Name: Opracowanie i optymalizacja modelu organoidowego ludzkiego raka wątrobowokomórkowego pochodzącego od pacjentów w celu identyfikacji potencjalnego celu i odkrycia leku (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Poznaj metodykę hodowli organoidów raka wątrobowokomórkowego pochodzących od pacjentów w celu identyfikacji celów terapeutycznych i testowania leków. Zoptymalizowane protokoły poprawiają wielkość i żywotność próbek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82122048; 82003773; 82203380) oraz Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2023A1515011416).

Pobrano od pacjenta pobrane biopsje tkanek od odpowiedniego pacjenta w Szpitalu Onkologicznym i Instytucie Uniwersytetu Medycznego w Kantonie, a od pacjentów uzyskano świadomą zgodę. Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, odczynników i przyrządów używanych w tym protokole można znaleźć w Tabeli materiałów.
1. Ustalanie organoidów HCC pochodzących od pacjentów z próbek chirurgicznych
UWAGA: Tworzenie organoidów HCC obejmuje różne etapy, a mianowicie dysocjację tkanek, posiewanie organoidów, hodowlę, pasażowanie, krioprezerwację i resuscytację. Proces dysocjacji tkanek trwa 2 godziny, natomiast wysiew organoidów na płytkę trwa około 40 minut. Następnie początkowe pokolenie organoidów HCC przechodzi okres hodowli trwający 10-14 dni przy użyciu pożywki izolacyjnej HCC. Po osiągnięciu zadowalającej gęstości przeprowadza się pasaże organoidowe, które wymagają 1 godziny. Kolejne hodowle organoidów są następnie utrzymywane przy użyciu pożywki ekspansywnej HCC przez 7-10 dni, która może się różnić w zależności od tempa wzrostu i stanu organoidów.
<ol>
	<li>Dysocjacja tkanek
	<ol>
		<li>Przygotowanie materiałów eksploatacyjnych i eksploatacyjnych
		<ol>
			<li>Pobrać 1-2cm3 tkanki HCC od pacjentów, którzy przed operacją nie otrzymali żadnego wcześniejszego leczenia miejscowego lub ogólnoustrojowego. Po resekcji chirurgicznej należy przechowywać tkankę w temperaturze 4 °C w roztworze do konserwacji tkanek (Tabela 1) do czasu przetworzenia. 
			UWAGA: Wysokiej jakości świeże próbki tkanek są niezbędne do pomyślnego powstania organoidów. Ważne jest, aby próbki były przetwarzane szybko, najlepiej w ciągu 1-4 godzin po resekcji chirurgicznej, aby utrzymać żywotność tkanki. Wszystkie kolejne procedury należy wykonywać w aseptycznym środowisku przy użyciu sterylnych materiałów i odczynników.</li>
			<li>Rozgrzej płytki do hodowli komórek o bardzo niskiej powierzchni przylegania (24 dołki) przez 1 godzinę w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Zamrożony ekstrakt z błony podstawnej (BME) rozmrażać przez noc w temperaturze 4 °C aż do momentu tuż przed użyciem. 
			UWAGA: Aby zapewnić całkowite rozmrożenie BME, należy go umieścić na lodzie na co najmniej 3 godziny. Całkowite stopienie BME jest niezbędne do udanej hodowli organoidów w kolejnych etapach.</li>
			<li>Przed użyciem należy upewnić się, że roztwór wytrawiający (tabela 1) jest podgrzany do temperatury 37 °C. 
			UWAGA: Roztwór do wytrawiania należy przygotować na świeżo w aseptycznym środowisku i niezwłocznie zużyć.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przepływ procesów organizacyjnych
		<ol>
			<li>W komorze z przepływem laminarnym pokrój tkankę nowotworową na małe kawałki (0,5-1 mm3) za pomocą nożyczek chirurgicznych na szalce Petriego. Przenieś przyciętą tkankę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i dodaj 5-10 ml podłoża podstawowego (Tabela 1). 
			UWAGA: Pożywka podstawowa (Tabela 1) może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.</li>
			<li>Użyj pipety barotropowej, aby zmyć jak najwięcej krwi i pozostaw na 1-2 minuty, aby usunąć część supernatantu, w tym wszelkie krwinki i pływające skrzepy tłuszczu. Powtórz tę procedurę dwukrotnie.</li>
			<li>Odwirować mieszaninę o stężeniu 300 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i ostrożnie usunąć sklarowany osad. Dodać 5 ml podgrzanego roztworu do wytrawiania (Tabela 1) do przyciętej tkanki.</li>
			<li>Obrócić probówkę w temperaturze 37 °C w celu roztrawienia.</li>
			<li>Po 30 minutach wstępnego trawienia poszukaj pod mikroskopem małych skupisk komórek. Sprawdzaj co 5-10 minut, aby uniknąć nadmiernego strawienia. 
			UWAGA: Czas potrzebny do trawienia tkanek będzie zależał od wielkości i rodzaju tkanki. Trawienie tkankowe nie powinno przekraczać 90 minut. Nadtrawiona tkanka pojawi się pod mikroskopem jako duży arkusz pojedynczych komórek. O odpowiednim poziomie trawienia świadczy fakt, że większość z nich to skupiska komórek i mają wygląd przypominający winogrona.</li>
			<li>Zatrzymaj trawienie, dodając zimną pożywkę podstawową (Tabela 1) i przefiltruj do nowej probówki o pojemności 50 ml z filtrem komórkowym 100 μm. Dodaj zimne podłoże podstawowe do objętości 50 ml.</li>
			<li>Odwirować komórki w temperaturze 2 × g przez 10 minut w temperaturze 8 °C. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad, dodając kolejne 50 ml zimnego podłoża podstawowego (tabela 1). Powtórz ten krok dwukrotnie. 
			UWAGA: Wirowanie z niską prędkością stosuje się, aby umożliwić ustabilizowanie się małych skupisk komórek, podczas gdy komórki krwi i szczątki komórek są nadal zawieszone w supernatancie; Proces ten powtarza się kilka razy, aby uzyskać stosunkowo czystą masę komórkową tkanki.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Posiewanie organoidów
	<ol>
		<li>Po drugim przemyciu należy usunąć jak najwięcej supernatantu i ponownie zawiesić żądaną liczbę komórek (1 000-5 000 komórek na dołek 24-dołkowej płytki) w odpowiednim BME do posiewu. 
		UWAGA: Zawsze utrzymuj BME w temperaturze 4 °C przed użyciem.</li>
		<li>Dodaj BME i zawieś klastry małych komórek w Advanced DMEM/F-12, dodając BME i delikatnie pipetując w górę iw dół, aż agregaty komórek zostaną całkowicie zawieszone. Kontroluj stężenie BME między 30% a 50%.</li>
		<li>Nasiona 50 μl kropelek BME zmieszanych z klastrami komórek w środku 24-dołkowych płytek hodowlanych. 
		UWAGA: O ile to możliwe, nie pozwól, aby kropelki rozprzestrzeniły się na ścianę boczną płytki studzienki. Ściana boczna płytki o niskiej adsorpcji nie jest w stanie niskiej adsorpcji, a kontakt kropelek ze ścianą boczną doprowadzi do adhezji, która nie sprzyja późniejszej inkubacji.</li>
		<li>Pozostawić płytki z dodanymi kropelkami do zastygnięcia w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Pod koniec inkubacji dodać 500 μl wstępnie podgrzanej pożywki (tabela 1) do każdego dołka i inkubować w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowla organoidów
	<ol>
		<li>Odświeżać pożywkę hodowlaną (tabela 1) raz na 2-3 dni. Na początku hodowli należy hodować organoidy HCC w pożywce izolacyjnej HCC (Tabela 1) przez 2 tygodnie.</li>
		<li>Po 2 tygodniach inkubacji z pożywką izolacyjną HCC zastąpić pożywkę pożywką do ekspandowania organoidów HCC (tabela 1) (przechowywaną w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni).</li>
		<li>Odświeżaj pożywkę hodowlaną raz na 3 dni.</li>
		<li>Po 7-10 dniach hodowli z podłożem ekspansywnym HCC, gdy organoid osiągnął odpowiednią gęstość lub rozmiar, należy rozpocząć interwencje eksperymentalne lub pasaż lub liofilizację organoidów w razie potrzeby.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pasażowanie organoidów
	<ol>
		<li>Przygotowanie materiałów eksploatacyjnych i eksploatacyjnych
		<ol>
			<li>Rozgrzej płytki do hodowli komórkowych o bardzo niskiej powierzchni przylegania (24 dołki) przez 1 godzinę w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Zamrożone BME rozmrażać przez noc w temperaturze 4 °C aż do momentu tuż przed użyciem.</li>
			<li>Wstępnie podgrzej roztwór do zbioru organoidów i trypsynę w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Proces przechodzenia
		<ol>
			<li>Po wyjęciu pożywki hodowlanej z płytki studzienki przenieść zawiesinę organoidu do probówki o pojemności 15 ml.</li>
			<li>Dodać roztwór do zbierania organoidów w zależności od ilości BME (500 μl roztworu do zbierania organoidów na 50 μl BME), skrobając i pipetując w górę iw dół za pomocą pistoletu do pipet o pojemności 1 000 μl. 
			UWAGA: Należy unikać pęcherzyków powietrza podczas całego procesu, aby zapobiec utracie organoidów, ponieważ obecność pęcherzyków powietrza wskazuje na wyższe ciśnienie pipetowania.</li>
			<li>Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Delikatnie zassać BME pipetą o pojemności 1 000 μl i obserwować, czy BME jest całkowicie rozpuszczone. Obserwować co 10 minut, aż do zaobserwowania klarownego skupiska komórek organoidowych, następnie odwirować przy 400 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usunąć jak najwięcej supernatantu. 
			UWAGA: Na tym etapie organoid można zamrozić i zakonserwować.</li>
			<li>Do enzymatycznego trawienia organoidów dodać 1-5 ml substytutu trypsyny (w zależności od liczby organoidów) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 minuty. Obserwuj pod mikroskopem stopień trawienia enzymatycznego, aby określić, czy organoidy dysocjują na małe skupiska po 2-10 komórek; jeśli nie, kontynuuj trawienie enzymatyczne. 
			UWAGA: Nadmierne trawienie spowoduje lizę klastrów komórek organoidowych w pojedyncze komórki, zmniejszając ich żywotność i wydłużając czas późniejszej hodowli.</li>
			<li>Dodać odpowiednią objętość zimnego podłoża podstawowego (Tabela 1), aby zatrzymać trawienie.</li>
			<li>Odwirować organoidy w temperaturze 400 × g przez 5 minut w temperaturze 8 °C; usunąć supernatant w jak największym stopniu.</li>
			<li>Ponownie zawiesić żądaną liczbę organoidów (1 000-5 000 organoidów na basenie na płytce 24-dołkowej) w odpowiedniej matrycy do posiewu. Wykonaj te same czynności, co w sekcji 1.2. 
			UWAGA: Gęstość posiewu powinna być zoptymalizowana w zależności od tempa wzrostu i wielkości organoidów.</li>
			<li>Organoidy należy przechodzić co 10 dni w stosunku 1:3 lub 1:4 w zależności od gęstości wzrostu organoidów.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kriokonserwacja i resuscytacja organoidów
	<ol>
		<li>Kriokonserwacja organoidów
		<ol>
			<li>Przygotować probówki liofilacyjne, z których każda powinna zlewać się z dwoma dołkami 24-dołkowej płytki zawierającej organoidy.</li>
			<li>Postępuj zgodnie z krokami od 1.4.2.1 do 1.4.2.4 dla pasażowania organoidów w celu uzyskania organoidów bez BME, i delikatnie ponownie zawieś organoidy, dodając 500 μl/basenik roztworu liofilizacji organoidów do płytki 24-dołkowej. 
			UWAGA: W zależności od stanu wzrostu i wielkości organoidów zaleca się krioprezerwację organoidów w kulturze do trzeciego pokolenia.</li>
			<li>Przenieść zawiesinę do probówek liofilacyjnych i umieścić ją w pojemniku chłodzonym gradientowo w temperaturze -80 °C. Po gradientowym schłodzeniu w temperaturze -80 °C przez co najmniej 24 godziny przenieść probówki do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Resuscytacja organoidów
		<ol>
			<li>Inkubować liofilizowane probówki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i przerwać inkubację, gdy pozostanie tylko mały blok lodu.</li>
			<li>Wirować przy 400 × g przez 5 minut w temperaturze 8 °C w celu całkowitego usunięcia sklarowanego nad osadem.</li>
			<li>Postępuj zgodnie z sekcjami 1.2 i 1.3 dla kolejnych operacji.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Optimizing HCC Organoid Formation for Target Identification and Drug Development

<ol><li>Vogel, A., Meyer, T., Sapisochin, G., Salem, R., Saborowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Hepatocellular carcinoma.</a> Lancet. 400 (10360), 1345-1362 (2022).</li>
<li>Craig, A. J., von Felden, J., Garcia-Lezana, T., Sarcognato, S., Villanueva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+evolution+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Tumour evolution in hepatocellular carcinoma.</a> Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 17 (3), 139-152 (2020).</li>
<li>Yang, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+view+of+hepatocellular+carcinoma%3A+trends%2C+risk%2C+prevention+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">A global view of hepatocellular carcinoma: trends, risk, prevention and management.</a> Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (10), 589-604 (2019).</li>
<li>Huang, A., Yang, X. R., Chung, W. Y., Dennison, A. R., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+therapy+for+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduction+and+Targeted+Therapy%22%5BJournal%5D)">Targeted therapy for hepatocellular carcinoma.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 146(2020).</li>
<li>Cancer Genome Atlas Research Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+and+Integrative+Genomic+Characterization+of+Hepatocellular+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive and Integrative Genomic Characterization of Hepatocellular Carcinoma.</a> Cell. 169 (7), 1327.e23-1341.e23 (2017).</li>
<li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+primary+liver+cancer-derived+organoid+cultures+for+disease+modeling+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).</li>
<li>Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+patient-derived+cancer+organoids+for+drug-screening+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications.</a> Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).</li>
<li>Peng, W. C., Kraaier, L. J., Kluiver, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+organoids+and+cell+transplantation%3A+What+the+future+holds%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte organoids and cell transplantation: What the future holds.</a> Experimental & Molecular Medicine. 53 (10), 1512-1528 (2021).</li>
<li>Nuciforo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+liver+cancers+derived+from+tumor+needle+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human liver cancers derived from tumor needle biopsies.</a> Cell Reports. 24 (5), 1363-1376 (2018).</li>
<li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hepatocyte+differentiation+model+reveals+two+subtypes+of+liver+cancer+with+different+oncofetal+properties+and+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A hepatocyte differentiation model reveals two subtypes of liver cancer with different oncofetal properties and therapeutic targets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (11), 6103-6113 (2020).</li>
<li>Kong, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+tumor+lineage+plasticity+in+hepatocellular+carcinoma+using+an+anti-CLDN6+antibody-drug+conjugate%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Targeting tumor lineage plasticity in hepatocellular carcinoma using an anti-CLDN6 antibody-drug conjugate.</a> Science Translational Medicine. 13 (579), eabb6282(2021).</li>
<li>Li, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+functional+characterization+of+potential+oncofetal+targets+in+human+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Identification and functional characterization of potential oncofetal targets in human hepatocellular carcinoma.</a> STAR Protocols. 3 (4), 101921(2022).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cell-mediated+therapeutic+resistance+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatoma+Research%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cell-mediated therapeutic resistance in hepatocellular carcinoma.</a> Hepatoma Research. 8, 36(2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Jedną z istotnych zalet modeli organoidowych pochodzących od pacjentów jest ich zdolność do wiernego odwzorowywania cech biologicznych nowotworów, obejmujących strukturę tkanek i krajobraz genomowy. Modele te wykazują niezwykły poziom dokładności i skutecznie odzwierciedlają niejednorodność i progresję nowotworów, nawet w długich okresach uprawy 6,8,9. Dzięki wykorzystaniu tego wyrafinowanego protokołu hodowli organoidów, skutec...

Rak wątrobowokomórkowy (HCC), powszechny i bardzo zróżnicowany nowotwór1, zyskał znaczną uwagę w środowisku medycznym. Obecność plastyczności linii i znaczna heterogeniczność HCC sugeruje, że komórki nowotworowe pochodzące od różnych pacjentów, a nawet odrębne zmiany u tego samego pacjenta, mogą wykazywać odmienne cechy molekularne i fenotypowe, co stanowi ogromne przeszkody w rozwoju innowacyjnych podejść terapeutycznych2,3,4,5. W związku z tym istnieje pilna potrzeba lepszego zrozumienia biologicznych cech i mechanizmów oporności na leki w HCC, aby uzyskać informacje na temat formułowania bardziej skutecznych strategii leczenia.
W ostatnich dziesięcioleciach badacze poświęcili swoje wysiłki na rozwój modeli in vitro w celu badania HCC3,4. Pomimo pewnych postępów nadal istnieją ograniczenia. Modele te obejmują szereg technik, takich jak wykorzystanie linii komórkowych, komórek pierwotnych i ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjenta (PDX). Linie komórkowe służą jako modele in vitro do długotrwałej hodowli komórek nowotworowych uzyskanych od pacjentów z HCC, oferując korzyści w postaci wygody i łatwej ekspansji. Pierwotne modele komórkowe obejmują bezpośrednią izolację i hodowlę pierwotnych komórek nowotworowych z tkanek nowotworowych pacjenta, zapewniając w ten sposób reprezentację cech biologicznych, które są bardzo podobne do cech samych pacjentów. Modele PDX polegają na przeszczepianiu tkanek nowotworowych pacjentów myszom w celu dokładniejszego symulowania wzrostu i odpowiedzi guza. Modele te odegrały zasadniczą rolę w badaniach nad HCC, jednak mają pewne ograniczenia, w tym niejednorodność linii komórkowych i niezdolność do pełnej replikacji w warunkach in vivo. Ponadto długotrwała hodowla in vitro może prowadzić do pogorszenia pierwotnych cech i funkcji komórek, co stanowi wyzwanie w dokładnym odwzorowaniu właściwości biologicznych HCC. Dodatkowo, korzystanie z modeli PDX jest zarówno czasochłonne, jak i kosztowne3.
Aby rozwiązać te problemy i dokładniej odtworzyć fizjologiczne atrybuty HCC, wprowadzono wykorzystanie technologii organoidów jako obiecującą platformę badawczą, zdolną do przekroczenia poprzednich ograniczeń. Organoidy, które są trójwymiarowymi modelami komórek hodowanymi in vitro, mają zdolność odtworzenia struktury i funkcjonalności rzeczywistych narządów. Jednak w kontekście HCC istnieją pewne wyzwania związane z tworzeniem modeli organoidowych. Wyzwania te obejmują niewystarczająco szczegółowe opisy procedur budowy organoidów HCC, brak kompleksowych protokołów dla całego procesu budowy organoidów HCC oraz zazwyczaj mały rozmiar hodowanych organoidów6,7,8. W świetle zazwyczaj ograniczonych wymiarów hodowanych organoidów, staraliśmy się sprostać tym wyzwaniom poprzez opracowanie kompleksowego protokołu obejmującego całość budowy organoidów HCC6. Protokół ten obejmuje dysocjację tkanek, posiew organoidów, hodowlę, pasażowanie, kriopkonserwację i resuscytację. Optymalizując etapy procedury i udoskonalając skład pożywki hodowlanej, udało nam się stworzyć modele organoidów HCC zdolne do trwałego wzrostu i długotrwałego pasażowania6,8. W kolejnych rozdziałach zostanie przedstawiony kompleksowy opis zawiłości operacyjnych i istotnych czynników związanych z budową organoidów HCC.

<table><tbody><tr><td>[Leu15]-gastryna I ludzka</td><td>Merck</td><td>G9145</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml mikroprobówki</td><td>Merck</td><td>AXYMCT150LC</td><td></td></tr><tr><td>A8301 (TGF i beta; inhibitor)</td> <td>Tocris Bioscience</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Suplement B27 (503), bez witaminy A</td><td>Suplement Thermo Fisher Scientific</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>B-27 (503), bez surowicy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>17504044</tr><tr><td>BMP7</td><td>Peprotech</td><td>120-03P</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek rozmiar 100 &mu; m</td><td>Merck</td><td>CLS352360</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Merck</td><td>SML1046</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Merck</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Costar Ultra-Low</td><td>Merck</td><td>CLS3473</td><td></td></tr><tr><td>Costar 24-dołkowa, przezroczysta, z płaskim dnem, ultra-niska nasadka Płytki wielodołkowe, indywidualnie pakowane, sterylne</td><td>Corning</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>Costar 6-dołkowe, przezroczyste, z płaskim dnem, ultra-niskie płytki wielodołkowe, indywidualnie pakowane, sterylne</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex Roztwór do zbioru organoidów</td><td>R& D SYSTEMS</td><td>3700-100-01</td><td>Roztwór do zbioru organoidów</td></tr><tr><td>Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME)</td> <td>Merck</td><td>3533-005-02</td><td></td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Merck</td><td>D5942</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Merck</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Merck</td><td>C6164</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Merck</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowany Eagle Medium firmy Dulbecco/Szynka F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12634028</td><td>Zaawansowany DMEM/F-12</td></tr><tr><td>Earle" s zrównoważony roztwór soli (EBSS)</td>Kleszcze do <td>24010043</td><td></td> <td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td></td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1099</td><td></td></tr><tr><td>Suplement GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 1 M</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjny mikroskop zmotoryzowany Leica DM6 B</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>N2 suplement (1003)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylocysteina</td><td>Merck</td><td>A0737-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Merck</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 15 ml stożkowe sterylne probówki wirówkowe z polipropylenu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 50 ml stożkowy sterylny polipropylen Probówki wirówkowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339653</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki FGF19</td><td>Peprotech</td><td>100-32</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki HGF</td><td>Peprotech</td><td>100-39</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki inhibitor kinazy Rho Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td></td></tr><tr><td>dichlorowodorek Y-27632</td><td>Merck</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka kondycjonowana R-spodin1</td> <td>(Broutier i wsp.)</td><td>Nie dotyczy</td><td>Wydzielanie linii komórkowych</td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td>NIE DOTYCZY</td> NIE <td>DOTYCZY</td><td></td></tr><tr><td>Próbka chirurgiczna guza usunięta od pacjentów z HCC</td><td>Stowarzyszony szpital onkologiczny i instytut Uniwersytetu Medycznego w Kantonie</td><td>NIE DOTYCZY</td><td></td></tr><tr><td>TNF I alfa;</td><td>Peprotech</td><td>315-01A</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1x), bez czerwieni fenolowej</td><td>Thermo Fisher Scientific 12604013</td><td></td><td>Substytut trypsyny</td></tr><tr><td>Pożywka kondycjonowana Wnt-3a</td> <td>(Broutier i wsp.)</td><td>Nie dotyczy</td><td>Wydzielanie linii komórkowych</td></tr></tbody></table>

opracowanie i optymalizacja modelu organoidowego ludzkiego raka wątrobowokomórkowego pochodzącego od pacjentów w celu identyfikacji potencjalnego celu i odkrycia leku

Development and Optimization of A Human Hepatocellular Carcinoma Patient-Derived Organoid Model for Potential Target Identification and Drug Discovery

Rak wątrobowokomórkowy (HCC) jest bardzo rozpowszechnionym i śmiertelnym nowotworem na całym świecie, a jego późne odkrycie i brak skutecznych specyficznych środków terapeutycznych wymagają dalszych badań nad jego patogenezą i leczeniem. Organoidy, nowy model, który bardzo przypomina natywną tkankę nowotworową i może być hodowany in vitro, wzbudziły w ostatnich latach znaczne zainteresowanie, z licznymi doniesieniami na temat rozwoju modeli organoidowych raka wątroby. W tym badaniu udało nam się zoptymalizować procedurę i opracować protokół hodowli, który umożliwia tworzenie organoidów HCC o większych rozmiarach ze stabilnymi warunkami pasażowania i hodowli. Kompleksowo opisaliśmy każdy etap procedury, obejmujący cały proces dysocjacji tkanek HCC, posiewu organoidów, hodowli, pasażu, krioprezerwacji i resuscytacji, a także przedstawiliśmy szczegółowe środki ostrożności w tym artykule. Organoidy te wykazują genetyczne podobieństwo do oryginalnych tkanek HCC i mogą być wykorzystywane do różnych zastosowań, w tym do identyfikacji potencjalnych celów terapeutycznych dla nowotworów i późniejszego opracowywania leków.

Po zastosowaniu wyżej opisanej procedury pojawienie się sferoidów organoidów HCC jest zazwyczaj widoczne w ciągu 3 dni (Rysunek 1). Rysunek 1A,B przedstawia ustanowiony organoid HCC, który w pierwszym dniu hodowli szybko rozwija zwarte sferoidy charakteryzujące się zaokrąglonymi krawędziami i przepuszczalnym cytosolem. Podczas wzrostu organoidów HCC zastosowanie różnych stężeń BME miało różny wpływ na tempo wzrostu organoidów. Hodowaliśmy dwa or...

Zapewniamy kompleksowy przegląd i udoskonalenie istniejących protokołów tworzenia organoidów raka wątrobowokomórkowego (HCC), obejmując wszystkie etapy hodowli organoidów. System ten służy jako cenny model do identyfikacji potencjalnych celów terapeutycznych i oceny skuteczności kandydatów na leki.

Opracowanie i optymalizacja modelu organoidowego ludzkiego raka wątrobowokomórkowego pochodzącego od pacjentów w celu identyfikacji potencjalnego celu i odkrycia leku

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a highly prevalent and lethal tumor worldwide and its late discovery and lack of effective specific therapeutic agents ...

Nasze laboratorium ma na celu zbadanie molekularnej patogenezy raka wątroby i zidentyfikowanie nowych celów terapeutycznych do opracowania leków. Chcielibyśmy odpowiedzieć na pytanie, w jaki sposób rak inicjuje przerzuty i postęp w kierunku tolerancji leków, wykorzystując nowe modele chorób, takie jak organoidy pochodzące od pacjentów. Obecne wyzwania eksperymentalne dotyczą dwóch aspektów.Po pierwsze, brakuje kompletnego zestawu protokołów do konstruowania organoidów raka wątrobowokomórkowego dla całego procesu. Po drugie, rozmiar hodowanych organoidów HCC jest zbyt mały, aby można je było później przetworzyć eksperymentalnie. W niniejszym protokole podajemy szczegółowe informacje na temat zoptymalizowanych procedur hodowli organoidów oraz późniejszych procedur przenoszenia i zamrażania, a także środków ostrożności, które należy podjąć podczas wszystkich procedur.Zoptymalizowaliśmy skład podłoża organoidowego pod kątem pozyskiwania większych organoidów o charakterystyce tkanek zbliżonej do pierwotnej. Będziemy monitorować ewolucję guza za pomocą nowo ustabilizowanych organoidów pacjentów i spróbujemy zidentyfikować nowy mechanizm molekularny i cele terapeutyczne w leczeniu HCC. Aby rozpocząć dysocjację tkanek, należy pobrać od jednego do dwóch centymetrów sześciennych tkanki raka wątrobowokomórkowego lub HCC od nieleczonych pacjentów.Następnie umieść tkankę w roztworze do konserwacji tkanek i utrzymuj ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu przetworzenia. Teraz podgrzej płytki do hodowli komórkowych o bardzo niskiej powierzchni przylegania przez godzinę w inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza. Wyciąg z błony podstawnej należy spiłować na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Za pomocą nożyczek chirurgicznych pokrój tkankę nowotworową na małe kawałki na szalce Petriego wewnątrz kaptura z przepływem laminarnym. Przenieś te kawałki do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów i dodaj od pięciu do 10 mililitrów podłoża podstawowego. Za pomocą pipety barotropowej zmyj jak najwięcej krwi.Pozostawić mieszaninę do osiadania przez jedną do dwóch minut przed usunięciem części supernatantu, w tym wszelkich komórek krwi i pływających skrzepów tłuszczu. Następnie odwirować mieszaninę w stężeniu 300 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie ostrożnie wyekstrahuj supernatant i dodaj pięć mililitrów podgrzanego roztworu trawiącego do przyciętej tkanki.Umieść probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wirniku, aby uzyskać optymalne trawienie. Po 30 minutach wstępnego trawienia użyj mikroskopu, aby poszukać małych skupisk komórek. Aby zatrzymać trawienie, dodaj do probówki pięć mililitrów zimnej pożywki podstawowej.Następnie użyj filtra komórkowego o średnicy 100 mikrometrów, aby przesiać do nowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Napełnij probówkę zimnym podłożem podstawowym, aby osiągnąć całkowitą objętość 50 mililitrów. Następnie odwiruj komórki w temperaturze dwóch G przez 10 minut w temperaturze ośmiu stopni Celsjusza.Po zakończeniu ostrożnie usunąć sklarowaną nad nim ciecz. Zawiesić osad w 50 mililitrach zimnego podłoża podstawowego, aby uzyskać osad komórkowy do posiewu organoidów. Aby wykonać posiew organoidowy, najpierw usuń supernatant z wirówki i umyj komórki raka wątrobowokomórkowego.Ponownie zawiesić komórki w 50 mikrolitrach ekstraktu z błony podstawnej lub BME na studzienkę w celu posiewania. Następnie zawieś komórki w zaawansowanym DMEM/F12. Następnie delikatnie odpipetować agregacje komórek, aż do uzyskania równomiernej zawiesiny.Dodaj BME do zawiesiny, upewniając się, że stężenie BME wynosi od 30 do 50% Teraz wysiew 50 mikrolitrów kropelek BME z klastrami komórek na środku 24-dołkowej płytki. Pozwól kropelkom zastygnąć w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut. Dodaj 500 mikrolitrów podgrzanej pożywki do każdej studzienki i inkubuj w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Odświeżaj pożywkę hodowlaną co dwa do trzech dni. Po dwóch tygodniach zastąp pożywkę izolacyjną pożywką do ekspandowania organoidów. Po siedmiu do 10 dniach hodowli, gdy organoidy osiągną odpowiednią gęstość, należy przetworzyć kultury zgodnie z potrzebami.Aby przejść przez organoidy, najpierw podgrzej płytki do hodowli komórek o bardzo niskiej powierzchni przylegania w inkubatorze. Następnie rozmrozić zamrożony BME przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza aż do momentu tuż przed użyciem. Podgrzej roztwór do zbioru organoidów i substytut trypsyny w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.Po zakończeniu etapu przygotowania należy usunąć pożywkę hodowlaną z płytki hodowlanej organoidu. Następnie przenieś zawiesinę organoidów do 15-mililitrowej probówki. Teraz dodaj roztwór do zbierania organoidów proporcjonalnie do ilości BME.Aby wymieszać zawiesinę, użyj pistoletu do pipet o pojemności 1000 mikrolitrów do zeskrobywania i pipetowania w górę iw dół. Po inkubacji probówki w temperaturze pokojowej przez 30 minut, użyj pipety o pojemności jednego mililitra, aby ostrożnie zassać BME. Upewnij się, że BME jest całkowicie rozpuszczony.Monitoruj ekstrakt co 10 minut, aż pojawi się wyraźny klaster komórek organoidowych. Następnie odwirować w temperaturze pokojowej przy 400 G przez pięć minut. Usunąć jak najwięcej supernatantu.Aby rozpocząć trawienie enzymatyczne organoidów raka wątrobowokomórkowego, dodaj od jednego do pięciu mililitrów podgrzanego substytutu trypsyny do hodowanego osadu organoidowego. Inkubować zawiesinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie minuty. Użyj mikroskopu, aby sprawdzić, czy organoidy dysocjują na małe skupiska od dwóch do 10 komórek.Aby zatrzymać trawienie, dodaj odpowiednią objętość zimnego podłoża podstawowego. Następnie odwirować organoidy w stężeniu 400 G przez pięć minut w temperaturze ośmiu stopni Celsjusza. Ostrożnie usunąć jak najwięcej supernatantu.Ponownie zawiesić żądaną liczbę organoidów w odpowiedniej matrycy do posiewu. Co 10 dni pasuj organoidy w zależności od gęstości wzrostu organoidów. Sferoidy organoidowe HCC obserwowano w ciągu trzech dni hodowli.Zwarte sferoidy z zaokrąglonymi krawędziami i przepuszczalnym cytozolem zaobserwowano w pierwszym dniu założenia. Organoidy były podobnej wielkości i miały największą średnicę, gdy były hodowane w 30 do 50% BME. BME był najbardziej rozdrobniony na poziomie 10%, co skutkowało najmniejszymi organoidami.BME był najbardziej nienaruszony w 100%, ale zaowocował organoidami o średniej średnicy. Rozmnażający się organoid HCC osiągnął rozmiar przekraczający 500 mikrometrów w każdej kulturze po trzech pokoleniach. W ciągu 20-dniowego okresu hodowli uzyskano organoidy HCC o znacznych rozmiarach przekraczających 1000 mikrometrów.

development-optimization-human-hepatocellular-carcinoma-patient

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten protokół przedstawia model biomimetyczny 3D z towarzyszącym zwłóknieniowym przedziałem zrębowym. Przygotowany z fizjologicznie odpowiednich hydrożeli w proporcjach naśladujących biofizyczne właściwości zrębu macierzy zewnątrzkomórkowej, aktywnego mediatora interakcji komórkowych, wzrostu guza i przerzutów.

Model biomimetyczny raka wątroby do badania interakcji guz-zręb w środowisku 3D o przestrajalnych właściwościach biofizycznych

Długoterminowy system hodowli organoidów 3D ex vitro został stworzony z mysich hepatocytów. Organoidy te mogą być pasażowane i manipulowane genetycznie przez infekcję lentiwirusem o konstrukcji shRNA/ektopowej, transfekcję siRNA i inżynierię CRISPR-Cas9.

Tworzenie i manipulacja genetyczna organoidów mysich hepatocytów

Protokół ten opisuje wytwarzanie szybkich i powtarzalnych endodermalnych organoidów wątrobowych (eHEPO). Dzięki temu protokołowi eHEPO mogą być produkowane w ciągu 2 tygodni i rozwijać się w dłuższej perspektywie (ponad 1 rok) bez utraty swojego zróżnicowania i funkcjonalności.

Wytwarzanie funkcjonalnych endodermalnych organoidów wątroby

Organoidy generowane z guzów pacjenta są ortotopowo wstrzykiwane do wątroby myszy. Resekcja nienowotworowej tkanki wątroby prowadzi do środowiska regeneracyjnego w tkance wątroby, w której znajduje się guz.

Model ksenoprzeszczepu organoidalnego uzyskany od pacjenta z rakiem wątrobowokomórkowym w celu zbadania wpływu regeneracji wątroby na wzrost guza

Protokół ten określa uproszczoną metodę generowania raka wątrobowokomórkowego, stosowania leczenia farmakologicznego oraz sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek przed i po leczeniu w celu scharakteryzowania zmian transkrypcyjnych związanych z leczeniem.

Generowanie i analiza transkryptomiczna pojedynczokomórkowych raków trzębowokomórkowych po leczeniu farmakologicznym

Wykorzystanie guzów pochodzących od pacjentów w podskórnym modelu przedklinicznym to doskonały sposób na badanie skuteczności nowych terapii, predykcyjnego odkrywania biomarkerów i ścieżek oporności na leki. Model ten, w procesie opracowywania leków, ma zasadnicze znaczenie dla określenia losu wielu nowatorskich terapii przeciwnowotworowych przed rozpoczęciem badań klinicznych.

Opracowanie i utrzymanie przedklinicznego modelu ksenoprzeszczepu nowotworu pochodzącego od pacjenta w celu zbadania nowych terapii przeciwnowotworowych

Ten protokół opisuje generowanie modeli ortotopowych ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów poprzez dopęcherzowe wkraplanie komórek raka urotelialnego o wysokim stopniu złośliwości lub dodoodbytnicze wstrzykiwanie komórek raka jelita grubego do myszy z nieotyłym cukrzycą/ciężkim złożonym niedoborem odporności (NOD/SCID) w celu pierwotnego wzrostu guza i spontanicznych przerzutów pod wpływem komórek zrębu węzłów chłonnych, co naśladuje postęp ludzkich chorób przerzutowych.

Ortotopowe modele ksenoprzeszczepów pobrane od pacjentów dla ludzkiego raka urotelialnokomórkowego i raka jelita grubego, wzrostu guza i spontanicznych przerzutów

Ten protokół opisuje procedury optymalizacyjne w opartym na wirusie, dwufluorescencyjnie znakowanym modelem ksenoprzeszczepu guza, wykorzystującym larwy danio pręgowanego jako gospodarzy. Ten heterogeniczny model ksenoprzeszczepu naśladuje skład tkankowy mikrośrodowiska raka trzustki in vivo i służy jako bardziej precyzyjne narzędzie do oceny reakcji leków w spersonalizowanych modelach zPDX (ksenoprzeszczep pobrany od pacjentów z danio pręgowanego).

Heterogeniczny model ksenoprzeszczepu raka trzustki uzyskany od pacjenta z wykorzystaniem larw danio pręgowanego jako gospodarzy do porównawczej oceny leków

Ten protokół opisuje generowanie sferoid pochodzących od pacjentów oraz dalszą analizę, w tym kwantyfikację proliferacji, testy cytotoksyczności, cytometrię przepływową, barwienie immunofluorescencyjne i obrazowanie konfokalne, w celu oceny potencjału kandydatów na leki jako terapii przeciwnowotworowych. Protokół ten wspiera medycynę precyzyjną w identyfikacji specyficznych leków dla każdego pacjenta i stadium choroby.

Fizjologiczne sferoidy 3D pochodzące od pacjenta do badań przesiewowych leków przeciwnowotworowych w celu ukierunkowania na rakowe komórki macierzyste

Hodowle organoidowe gruczolakoraka przewodowego trzustki pochodzące od pacjentów są szybko ustalonym trójwymiarowym modelem, który z dużą wiernością przedstawia przedziały komórek nowotworowych nabłonka, umożliwiając badania translacyjne nad tą śmiertelną złośliwością. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe metody tworzenia i rozmnażania organoidów, a także wykonywania odpowiednich testów biologicznych przy użyciu tych modeli.

Izolacja i charakterystyka modeli organoidowych gruczolakoraka przewodowego trzustki pochodzących od pacjenta

Poznaj metodykę hodowli organoidów raka wątrobowokomórkowego pochodzących od pacjentów w celu identyfikacji celów terapeutycznych i testowania leków. Zoptymalizowane protokoły poprawiają wielkość i żywotność próbek.

Opracowanie i optymalizacja modelu organoidowego ludzkiego raka wątrobowokomórkowego pochodzącego od pacjentów w celu identyfikacji potencjalnego celu i odkrycia leku (Wideo) | JoVE Journal

Opracowanie i optymalizacja modelu organoidowego ludzkiego raka wątrobowokomórkowego pochodzącego od pacjentów w celu identyfikacji potencjalnego celu i odkrycia leku

Przeglądaj więcej filmów