Name: Edycja genów pierwotnych komórek B makaka rezusa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Poznaj metodę edycji genów pierwotnych komórek B makaka rezusa przy użyciu CRISPR/Cas9 i rAAV6. Technika ta umożliwia badania terapii komórkowych B i może być dostosowana do innych typów komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Harry'emu B. Gristickowi i Pameli Bjorkman za dostarczenie antygenu RC1 oraz całym laboratoriom Nussenzweig i Martin za krytyczną dyskusję. Praca ta była wspierana przez grant Fundacji Billa i Melindy Gatesów INV-002777 (dla M.C.N.) oraz Intramural Research Program Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych, National Institutes of Health. (R.G. i M.A.M.). M.C.N. jest badaczem HHMI.

<ol><li>Victora, G. D., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germinal+centers%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Germinal centers.</a> Annual Review of Immunology. 40, 413-442 (2022).</li>
<li>Plotkin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlates+of+protection+induced+by+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Vaccine+Immunology%22%5BJournal%5D)">Correlates of protection induced by vaccination.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 17 (7), 1055-1065 (2010).</li>
<li>Brinkmann, V., Heusser, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell-dependent+differentiation+of+human+B+cells+into+IgM%2C+IgG%2C+IgA%2C+or+IgE+plasma+cells%3A+High+rate+of+antibody+production+by+IgE+plasma+cells%2C+but+limited+clonal+expansion+of+IgE+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Immunology%22%5BJournal%5D)">T cell-dependent differentiation of human B cells into IgM, IgG, IgA, or IgE plasma cells: High rate of antibody production by IgE plasma cells, but limited clonal expansion of IgE precursors.</a> Cellular Immunology. 152 (2), 323-332 (1993).</li>
<li>Chernecky, C. C., Berger, B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChernecky%2C+CC+%22Protein+Electrophoresis+-+Serum.%2C+6th+edition%22">Protein Electrophoresis - Serum., 6th edition</a>. , Elsevier Saunders. St Louis, MO. 917-920 (2013).</li>
<li>Balazs, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-based+protection+against+HIV+infection+by+vectored+immunoprophylaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antibody-based protection against HIV infection by vectored immunoprophylaxis.</a> Nature. 481 (7379), 81-84 (2011).</li>
<li>Greiner, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+editing+of+the+B+cell+receptor+in+primary+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated editing of the B cell receptor in primary human B cells.</a> iScience. 12, 369-378 (2019).</li>
<li>Hartweger, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-specific+humoral+immune+responses+by+CRISPR%2FCas9-edited+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">HIV-specific humoral immune responses by CRISPR/Cas9-edited B cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1301-1310 (2019).</li>
<li>Huang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccine+elicitation+of+HIV+broadly+neutralizing+antibodies+from+engineered+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Vaccine elicitation of HIV broadly neutralizing antibodies from engineered B cells.</a> Nature Communications. 11, 5850(2020).</li>
<li>Jeske, A. M., Boucher, P., Curiel, D. T., Voss, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+strategies+to+actualize+B+cell-based+gene+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Vector strategies to actualize B cell-based gene therapies.</a> Journal of Immunology. 207 (3), 755-764 (2021).</li>
<li>Nahmad, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+engineered+B+cells+secrete+high+titers+of+broadly+neutralizing+anti-HIV+antibodies+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In vivo engineered B cells secrete high titers of broadly neutralizing anti-HIV antibodies in mice.</a> Nature Biotechnology. 40 (8), 1241-1249 (2022).</li>
<li>Nahmad, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+B+cells+expressing+an+anti-HIV+antibody+enable+memory+retention%2C+isotype+switching+and+clonal+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Engineered B cells expressing an anti-HIV antibody enable memory retention, isotype switching and clonal expansion.</a> Nature Communications. 11, 5851(2020).</li>
<li>Voss, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+the+antigen+specificity+of+B+cells+using+genome-editing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Reprogramming the antigen specificity of B cells using genome-editing technologies.</a> eLife. 8, 42995(2019).</li>
<li>Pesch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+design%2C+optimization%2C+and+genomic+integration+of+chimeric+B+cell+receptors+in+murine+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Molecular design, optimization, and genomic integration of chimeric B cell receptors in murine B cells.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2630(2019).</li>
<li>Cheong, T. C., Compagno, M., Chiarle, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editing+of+mouse+and+human+immunoglobulin+genes+by+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Editing of mouse and human immunoglobulin genes by CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Communications. 7, 10934(2016).</li>
<li>Rogers, G. L., Cannon, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+edited+B+cells%3A+A+new+frontier+in+immune+cell+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Genome edited B cells: A new frontier in immune cell therapies.</a> Molecular Therapy. 29 (11), 3192-3204 (2021).</li>
<li>Hung, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+protein-secreting+plasma+cells+by+homology-directed+repair+in+primary+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Engineering protein-secreting plasma cells by homology-directed repair in primary human B cells.</a> Molecular Therapy. 26 (2), 456-467 (2018).</li>
<li>Johnson, M. J., Laoharawee, K., Lahr, W. S., Webber, B. R., Moriarity, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+primary+human+B+cells+with+CRISPR%2FCas9+targeted+nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Engineering of primary human B cells with CRISPR/Cas9 targeted nuclease.</a> Scientific Reports. 8, 12144(2018).</li>
<li>Wu, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+in+primary+human+B+cells+with+CRISPR-Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering in primary human B cells with CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins.</a> Journal of Immunological Methods. 457, 33-40 (2018).</li>
<li>Luo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+alpha-PD-1+antibody-expressing+long-lived+plasma+cells+by+CRISPR%2FCas9-mediated+targeted+gene+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Engineering of alpha-PD-1 antibody-expressing long-lived plasma cells by CRISPR/Cas9-mediated targeted gene integration.</a> Cell Death and Disease. 11 (11), 973(2020).</li>
<li>Laoharawee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+of+primary+human+B+cells+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Genome engineering of primary human B cells using CRISPR/Cas9.</a> Journal of Visualized Experiments. (165), e61855(2020).</li>
<li>Laoharawee, K., Johnson, M. J., Moriarity, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+genome+engineering+of+primary+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated genome engineering of primary human B cells.</a> Methods in Molecular Biology. 2115, 435-444 (2020).</li>
<li>Moffett, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+engineered+to+express+pathogen-specific+antibodies+protect+against+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Immunology%22%5BJournal%5D)">B cells engineered to express pathogen-specific antibodies protect against infection.</a> Science Immunology. 4 (35), (2019).</li>
<li>Hartweger, H., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+comes+a-knock-in+to+reprogram+antibodies+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">CRISPR comes a-knock-in to reprogram antibodies in vivo.</a> Nature Biotechnology. 40 (8), 1183-1184 (2022).</li>
<li>Nishimura, Y., Martin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice%2C+macaques%2C+and+men%3A+Broadly+neutralizing+antibody+immunotherapy+for+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Of mice, macaques, and men: Broadly neutralizing antibody immunotherapy for HIV-1.</a> Cell Host & Microbe. 22 (2), 207-216 (2017).</li>
<li>Shedlock, D. J., Silvestri, G., Weiner, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monkeying+around+with+HIV+vaccines%3A+Using+rhesus+macaques+to+define+%27gatekeepers%27+for+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Monkeying around with HIV vaccines: Using rhesus macaques to define 'gatekeepers' for clinical trials.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (10), 717-728 (2009).</li>
<li>Kreuser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+methods+for+generation+and+expansion+of%2C+and+gene+delivery+to+rhesus+macaque+plasma+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Efficient methods for generation and expansion of, and gene delivery to rhesus macaque plasma B cells.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Gujer, C., Sundling, C., Seder, R. A., Karlsson Hedestam, G. B., Lore, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+rhesus+plasmacytoid+dendritic+cell+and+B-cell+responses+to+Toll-like+receptor+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Human and rhesus plasmacytoid dendritic cell and B-cell responses to Toll-like receptor stimulation.</a> Immunology. 134 (3), 257-269 (2011).</li>
<li>Kim, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+enrichment-free+massive+ex-vivo+expansion+of+peripheral+CD20%28%2B%29+B+cells+via+CD40-CD40L+signals+in+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Cell enrichment-free massive ex-vivo expansion of peripheral CD20(+) B cells via CD40-CD40L signals in non-human primates.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 473 (1), 92-98 (2016).</li>
<li>Su, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-attenuating+adenovirus+enables+production+of+recombinant+adeno-associated+virus+for+high+manufacturing+yield+without+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Self-attenuating adenovirus enables production of recombinant adeno-associated virus for high manufacturing yield without contamination.</a> Nature Communications. 13, 1182(2022).</li>
<li>Endo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-+and+long-term+clinical+outcomes+in+rhesus+monkeys+inoculated+with+a+highly+pathogenic+chimeric+simian%2Fhuman+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Short- and long-term clinical outcomes in rhesus monkeys inoculated with a highly pathogenic chimeric simian/human immunodeficiency virus.</a> Journal of Virology. 74 (15), 6935-6945 (2000).</li>
<li>Balaphas, A., Buchs, N. C., Meyer, J., Hagen, M. E., Morel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+splenectomy+in+the+era+of+minimally+invasive+surgery%3A+The+current+laparoscopic+and+robotic+experiences%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+Endoscopy%22%5BJournal%5D)">Partial splenectomy in the era of minimally invasive surgery: The current laparoscopic and robotic experiences.</a> Surgical Endoscopy. 29 (12), 3618-3627 (2015).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Labun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHOPCHOP+v3%3A+Expanding+the+CRISPR+web+toolbox+beyond+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CHOPCHOP v3: Expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing.</a> Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).</li>
<li>Strobel, B., Miller, F. D., Rist, W., Lamla, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+cesium+chloride-+and+iodixanol-based+purification+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors+for+preclinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of cesium chloride- and iodixanol-based purification of recombinant adeno-associated viral vectors for preclinical applications.</a> Human Gene Therapy Methods. 26 (4), 147-157 (2015).</li>
<li>Guo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+simplified+purification+of+recombinant+adeno-associated+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid and simplified purification of recombinant adeno-associated virus.</a> Journal of Virological Methods. 183 (2), 139-146 (2012).</li>
<li>Vandenberghe, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+serotype-dependent+release+of+functional+vector+into+the+culture+medium+during+adeno-associated+virus+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing.</a> Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).</li>
<li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), 168(2014).</li>
<li>Conant, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inference+of+CRISPR+edits+from+Sanger+trace+data%5BTitle%5D)+AND+%22The+CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">Inference of CRISPR edits from Sanger trace data.</a> The CRISPR Journal. 5 (1), 123-130 (2022).</li>
<li>Wilkinson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-AAV6+gene+correction+of+beta-globin+in+autologous+HSCs+improves+sickle+cell+disease+erythropoiesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice.</a> Nature Communications. 12, 686(2021).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+broadly+neutralizing+macaque+monoclonal+antibody+against+the+HIV-1+V3-Glycan+patch%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A broadly neutralizing macaque monoclonal antibody against the HIV-1 V3-Glycan patch.</a> eLife. 9, 61991(2020).</li>
<li>Escolano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+expands+B+cells+specific+to+HIV-1+V3+glycan+in+mice+and+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immunization expands B cells specific to HIV-1 V3 glycan in mice and macaques.</a> Nature. 570 (7762), 468-473 (2019).</li>
<li>Pathiraja, V., Matar, A. J., Gusha, A., Huang, C. A., Duran-Struuck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukapheresis+protocol+for+nonhuman+primates+weighing+less+than+10+kg%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Leukapheresis protocol for nonhuman primates weighing less than 10 kg.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (1), 70-77 (2013).</li>
<li>Stratigopoulos, G., De Rosa, M. C., LeDuc, C. A., Leibel, R. L., Doege, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DMSO+increases+efficiency+of+genome+editing+at+two+non-coding+loci%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">DMSO increases efficiency of genome editing at two non-coding loci.</a> PLoS One. 13 (6), 0198637(2018).</li>
</ol>

Nie deklaruje się żadnych sprzecznych interesów.

Przedstawione tutaj protokoły zapewniają szybką i wydajną metodę generowania wysokich plonów i mian rAAV6 jako HDRT oraz nowatorskie metody skutecznej edycji genów pierwotnych komórek B makaków rezusów in vitro.
Protokół produkcyjny rAAV6 jest stosunkowo prosty i szybki, co pozwala na produkcję i testowanie wielu różnych konstrukcji jednocześnie bez nadmiernego wysiłku. W razie potrzeby rAAV6 można dalej oczyszczać przy użyciu ustalonych protokołów, takich jak ultrawirowanie w gradionym jodiksanolu34 lub wodne dwufazowe rozdzielanie35 przed wymianą buforu i zatężeniem.
Chociaż zmniejszyło to ogólną wydajność, zdecydowaliśmy się użyć tylko pożywki do hodowli komórkowych o obniżonej surowicy do oczyszczania rAAV6 zamiast oczyszczania z osadu komórkowego, ponieważ większość rAAV6 jest uwalniana do pożywki36, a oczyszczanie z osadu komórkowego zwiększa koszty i nakład pracy. Zastosowanie samoinaktywującego się pomocnika adenowirusowego zwiększyło plony średnio 30-40-krotnie, umożliwiając testowanie konstruktów zapakowanych w AAV6 w pojedynczym naczyniu o średnicy 15 cm. Chociaż nasza metoda oczyszczania jest podstawowa, przy użyciu tej metody uzyskujemy stosunkowo niewielką różnicę między partiami w wydajności edycji genów lub żywotności komórek po transdukcji przy użyciu różnych linii komórkowych lub innych komórek pierwotnych (dane nie pokazane).
Opracowaliśmy protokół oczyszczania komórek B makaka rezusa w celu uzyskania nietkniętych pierwotnych komórek B przy użyciu ujemnego zubożenia niepożądanych populacji. Chociaż nie jest to konieczne do edycji genów tych komórek, zapewnia sposób na uzyskanie stosunkowo czystej populacji pierwotnych komórek B makaków rezusów do tego lub innych zastosowań, jeśli inne typy komórek kolidują z celami eksperymentalnymi. Jednak czystość odbywa się kosztem zmniejszonej ogólnej wydajności limfocytów B. Warto zauważyć, że zarówno w przypadku wzbogaconych, jak i niewzbogaconych hodowli komórek B, frakcja komórek B w początkowych preparatach PBMC lub splenocytów ma kluczowe znaczenie. W szczególności w przypadku PBMC zalecamy badania przesiewowe różnych makaków pod kątem osób z wysokim odsetkiem komórek B we krwi obwodowej w celu uzyskania dużej liczby komórek B do eksperymentów, ponieważ wartość ta może się znacznie różnić między osobnikami27. PBMC można uzyskać przez regularne krwawienie lub leukaferezę42.
Protokół edycji genów prowadzi do wydajnej edycji genów, zwykle między 60% -80% komórek B z nokautem i 5% -20% komórek B z nokautem, chociaż osiągnęliśmy do 90% komórek B z nokautem BCR i 40% komórek B z nokautem BCR (Figura 5 i Figura 6).
Głównymi parametrami efektywnej edycji limfocytów B makaka rezusa są wydajność cięcia sgRNA, parametry elektroporacji, MOI oraz jakość preparatu rAAV6. Wydajność cięcia potencjalnych sgRNA powinna być określona empirycznie, aby umożliwić optymalną edycję i projektowanie HDRT. Przedstawione tutaj parametry elektroporacji równoważą wydajność z możliwością uzyskania maksymalnej całkowitej liczby edytowanych komórek B, a nie najwyższego procentu edytowanych komórek B. Jeśli wymagany jest większy odsetek edytowanych ogniw, zaleca się zwiększenie napięcia (do 1,750 V) lub zmianę długości impulsów (10-30 ms), chociaż można zaobserwować większą śmierć ogniwa. Zauważyliśmy również nieco wyższą wydajność edycji w komórkach B śledziony w porównaniu z komórkami B z PBMC od tej samej osoby (Figura 5); Jednak podstawowa przyczyna tego stanu rzeczy jest obecnie nieznana.
Odkryliśmy, że dodanie 1% DMSO po elektroporacji znacznie zwiększyło wydajność edycji genów o ~ 40% w komórkach B makaka rezusa bez wpływu na żywotność komórek (Figura 6A-C), zgodnie z raportami w innych komórkach43. Należy jednak unikać przedłużonej hodowli w 1% DMSO, która może wpływać na żywotność komórek. W razie potrzeby DMSO można całkowicie pominąć.
Hodowla komórek w małej objętości po elektroporacji przez kilka godzin razem z rAAV6 prowadzi do wyższej wydajności edycji, prawdopodobnie ze względu na lepszą transdukcję HDRT przez rAAV6, a tym samym wyższe wewnątrzkomórkowe stężenie HDRT w odpowiednim czasie, gdy Cas9 jest aktywny. Odkryliśmy, że hodowla komórek w ten sposób przez okres do 8 godzin nie wpłynęła na żywotność komórek, ale wydajność edycji nie wzrosła dramatycznie po 5 godzinach (Figura 6). Jeśli wymagane jest tylko wybicie zamiast knock-in, ten krok można pominąć.
Podsumowując, przedstawiamy kompleksowe protokoły edycji genów limfocytów B makaka rezusa in vitro oraz produkcji rAAV6 HDRT niezbędnego do skutecznego knock-inu pożądanych konstruktów. Protokoły te umożliwiają szybkie i ekonomiczne testowanie wielu konstruktów w pakiecie jako rAAV6 i umożliwiają przedkliniczne testowanie wykonalności i skalowalności terapii komórkami B w bardziej odpowiednim modelu naczelnych innych niż ludzie.

Komórki B są podstawą odporności humoralnej. Po aktywacji przez pokrewny antygen i sygnały wtórne, naiwne limfocyty B dają początek komórkom B centrum rozrodczego, komórkom B pamięci i komórkom plazmatycznym1. Ten ostatni jest źródłem wydzielanych przeciwciał, które pośredniczą w funkcjach ochronnych większości obecnie dostępnych szczepionek2. Komórki plazmatyczne zostały opisane jako fabryki przeciwciał, ponieważ wydzielają ogromne ilości przeciwciał do surowicy - około 2 ng / dzień / komórka 3, wynoszące 7-16 g / L surowicy, co czyni przeciwciała jednym z trzech najliczniej występujących białek w surowicy4. Limfocyty B są obfite we krwi, dzięki czemu można je łatwo pobrać i wprowadzić z powrotem do organizmu.
Te cechy sprawiły, że limfocyty B stały się celem terapii komórkowej mającej na celu edycję genów receptora limfocytów B (BCR) i ekspresję szeroko neutralizujących przeciwciał (bNAbs) przeciwko ludzkiemu wirusowi niedoboru odporności (HIV)5,6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15 i inne białka16,17,18,19,20,21. Takie podejścia wykazały potencjał w licznych badaniach na myszach in vivo7,8,10,11,16,22. Jednak nadal trzeba pokonać kilka przeszkód związanych z translacją kliniczną9,15,23, wśród nich bezpieczeństwo, czas trwania i wielkość skuteczności terapeutycznej, a także skalowanie do większych zwierząt, takich jak naczelne (NHP). Rzeczywiście, NHP, a w szczególności makaki rezusy, które mają długą historię w badaniach nad przeciwciałami i HIV24,25, są najbardziej odpowiednim modelem do testowania tych parametrów.
Tutaj opracowaliśmy protokoły, które umożliwiają rozwiązanie tych problemów. Do tej pory niewiele badań próbowało hodować limfocyty B makaków rezusów ex vivo i tylko pozytywna selekcja przy użyciu CD20 została zgłoszona do oczyszczania komórek B makaków rezusów26,27,28. Ustaliliśmy protokół izolacji nietkniętych komórek B makaka rezusa poprzez ujemne zubożenie innych typów komórek. Ponadto określono warunki hodowli dla ukierunkowanej edycji genów limfocytów B makaka rezusa. Protokół ten określa zastosowanie rybonukleoprotein CRISPR/Cas9 (RNP) i rekombinowanego serotypu 6 wirusa związanego z adenowirusem (rAAV6) jako matrycy naprawy ukierunkowanej na homologię (HDRT) do edycji genów hodowanych komórek B makaków rezusów. Korzystając z tego protokołu, osiągnięto wydajność edycji do 40% przy dużych (~1,5 kb) wstawkach. Przedstawiamy również szybką i opłacalną metodę wytwarzania rAAV6 przy użyciu włączonego tetracykliny, samowyciszającego pomocnika adenowirusowego29, aby umożliwić szybkie testowanie HDRT w tym formacie. Połączone protokoły te opisują wydajny proces edycji genów komórek B makaka rezusa (<silna klasa="xfig">Rysunek 1), umożliwiając ocenę terapii komórkami B w modelu NHP.
Aby rozpocząć eksperymenty, materiał dawcy można zamówić z komercyjnych źródeł lub uzyskać za pomocą flebotomii lub splenektomii. W tym badaniu flebotomia i pobieranie krwi zostały przeprowadzone zgodnie z wcześniejszym opisem30 przy użyciu antykoagulantu EDTA. Aby uzyskać śledzionę, pierwotne limfocyty B makaków rezusów, częściowe (25%-50%) lub całkowite splenektomie wykonano przy użyciu technik opisanych wcześniej31. Zwierzęta były poszczone przez noc przed operacją. Krótko mówiąc, podczas operacji brzuch był obcinany i przygotowywany naprzemiennie peelingami z chlorheksydyny i 70% alkoholu izopropylowego trzy razy. Wykonano nacięcie (5-10 cm) w jamie brzusznej w celu zidentyfikowania i odizolowania śledziony. Układ naczyniowy śledziony podwiązano za pomocą szwów lub zacisków naczyniowych. Nacięcie zamknięto w dwóch warstwach szwami polidioksanonowymi 4-0 PDS. Splenektomię wykonywano jednorazowo dla pojedynczego zwierzęcia. Zawiesiny jednokomórkowe przygotowywano ze śledziony makaków przez macerację przez sitka komórkowe. Komórki jednojądrzaste z zawiesin komórek krwi i śledziony przygotowano za pomocą wirowania w gradiacji gęstości i przechowywano w ciekłym azocie.

<table><tbody><tr><td>Sterylna probówka 1,5 mL, wolna od dnazy, rnaz i purogenów</td><td>Stellar Scientific</td><td>T17-125</td><td>lub podobna</td></tr><tr><td>pipeta serologiczna 10 mL, polistyrenowa, sterylna, niepirogenna, wolna od DNaz/RNaz i ludzkiego DNA</td><td>Corning</td><td>4488</td><td>lub podobna</td></tr><tr><td>15 cm naczynie do hodowli tkankowych</td><td>Falcon</td><td>353025</td><td>lub podobne</td></tr><tr><td>15 ml polipropylenowe stożkowe</td><td>tybe Falcon</td><td>352097</td><td>lub podobne</td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna 25 mL, polistyrenowa, sterylna, niepirogenna, wolna od DNaz/RNaz i ludzkiego DNA</td><td>Corning</td><td>4489</td><td>lub podobna</td></tr><tr><td>250 ml polipropylenowa stożkowa tyba</td><td>Corning</td><td>430776</td><td>lub podobna</td></tr><tr><td>Linia komórkowa 293AAV</td><td>Cell Biolabs</td><td>AAV-100</td><td></td></tr><tr><td>2-B-merkaptoetanol, 55mM (1000x)</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>48-dołkowa hodowla tkankowa płytka</td><td>Corning</td><td>3548</td><td>lub podobna</td></tr><tr><td>pipeta serologiczna 5 ml, polistyrenowa, sterylna, niepirogenna, wolna od DNaz/RNaz i ludzkiego DNA</td><td>Corning</td><td>4487</td><td>lub podobna</td></tr><tr><td>strzykawka 5 ml z końcówką Luer-Lok</td><td>BD</td><td>309646</td><td>lub podobna</td></tr><tr><td>50 ml polipropylenowa stożkowa tybe</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td>lub podobna</td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna 50 ml, polistyrenowa, sterylna, niepirogenna, wolna od DNaz/RNaz i ludzkiego DNA</td><td>Corning</td><td>4490</td><td>lub podobna</td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka do hodowli tkankowej</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td>lub podobny</td></tr><tr><td>System pakowania AAV-6 (plazmidy)</td><td>Cell Biolabs</td><td>VPK-406</td><td></td></tr><tr><td>AAV6 Materiały referencyjne (pełne kapsydy)</td><td>Charles River</td><td>RS-AAV6-FL</td><td></td></tr><tr><td>Accu-jet S Kontroler pipet</td><td>marki</td><td>26350</td><td>lub podobny kontroler pipet</td></tr><tr><td>Antybiotyk/Antybiotyk Grzybiczy 100x</td><td>Gibco</td><td>15260-062</td><td></td></tr><tr><td>anty-ludzki CD14 AlexaFluor647</td><td>Biolegend</td><td>301812</td><td></td></tr><tr><td>anty-ludzka biotyna CD14</td><td>BioLegend</td><td>301826</td><td></td></tr><tr><td>anty-ludzka CD16 AlexaFluor700</td><td>BD Biosciences</td><td>557920</td><td></td></tr><tr><td>anty-ludzka biotyna CD16</td><td>BioLegend</td><td>302004</td><td></td></tr><tr><td>anty-ludzka CD20 PECy7</td><td>Biolegend</td><td>302312</td><td></td></tr><tr><td>anty-ludzka biotyna CD3</td><td>Thermo Fisher</td><td>APS0309</td><td></td></tr><tr><td>anty-ludzka CD3 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>552127</td><td></td></tr><tr><td>anty-ludzka biotyna CD33</td><td>Miltenyi</td><td>130-113-347</td><td></td></tr><tr><td>anty-ludzka biotyna CD64</td><td>BioLegend</td><td></td><td></td>305004</tr><tr><td>anty-ludzka biotyna CD66</td><td>Miltenyi</td><td>130-100-143</td><td></td></tr><tr><td>anty-ludzka biotyna CD89</td><td>BioLegend</td><td>354112</td><td></td></tr><tr><td>anty-ludzka biotyna CD8a</td><td>BioLegend</td><td>301004</td><td></td></tr><tr><td>anty-ludzka HLA-DR BV605</td><td>Biolegend</td><td>307640</td><td></td></tr><tr><td>anty-ludzki łańcuch lekki Ig lambda APC</td><td>Biolegend</td><td>316610</td><td></td></tr><tr><td>anty-ludzki IgM BV421</td><td>Biolegend</td><td>314516</td><td></td></tr><tr><td>anty-ludzki łańcuch lekki Kappa FITC</td><td>Fisher Scientific</td><td>A18854</td><td></td></tr><tr><td>Autoklaw</td><td>Steris</td><td>Amsco Lab 250</td><td>lub podobny</td></tr><tr><td>Inkubator CO2 do hodowli komórkowych</td><td>Fisher Scientific</td><td>51026331</td><td>lub podobny</td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy (Amicon Ultra - 4, 100 kDa)</td><td>Millipore</td><td>UFC810024</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka 5920 R</td><td>Eppendorf</td><td>EP022628188</td><td>lub dowolna, chłodzona wirówka kubełkowa z wkładami do płytek 96-dołkowych, probówki o pojemności 15, 50 i 250 ml</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>C298SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Cpg ODN</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-2395</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34869-500ML</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, wysoka zawartość glukozy</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI (bez RNaz)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303L</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, bez wapnia, bez magnezu</td><td>Zestaw do</td> elektroporacji <td>Gibco 14190144</td><td></td></tr><tr><td>(Neon Transfection System 10 i mikro; L)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>MPK1096</td><td>lub inne rozmiary lub zestaw do transfekcji 100 μl System elektroporacji MPK 10096</td></tr><tr><td>(system transfekcji neonów)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>MPK5000</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Hyclone</td><td>SH30910.03 *</td><td></td></tr> <tr><td>Ficoll-PM400 (Ficoll-Paque PLUS)</td> <td>Cytiva</td><td>17144002</td><td>lub podobny</td></tr><tr><td>okap</td> wyciągowy <td>Fisher Scientific</td><td>FH3943810244</td><td>lub podobne</td></tr><tr><td>Glutamina 200 mM</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Cylinder z podziałką 1L</td><td>Corning</td><td>3022-1L</td><td>lub podobny</td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z375357-1EA</td><td>lub podobny</td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne z płytą grzejną</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP88857200</td><td>lub podobny</td></tr><tr><td>Human BAFF</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>310-13</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki blok BD Fc BD</td><td></td><td>564220</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki IL-10</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>200-10</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki IL-2</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144S-500</td><td></td></tr><tr><td>Hydrofilowe filtry strzykawkowe z polieterosulfonu, (membrana Supor), sterylne - 0,2 i mikro; m, 25 mm&nbsp;</td><td>Pall</td><td>4612</td><td></td></tr><tr><td>Insulina-Transferyna-Selen, 100x</td><td>Gibco</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>Starter ITR do przodu: GGAACCCCTAGTGATGGAGTT</td><td>Zintegrowane technologie DNA niestandardowy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>starter ITR odwrócony: CGGCCTCAGTGAGCGA</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>niestandardowa</td><td></td></tr><tr><td>szafa bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym</td><td>The Baker Company</td><td>SG403A</td><td>lub podobny</td></tr><tr><td>Kolumna o dużym zbożu magnetycznym (LD)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>Separator magentyczny (separator MidiMACS i wielostanowisko)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-329</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-512-127</td><td>lub podobne</td></tr><tr><td>Magnetyczne kulki streptawidyny (Streptavidin MicroBeads)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-101</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Maxiprep</td><td>Machery-Nagel</td><td>740414.5</td><td>lub podobne</td></tr><tr><td>Butelki na media 2L z nakrętką</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-34514-26</td><td>lub podobnym</td></tr><tr><td>MegaCD40L</td><td>Enzo</td><td>ALX-522-110-C010</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Opyczna 384-dołkowa płytka reakcyjna</td><td>Fisher Scientific 4309849</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optyczny klej samoprzylepny</td><td>Fisher Scientific</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka 5424 R</td><td>Eppendorf</td><td>5404000014</td><td>lub dowolna inna wirówka stołowa do probówek 1,5 ml</td></tr><tr><td>Kuchenka mikrofalowa</td><td>Panasonic</td><td>NN-SD987SA</td><td>lub podobna</td></tr><tr><td>Mikroskop kontrastowy z odwróconą fazą TMS firmy Nikon</td><td></td><td>TMS</td><td>lub dowolny inny Mikroskop z odwróconym kontrastem fazowym do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne, 100x</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Beznukleazowy bufor dupleksowy</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>11-01-03-01</td><td></td></tr><tr><td>Woda bez nukleaz</td> pH-metr <td>Qiagen</td><td>129115</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Mettler Toledo</td><td>30019028</td><td>lub podobny</td></tr><tr><td>Zestaw startowy Pipetman Classic, zestaw 4 pipet, P2, P20, P200, P1000 i końcówki</td><td>Gilson</td><td>F167380</td><td>lub podobny zestaw pipet i końcówek</td></tr><tr><td>Pluronic F-68 10 %</td><td>Gibco</td><td>24040-032</td><td></td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy 8000</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP233-1</td><td></td></tr><tr><td>Polietyleno, liniowy, MW 25000, klasa transfekcji (PEI 25K</td><td>Polysciences</td><td>23966-100</td><td></td></tr><tr><td>Waga precyzyjna</td><td>Mettler Toledo</td><td>ME4001TE</td><td>lub podobne</td></tr><tr><td>filtry do wstępnej separacji (30 &mikro; m)</td> <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Zlewka ze szkła Pyrex 2 L</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-34502-13</td><td>lub podobna</td></tr><tr><td>Zlewka ze szkła Pyrex 250 ml</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS1000250</td><td>lub podobny</td></tr><tr><td>Instrument qPCR</td><td>Fisher Scientific</td><td>4485691</td><td>lub podobny</td></tr><tr><td>antygen RC1 losowo biotynylowany</td><td>Bjorkman lab, CalTech</td><td>we własnym zakresie</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>S.p. Cas9 Nuclease</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1081059</td><td></td></tr><tr><td>Scientific 1203 Łaźnia wodna</td><td>VWR</td><td>24118</td><td>lub dowolna kąpiel wodna ustawiona na&nbsp; 37 & C</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-500G</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu 100 mM</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne jednorazowe jednostki filtracyjne z membranami PES</td><td>Thermo&nbsp; Naukowy Nalgene&nbsp;</td><td>567-0020&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>554061</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green Master Mix&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>Samowyciszający wektor adenowirusowy z obsługą tetracykliny RepCap6&nbsp;</td><td>Oxgene</td><td>TESSA-RepCap6</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0,4%</td> <td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>System Oczyszczania Wody</td><td>Millipore Sigma</td><td>ZEQ7000TR</td><td>lub podobny</td></tr><tr><td>Zombie-NIR</td><td>Biolegend</td><td>423106</td><td></td></tr></tbody></table>

edycja genów pierwotnych komórek b makaka rezusa

Gene Editing of Primary Rhesus Macaque B Cells

Limfocyty B i ich potomstwo są źródłem wysoce ekspresji przeciwciał. Ich wysokie możliwości ekspresji białek w połączeniu z ich obfitością, łatwą dostępnością przez krew obwodową i możliwością prostych transferów adopcyjnych sprawiły, że stały się atrakcyjnym celem dla podejść do edycji genów w celu ekspresji rekombinowanych przeciwciał lub innych białek terapeutycznych. Edycja genów pierwotnych komórek B myszy i człowieka jest wydajna, a modele mysie do badań in vivo okazały się obiecujące, ale do tej pory nie wykazano wykonalności i skalowalności dla większych modeli zwierzęcych. W związku z tym opracowaliśmy protokół edycji pierwotnych limfocytów B makaka rezusa in vitro, aby umożliwić takie badania. Opisujemy warunki hodowli in vitro i edycji genów pierwotnych komórek B makaka rezusa z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej lub splenocytów przy użyciu CRISPR / Cas9. Aby osiągnąć ukierunkowaną integrację dużych (<4,5 kb) kaset, dołączono szybki i wydajny protokół przygotowania rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem serotypu 6 jako matrycy naprawczej ukierunkowanej na homologię przy użyciu samowyciszającego wektora pomocniczego adenowirusa z obsługą tetracykliny. Protokoły te umożliwiają badanie prospektywnych terapii komórkami B u makaków rezusów.

Prezentujemy metodę hodowli i edycji genów pierwotnych komórek B makaków rezusów przy użyciu CRISPR/Cas9 i rekombinowanego adenowirusa serotypu 6 do badania terapii komórkami B.

Edycja genów pierwotnych komórek B makaka rezusa

B cells and their progeny are the sources of highly expressed antibodies. Their high protein expression capabilities together with their abundance, easy ...

Metoda jest stosunkowo prosta i pozwala na efektywną edycję genów limfocytów B makaka rezusa. Metoda pozwala na badanie komórek B z edytowanymi genami w celach terapeutycznych u makaków rezusów. Nadaje się również do przedklinicznych badań nad terapią komórkami B.Ogólna metoda może być dostosowana do innych typów komórek. Jeśli procedura zostanie wykonana prawidłowo, nie należy spodziewać się problemów. Jednak jako gRNA, wydajność cięcia i dobrej jakości partia rekombinowanej matrycy dostarczającej AAV6 mają kluczowe znaczenie.Na początek podgrzej pożywkę do hodowli komórek B w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Rozmrozić stymulanty limfocytów B na lodzie. Przygotuj probówkę o odpowiedniej wielkości zawierającą wstępnie podgrzany środek do rozmrażania.Rozmrozić jedną lub dwie fiolki pierwotnych splenocytów makaków rezusów lub PBMC w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zdekantować splenocyty do przygotowanej probówki zawierającej wstępnie podgrzane podłoże do rozmrażania. Opłucz krioprobówki, aby zebrać wszystkie komórki.Odwirować komórki w temperaturze 200 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 mililitrach pożywki do rozmrażania w celu przemycia. Powtórz wirowanie trzy razy, aby usunąć pożywkę zamrażającą.Po ostatnim odwirowaniu ponownie zawieś komórki w ilości około pięć razy 10 do sześciu komórek na mililitr w pożywce do hodowli komórek B. Połącz 10 mikrolitrów zawiesiny komórek z 10 mikrolitrami 0,4% błękitu trypanowego i policz komórki na hemocytometrze. Dostosuj stężenie komórek do trzech razy 10 do sześciu komórek na mililitr za pomocą pożywki do hodowli komórek B zgodnie z liczbą komórek.Następnie dodaj stymulanty limfocytów B do ich końcowych stężeń i wymieszaj. Przenieś komórki do naczynia do hodowli komórkowej i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 48 godzin. Po osiadaniu komórki powinny tworzyć gęstą monowarstwę, a małe skupiska komórek mogą być już widoczne.Po około dwóch dniach komórki powinny być zdrowe, nieregularne i utworzyły widocznie większe skupiska. Po aktywacji limfocytów B przygotuj odczynniki do elektroporacji i transdukcji. Wstępnie podgrzej beznukleazowy bufor dupleksowy DMSO, bufor T i bufor E lub E2 z zestawu do elektroporacji do temperatury pokojowej.Rozmrozić szablon naprawczy skierowany homologią rAAV6 lub HDRT i stymulanty limfocytów B na lodzie. Ponownie zawiesić CRISPR Cas9 z pojedynczym przewodnikiem RNA lub sgRNA na poziomie 100 mikromolów w buforze dupleksowym. Rozpuść przez 10 minut w temperaturze pokojowej i mieszaj, wirując i strzepując.Umieść odtworzone sgRNA na lodzie do czasu użycia. Do elektroporacji 10 mikrolitrów przygotuj 550 mikrolitrów pożywki do hodowli komórek B ze stymulantami i 1% DMSO. Dodaj 50 mikrolitrów tej pożywki z antybiotykami lub bez nich do 48-dołkowej płytki do hodowli komórkowej.Następnie dodaj rAAV6 HDRT do pożywki w studzienkach, do 20% objętości studzienki. Podgrzej przygotowane danie i pozostałą pożywkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Następnie do elektroporacji o pojemności 10 mikrolitrów przygotuj 1,15 mikrolitra rybonukleoproteiny lub RNP, mieszając 0,4 mikrolitra 61-mikromolowego Cas9 z 0,75 mikrolitra 100-mikromolowego sgRNA w buforze dupleksowym.Inkubować RNP przez 15 minut w temperaturze pokojowej przed zmieszaniem go z komórkami. Po inkubacji można połączyć wiele RNP, jeśli jednocześnie ma być celem więcej niż jednego locus. Następnie przygotuj ogniwa do elektroporacji.Pozostaw ogniwa w temperaturze pokojowej, aby uniknąć szoku temperaturowego. Po inkubacji zebrać komórki do odpowiedniego naczynia. Opłucz naczynie DPBS, aby zebrać maksymalną liczbę komórek.Odwirować komórki przy sile 200 G przez 10 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w DPBS w ilości około dwa razy 10 do sześciu komórek na mililitr, w zależności od liczby komórek wprowadzonych do hodowli. Połącz równe objętości zawiesiny komórkowej i 0,4% błękitu trypanowego i policz za pomocą hemocytometru.Po odwirowaniu i odrzuceniu supernatantu, ponownie zawiesić komórki we wstępnie podgrzanym buforze T w proporcji 5,55 razy 10 do siedmiu komórek na mililitr, w oparciu o liczbę komórek. Skonfiguruj system transfekcji, włączając maszynę i ustawiając ją na 1 350 woltów, 15 milisekund i jeden impuls. Umieść stację pipetową w okapie z przepływem laminarnym.Dla każdego zestawu 10 elektroporacji przygotuj probówkę do transfekcji z trzema mililitrami buforu E. Włóż probówkę do stacji pipetowej. Połącz 1,15 mikrolitra RNP z dziewięcioma mikrolitrami ogniw na elektroporację. Przygotuj co najmniej 20% więcej, aby uniknąć pęcherzyków i inkubuj w temperaturze pokojowej przez minutę przed elektroporacją.Zassać 10 mikrolitrów mieszaniny RNP i komórek do końcówki do elektroporacji na pipecie do elektroporacji. Włóż załadowaną pipetę do stacji pipetowej i rozpocznij elektroporację. Upewnij się, że końcówki są całkowicie wolne od pęcherzyków powietrza, aby zapobiec wyładowaniom łukowym.Natychmiast wyrzuć elektroporowane ogniwa do przygotowanej, wstępnie podgrzanej, małej objętości pożywki, z rAAV6 lub bez, wewnątrz 48-dołka. Dodać próbki kontrolne bez transfekcji do dołków hodowlanych. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez cztery do sześciu godzin.Pod koniec inkubacji dodać do płytki 450 mikrolitrów wstępnie podgrzanej pożywki do hodowli komórek B zawierającej stymulanty, DMSO oraz z antybiotykami lub bez. Wykonaj analizę genomowego DNA po 24 godzinach. Określ ilościowo wydajność edycji za pomocą cyfrowej kropelkowej reakcji łańcuchowej polimerazy lub PCR, używając startera na zewnątrz ramienia homologicznego i startera wewnątrz wkładki.Wykonaj PCR, aby wzmocnić miejsce wprowadzenia i sekwencjonowanie Sangera, aby zweryfikować poprawność edycji. Aby przeanalizować poziomy białka, hoduj komórki przez 40 do 48 godzin po elektroporacji, aby umożliwić zmiany w ekspresji białek i przeprowadź analizę za pomocą cytometrii przepływowej. Produkcja rAAV6 przy użyciu samowyciszającego pomocnika adenowirusowego z obsługą tetracykliny skutkowała produkcją od czterech razy od 10 do 10 GC na mililitr pożywki do hodowli komórkowych, przewyższając produkcję przy użyciu potrójnej transfekcji bez pomocy od 30 do 40 razy.Opcjonalne oczyszczanie spowodowało eliminację większości komórek T CD3 + oraz komórek szpikowych CD14 + i CD16 +, przy czym rutynowo uzyskuje się czystość od 80 do 95% komórek CD20 + B. Pokazano tutaj edycję genów pierwotnych limfocytów B makaka rezusa. Badanie to utrzymało wysoką żywotność komórek, jednocześnie usuwając ekspresję łańcucha lekkiego w 80% komórkach B.Większość limfocytów B nadal wykazywała ekspresję izotypu IgM. Dodanie rAAV6 kodującego przeciwciało 1485 HDRT spowodowało edycję genu i ekspresję powierzchniową przeciwciała 1485 w 16 do 21% limfocytów B, choć przy niższej intensywności fluorescencji dla łańcuchów przeciwciał niż na nieedytowanych komórkach B. Dodanie 1% DMSO i rozszerzone, skoncentrowane inkubacje z rAAV6 HDRT ogólnie zwiększyły wydajność edycji.Stosując tę metodę, zazwyczaj osiągano od pięciu do 20% i do 40% wydajności edycji, w zależności od indywidualnego makaka rezusa i jakości partii rAAV6 HDRT. Podczas wykonywania elektroporacji upewnij się, że masz wystarczającą ilość mieszanki do transfekcji i że w końcówce nie ma pęcherzyków. Komórki można analizować dowolną metodą lub przeprowadzić autologiczny transfer do dawcy makaka rezusa.

gene-editing-of-primary-rhesus-macaque-b-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przedstawiamy użyteczność wielokolorowej cytometrii przepływowej w szczegółowej charakterystyce fenotypowej i funkcjonalnej całkowitych populacji, a także podzbiorów komórek pamięci limfocytów T CD4+ i CD8+ u makaków rhesus, które stanowią idealny model w badaniach nad szczepionkami przeciwko HIV/AIDS.

Wielokolorowe analizy cytometryczne odpowiedzi immunologicznej komórkowej u makaków rezus

Opisujemy metodę modyfikacji genetycznej pierwotnych ludzkich limfocytów T za pomocą transgenu przy użyciu niewirusowego systemu transpozonu piggyBac. Limfocyty T zmodyfikowane z wykorzystaniem systemu transpozonu piggyBac wykazują stabilną ekspresję transgenu.

Modyfikacja pierwotnych ludzkich limfocytów T za pomocą systemu transpozonalnego piggyBac

Tutaj prezentujemy zoptymalizowany protokół do liczenia i charakteryzowania limfocytów T CD8+ makaków rezusów przeciwko wirusowi AIDS. Ten artykuł jest przydatny nie tylko w dziedzinie immunologii HIV, ale także w innych obszarach badań biomedycznych, w których wiadomo, że odpowiedzi limfocytów T CD8 + wpływają na wynik choroby.

Analiza limfocytów T CD8 + specyficznych dla małpiego wirusa niedoboru odporności u makaków rezusów za pomocą barwienia tetramerem peptydowo-MHC-I

Wykorzystanie wstępnie złożonego kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9 (RNP) to potężna metoda precyzyjnej, efektywnej edycji genomu. W tym miejscu podkreślamy jego użyteczność w szerokim zakresie komórek i organizmów, w tym pierwotnych komórek ludzkich oraz zarówno klasycznych, jak i powstających organizmów modelowych.

Ulepszona edycja genomu za pomocą rybonukleoproteiny Cas9 w różnych komórkach i organizmach

Celem tego protokołu jest wyizolowanie komórek CD34+ naczelnych innych niż człowiek z przygotowanego szpiku kostnego, modyfikowanie genów tych komórek za pomocą wektorów lentiwirusowych oraz przygotowanie produktu do infuzji do autologicznego gospodarza. Łączna długość protokołu wynosi około 48 godzin.

Przygotowanie i modyfikacja genów hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych naczelnych

Prezentowany jest tutaj protokół do efektywnej edycji genów za pośrednictwem rybonukleoproteiny CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków za pomocą elektroporacji rurkowej.

CRISPR/Cas9 Precyzyjna edycja genów za pośrednictwem rybonukleoprotein za pomocą elektroporacji rurkowej

Przedstawiamy 9-dniowy protokół transdukcji i ekspansji komórek jednojądrzastych krwi obwodowej makaków rezusów, który daje komórki o doskonałej koekspresji interesujących genów w liczbie wystarczającej do badań infuzyjnych skuteczności komórek.

Transdukcja i ekspansja pierwotnych limfocytów T w ciągu dziewięciu dni z utrzymaniem fenotypu pamięci centralnej

Tutaj udostępniamy szczegółowy, krok po kroku protokół inżynierii genomowej opartej na CRISPR/Cas9 pierwotnych ludzkich limfocytów B do nokautowania genów (KO) i knock-in (KI) w celu zbadania biologicznych funkcji genów w komórkach B i rozwoju terapii komórek B.

Inżynieria genomu pierwotnych ludzkich komórek B przy użyciu CRISPR/Cas9

Celem tego protokołu jest umożliwienie bezproblemowej edycji genomu C. elegans za pomocą CRISPR/Cas9 przy użyciu złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych i markera co-CRISPR dpy-10 do badań przesiewowych. Protokół ten może być stosowany do dokonywania różnych modyfikacji genetycznych u C. elegans, w tym insercji, delecji, wymiany genów i podstawiania kodonów.

Edycja CRISPR/Cas9 genu rbm-3.2 C. elegans przy użyciu markera przesiewowego dpy-10 Co-CRISPR i złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych.

Ten protokół opisuje procedurę edycji genomu w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy przy użyciu kompleksów rybonukleoprotein Cas9-sgRNA składanych in vitro i dostarczanych przez elektroporację.

Wysokowydajne rozrywanie genów w pierwotnych makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego przy użyciu elektroporowanych kompleksów Cas9-sgRNA

Dostarczanie edytorów genomu jako RNA jest szczególnie skuteczną metodą modyfikacji genomów komórek pierwotnych ssaków i linii komórkowych. Celem tego protokołu jest dostarczenie edytorów genomu jako mRNA do pierwotnych komórek ssaków i linii komórkowych, po którym następuje ukierunkowane sekwencjonowanie i analiza Illumina w celu ilościowego określenia wyników edycji.

Edycja genomu w pierwotnych komórkach ssaków poprzez elektroporację edytora RNA

Poznaj metodę edycji genów pierwotnych komórek B makaka rezusa przy użyciu CRISPR/Cas9 i rAAV6. Technika ta umożliwia badania terapii komórkowych B i może być dostosowana do innych typów komórek.

Edycja genów pierwotnych komórek B makaka rezusa

Przeglądaj więcej filmów