzęciu przeżyć po operacji, a tym samym pomaga w zrozumieniu zmian w stanie chorobowym po terapii u tego samego zwierzęcia.
Pomaga to w sekwencyjnych i poklatkowych zastosowaniach terapeutycznych. Za pomocą tej techniki możemy ocenić biologię choroby i zaplanować ewentualne późniejsze leczenie. Ma to znaczące implikacje i możliwości w zakresie odkrywania leków i nowych terapii.
Koncepcje standaryzowanej resekcji, minimalnie inwazyjnego podejścia i zautomatyzowanego konserwowania tkanek można rozszerzyć na inne rodzaje nowotworów w różnych układach narządów, takie jak guzy wątroby oraz nowotwory głowy i szyi. Protokół jest prosty, a system przyjazny dla użytkownika. Najlepiej zapoznać się z opublikowanym protokołem, który zawiera wszystkie niezbędne kroki i rozwiązywanie problemów.
Rozpocznij eksperyment od oceny myszy pod kątem sedacji, szczypiąc palec u nogi. Nałóż maść okulistyczną na oczy, aby uniknąć wysuszenia rogówki. Następnie umieść mysz na ramce stereotaktycznej.
Usuń zszywkę z poprzedniego zabiegu i zdezynfekuj skórę naprzemiennymi cyklami peelingu na bazie chlorheksydyny lub betainy i alkoholu. Następnie za pomocą sterylnego skalpela wykonaj jednocentymetrowe podłużne nacięcie linii środkowej wzdłuż poprzedniej blizny pooperacyjnej. Przymocuj rękojeść MIRS do ramienia stereotaktycznego za pomocą stage adapter.
Aby skonfigurować urządzenie MIRS, włóż zestaw przewodu zasilającego na tylnym panelu do gniazda przewodu zasilającego. Włącz lub wyłącz zasilanie systemu, przełączając się między zerem a jedynką. Włóż jeden koniec węża azotowego do złączki męskiej na tylnym panelu konsoli.
Obróć nakrętkę łączącą zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby ją dokręcić. Upewnij się, że ciśnienie zasilania nie przekracza 100 PSIG i podłącz wąż do dopływu azotu. Uszczelnij pokrywę portu próżniowego, aby uniknąć wycieków.
Sprawdź, czy pokrętło zasysania z przodu konsoli jest ustawione na 100, czy nie ma wycieków w systemie zasysania i czy ciśnienie dopływu azotu jest prawidłowe. Włóż szare złącze pedału nożnego do szarego gniazda, aż usłyszysz kliknięcie. W ten sam sposób włóż niebieskie złącze rękojeści do niebieskiego gniazda.
Zalać każdą rękojeść, zasysając sterylny płyn do otworu przez rurkę i rękojeść, a następnie do kanistra, aby upewnić się, że wnętrze rurki i rękojeści są nasmarowane. Wybierz tryb aspiracji na panelu przednim konsoli i rozpocznij za pomocą pedału nożnego. Włóż kaniulę 23-G MIRS do otworu zadziorów na głębokość 2.5 milimetra.
Rozpocznij proces resekcji, naciskając pedał nożny podłączony do kaniuli. Wykonaj pełne cykle resekcji za pomocą pokrętła w rękojeści. Po procesie resekcji wyjmij kaniulę MIRS o rozmiarze 23 i dodaj pięć mililitrów 1X PBS, aby przepłukać rurkę i usunąć wszelkie resztki zanieczyszczeń.
Następnie zamknij ranę zszywaczem i wyjmij mysz z ramki stereotaktycznej. Umieść mysz z powrotem na poduszce grzewczej, aby wyleczyć się ze znieczulenia, zanim umieścisz ją z powrotem w klatce. Po eksperymencie przeoczyść kaniulę schłodzonym medium i powietrzem, aby wepchnąć całą wyciętą tkankę z powrotem do pojemnika zbiorczego.
Wyjmij pojemnik zbiorczy z systemu i załóż nakrętkę. Następnie umieść dystalną końcówkę kaniuli w 3% nadtlenku wodoru i zastosuj ssanie, aby napełnić przewód ssący z powrotem do pojemnika na ssawkę. Pozostaw na 60 do 90 sekund i od czasu do czasu pulsuj powietrzem i mediami, aby je przepłukać.
Zanurz próbkę guza w naczyniu do hodowli tkankowej zawierającym pożywkę do lizy RBC na pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie umieść filtr o grubości 70 mikronów na 50-mililitrowej stożkowej rurce i użyj tłoka strzykawki, aby przepuścić próbkę guza przez filtr. Za pomocą pipety transferowej użyj pożywki RPMI 1640, aby przepuścić komórki i dowolną masę tkankową przez filtr.
Wirować w temperaturze 428 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić każdą próbkę w pięciu mililitrach przygotowanego podłoża RPMI 1640. Umieścić próbki w inkubatorze z wytrząsarką na 20 minut przy 200 obr./min w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Po inkubacji odwirować próbki w temperaturze 428 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i wyrzucić supernatant. Przefiltruj pojedyncze komórki przez sitko o średnicy 70 mikronów i odwiruj w temperaturze 274 razy G przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przeprowadź analizę żywotności komórek za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru.
Resekcja chirurgiczna u myszy przy użyciu MIRS spowodowała znaczne zmniejszenie masy guza, na co wskazuje zmniejszenie średniego wyjściowego sygnału bioluminescencyjnego dla grup zarówno z dużym, jak i małym obciążeniem guza. W porównaniu z obrazami MRI guzów przed resekcją, jamę resekcji można zidentyfikować na skanach po resekcji jako duży, okrągły, hipointensywny obszar w miejscu inokulacji guza. W skrawkach barwionych H&E zaobserwowano przezroczystą kolistą jamę resekcji z brzegiem produktów krwiopochodnych, stanem zapalnym i resztkami komórek nowotworowych.
Objętość resekcji znacznie się zwiększała, gdy wykonano dwa obroty otworu do cięcia, co pozwoliło na optymalizację objętości resekcji w zależności od obciążenia guza. Porównanie przeżycia myszy z nieleczonymi nowotworami z myszami poddawanymi resekcji guzów za pomocą MIRS wykazało wzrost przeżycia z 16 do 22 dni w grupie małych guzów. Podobnie w grupie z większym obciążeniem nowotworem mediana przeżycia wzrosła z 12 do 19 dni.
Obrazy mikroskopowe próbek pobranych z systemu konserwacji tkanek pojawiły się jako pojedyncze komórki z obecnością kilku małych fragmentów tkanki w dniu zero. Po siedmiu dniach komórki zebrane za pomocą MIRS wykazały tworzenie się neurosfery w kulturach zawiesinowych, co wskazywało na ich potencjał inicjacji guza. Ważne jest, aby oczyścić i przepłukać system przewodów bezpośrednio po zabiegu, aby uniknąć zatkania systemu.
Po tej procedurze można przeprowadzić badania skuteczności terapii oraz badania markerów diagnostycznych i prognostycznych na zwierzętach, które przeżyły po resekcji chirurgicznej za pomocą minimalnie inwazyjnego systemu resekcji.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje znormalizowaną metodę resekcji guzów mózgu u gryzoni z wykorzystaniem podejścia małoinwazyjnego zintegrowanego z systemem konserwacji tkanek. Technika ta zwiększa dokładność badań przedklinicznych, umożliwiając przeżycie zwierząt po operacji, co ułatwia badanie progresji choroby oraz efektów terapeutycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- badania przedkliniczne
- onkologia
Wprowadzenie
- Badania nad guzami mózgu są kluczowe dla opracowania skutecznych terapii.
- Ustandaryzowane techniki chirurgiczne poprawiają powtarzalność badań.
- Metody małoinwazyjne skracają czas rekonwalescencji i zmniejszają liczbę powikłań.
- Konserwacja tkanek jest niezbędna do przeprowadzania późniejszych analiz.
Cel badania
- Ustanowienie niezawodnej metody resekcji guzów mózgu w modelach gryzoni.
- Umożliwienie prowadzenia badań podłużnych nad biologią nowotworów i odpowiedzią na leczenie.
- Wsparcie wysiłków w zakresie odkrywania leków poprzez usprawnienie projektowania eksperymentalnego.
Zastosowane metody
- Małoinwazyjne techniki chirurgiczne do resekcji guza.
- Zautomatyzowane systemy konserwacji tkanek w celu zachowania integralności próbek.
- Monitorowanie pooperacyjne w celu oceny rekonwalescencji zwierząt.
- Sekwencyjne zastosowania terapeutyczne w celu oceny skuteczności leczenia.
Główne wyniki
- Protokół umożliwia skuteczną resekcję guza przy minimalnej liczbie powikłań.
- Zwierzęta wykazują dobrą rekonwalescencję i mogą być wykorzystane w badaniach kontrolnych.
- Ułatwia ocenę interwencji terapeutycznych w czasie.
- Stanowi podstawę dla przyszłych badań nad terapiami guzów mózgu.
Wnioski
- Technika ta stanowi znaczący postęp w przedklinicznych badaniach nad guzami mózgu.
- Udoskonala ona możliwość badania dynamiki choroby oraz efektów leczenia.
- Przyszłe zastosowania mogą doprowadzić do opracowania lepszych strategii terapeutycznych w leczeniu guzów mózgu.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zstandaryzowana, małoinwazyjna resekcja guza mózgu u gryzoni umożliwia pobranie tkanek o wysokiej żywotności oraz przeżycie zwierząt po zabiegu, co bezpośrednio wypełnia krytyczną lukę w przedklinicznych modelach onkologicznych. Podejście to wspiera podłużną ocenę terapeutyczną i zmniejsza zmienność eksperymentalną, zwiększając pewność prognostyczną w badaniach translacyjnych. Integracja protokołu z automatyczną konserwacją tkanek odpowiada potrzebom przedsiębiorstw w zakresie powtarzalności i skalowalnej integracji procesów roboczych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia rygorystyczną analizę biologii nowotworu oraz okołoperoperacyjnych efektów terapeutycznych in vivo.
- Zmniejsza niejednoznaczność w zakresie mechanizmów poprzez możliwość sekwencyjnych interwencji i monitorowania stanu choroby u tego samego zwierzęcia.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów terapeutycznych dzięki odzyskiwaniu tkanek i komórek o wysokiej żywotności do dalszych analiz.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia ustandaryzowane, powtarzalne próbki tkanek do opracowywania testów i odkrywania biomarkerów.
- Ułatwia przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do przesiewania związków i badań skuteczności.
- Poprawia skalowalność testów i możliwość ponownego wykorzystania platformy poprzez minimalizację zmienności operacyjnej i strat tkanek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia modelowanie interwencji chirurgicznych i opieki okołoperacyjnej istotnych w onkologii klinicznej.
- Zapewnia ciągłość procesu od fazy odkrycia po walidację przedkliniczną, umożliwiając ocenę przeżywalności i analizy podłużne.
- Jest zgodne z translacyjnymi strategiami biomarkerów poprzez zachowanie żywych komórek nowotworowych do badań molekularnych i funkcjonalnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół łączy etapy wczesnego odkrywania, identyfikacji wiodących związków oraz walidacji przedklinicznej, umożliwiając standaryzowane modelowanie chirurgiczne i pobieranie tkanek u gryzoni.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez kontrolowaną resekcję oraz analizę tkanek.
- Screening: Dostarcza powtarzalne, wysokiej jakości próbki do ilościowych analiz i badań porównawczych.
- Analityka: Zapewnia żywe komórki i tkanki do późniejszych pomiarów molekularnych, komórkowych i oceny żywotności.
- Badania translacyjne: Modeluje kliniczne scenariusze chirurgiczne i wspiera dopasowanie biomarkerów w celu zapewnienia ciągłości między etapem przedklinicznym a klinicznym.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Tworzy wielokrotnego użytku, skalowalną platformę dla różnorodnych modeli nowotworów i oceny terapii.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje ryzyko biologiczne w przedklinicznych badaniach onkologicznych.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i przepustowość w procesach pobierania tkanek.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz zwiększa efektywność kapitałową poprzez umożliwienie generowania solidnych danych podłużnych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój kandydatów na terapię.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza chirurgiczna w zakresie modeli gryzoni oraz biegłość w obsłudze systemów stereotaktycznych.
- Niezbędny jest dostęp do urządzenia do małoinwazyjnej resekcji oraz zintegrowanej infrastruktury do utrwalania tkanek.
- Wymagana jest standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia spójności w obchodzeniu się z tkankami i ocenie ich żywotności.
- Metoda jest możliwa do adaptacji do innych modeli nowotworowych, przy uwzględnieniu różnic anatomicznych i proceduralnych.
- Terminowe płukanie i konserwacja systemu są kluczowe dla zapobiegania zatorom oraz zapewnienia integralności próbek.
