Ekstrakcja zmodyfikowanych mikrotubul z komórek ssaków w celu badania kompleksów mikrotubula-białko za pomocą mikroskopii krioelektronowej

Badania strukturalne białek oddziałujących z mikrotubulami za pomocą mikroskopii krioelektronowej mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia mechanizmów komórkowych. Przygotowanie jednorodnych mikrotubul związanych z oddziałującymi białkami na siatce krio-EM ma kluczowe znaczenie dla sukcesu. Protokół ten jest prosty, tani i pozwala na przygotowanie mikrotubul z kontrolowanymi modyfikacjami potranslacyjnymi w ilości i jakości wystarczającej do mikroskopii krioelektronowej.

Mikrotubule są bardzo wrażliwe na temperaturę. Dlatego ważne jest, aby roztwory zawierające mikrotubule były ciepłe, aby zapobiec depolimeryzacji. Na początek należy wyhodować genetycznie zmodyfikowaną linię komórkową HCT116 w pożywce do hodowli komórek DMEM, aż do uzyskania od sześciu do 12 zlewających się płytek.

Delikatnie umyj komórki 10 mililitrami PBS, aby usunąć wszelkie pożywki do hodowli komórkowych. Oderwij komórki od płytek, inkubując komórki przez pięć minut w temperaturze pokojowej z trzema mililitrami lodowatego PBS uzupełnionego pięciomilimolowym EDTA, a następnie za pomocą skrobaka do komórek. Zbierz komórki do 50-mililitrowej probówki na lodzie i wiruj z prędkością 250 G przez 10 minut.

Zwróć uwagę na objętość zebranych komórek za pomocą skali wolumetrycznej na probówce. Ponownie zawiesić zebrany osad komórkowy w równej objętości buforu do lizy i poddać je lizie komórek za pomocą sonikacji. Po sonikacji, do analizy SDS-PAGE, dodaj dwa mikrolitry lizatu do probówki zawierającej 18 mikrolitrów wody i pięć mikrolitrów buforu do próbek 5X SDS.

Pozostałe zlizowane komórki odpipetować do probówki wirówkowej i wirować z prędkością 100 000 G przez jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wirniku ultrawirówkowym w celu usunięcia lizatu. Za pomocą strzykawki usuń oczyszczony lizat, nie naruszając osadu i pływającej warstwy na wierzchu. Dodaj dwa mikrolitry oczyszczonego lizatu do probówki zawierającej 18 mikrolitrów wody i pięć mikrolitrów buforu do próbek 5X SDS.

Ostrożnie opłucz osad i zgarnij trochę osadu, przekręcając końcówkę pipety P-10 przez osad. Następnie dodaj 200 mikrolitrów wody i 50 mikrolitrów buforu SDS. Dodaj jednomilimolowy GTP i 20-mikromolowy paklitaksel do zebranego supernatantu w celu polimeryzacji mikrotubul i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, aby umożliwić mikrotubulom złożenie się.

Przygotować bufor poduszkowy, dodając 600 mikrolitrów glicerolu do 400 mikrolitrów buforu do lizy i uzupełnić mieszaninę 20 mikromolowym paklitakselem. Rozgrzej bufor do 37 stopni Celsjusza. Dodać 800 mikrolitrów buforu poduszkowego do probówki ultrawirówkowej.

Następnie ostrożnie odpipetować lizat z dodatkiem GTP-paklitakselu na wierzchu buforu poduszkowego. Umieść probówkę w wirniku ultrawirówki, aby wirowała z prędkością 100 000 G w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 30 minut. Zaznacz skierowaną na zewnątrz krawędź probówki, aby łatwo rozpoznać, gdzie powinna uformować się osadka mikrotubuli.

Po odwirowaniu ostrożnie usunąć bufor poduszki za pomocą pipety, nie naruszając osadu. Ostrożnie dodaj bufor do lizy obok osadu, obróć rurkę kilka razy, aby usunąć jak najwięcej glicerolu z osadu i ścianek probówki, a następnie odessać i powtórzyć krok mycia trzy razy. Delikatnie zawiesić umyty granulat z odciętą końcówką w 50 mikrolitrach wstępnie podgrzanego bufora do sporządzania zawiesiny i umieścić probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Dodaj dwa mikrolitry zawieszonej frakcji osadów w 18 mikrolitrach wody i pięciu mikrolitrach buforu do próbek 5X SDS. Przygotuj zamrażarkę wgłębną, instalując bibułę. Ustaw temperaturę urządzenia na 30 stopni Celsjusza i nawilżanie na 100%Pozwól urządzeniu osiągnąć równowagę przez 30 minut.

Przygotuj ustawienia zamrażarki wgłębnej na dwie aplikacje. Dla pierwszej aplikacji ustaw siłę na 10, dwie sekundy czasu kleksa i zero sekund czasu oczekiwania. W przypadku drugiej aplikacji ustaw siłę na 10, 6,5 sekundy czasu blot i 10 sekund czasu oczekiwania.

Umieść kratki stroną z włókna węglowego do góry w pojeździe z metalowym wyrzutem żaru. Wyładowanie jarzeniowe w mikroskopii krioelektronowej lub siatkach EM o natężeniu 30 miliamperów przez 60 sekund. Schłodzić zespół pojemnika z polistyrenu ciekłym azotem i przygotować ciekły etan w metalowym kubku, skraplając etan w zimnym metalowym kubku.

Rozcieńczyć białko oddziałujące z mikrotubulami w równej objętości buforem rozcieńczającym przed nałożeniem go na siatki w celu obniżenia stężenia w komórkach. Ustaw mikser w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Użyj ciepłego metalowego bloku w izolacyjnym pudełku z polistyrenu, jeśli w pobliżu urządzenia do zamrażania wgłębnego nie ma bloku grzewczego.

Chwyć rozżarzoną siatkę za pomocą pęsety wgłębnej i wciśnij ją do zamrażarki wgłębnej. Umieść pojemnik z polistyrenu z ciekłym etanem w zamrażarce wgłębnej i uruchom przygotowany program. Najpierw nałóż 3,5 mikrolitra roztworu mikrotubul na siatkę.

Pozwól zamrażarce zanurzeniowej osuszyć siatkę. Następnie natychmiast nałóż 3,5 mikrolitra rozcieńczonego białka. I na koniec pozwól, aby tłok osuszył się i zanurz zamrozić siatkę w ciekłym etanie.

Przenieś siatki do skrzynki do przechowywania siatki i przechowuj je w ciekłym azocie Dewara do czasu obrazowania. Jakość i stężenie wyekstrahowanych mikrotubul oceniano za pomocą żelu SDS barwionego Coomassie. Nieliniowa linia regresji względnych wielkości BSA, wyprowadzona z interpolacji pasma mikrotubul około 50 kilodaltonów w pasie P2 z krzywą BSA, wskazuje końcowe stężenie 1,42 miligrama na mililitr.

Zgadza się to dobrze z liczbą zmierzoną spektrofotometrem przez dwie osoby. Świeżo wyekstrahowane mikrotubule wykorzystano do wykonania próbek krio-EM. Mikrotubule wyglądają na nienaruszone i obfite na mikrofotografiach.

Gęstość mikrotubul na mikrofotografię nie powinna być zbyt wysoka, aby uniknąć krzyżowania się mikrotubul. Uszkodzone mikrotubule wskazują, że mikrotubule są zdepolimeryzowane lub że stężenie mikrotubul było zbyt gęste. Mikrotubule związane z MATCAP miały ostre krawędzie charakteryzujące się gęstymi od elektronów kropkami na powierzchni mikrotubul.

W obliczonych klasach 2D można było również wyróżnić mikrotubule związane z MATCAP i niezwiązane z MATCAP. Wykonanie siatek krio-EM tą metodą może pozwolić na badanie struktury mikrotubul związanych z określonym białkiem oddziałującym. Może to prowadzić do lepszego zrozumienia mechanizmów zachodzących w strukturalnej biologii komórki.