Name: Metabolomika tętniczo-żylna do pomiaru wymiany metabolitów in vivo w brunatnej tkance tłuszczowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-06T12:40:00.000+00:00
Duration: 2 min 55 s
Description: Poznaj metodę metabolomiki tętniczo-żylnej zoptymalizowaną dla brunatnej tkanki tłuszczowej w modelu mysim. Technika ta umożliwia badanie wymiany metabolitów na poziomie organizmu i walidację wyników przy użyciu modeli genetycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy wszystkim członkom laboratoriów Choi i Junga za dyskusję metodologiczną. Dziękujemy C. Jang i D. Guertinowi za rady i opinie. Dziękujemy M.S. Choi za krytyczną lekturę manuskryptu. Ta praca została sfinansowana przez NRF-2022R1C1C1012034 dla SMJ; NRF-2022R1C1C1007023 do DWC; NRF-2022R1A4A3024551 do SMJ i DWC Prace te były wspierane przez Chungnam National University dla W.T.K. Rysunek 1 i rysunek 2 zostały stworzone przy użyciu BioRender (http://biorender.com/).

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone za zgodą Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Sungkyunkwan (IACUC). Myszy trzymano w zatwierdzonym przez IACUC obiekcie dla zwierząt, umieszczonym w czystym pomieszczeniu o temperaturze 22 °C i wilgotności 45%, po codziennym 12-godzinnym cyklu światła/ciemności. Trzymano ich w wentylowanych szafach i mieli dostęp do standardowej diety ad libitum (składającej się z 60% węglowodanów, 16% białka i 3% tłuszczu). Pościel i materiały do budowy gniazd były zmieniane co tydzień. W tym badaniu wykorzystano samce myszy C57BL/6J w wieku 12 tygodni i ważące od 25 g do 30 g. Zwierzęta te pochodziły od komercyjnego dostawcy (patrz tabela materiałów).
1. Modulacja aktywności metabolicznej brunatnej tkanki tłuszczowej poprzez aklimatyzację do temperatury i stymulację farmakologiczną
UWAGA: Aklimatyzacja do temperatury przez kilka dni lub tygodni lub stymulacja farmakologiczna za pomocą agonistów receptora β-adrenergicznego są powszechnie stosowanymi metodami modulacji aktywności BAT1. Dlatego poniżej znajduje się zwięzły przegląd metody, aby umożliwić czytelnikom wybór odpowiedniego podejścia zgodnie z wymaganiami. Aby uzyskać metabolicznie nieaktywny (mniej termogeniczny) BAT, dla myszy C57BL/6J wybiera się podstawową temperaturę ciepłą, określaną jako termoneutralność (28-30 °C). Ten zakres zapewnia, że myszy nie muszą zużywać dodatkowej energii, aby utrzymać stałą temperaturę ciała. Aby uzyskać umiarkowanie lub wysoce aktywny (termogeniczny) BAT, można wybrać odpowiednio łagodne zimno (20-22 °C) lub silne zimno (6 °C). Na potrzeby tego eksperymentu myszy hodowano w standardowych warunkach inwentarskich w temperaturze 22 °C, która, choć umiarkowanie zimna dla myszy, nie wiązała się z żadną stymulacją farmakologiczną.
<ol>
	<li>Aklimatyzacja do temperatury
	<ol>
		<li>Oddziel myszy tak, aby trzymały 1 lub 2 myszy w klatce co najmniej 1 tydzień przed rozpoczęciem aklimatyzacji do temperatury. Przygotuj inkubatory dla gryzoni wyposażone w wentylację powietrza, kontrolę temperatury i wilgotności w żądanych warunkach.</li>
		<li>Przenieś klatki do odpowiednich inkubatorów dla gryzoni w odpowiednich dniach dla wybranego rodzaju aklimatyzacji do temperatury.</li>
		<li>Upewnij się, że rozkład liczby myszy jest równy we wszystkich grupach, z 1 lub 2 myszami na klatkę. Preferowane jest trzymanie pojedyncze, ponieważ jest bardziej wrażliwe na zmiany fizjologiczne wywołane temperaturą w porównaniu do trzymania grupowego43. Oto szczegółowe warunki mieszkaniowe dla każdej grupy:
		<ol>
			<li>Grupa termoneutralności (30 °C): Utrzymuj myszy w tej grupie w sposób ciągły w temperaturze 30 °C przez okres do czterech tygodni.</li>
			<li>Grupa silnego przeziębienia: Początkowo myszy w tej grupie należy trzymać w temperaturze 18 °C bez żadnych materiałów do gniazdowania. Będą doświadczać stopniowego tygodniowego spadku temperatury, osiągając 6 °C w czwartym tygodniu. Przebieg temperatury jest następujący: 18 °C → 14 °C → 10 °C → 6 °C.</li>
			<li>Grupa z łagodnym zimnem (20-22 °C): Myszy z tej grupy należy trzymać w inkubatorach dla gryzoni w takich samych warunkach, jak w standardowych warunkach inwentarskich, o których mowa wcześniej.</li>
			<li>Ostre wyzwania związane z zimnem: W przypadku ostrych wyzwań związanych z zimnem umieść 1-2 myszy w klatce bez żadnych materiałów do gniazdowania i wystawij je na działanie inkubatora dla gryzoni ustawionego na 6 °C przez maksymalnie 8 godzin 
			UWAGA: Te warunki w pomieszczeniach i wahania temperatury mają zasadnicze znaczenie dla badania wpływu środowisk o różnej temperaturze na aktywność i metabolizm BAT.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zmieniaj klatki i uzupełniaj jedzenie i wodę co tydzień. Klatki należy wstępnie zaaklimatyzować co najmniej 24 godziny przed suplementacją, w odpowiedniej temperaturze (inkubator dla gryzoni). 
		UWAGA: Aby zapobiec zakłóceniu odpowiedniego bodźca temperaturowego, ważne jest, aby nie dostarczać myszom urozmaicenia, które mogłoby prowadzić do budowy gniazda. W odpowiedzi na silne zimno myszy zużywają więcej energii na utrzymanie temperatury ciała, co skutkuje zwiększonym spożyciem pokarmu i wyższymi wskaźnikami wydalania. Dlatego ważne jest, aby sprawdzać klatki co najmniej dwa do trzech razy w tygodniu (zgodnie z lokalnymi wytycznymi instytucjonalnymi), aby upewnić się, że myszy mają odpowiedni zapas pożywienia i wody oraz że klatki nie są nadmiernie mokre. Monitorowanie to jest niezbędne do utrzymania dobrego samopoczucia i zdrowia myszy podczas badania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Stymulacja farmakologiczna1 z użyciem agonisty receptora β3-adrenergicznego CL316,243
	<ol>
		<li>Aby zmaksymalizować efekt stymulujący, należy wstępnie trzymać myszy w temperaturze termoneutralnej (30 °C) przez 2-4 tygodnie przed wstrzyknięciem.</li>
		<li>Po okresie aklimatyzacji wstrzyknąć dootrzewnowo 1 mg/kg CL316,243. 
		UWAGA: W przypadku przewlekłej stymulacji agonistą receptora β3-adrenergicznego (np. od 3 dni do tygodni1,44,45), ze względu na stabilność leku, wymagane są codzienne zastrzyki. Rozcieńczony CL316,243 należy przygotować w dniu wstrzyknięcia ze względu na stabilność.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Pobieranie próbek krwi tętniczo-żylnej
UWAGA: Myszy powyżej 12-14 tygodni są najlepiej polecane do pobierania próbek krwi tętniczo-żylnej. Młodsze myszy mogą nie mieć wystarczającej wielkości żył Sulzera, odrębnego naczynia krwionośnego, które specyficznie odprowadza krew żylną z międzyłopatkowego BAT46.
<ol>
	<li>Delikatnie znieczulić za pomocą skalibrowanego waporyzatora z 3% izofluranem do indukcji (w komorze o wymiarach 205 x 265 x 200 mm) i 2% izofluranu do konserwacji (z maską do znieczulenia gazowego). 
	UWAGA: Cała procedura pobierania krwi tętniczo-żylnej powinna być wykonana niezwłocznie po znieczuleniu. Podczas znieczulenia można używać podgrzewanej wodą podkładki rozgrzewającej, aby utrzymać temperaturę ciała. 
	UWAGA: Izofluran jest wysoce lotny i toksyczny w następstwie wdychania. Dlatego znieczulenie pierwotne musi być wykonywane pod wyciągiem.</li>
	<li>Sprawdź odruchy zwierzęcia, takie jak cofnięcie łapy, aby potwierdzić, że znieczulenie osiągnęło odpowiednią głębokość.</li>
	<li>Pobieranie krwi żylnej z żyły Sulzera
	<ol>
		<li>Ustaw mysz tak, aby odsłonić skórę grzbietową, potwierdź głębokość znieczulenia poprzez uszczypnięcie palca u nogi tuż przed wykonaniem nacięcia. Zwilż skórę grzbietową dużą ilością 70% etanolu, aby zapobiec odrywaniu się włosów, i wykonaj nacięcie wzdłuż pleców od dolnej części klatki piersiowej aż do szyi. 
		UWAGA: BAT międzyłopatkowy znajduje się tuż pod skórą, składa się z dwóch poduszek tłuszczowych pokrytych cienką białą tkanką tłuszczową. Ważne jest, aby upewnić się, że mysz pozostaje pod narkozą przez maskę do znieczulenia gazowego.</li>
		<li>Delikatnie podnieś BAT międzyłopatkowy za pomocą kleszczyków z wygiętą końcówką i ostrożnie przeciąć przyczepione tkanki, z których większość to mięśnie. Podnieś poduszeczkę tłuszczową w kierunku głowy, kontynuuj cięcie przyczepionych tkanek i ostrożnie otwórz obszar, aż odsłoni się żyła Sulzera (duże ciemnoczerwone naczynie w kształcie litery "Y" połączone z obiema poduszeczkami tłuszczowymi międzyłopatkowego BAT). 
		UWAGA: Należy uważać, aby nie przeciąć naczyń włosowatych tkanek mięśniowych, które są połączone z przednim i bocznym obszarem międzyłopatkowym BAT, ponieważ spowoduje to znaczne zmniejszenie ilości i jakości krwi odprowadzanej z żyły Sulzera.</li>
		<li>Ostrożnie przeciąć żyłę Sulzera i pobrać około 40 μl krwi za pomocą naciętych od dołu końcówek do pipet o pojemności 200 μl i pipety P100. Przechowywać krew w probówce do pobierania krwi i trzymać probówkę na lodzie do czasu procesu pobierania surowicy. 
		UWAGA: Ważne jest, aby pobierać krew tuż poniżej punktu podziału żyły Sulzera w kształcie litery Y, aby zapobiec zanieczyszczeniu krwi przez żyłę <główną górną class="xref">47. Pobranie zbyt dużej ilości krwi zmniejszy charakterystykę żyły Sulzera. Dlatego upewnij się, że pobrałeś minimalną ilość krwi potrzebną z żyły Sulzera do analizy. Zachowaj ostrożność przy wyborze probówek do pobierania krwi, ponieważ surowica i osocze dają różne profile metabolitów48,49,50. Do pobierania osocza konieczne jest użycie probówek pokrytych heparyną. W tym eksperymencie wybrano probówki pokryte aktywatorem krzepnięcia, aby uzyskać surowicę. W żadnym wypadku nie należy używać lamp powlekanych EDTA, ponieważ EDTA znacząco wpływa na sygnały spektrometrii mas51,52.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie krwi tętniczej z lewej komory
	<ol>
		<li>Odwróć mysz, nie tracąc kontaktu ze stożkiem nosowym, aby odsłonić brzuszną skórę. Potwierdź głębokość znieczulenia za pomocą uszczypnięcia palca u nogi przed wykonaniem nacięcia. Zwilż skórę brzuszną dużą ilością 70% etanolu, aby zapobiec odrywaniu się włosów, i ostrożnie otwórz klatkę piersiową nożyczkami, aby odsłonić serce bez uszkadzania jakiejkolwiek struktury wewnętrznej.</li>
		<li>Dokładnie nakłuć obszar wierzchołkowy lewej komory za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 29 G (1/2"). Włóż dwie trzecie igły 1/2'' na 3-5 mm w prawo poziomo od wierzchołka serca (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B) i pociągnij strzykawkę do tyłu, aby pobrać krew z lewej komory (50-100 μL). Krew z lewej komory to natleniona krew tętnicza, która jest jaskrawoczerwona. Przechowywać krew w probówce do pobierania krwi i trzymać probówkę na lodzie do czasu procesu pobierania surowicy. 
		UWAGA: W jamie klatki piersiowej należy wykonać minimalne nacięcie, aby uzyskać dostęp do serca. Nadmierne nacięcie może prowadzić do miejscowego krwawienia, które z kolei może skutkować niskim ciśnieniem krwi. Może to mieć wpływ na jakość krwi tętniczej pobranej z lewej komory. Unikaj obracania lub odwracania serca, ponieważ utrudni to określenie dokładnej pozycji lewej komory.</li>
		<li>Dokonaj eutanazji i zapewnij ją odpowiednią metodą, zgodnie z wytycznymi lokalnych instytucji. Na przykład eutanazja może być przeprowadzona przez zwichnięcie szyjki macicy i potwierdzona przez zatrzymanie bicia serca.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwirować próbki krwi przy 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie zebrać supernatant za pomocą pipety. Supernatant powinien zawierać surowicę lub osocze, w zależności od rodzaju użytej probówki do pobierania krwi. Można na tym zatrzymać się i przechowywać próbki w temperaturze -20 °C do czasu przetworzenia surowicy do analizy GC-MS. 
	UWAGA: Hemoliza mogła potencjalnie wystąpić, jeśli zaobserwowano supernatant o czerwonym zabarwieniu. Aby uniknąć hemolizy, należy wymieszać próbkę przed zakończeniem krzepnięcia. Niektóre metabolity wzbogacone w czerwone krwinki, w tym glutamina i mleczan, mogą prowadzić do błędnej interpretacji danych, chociaż większość metabolitów może nie być znacząco dotknięta hemolizą. Zaleca się analizę surowicy/osocza w ciągu tygodnia.</li>
</ol>
3. Ekstrakcja metabolitów z surowicy i derywatyzacja chemiczna
<ol>
	<li>Przygotowanie do ekstrakcji 
	UWAGA: Wszystkie metody, w tym ekstrakcja metabolitów, derywatyzacja i analiza danych, są nieznacznie zmodyfikowanymi wersjami wcześniej opisanych metod53,54.
	<ol>
		<li>Przygotować bufor ekstrakcyjny, dodając 100 μM roztwór DL-norwaliny, wzorca wewnętrznego (patrz tabela materiałów), do metanolu o czystości MS.</li>
		<li>Upewnij się, że wszystkie procedury eksperymentalne są przeprowadzane na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść 10 μl surowicy myszy wyekstrahowanej z żyły Sulzera lub lewej komory do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 40 μl buforu ekstrakcyjnego.</li>
	<li>W celu usunięcia resztek komórkowych i białka należy krótko zawirować próbki surowicy, a następnie odwirować z maksymalną prędkością (18 000 x g) przez 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po odwirowaniu ostrożnie przenieść 40 μl supernatantu do szklanej fiolki, a następnie 3 godziny suszenia w wirówce próżniowej w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Zamiast plastikowych rurek zaleca się szklaną wkładkę (patrz Tabela materiałów) ze względu na chemikalia reagujące z tworzywem sztucznym stosowane na kolejnym etapie derywatyzacji.</li>
	<li>Wysuszone próbki należy poddać dwóm kolejnym etapom derywatyzacji w celu przeprowadzenia analizy GC-MS metabolitów surowicy. 
	UWAGA: Poniższe czynności należy wykonywać pod wyciągiem wyciągowym ze względu na ryzyko podrażnienia rozpuszczalników.
	<ol>
		<li>Zawiesić wysuszone ekstrakty surowicy w 30 μl 10 mg/ml chlorowodorku metoksyaminy (patrz tabela materiałów) rozpuszczonego w pirydynie i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
		<li>Pobrać próbki do sililowania metabolitów za pomocą 70 μl N-metylo-N-tert-butylodimetylosilifluoroacetamidu (MTBSTFA, patrz tabela materiałów) w temperaturze 70 °C przez 1 h. 
		UWAGA: W poniższych krokach zaleca się używanie szklanej strzykawki zamiast plastikowej końcówki ze względu na rozpuszczalniki do derywatyzacji, które reagują z plastikiem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza metabolomiczna przy użyciu GC-MS
UWAGA: Pojedynczy poczwórny GC-MS (patrz Tabela Materiałów) został użyty do pomiaru różnych metabolitów surowicy, w tym węglowodanów, aminokwasów i produktów pośrednich cyklu TCA w derywatyzowanych próbkach z żyły Sulzera i lewej komory. Alternatywnie można użyć innych kolumn, chociaż ustawienia eksperymentalne, w tym program temperatury, mogą się różnić w zależności od typów używanych kolumn.
<ol>
	<li>Wstrzyknąć 1 μl derywatyzowanej próbki do GC w trybie bez rozdzielania w temperaturze 280 °C (temperatura wlotowa), używając helu jako gazu nośnego o natężeniu przepływu 1.500 ml/min (wartość zadana).</li>
	<li>Ustaw kwadrupol na 200 °C z interfejsem GC-MS na 300 °C. 
	UWAGA: Program pieca dla wszystkich analiz metabolitów rozpoczyna się w temperaturze 60 °C, jest utrzymywany przez 1 minutę, a następnie zwiększa się z szybkością 10 °C/min aż do osiągnięcia temperatury 320 °C.</li>
	<li>Zbierz dane za pomocą jonizacji elektronowej (EI) ustawionej na 70 eV i uzyskaj dane próbki w trybie skanowania (50-550 m/z)53. Wszystkie metabolity użyte w tym badaniu zostały wcześniej zwalidowane za pomocą wzorców w celu potwierdzenia widm masowych i czasów retencji.</li>
	<li>Przeprowadź integrację powierzchni pików za pomocą dostępnego na rynku oprogramowania analitycznego (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Dopasuj związki do jonu produktowego każdej pochodnej TBMDS. Następnie należy uzyskać chromatogram jonów ekstrakcyjnych (EIC), całkując wartość m/z jonu fragmentacyjnego w odpowiednim obszarze piku, a następnie wyeksportować go. Jony fragmentacyjne przedstawiono w tabeli 1. 
	UWAGA: EIC każdego związku znormalizowano przez poziom DL-norwaliny w każdej próbce. Dane są reprezentowane przez logarytm2 żyły Sulzera do lewej komory (Log2 (SV / LV)) przy użyciu każdej znormalizowanej wartości EIC.</li>
</ol>

Exploring Metabolite Exchange in Brown Adipose Tissue

Autorzy oświadczają, że nie mają do zgłaszania żadnych konfliktów interesów.

Kluczowym krokiem w zrozumieniu potencjału metabolicznego BAT w bilansie energetycznym całego organizmu jest określenie, jakie składniki odżywcze są spożywane, w jaki sposób są one przetwarzane metabolicznie i jakie metabolity są uwalniane do krążenia. Protokół ten wprowadza specjalistyczną technikę pobierania próbek tętniczo-żylnych, która umożliwia dostęp do unaczynienia żylnego BAT międzyłopatkowego i układowego naczynia tętniczego u myszy C57BL / 6J, która została niedawno opracowana i zwalidowana przez Park i wsp.<s...

Brązowa tkanka tłuszczowa (BAT) posiada unikalną właściwość wydatkowania energii znaną jako termogeneza bez dreszczy (NST), która obejmuje zarówno mechanizmy zależne od mitochondrialnego białka rozprzęgającego 1 (UCP1), jak i niezależne od UCP11,2,3,4,5. Te charakterystyczne cechy wskazują na to, że BAT przyczynia się do regulacji metabolizmu ogólnoustrojowego i patogenezy chorób metabolicznych, w tym otyłości, cukrzycy typu 2, chorób układu krążenia i kacheksji nowotworowej6,7,8. Ostatnie badania retrospektywne wykazały odwrotny związek między masą BAT i/lub jego aktywnością metaboliczną a otyłością, hiperglikemią i zdrowiem kardiometabolicznym u ludzi9,10,11.
Ostatnio BAT został zaproponowany jako metaboliczny pochłaniacz odpowiedzialny za utrzymanie NST, ponieważ wymaga znacznych ilości krążących składników odżywczych jako paliwa termogenicznego6,7. Ponadto BAT może generować i uwalniać czynniki bioaktywne, określane jako brązowe adipokiny lub BATokiny, które działają jako sygnały endokrynologiczne i/lub parakrynne, wskazując na ich aktywny udział w homeostazie metabolicznej na poziomie układów12,13,14,15. W związku z tym zrozumienie metabolizmu składników odżywczych BAT powinno poszerzyć naszą wiedzę na temat jego patofizjologicznego znaczenia u ludzi, wykraczającego poza jego konwencjonalną rolę jako narządu termoregulacyjnego.
Badania metabolomiczne z wykorzystaniem znaczników stabilnych izotopów, w połączeniu z klasycznymi badaniami pobierania składników odżywczych z użyciem radioznaczników niemetabolizowalnych, znacznie poprawiły nasze zrozumienie, które składniki odżywcze są preferencyjnie pobierane przez BAT i jak są wykorzystywane16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Na przykład badania znaczników promieniotwórczych wykazały, że BAT aktywowany na zimno pobiera glukozę, kwasy tłuszczowe związane z lipoproteinami i aminokwasy o rozgałęzionych łańcuchach16,17,18,19,20,21,22,23,27. Ostatnie śledzenie izotopów w połączeniu z badaniami metabolomicznymi pozwoliło nam zmierzyć metaboliczny los i przepływ tych składników odżywczych w tkankach i hodowanych komórkach24,25,26,28,29,30. Jednak analizy te koncentrują się przede wszystkim na indywidualnym wykorzystaniu składników odżywczych, pozostawiając nam ograniczoną wiedzę na temat ról BAT na poziomie systemowym w wymianie metabolitów narządowych. Pytania dotyczące konkretnych serii krążących składników pokarmowych zużywanych w ramach BAT i ich ilościowego wkładu w postaci węgla i azotu pozostają nieuchwytne. Ponadto dopiero się zaczyna, aby dowiedzieć się, czy BAT może generować i uwalniać BATokin pochodzące z metabolitów (np. lipokiny) za pomocą składników odżywczych12,13,14,15,31,32.
Analiza krwi tętniczo-żylnej jest klasycznym podejściem fizjologicznym używanym do oceny specyficznego pobierania lub uwalniania krążących cząsteczek w narządach/tkankach. Technika ta została wcześniej zastosowana do międzyłopatkowego BAT szczurów do pomiaru tlenu i kilku metabolitów, ustanawiając w ten sposób BAT jako główne miejsce adaptacyjnej termogenezy z jej potencjałem katabolicznym33,34,35,36,37. Niedawno, badanie tętniczo-żylne z wykorzystaniem BAT międzyłopatkowego szczura zostało połączone z podejściem transomicznym, co doprowadziło do identyfikacji nieodkrytych BATokin uwalnianych przez termogenicznie stymulowany BAT38.
Ostatnie postępy w metabolomice opartej na chromatografii gazowej i chromatografii cieczowej opartej na spektrometrii mas (GC-MS i LC-MS) o wysokiej czułości ponownie wzbudziły zainteresowanie badaniami tętniczo-żylnymi w celu ilościowej analizy wymiany metabolitów specyficznych dla narządu39,40,41. Techniki te, dzięki wysokiej zdolności rozdzielczej i dokładności masy, umożliwiają kompleksową analizę szerokiego zakresu metabolitów przy użyciu małych ilości próbek.
Zgodnie z tymi postępami, niedawne badanie z powodzeniem zaadaptowało metabolomikę tętniczo-żylną do badania BAT na poziomie myszy, umożliwiając ilościową analizę aktywności wymiany metabolitów w BAT w różnych warunkach42. W artykule przedstawiono protokół metabolomiki tętniczo-żylnej ukierunkowany na BAT z wykorzystaniem GC-MS w modelu myszy C57BL/6J.

<table><tbody><tr><td>0,5-20 &mikro; l Końcówki filtracyjne</td><td>Axygen</td><td>AX. TF-20-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml z dołączoną igłą - 26 G 5/8"</td><td>BD Biosciences</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 5977B GC/MSD (masowy detektor selektywny)</td><td>Agilent</td><td>G7077B</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny podajnik próbek Agilent 7693A</td><td>Agilent</td><td>G4513A</td><td></td></tr><tr><td>System GC Agilent 8890 GC</td><td>Agilent</td><td>G3542A</td><td></td></tr><tr><td>Agilent J& W kolumnie GC (kolumna Capilary) HP-5MS UI</td><td>Agilent</td><td>19091S-433UI</td><td></td></tr><tr><td>Stacja robocza Agilent MassHunter software_MS Analiza ilościowa (Quant-My-way)</td><td>Agilent</td><td>G3335-90240</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J mysz</td><td>DBL</td><td>C57BL/6JBomTac</td><td></td></tr><tr><td>CentriVap -50 &deg; C Wymrażarka (z pokrywą ze stali nierdzewnej)</td><td>LABCONCO&nbsp;</td><td></td><td></td>7811041</tr><tr><td>Wirówka DL-Norvaline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7502-25G</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5430R</td><td>Eppendorf</td><td>5428000210</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Eppendorf Safe-Lock 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>Wkład szklany 250 &mu; L&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>5181-1270</td><td></td></tr><tr><td>Metanol (klasa LC-MS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Q34966-1L</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek metoksyaminy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>226904-5G</td><td></td></tr><tr><td>Microvette&nbsp; 200 Serum, 200 &mikro; L, czapka czerwona, płaska podstawa</td><td>Sarstedt</td><td>20.1290.100</td><td></td></tr><tr><td>MTBSTFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>394882-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Pirydyna(bezwodna, 99,8%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270970-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Chłodnicze koncentratory próżniowe CentriVap</td><td>LABCONCO&nbsp;</td><td></td><td></td>7310041</tr><tr><td>Dieta dla gryzoni</td><td>SAFE</td><td>SAFE R+40-10</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator dla gryzoni</td><td>Power scientific</td><td>RIT33SD</td><td></td></tr><tr><td>Ultracienkie igły do wstrzykiwaczy - 29 G 1/2"</td><td>BD Biosciences</td><td>328203</td><td></td></tr><tr><td>Nasadka na fiolkę 9 mm</td><td>Agilent</td><td>5190-9067</td><td></td></tr><tr><td>Fiolka, ambr scrw wrtn 2 mL</td><td>Agilent</td><td>5190-9063</td><td></td></tr><tr><td>Fiolka, ambr scrw wrtn 2 ml + A2: C40</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr></tbody></table>

metabolomika tętniczo-żylna do pomiaru wymiany metabolitów in vivo w brunatnej tkance tłuszczowej

Arteriovenous Metabolomics to Measure In Vivo Metabolite Exchange in Brown Adipose Tissue

Brązowa tkanka tłuszczowa (BAT) odgrywa kluczową rolę w regulacji homeostazy metabolicznej poprzez unikalny proces wydatkowania energii, znany jako termogeneza bez dreszczy. Aby to osiągnąć, BAT wykorzystuje zróżnicowane menu krążących składników odżywczych, aby wspierać swoje wysokie zapotrzebowanie metaboliczne. Ponadto w ramach BAT wydzielane są czynniki bioaktywne pochodzące z metabolitów, które mogą służyć jako paliwa metaboliczne lub cząsteczki sygnałowe, ułatwiając komunikację wewnątrztkankową lub międzytkankową za pośrednictwem BAT. Sugeruje to, że BAT aktywnie uczestniczy w ogólnoustrojowej wymianie metabolitów, co jest interesującą cechą, którą zaczyna się badać. W tym miejscu przedstawiamy protokół metabolomiki tętniczo-żylnej BAT zoptymalizowanej na poziomie myszy in vivo. Protokół koncentruje się na odpowiednich metodach stymulacji termogenicznej i technice pobierania krwi tętniczo-żylnej przy użyciu żyły Sulzera, która selektywnie drenuje krew żylną pochodzącą z BAT i ogólnoustrojową krew tętniczą. Następnie demonstrowany jest protokół metabolomiczny, oparty na chromatografii gazowej, wykorzystujący te próbki krwi. Zastosowanie tej techniki powinno poszerzyć wiedzę na temat regulowanej przez BAT wymiany metabolitów na poziomie międzynarządowym poprzez pomiar wychwytu i uwalniania netto metabolitów przez BAT.

Rysunek 1 przedstawia schemat doświadczalny zoptymalizowanej metabolomiki AV w tkance BAT. Jak wspomniano w sekcji Protokół, aby uzyskać różnicowo stymulowane brązowe tkanki tłuszczowe, myszy poddawane są aklimatyzacji termicznej w inkubatorach dla gryzoni lub otrzymują środki farmakologiczne, takie jak agoniści receptorów β-adrenergicznych. Następnie myszy są znieczulane, a próbki krwi pobierane do analizy metabolomicznej (Rysunek 1A). W przypadku pobierania kr...

W tym protokole przedstawiono metody istotne dla metabolomiki tętniczo-żylnej zoptymalizowanej pod kątem BAT przy użyciu GC-MS w modelu mysim. Metody te pozwalają na uzyskanie cennych informacji na temat wymiany metabolitów na poziomie organizmu, w której pośredniczy BAT.

Metabolomika tętniczo-żylna do pomiaru wymiany metabolitów in vivo w brunatnej tkance tłuszczowej

Brown adipose tissue (BAT) plays a crucial role in regulating metabolic homeostasis through a unique energy expenditure process known as non-shivering ...

Nasze laboratorium jest zainteresowane identyfikacją mechanizmów, za pomocą których szlaki sygnałowe i metaboliczne współpracują w celu regulacji metabolizmu i fizjologii tkanki tłuszczowej. Dzięki takiemu podejściu staramy się znaleźć sposób na zapobieganie chorobom metabolicznym spowodowanym brakiem równowagi energetycznej, takim jak otyłość i cukrzyca. Główną zaletą naszego protokołu jest to, że przeszliśmy od konwencjonalnego modelu szczurzego do używania modelu mysiego do pobierania próbek krwi żylnej tętniczej i analizy metabolomicznej.Wierzymy, że to przejście pozwoli nam szybciej zweryfikować nasze odkrycia przy użyciu modeli genetycznych opartych na złotym standardzie w badaniach nad brunatną tkanką tłuszczową.

arteriovenous-metabolomics-to-measure-vivo-metabolite-exchange-brown

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Przedstawiona tutaj metoda wykorzystuje 18pozytonowej tomografii emisyjnej/tomografii komputerowej (PET-CT) F-Fluorodeoxyglucose (18F-FDG) oraz rezonansu magnetycznego (MRI) oddzielonego tłuszczem i wodą, z których każdy jest skanowany po 2 godzinach ekspozycji na warunki termoneutralne (24 °C) i zimne (17 °C) w celu zmapowania brązowej tkanki tłuszczowej (BAT) u dorosłych ludzi.

Ludzkie brązowe magazyny tkanki tłuszczowej automatycznie segmentowane za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej/tomografii komputerowej i zarejestrowanych obrazów rezonansu magnetycznego

Korzystając z darmowego, otwartego oprogramowania, opracowaliśmy analityczne podejście do ilościowego określania całkowitej i regionalnej objętości brunatnej tkanki tłuszczowej (BAT) oraz aktywności metabolicznej BAT przy użyciu 18F-FDG PET/CT.

Kwantyfikacja całego ciała i regionu aktywnej ludzkiej brunatnej tkanki tłuszczowej przy użyciu 18F-FDG PET/CT

Ta technika opisuje rejestrowanie w czasie rzeczywistym zużycia tlenu i wskaźników zakwaszenia zewnątrzkomórkowego w eksplantowanych tkankach siatkówki myszy za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego.

Pomiar metabolizmu energetycznego w eksplantowanej tkance siatkówki za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego

Funkcjonalne obrazowanie i ilościowe określanie termogenicznych magazynów tłuszczu u myszy przy użyciu podejścia opartego na obrazowaniu mikro-PET/MR.

Wizualizacja i kwantyfikacja brązowych i beżowych tkanek tłuszczowych u myszy za pomocą obrazowania [18F]FDG Micro-PET/MR

Ten manuskrypt opisuje protokół do pomiaru podstawowej przemiany materii i zdolności oksydacyjnej termogenicznych adipocytów u otyłych myszy.

Określanie podstawowego wydatku energetycznego i zdolności adipocytów termogenicznych do wydatkowania energii u otyłych myszy

Tutaj prezentujemy protokół do ilościowego określenia fizjologicznego znaczenia wpływu aktywności brunatnej tkanki tłuszczowej (BAT) na metabolizm człowieka. Osiąga się to poprzez połączenie obciążenia węglowodanami i kalorymetrii pośredniej z pomiarami zmian temperatury nadobojczykowej. To nowatorskie podejście może pomóc w opracowaniu celu farmakologicznego dla termogenezy BAT u ludzi.

Wykorzystanie kombinacji kalorymetrii pośredniej, termografii w podczerwieni i poziomu glukozy we krwi do pomiaru termogenezy brunatnej tkanki tłuszczowej u ludzi

Tutaj opisujemy protokół izolacji, hodowli i fenotypowania mikronaczyniowych komórek śródbłonka z ludzkiej podskórnej tkanki tłuszczowej (hSATMVECs). Dodatkowo opisujemy eksperymentalny model wzajemnego przenikania się hSATMVEC-adipocytów.

Badanie wzajemnych oddziaływań komórek śródbłonka tkanki tłuszczowej i adipocytów w ludzkiej podskórnej tkance tłuszczowej

Ten manuskrypt opisuje, jak przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem mutacji termostabilizujących, oczyścić ludzki transporter serotoniny, wygenerować przeciwciała o wysokim powinowactwie i skrystalizować kompleks transporter-przeciwciało serotoniny związany z lekiem przeciwdepresyjnym S-citalopram. Protokół ten można dostosować do badania innych trudnych transporterów błonowych, receptorów i kanałów.

Termostabilizacja, ekspresja, oczyszczanie i krystalizacja ludzkiego transportera serotoniny związanego z S-citalopramem

Elastyczność konformacyjna odgrywa kluczową rolę w funkcjonowaniu białek. W tym artykule opisujemy zastosowanie czasowo-rozdzielczej spektrometrii mas z jonizacją elektronrozpylającą sprzężoną z wymianą wodorowo-deuterową do badania szybkich zmian strukturalnych, które napędzają funkcję w uporządkowanych i nieuporządkowanych białkach.

Spektrometria mas z jonizacją wodorowo-deuterową z jonizacją elektrorozpylającą do badania struktury i dynamiki białek

Celem protokołu jest przygotowanie hydrolizatu keratyny z piór kurczaka metodą hydrolizy alkaliczno-enzymatycznej oraz sprawdzenie, czy dodanie hydrolizatu keratyny do bazy maści kosmetycznej poprawia funkcję bariery skórnej (zwiększając nawilżenie i zmniejszając przeznaskórkową utratę wody). Testy przeprowadza się na ochotnikach i ochotniczkach.

Przygotowanie hydrolizatu keratyny z piór kurczaka i jego zastosowanie w kosmetyce

Poznaj metodę metabolomiki tętniczo-żylnej zoptymalizowaną dla brunatnej tkanki tłuszczowej w modelu mysim. Technika ta umożliwia badanie wymiany metabolitów na poziomie organizmu i walidację wyników przy użyciu modeli genetycznych.

Metabolomika tętniczo-żylna do pomiaru wymiany metabolitów in vivo w brunatnej tkance tłuszczowej

Przeglądaj więcej filmów