Opracowanie i optymalizacja modelu organoidowego ludzkiego raka wątrobowokomórkowego pochodzącego od pacjentów w celu identyfikacji potencjalnego celu i odkrycia leku
18 sierpnia 2023
Zapewniamy kompleksowy przegląd i udoskonalenie istniejących protokołów tworzenia organoidów raka wątrobowokomórkowego (HCC), obejmując wszystkie etapy hodowli organoidów. System ten służy jako cenny model do identyfikacji potencjalnych celów terapeutycznych i oceny skuteczności kandydatów na leki.
Nasze laboratorium ma na celu zbadanie molekularnej patogenezy raka wątroby i zidentyfikowanie nowych celów terapeutycznych do opracowania leków. Chcielibyśmy odpowiedzieć na pytanie, w jaki sposób rak inicjuje przerzuty i postęp w kierunku tolerancji leków, wykorzystując nowe modele chorób, takie jak organoidy pochodzące od pacjentów. Obecne wyzwania eksperymentalne dotyczą dwóch aspektów.
Po pierwsze, brakuje kompletnego zestawu protokołów do konstruowania organoidów raka wątrobowokomórkowego dla całego procesu. Po drugie, rozmiar hodowanych organoidów HCC jest zbyt mały, aby można je było później przetworzyć eksperymentalnie. W niniejszym protokole podajemy szczegółowe informacje na temat zoptymalizowanych procedur hodowli organoidów oraz późniejszych procedur przenoszenia i zamrażania, a także środków ostrożności, które należy podjąć podczas wszystkich procedur.
Zoptymalizowaliśmy skład podłoża organoidowego pod kątem pozyskiwania większych organoidów o charakterystyce tkanek zbliżonej do pierwotnej. Będziemy monitorować ewolucję guza za pomocą nowo ustabilizowanych organoidów pacjentów i spróbujemy zidentyfikować nowy mechanizm molekularny i cele terapeutyczne w leczeniu HCC. Aby rozpocząć dysocjację tkanek, należy pobrać od jednego do dwóch centymetrów sześciennych tkanki raka wątrobowokomórkowego lub HCC od nieleczonych pacjentów.
Następnie umieść tkankę w roztworze do konserwacji tkanek i utrzymuj ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu przetworzenia. Teraz podgrzej płytki do hodowli komórkowych o bardzo niskiej powierzchni przylegania przez godzinę w inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza. Wyciąg z błony podstawnej należy spiłować na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Za pomocą nożyczek chirurgicznych pokrój tkankę nowotworową na małe kawałki na szalce Petriego wewnątrz kaptura z przepływem laminarnym. Przenieś te kawałki do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów i dodaj od pięciu do 10 mililitrów podłoża podstawowego. Za pomocą pipety barotropowej zmyj jak najwięcej krwi.
Pozostawić mieszaninę do osiadania przez jedną do dwóch minut przed usunięciem części supernatantu, w tym wszelkich komórek krwi i pływających skrzepów tłuszczu. Następnie odwirować mieszaninę w stężeniu 300 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie ostrożnie wyekstrahuj supernatant i dodaj pięć mililitrów podgrzanego roztworu trawiącego do przyciętej tkanki.
Umieść probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wirniku, aby uzyskać optymalne trawienie. Po 30 minutach wstępnego trawienia użyj mikroskopu, aby poszukać małych skupisk komórek. Aby zatrzymać trawienie, dodaj do probówki pięć mililitrów zimnej pożywki podstawowej.
Następnie użyj filtra komórkowego o średnicy 100 mikrometrów, aby przesiać do nowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Napełnij probówkę zimnym podłożem podstawowym, aby osiągnąć całkowitą objętość 50 mililitrów. Następnie odwiruj komórki w temperaturze dwóch G przez 10 minut w temperaturze ośmiu stopni Celsjusza.
Po zakończeniu ostrożnie usunąć sklarowaną nad nim ciecz. Zawiesić osad w 50 mililitrach zimnego podłoża podstawowego, aby uzyskać osad komórkowy do posiewu organoidów. Aby wykonać posiew organoidowy, najpierw usuń supernatant z wirówki i umyj komórki raka wątrobowokomórkowego.
Ponownie zawiesić komórki w 50 mikrolitrach ekstraktu z błony podstawnej lub BME na studzienkę w celu posiewania. Następnie zawieś komórki w zaawansowanym DMEM/F12. Następnie delikatnie odpipetować agregacje komórek, aż do uzyskania równomiernej zawiesiny.
Dodaj BME do zawiesiny, upewniając się, że stężenie BME wynosi od 30 do 50% Teraz wysiew 50 mikrolitrów kropelek BME z klastrami komórek na środku 24-dołkowej płytki. Pozwól kropelkom zastygnąć w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut. Dodaj 500 mikrolitrów podgrzanej pożywki do każdej studzienki i inkubuj w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Odświeżaj pożywkę hodowlaną co dwa do trzech dni. Po dwóch tygodniach zastąp pożywkę izolacyjną pożywką do ekspandowania organoidów. Po siedmiu do 10 dniach hodowli, gdy organoidy osiągną odpowiednią gęstość, należy przetworzyć kultury zgodnie z potrzebami.
Aby przejść przez organoidy, najpierw podgrzej płytki do hodowli komórek o bardzo niskiej powierzchni przylegania w inkubatorze. Następnie rozmrozić zamrożony BME przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza aż do momentu tuż przed użyciem. Podgrzej roztwór do zbioru organoidów i substytut trypsyny w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.
Po zakończeniu etapu przygotowania należy usunąć pożywkę hodowlaną z płytki hodowlanej organoidu. Następnie przenieś zawiesinę organoidów do 15-mililitrowej probówki. Teraz dodaj roztwór do zbierania organoidów proporcjonalnie do ilości BME.
Aby wymieszać zawiesinę, użyj pistoletu do pipet o pojemności 1000 mikrolitrów do zeskrobywania i pipetowania w górę iw dół. Po inkubacji probówki w temperaturze pokojowej przez 30 minut, użyj pipety o pojemności jednego mililitra, aby ostrożnie zassać BME. Upewnij się, że BME jest całkowicie rozpuszczony.
Monitoruj ekstrakt co 10 minut, aż pojawi się wyraźny klaster komórek organoidowych. Następnie odwirować w temperaturze pokojowej przy 400 G przez pięć minut. Usunąć jak najwięcej supernatantu.
Aby rozpocząć trawienie enzymatyczne organoidów raka wątrobowokomórkowego, dodaj od jednego do pięciu mililitrów podgrzanego substytutu trypsyny do hodowanego osadu organoidowego. Inkubować zawiesinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie minuty. Użyj mikroskopu, aby sprawdzić, czy organoidy dysocjują na małe skupiska od dwóch do 10 komórek.
Aby zatrzymać trawienie, dodaj odpowiednią objętość zimnego podłoża podstawowego. Następnie odwirować organoidy w stężeniu 400 G przez pięć minut w temperaturze ośmiu stopni Celsjusza. Ostrożnie usunąć jak najwięcej supernatantu.
Ponownie zawiesić żądaną liczbę organoidów w odpowiedniej matrycy do posiewu. Co 10 dni pasuj organoidy w zależności od gęstości wzrostu organoidów. Sferoidy organoidowe HCC obserwowano w ciągu trzech dni hodowli.
Zwarte sferoidy z zaokrąglonymi krawędziami i przepuszczalnym cytozolem zaobserwowano w pierwszym dniu założenia. Organoidy były podobnej wielkości i miały największą średnicę, gdy były hodowane w 30 do 50% BME. BME był najbardziej rozdrobniony na poziomie 10%, co skutkowało najmniejszymi organoidami.
BME był najbardziej nienaruszony w 100%, ale zaowocował organoidami o średniej średnicy. Rozmnażający się organoid HCC osiągnął rozmiar przekraczający 500 mikrometrów w każdej kulturze po trzech pokoleniach. W ciągu 20-dniowego okresu hodowli uzyskano organoidy HCC o znacznych rozmiarach przekraczających 1000 mikrometrów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowy protokół tworzenia organoidów raka wątrobowokomórkowego (HCC), odnosząc się do wyzwań związanych z hodowlą organoidów. Udoskonalone metody mają na celu zwiększenie rozmiaru i żywotności organoidów w celu identyfikacji celów terapeutycznych oraz testowania leków.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Onkologia
- Biologia komórki
Wstęp
- Rak wątrobowokomórkowy jest główną przyczyną zgonów związanych z nowotworami.
- Obecne modele służące do badania HCC mają ograniczoną skuteczność.
- Organoidy pochodzące od pacjentów oferują nowatorskie podejście do badania raka wątroby.
- Istnieje potrzeba opracowania kompleksowych protokołów w celu optymalizacji hodowli organoidów.
Cel badania
- Zbadanie mechanizmów molekularnych raka wątroby.
- Identyfikacja nowych celów terapeutycznych dla rozwoju leków.
- Poprawa wielkości i funkcjonalności organoidów HCC na potrzeby badań.
Zastosowane metody
- Opracowanie pełnego zestawu protokołów tworzenia organoidów HCC.
- Optymalizacja warunków hodowli organoidów.
- Procedury przenoszenia i mrożenia organoidów.
- Środki ostrożności podczas pracy z organoidami.
Główne wyniki
- Skuteczna optymalizacja protokołów hodowli organoidów HCC.
- Poprawa wielkości i żywotności organoidów do celów eksperymentalnych.
- Identyfikacja kluczowych czynników wpływających na wzrost organoidów.
- Zwiększony potencjał w zakresie testowania leków i identyfikacji celów terapeutycznych.
Wnioski
- Udoskonalone protokoły stanowią solidne ramy dla badań nad HCC.
- Organoidy pochodzące od pacjentów mogą znacząco przyspieszyć odkrywanie nowych metod terapeutycznych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych metodach, aby pogłębić wiedzę na temat raka wątroby.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Modele organoidów raka wątrobowokomórkowego (HCC) pochodzące od pacjentów wypełniają krytyczną lukę w onkologii translacyjnej, umożliwiając identyfikację istotnych dla przebiegu choroby celów terapeutycznych oraz odkrywanie nowych leków. Zoptymalizowany protokół wspiera generowanie dużych, reprezentatywnych genetycznie organoidów, co zwiększa wiarygodność predykcyjną wczesnych etapów testowania hipotez terapeutycznych. Możliwość ta usprawnia selekcję i ograniczanie ryzyka w portfelu projektów w punkcie przejścia z fazy odkrywania do badań przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie mechanizmów molekularnych HCC w systemie odpowiadającym warunkom klinicznym pacjenta.
- Wspiera walidację funkcjonalną potencjalnych celów terapeutycznych z wykorzystaniem genetycznie dopasowanych organoidów.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez modelowanie ewolucji guza i tolerancji na leki.
- Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie wyboru i priorytetyzacji celów terapeutycznych.
Przesiewy i rozwój testów
- Zapewnia standaryzowane, skalowalne kultury organoidów do powtarzalnego screeningu związków.
- Dostarcza ilościowych danych na temat wzrostu i żywotności organoidów do opracowywania testów.
- Umożliwia przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do późniejszej oceny leków.
- Wspiera ponowne wykorzystanie platformy w wielu kampaniach screeningowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia zgodność modeli przedklinicznych z genetyką nowotworów pacjentów w celu zachowania ciągłości translacyjnej.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o odpowiedzi istotne dla danej choroby.
- Ułatwia odkrywanie i walidację biomarkerów w kontekście klinicznie istotnym.
- Zmniejsza biologiczne ryzyko na późnych etapach badań poprzez modelowanie odpowiedzi na lek w organoidach.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół dotyczący organoidów integruje etapy od wczesnego odkrycia, poprzez identyfikację wiodących związków, aż po walidację przedkliniczną, wspierając testowanie hipotez i ograniczanie ryzyka związanego z doborem celu w badaniach nad HCC.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia rzetelne testowanie hipotezy zerowej oraz wyjaśnianie szlaków sygnałowych w kontekście pochodzącym od pacjenta.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe analizy organoidów do oceny związków chemicznych.
- Analityka: Wspiera pomiar rozmiaru organoidów, ich żywotności oraz odpowiedzi na interwencje.
- Badania translacyjne: Łączy fazę odkrywczą z fazą przedkliniczną za pomocą genetycznie dopasowanych modeli chorobowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę organoidową dla prowadzenia dalszych prac nad odkrywaniem celów terapeutycznych i leków.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów terapeutycznych w HCC.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje hodowlę organoidów oraz przepływy pracy w badaniach w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywne pod względem kapitałowym zarządzanie portfolio.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów terapeutycznych w HCC.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie przetwarzania tkanek, hodowli organoidów oraz analizy molekularnej.
- Wymaga dostępu do specjalistycznej infrastruktury do hodowli komórkowych i aparatury analitycznej.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia powtarzalności protokołu i porównywalności danych.
- Może wymagać adaptacji dla różnych podtypów nowotworów lub próbek pacjentów.
- Wielkość i żywotność organoidów są wrażliwe na skład macierzy oraz warunki manipulacji.
