Opracowanie i optymalizacja modelu organoidowego ludzkiego raka wątrobowokomórkowego pochodzącego od pacjentów w celu identyfikacji potencjalnego celu i odkrycia leku

Nasze laboratorium ma na celu zbadanie molekularnej patogenezy raka wątroby i zidentyfikowanie nowych celów terapeutycznych do opracowania leków. Chcielibyśmy odpowiedzieć na pytanie, w jaki sposób rak inicjuje przerzuty i postęp w kierunku tolerancji leków, wykorzystując nowe modele chorób, takie jak organoidy pochodzące od pacjentów. Obecne wyzwania eksperymentalne dotyczą dwóch aspektów.

Po pierwsze, brakuje kompletnego zestawu protokołów do konstruowania organoidów raka wątrobowokomórkowego dla całego procesu. Po drugie, rozmiar hodowanych organoidów HCC jest zbyt mały, aby można je było później przetworzyć eksperymentalnie. W niniejszym protokole podajemy szczegółowe informacje na temat zoptymalizowanych procedur hodowli organoidów oraz późniejszych procedur przenoszenia i zamrażania, a także środków ostrożności, które należy podjąć podczas wszystkich procedur.

Zoptymalizowaliśmy skład podłoża organoidowego pod kątem pozyskiwania większych organoidów o charakterystyce tkanek zbliżonej do pierwotnej. Będziemy monitorować ewolucję guza za pomocą nowo ustabilizowanych organoidów pacjentów i spróbujemy zidentyfikować nowy mechanizm molekularny i cele terapeutyczne w leczeniu HCC. Aby rozpocząć dysocjację tkanek, należy pobrać od jednego do dwóch centymetrów sześciennych tkanki raka wątrobowokomórkowego lub HCC od nieleczonych pacjentów.

Następnie umieść tkankę w roztworze do konserwacji tkanek i utrzymuj ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu przetworzenia. Teraz podgrzej płytki do hodowli komórkowych o bardzo niskiej powierzchni przylegania przez godzinę w inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza. Wyciąg z błony podstawnej należy spiłować na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Za pomocą nożyczek chirurgicznych pokrój tkankę nowotworową na małe kawałki na szalce Petriego wewnątrz kaptura z przepływem laminarnym. Przenieś te kawałki do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów i dodaj od pięciu do 10 mililitrów podłoża podstawowego. Za pomocą pipety barotropowej zmyj jak najwięcej krwi.

Pozostawić mieszaninę do osiadania przez jedną do dwóch minut przed usunięciem części supernatantu, w tym wszelkich komórek krwi i pływających skrzepów tłuszczu. Następnie odwirować mieszaninę w stężeniu 300 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie ostrożnie wyekstrahuj supernatant i dodaj pięć mililitrów podgrzanego roztworu trawiącego do przyciętej tkanki.

Umieść probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wirniku, aby uzyskać optymalne trawienie. Po 30 minutach wstępnego trawienia użyj mikroskopu, aby poszukać małych skupisk komórek. Aby zatrzymać trawienie, dodaj do probówki pięć mililitrów zimnej pożywki podstawowej.

Następnie użyj filtra komórkowego o średnicy 100 mikrometrów, aby przesiać do nowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Napełnij probówkę zimnym podłożem podstawowym, aby osiągnąć całkowitą objętość 50 mililitrów. Następnie odwiruj komórki w temperaturze dwóch G przez 10 minut w temperaturze ośmiu stopni Celsjusza.

Po zakończeniu ostrożnie usunąć sklarowaną nad nim ciecz. Zawiesić osad w 50 mililitrach zimnego podłoża podstawowego, aby uzyskać osad komórkowy do posiewu organoidów. Aby wykonać posiew organoidowy, najpierw usuń supernatant z wirówki i umyj komórki raka wątrobowokomórkowego.

Ponownie zawiesić komórki w 50 mikrolitrach ekstraktu z błony podstawnej lub BME na studzienkę w celu posiewania. Następnie zawieś komórki w zaawansowanym DMEM/F12. Następnie delikatnie odpipetować agregacje komórek, aż do uzyskania równomiernej zawiesiny.

Dodaj BME do zawiesiny, upewniając się, że stężenie BME wynosi od 30 do 50% Teraz wysiew 50 mikrolitrów kropelek BME z klastrami komórek na środku 24-dołkowej płytki. Pozwól kropelkom zastygnąć w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut. Dodaj 500 mikrolitrów podgrzanej pożywki do każdej studzienki i inkubuj w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Odświeżaj pożywkę hodowlaną co dwa do trzech dni. Po dwóch tygodniach zastąp pożywkę izolacyjną pożywką do ekspandowania organoidów. Po siedmiu do 10 dniach hodowli, gdy organoidy osiągną odpowiednią gęstość, należy przetworzyć kultury zgodnie z potrzebami.

Aby przejść przez organoidy, najpierw podgrzej płytki do hodowli komórek o bardzo niskiej powierzchni przylegania w inkubatorze. Następnie rozmrozić zamrożony BME przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza aż do momentu tuż przed użyciem. Podgrzej roztwór do zbioru organoidów i substytut trypsyny w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Po zakończeniu etapu przygotowania należy usunąć pożywkę hodowlaną z płytki hodowlanej organoidu. Następnie przenieś zawiesinę organoidów do 15-mililitrowej probówki. Teraz dodaj roztwór do zbierania organoidów proporcjonalnie do ilości BME.

Aby wymieszać zawiesinę, użyj pistoletu do pipet o pojemności 1000 mikrolitrów do zeskrobywania i pipetowania w górę iw dół. Po inkubacji probówki w temperaturze pokojowej przez 30 minut, użyj pipety o pojemności jednego mililitra, aby ostrożnie zassać BME. Upewnij się, że BME jest całkowicie rozpuszczony.

Monitoruj ekstrakt co 10 minut, aż pojawi się wyraźny klaster komórek organoidowych. Następnie odwirować w temperaturze pokojowej przy 400 G przez pięć minut. Usunąć jak najwięcej supernatantu.

Aby rozpocząć trawienie enzymatyczne organoidów raka wątrobowokomórkowego, dodaj od jednego do pięciu mililitrów podgrzanego substytutu trypsyny do hodowanego osadu organoidowego. Inkubować zawiesinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie minuty. Użyj mikroskopu, aby sprawdzić, czy organoidy dysocjują na małe skupiska od dwóch do 10 komórek.

Aby zatrzymać trawienie, dodaj odpowiednią objętość zimnego podłoża podstawowego. Następnie odwirować organoidy w stężeniu 400 G przez pięć minut w temperaturze ośmiu stopni Celsjusza. Ostrożnie usunąć jak najwięcej supernatantu.

Ponownie zawiesić żądaną liczbę organoidów w odpowiedniej matrycy do posiewu. Co 10 dni pasuj organoidy w zależności od gęstości wzrostu organoidów. Sferoidy organoidowe HCC obserwowano w ciągu trzech dni hodowli.

Zwarte sferoidy z zaokrąglonymi krawędziami i przepuszczalnym cytozolem zaobserwowano w pierwszym dniu założenia. Organoidy były podobnej wielkości i miały największą średnicę, gdy były hodowane w 30 do 50% BME. BME był najbardziej rozdrobniony na poziomie 10%, co skutkowało najmniejszymi organoidami.

BME był najbardziej nienaruszony w 100%, ale zaowocował organoidami o średniej średnicy. Rozmnażający się organoid HCC osiągnął rozmiar przekraczający 500 mikrometrów w każdej kulturze po trzech pokoleniach. W ciągu 20-dniowego okresu hodowli uzyskano organoidy HCC o znacznych rozmiarach przekraczających 1000 mikrometrów.