Name: Tandemowa spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości do badania składników chemicznych Gynura bicolor DC (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Poznaj protokół analizy związków chemicznych Gynura bicolor DC przy użyciu tandemowej spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości i dokowania molekularnego. Ta metoda umożliwia identyfikację składników aktywnych w badaniach fitochemicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82104881), Zespół ds. Dziedziczenia i Innowacji Leczenia Chorób Immunologicznych TCM, Chongqing Medical Scientific Research Project (Wspólny projekt Komisji Zdrowia Chongqing oraz Biura Nauki i Technologii) (2022DBXM007), Specjalny projekt motywacyjny i przewodnicki Instytutu Badań Naukowych Chongqing (cstc2022jxjl120005), Specjalny projekt dla Chongqing Postdoctoral Science Fundacja (2022CQBSHTB3035), Program Starszych Talentów Medycznych Chongqing dla Yong i osób w średnim wieku, Program dla Instytucji Naukowych Chongqing (niezależny projekt badawczy nr 2022GDRC015).

1. Wstępna obróbka próbki
<ol>
	<li>Umyj całe ziele BFH w czystej wodzie, aż nie będzie widocznych osadów i zanieczyszczeń. Umieść czysty BFH w naczyniu, a następnie włóż go do piekarnika (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Nastaw piekarnik na 50 °C na 24 godz. 
	UWAGA: Cała roślina BFH została zebrana w prowincji Syczuan w Chinach.</li>
	<li>Rozdrobnić suszony BFH w wielofunkcyjnej kruszarce szybkoobrotowej. Przenieś gruboziarnisty proszek na sito o oczkach 50 (<klasa mocna = "xfig">Rysunek 1C). Zbierz drobny proszek w hermetycznej torbie i przechowuj go w wieży suszącej.</li>
	<li>Dokładnie zważyć sześć próbek BFH po 0,25 g każda i umieścić je w sześciu stożkowych kolbach. Dodaj 30 ml rozpuszczalnika organicznego (50% etanolu z wody, 70% etanolu z wody, chloroformu, eteru naftowego, octanu etylu i alkoholu n-butylowego) do każdej stożkowej butelki (<klasa mocna = "xfig">Rysunek 1D).</li>
	<li>Przenieść mieszaninę do sonikatora w kąpieli ultradźwiękowej na 30 minut ekstrakcji w temperaturze 25 °C. Odwirować próbkę przy 14 000 x g przez 5 minut. Przygotować strzykawkę do wstrzykiwań i organiczny mikroporowaty filtr membranowy o wielkości 0,22 μm. Przefiltrować wszystkie supernatanty do butelek na próbki o pojemności 2 ml.</li>
</ol>
2. Kalibracja MS
<ol>
	<li>Za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl przenieś 500 μl 0,1 M roztworu wodorotlenku sodu do kolby miarowej o pojemności 100 ml, a następnie przenieś 450 μl wody dejonizowanej lub ultraczystej do kolby miarowej o pojemności 100 ml (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Używając pipety o pojemności 200 μl, dodać 50 μl kwasu mrówkowego do kolby miarowej o pojemności 100 ml. Uzupełnić całkowitą objętość 100 ml roztworem 2-propanolu:wody w proporcji 90:10 i sonikować roztwór przez 5 minut. Oznaczyć kolbę jako 0,5 mM roztworu mrówczanu sodu w wodzie 2-propanolu w proporcji 90:10 i przechowywać w lodówce. 
	UWAGA: Roztwór mrówczanu sodu traci ważność w ciągu 1 tygodnia w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie sterujące UPLC-Q-TOF-MS, a następnie otwórz okno MS tune. W panelu Sample Flow Control (Sterowanie przepływem próbki) ustaw wartość 25 μl/min w opcji Infusion Flow Rate (Natężenie przepływu infuzji) i wybierz C w opcji Reservoir (Zbiornik). Poczekaj około 1 minuty, aż automatyczne przedmuchiwanie zakończy się.</li>
	<li>Kliknij przycisk Przepływ, aby rozpocząć podawanie roztworu mrówczanu sodu. Kliknij przycisk Dodatni, aby przełączyć się na tryb jonów dodatnich, a następnie kliknij przycisk Czułość, aby przełączyć się na tryb czułości. 
	UWAGA: Przejdź do następnego kroku, aż w oknie widma w czasie rzeczywistym pojawią się charakterystyczne piki mrówczanu sodu.</li>
	<li>W oprogramowaniu sterującym UPLC-Q-TOF-MS otwórz okno MS Console. W lewej pozycji wybierz kolejno opcje SYNAPT XS i Intellistart.</li>
	<li>Zaznacz Utwórz kalibrację i kliknij przycisk Start. Kliknij przycisk Dalej i wybierz Profil kalibracji z menu rozwijanego. Kliknij przycisk Dalej i wybierz tryb czułości w Polaryzacja dodatnia. Kliknij kolejno przyciski Dalej, Dostrój stronę, Dalej i Start.</li>
	<li>Przejdź do okna MS tune i kliknij przycisk Ujemny, aby przełączyć się na tryb jonów ujemnych. Wróć do okna MS Console.</li>
	<li>Zaznacz Utwórz kalibrację i kliknij przycisk Start. Kliknij przycisk Dalej i wybierz Profil kalibracji z menu rozwijanego. Kliknij przycisk Dalej i wybierz Tryb czułości w Polaryzacja ujemna. Kliknij kolejno przyciski Dalej, Dostrój stronę, Dalej i Start.</li>
	<li>W panelu sterowania przepływem LockSpray ustaw natężenie przepływu 50 μl/min i kliknij przycisk Przepływ, aby roztwór LE wszedł do spektrometru masowego. Przejdź do okna MS tune, zaznacz konfigurację źródła LockSpray i kliknij przycisk Start, aby rozpocząć kalibrację.</li>
</ol>
3. Przejęcie MS
<ol>
	<li>Przejdź do głównego interfejsu i kliknij prawym przyciskiem myszy kolumnę Plik wlotowy, aby otworzyć metodę chromatografii cieczowej.</li>
	<li>Kliknij przycisk Wlot, a następnie ustaw parametry, w tym czas pracy i nachylenie. Kliknij przycisk Autosampler, a następnie ustaw parametry, w tym Czas pracy, Kolumnę i Próbkę. Kliknij przycisk Zapisz.</li>
	<li>Kliknij prawym przyciskiem myszy kolumnę Metoda MS, aby otworzyć metodę spektrometrii mas.</li>
	<li>Kliknij przycisk Informacje, a następnie ustaw parametry, w tym czas zakończenia, polaryzację, tryb analizatora, niską masę, wysoką masę i energię zderzenia z przeniesieniem rampy. Kliknij przycisk OK, a następnie przycisk Zapisz.</li>
	<li>Wypełnij tabelę sekwencji, w tym nazwę pliku, fiolkę i objęt. Kliknij przycisk Zapisz.</li>
	<li>Zaznacz wiersz w tabeli sekwencji dla próbki, którą chcesz uruchomić. Kliknij przycisk Uruchom i kliknij przycisk OK w oknie, które właśnie się pojawi.</li>
</ol>
4. Przetwarzanie danych
<ol>
	<li>Uruchom oprogramowanie do analizy danych. W kolumnie Moja praca kliknij przycisk Importuj dane MassLynx, aby otworzyć nowe okno.</li>
	<li>Kliknij przycisk ze znakiem plus i sprawdź wszystkie pięć plików RAW w trybie pozytywnym. Wprowadź nazwę grupy i kliknij przycisk Utwórz zestaw próbek UNIFI, aby rozpocząć import danych (Rysunek 3A).</li>
	<li>Kliknij dwukrotnie plik Analysis Method w trybie pozytywnym. Kliknij etykietę Przetwarzanie, a następnie kliknij przycisk Cel masowy. Wprowadź liczbę 5 ppm w polu wejściowym po polach Docelowa tolerancja dopasowania i Tolerancja dopasowania fragmentu.</li>
	<li>Kliknij przycisk Strona główna, a następnie kliknij przycisk Adducts. Wybierz rzędy +H i +Na, a następnie kliknij prawy przycisk w kształcie strzałki. Kliknij przycisk Zapisz (Rysunek 3B).</li>
	<li>Kliknij dwukrotnie plik Metoda analizy w trybie ujemnym. Kliknij etykietę Przetwarzanie, a następnie kliknij przycisk Cel masowy. Wprowadź liczbę 5ppm w polu wejściowym po polach Docelowa tolerancja dopasowania i Tolerancja dopasowania fragmentu.</li>
	<li>Kliknij przycisk Strona główna, a następnie kliknij przycisk Przydukty. Wybierz wiersze -H i +HCOO i kliknij przycisk w kształcie strzałki w prawo. Kliknij przycisk Zapisz.</li>
	<li>W kolumnie Moja praca kliknij przycisk Analiza, aby otworzyć nowe okno. Wybierz właśnie zaimportowane dane i właśnie utworzoną metodę, a następnie kliknij przycisk Dalej. Wprowadź nazwę pliku. Wybierz folder, w którym przechowywane są dane analizy, a następnie kliknij przycisk Zakończ </li>
	<li>Kliknij przycisk Proces i poczekaj kilka minut, aż pojawią się wyniki (Rysunek 3C).</li>
	<li>Skopiuj tabelę wyników do pustego formularza (<silna klasa="xfig">Rysunek 3D).</li>
</ol>
5. Analiza wyników
<ol>
	<li>Wybierz związek w tabeli wyników. Odpowiednie widmo masy wtórnej zostanie wyświetlone w prawym dolnym rogu (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A).</li>
	<li>Kliknij przycisk w kształcie tabeli i wybierz opcję Fragmenty o wysokiej energii, aby wyświetlić tabelę wtórnych jonów fragmentów (<silna klasa="xfig">Rysunek 4B).</li>
	<li>Wybierz wtórny jon fragmentacyjny w tabeli. Najedź myszką na pik jonowy odpowiadający wtórnemu widmu masy, a odpowiednie pęknięcie strukturalne zostanie wyświetlone na ekranie (<silna klasa="xfig">Rysunek 4C). 
	UWAGA: Ręcznie oceń zasadność pękania podaną przez oprogramowanie i rozróżnij izomery na podstawie jonów wtórnych fragmentów.</li>
	<li>Ręcznie narysuj wzór fragmentacji w oprogramowaniu do rysowania. 
	UWAGA: Przykłady wzorców fragmentacji są szczegółowo opisane w sekcji dotyczącej wyników reprezentatywnych.</li>
</ol>

Identifying Chemical Composition of Gynura bicolor by UPLC-TOF Mass Spectrometry

<ol><li>Lin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+and+quantitative+analysis+of+the+chemical+profile+for+gualou-xiebai-banxia+decoction%2C+a+classical+traditional+chinese+medicine+formula+for+the+treatment+of+coronary+heart+disease%2C+by+uplc-q%2Ftof-ms+combined+with+chemometric+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Biomed+Anal%22%5BJournal%5D)">Qualitative and quantitative analysis of the chemical profile for gualou-xiebai-banxia decoction, a classical traditional chinese medicine formula for the treatment of coronary heart disease, by uplc-q/tof-ms combined with chemometric analysis.</a> J Pharm Biomed Anal. 197, 113950(2021).</li>
<li>Hui, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uplc-q-tof%2Fms-based+metabolomic+studies+on+the+toxicity+mechanisms+of+traditional+chinese+medicine+chuanwu+and+the+detoxification+mechanisms+of+gancao%2C+baishao%2C+and+ganjiang%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+J+Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Uplc-q-tof/ms-based metabolomic studies on the toxicity mechanisms of traditional chinese medicine chuanwu and the detoxification mechanisms of gancao, baishao, and ganjiang.</a> Chinese J Nat Med. 13 (9), 687-698 (2015).</li>
<li>Newman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+traditional+chinese+medicine%3A+Identifying%2C+defining+and+usage+of+tcm+components%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Modern traditional chinese medicine: Identifying, defining and usage of tcm components.</a> Adv Pharmacol. 87, 113-158 (2020).</li>
<li>Liu, S., Yi, L. Z., Liang, Y. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traditional+chinese+medicine+and+separation+science%5BTitle%5D)+AND+%22J+Sep+Sci%22%5BJournal%5D)">Traditional chinese medicine and separation science.</a> J Sep Sci. 31 (11), 2113-2137 (2008).</li>
<li>Yuan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+classification+and+identification+of+complex+chemical+compositions+in+traditional+chinese+medicine+based+on+uplc-q-tof%2Fms+coupled+with+data+processing+techniques+using+the+kudiezi+injection+as+an+example%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid classification and identification of complex chemical compositions in traditional chinese medicine based on uplc-q-tof/ms coupled with data processing techniques using the kudiezi injection as an example.</a> Anal Methods. 7 (12), 5210-5217 (2015).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hplc+coupled+with+chemical+fingerprinting+for+multi-pattern+recognition+for+identifying+the+authenticity+of+clematidis+armandii+caulis%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Hplc coupled with chemical fingerprinting for multi-pattern recognition for identifying the authenticity of clematidis armandii caulis.</a> JoVE. (189), e64690(2022).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra+high-performance+liquid+chromatography-mass+spectrometry+and+self-established+database+analysis+of+chinese+herbal+medicine+components%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Ultra high-performance liquid chromatography-mass spectrometry and self-established database analysis of chinese herbal medicine components.</a> JoVE. (201), e66091(2023).</li>
<li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+identification+of+compound+structure+in+tibetan+medicine+using+ion+trap+mass+spectrometry+and+multiple-stage+fragmentation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Standardized identification of compound structure in tibetan medicine using ion trap mass spectrometry and multiple-stage fragmentation analysis.</a> JoVE. (193), e65054(2023).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+morphological+and+physiological+characteristics+in+two+phenotypes+of+a+rare+and+endangered+plant%2C+begonia+fimbristipula+hance%5BTitle%5D)+AND+%22Photosynthetica%22%5BJournal%5D)">Comparison of morphological and physiological characteristics in two phenotypes of a rare and endangered plant, begonia fimbristipula hance.</a> Photosynthetica. 54, 381-389 (2016).</li>
<li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+population+canopy+color+gradation+skewed+distribution+parameters+of+the+rgb+model+to+micrometeorology+environment+in+begonia+fimbristipula+hance%5BTitle%5D)+AND+%22Atmosphere%22%5BJournal%5D)">Response of population canopy color gradation skewed distribution parameters of the rgb model to micrometeorology environment in begonia fimbristipula hance.</a> Atmosphere. 13 (6), 890(2022).</li>
<li>Yu, L., Ning, L., Youzhen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+microwave+extraction+of+the+pigment+from+begonia+fimbristipula+hance%5BTitle%5D)+AND+%22Guangdong+Trace+Elements+Science%22%5BJournal%5D)">Studies on microwave extraction of the pigment from begonia fimbristipula hance.</a> Guangdong Trace Elements Science. 11 (10), 60-63 (2004).</li>
<li>Xiao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+fusion+protein+consisting+of+metallothionein%2C+cellulose+binding+module%2C+and+superfolder+gfp+for+lead+removal+from+the+water+decoction+of+traditional+chinese+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">Novel fusion protein consisting of metallothionein, cellulose binding module, and superfolder gfp for lead removal from the water decoction of traditional chinese medicine.</a> ACS Omega. 5 (6), 2893-2898 (2020).</li>
<li>Huang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+multiple+light+scattering+to+examine+the+stability+of+phyllanthus+emblica+l.+Extracts+obtained+with+different+extraction+methods%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Using multiple light scattering to examine the stability of phyllanthus emblica l. Extracts obtained with different extraction methods.</a> JoVE. (194), e65130(2023).</li>
<li>Miao, W. G., Tang, C., Ye, Y., Quinn, R. J., Feng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traditional+chinese+medicine+extraction+method+by+ethanol+delivers+drug-like+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+J+Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Traditional chinese medicine extraction method by ethanol delivers drug-like molecules.</a> Chin J Nat Med. 17 (9), 713-720 (2019).</li>
<li>Olejar, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasonic-assisted+extraction+of+cannabidiolic+acid+from+cannabis+biomass%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Ultrasonic-assisted extraction of cannabidiolic acid from cannabis biomass.</a> JoVE. (183), e63076(2022).</li>
<li>Zhu, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sedative+and+hypnotic+effects+of+supercritical+carbon+dioxide+fluid+extraction+from+schisandra+chinensis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Food+Drug+Anal%22%5BJournal%5D)">Sedative and hypnotic effects of supercritical carbon dioxide fluid extraction from schisandra chinensis in mice.</a> J Food Drug Anal. 24 (4), 831-838 (2016).</li>
<li>Lin, X., Wang, Y., Liu, X., Huang, S., Zeng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ils-based+microwave-assisted+extraction+coupled+with+aqueous+two-phase+for+the+extraction+of+useful+compounds+from+chinese+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Ils-based microwave-assisted extraction coupled with aqueous two-phase for the extraction of useful compounds from chinese medicine.</a> Analyst. 137 (17), 4076-4085 (2012).</li>
<li>Wu, T., Lv, H., Wang, F., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+polyphenols+from+lycium+ruthenicum+fruit+by+uplc-q-tof%2Fmse+and+their+antioxidant+activity+in+caco-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Agric+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of polyphenols from lycium ruthenicum fruit by uplc-q-tof/mse and their antioxidant activity in caco-2 cells.</a> J Agric Food Chem. 64 (11), 2280-2288 (2016).</li>
<li>Distler, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drift+time-specific+collision+energies+enable+deep-coverage+data-independent+acquisition+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Drift time-specific collision energies enable deep-coverage data-independent acquisition proteomics.</a> Nat Methods. 11 (2), 167-170 (2014).</li>
<li>Sawada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widely+targeted+metabolomics+based+on+large-scale+ms%2Fms+data+for+elucidating+metabolite+accumulation+patterns+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Widely targeted metabolomics based on large-scale ms/ms data for elucidating metabolite accumulation patterns in plants.</a> Plant Cell Physiol. 50 (1), 37-47 (2009).</li>
<li>Zhang, X. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data-dependent+acquisition+based+high-resolution+mass+spectrum+for+trace+alternaria+mycotoxin+analysis+and+sulfated+metabolites+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Data-dependent acquisition based high-resolution mass spectrum for trace alternaria mycotoxin analysis and sulfated metabolites identification.</a> Food Chem. 364, 130450(2021).</li>
<li>Downard, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indirect+study+of+non-covalent+protein+complexes+by+maldi+mass+spectrometry%3A+Origins%2C+advantages%2C+and+applications+of+the+%26%2334%3Bintensity-fading%26%2334%3B+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom+Rev%22%5BJournal%5D)">Indirect study of non-covalent protein complexes by maldi mass spectrometry: Origins, advantages, and applications of the &#34;intensity-fading&#34; approach.</a> Mass Spectrom Rev. 35 (5), 559-573 (2016).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Oprócz wywaru wodnego12, ekstrakcja rozpuszczalnikiem organicznym jest kolejną powszechną metodą wstępnej obróbki TCM13. Zgodnie z zasadą rozpuszczania w podobnych fazach, wiele składników zostało wyekstrahowanych przez połączenie różnych rozpuszczalników organicznych14. Ekstrakcja wspomagana ultradźwiękami jest jedną z głównych metod stosowanych do otrzymywania składników w TCM15. Ekstrakcja dwutlenkiem węgla w stanie nadkrytycznym jest dobra do ekstrakcji niektórych rodzajów substancji, takich jak lignany16. Ponadto zbadano ekstrakcję wspomaganą mikrofalami w cieczach jonowych (IL) jako alternatywę dla konwencjonalnych ekstrakcji rozpuszczalnikami organicznymi17. Jednak precyzyjna kontrola energii mikrofalowej jest trudna do osiągnięcia, co może powodować reakcje wtórne, takie jak odwodnienie eteryfikacji i odwodnienie estryfikacji.
Optymalne ustawienia energii zderzenia mogą dostarczyć dodatkowych informacji o fragmentach MS drugiego rzędu. Informacje z tandemowego MS, tj. trybu MSE , zostały dostarczone przez dwa równoległe naprzemienne skanowania przy użyciu albo niskiej energii w celu uzyskania informacji o jonach molekularnych, albo wysokiej energii w celu uzyskania w pełni dokładnych jonów fragmentów masy18. Podczas ustawiania parametrów wysokoenergetycznych zakres 10-35 V jest zwykle używany w energii zderzenia z przeniesieniem rampy w celu zwiększenia wydajności fragmentacji prekursora19.
Ogromna ilość surowych danych MS została wygenerowana z MS o wysokiej rozdzielczości. Surowe dane MS, które obejmowały piki jonów molekularnych w widmie MS i piki jonów fragmentacyjnych w widmie MS/MS, muszą zostać dokładnie przetworzone i zintegrowane. Oprogramowanie do analizy danych MS miało na celu kompleksową analizę wszystkich metabolitów w próbce biologicznej20. Badania przesiewowe metabolitów siarczanowych opierały się na zależnym od danych pozyskiwaniu pełnych skanów SM i wielowymiarowych danych dotyczących metabolitów21. W oparciu o rozwijającą się technologię, predykcja sztucznej inteligencji będzie realnym kierunkiem rozwoju analizy danych MS.
Większość związków można zidentyfikować za pomocą tej metody. Jednak ograniczone fragmenty wtórne nie mogą w pełni zidentyfikować wszystkich izomerów, w tym flawonoidów i garbników. Aby osiągnąć identyfikację struktury, naukowcy mogą wykorzystać tandemową spektrometrię mas w celu uzyskania dalszych informacji na temat jonów fragmentacyjnych, które pomogą w identyfikacji struktur złożonych8. Biorąc pod uwagę ograniczenie jonu jonizacji elektronatryskowej lub źródła jonizacji chemicznej pod ciśnieniem atmosfery, MS o wysokiej rozdzielczości nie nadaje się do analizy makrocząsteczek. Jonizacja desorpcji laserowej wspomagana matrycą może sprzyjać jonizacji dużych związków molekularnych, takich jak białka22. Podsumowując, UPLC-Q-TOF-MS/MS jest jedną z najszerzej stosowanych technik identyfikacji związków TCM. Ma potencjał do zastosowania w innych dziedzinach, w tym w medycynie klinicznej i chemii energetycznej.

Tradycyjna medycyna chińska (TCM) jest klinicznie praktykowana w Chinach od tysięcy lat i odgrywa istotną rolę w utrzymaniu zdrowia Chińczyków1. Skład TCM jest zróżnicowany i złożony, a TCM został szeroko opisany w wielu badaniach jakościowych koncentrujących się na składzie chemicznym2. Składniki chemiczne w TCM można z grubsza podzielić na następujące kategorie, takie jak alkaloidy, kwasy organiczne, fenylopropanoidy, kumaryny, lignany, chinony, flawonoidy, terpenoidy, saponiny triterpenoidowe, saponiny steroidowe, glikozydy nasercowe i garbniki3. Biorąc pod uwagę dużą liczbę nieznanych składników i nierozróżnialnych izomerów w TCM, separacja i analiza pożądanych składników chemicznych są ważnymi tematami dla podstawowych badań TCM4.
Ultra-wysokowydajna chromatografia cieczowa kwadrupolowa spektrometria mas czasu przelotu (UPLC-Q-TOF-MS) została zastosowana do analizy substancji w tradycyjnej medycynie chińskiej (TCM), które mogą być oddzielone za pomocą ultra-wysokowydajnej chromatografii cieczowej5,6. Wysoka rozdzielczość MS może dostarczyć obszernych informacji o jonach, które są wykorzystywane do analizy bazy danych z błędem mniejszym niż 5 ppm7. Po włączeniu energii zderzenia, wtórny tryb MS może otrzymać wtórne jony fragmentacyjne, na których intensywność i liczbę wpływa wielkość energii8. 
Gynura bicolor DC. (BFH), wieloletnie zioło bez łodyg, szeroko stosowane w medycynie i żywności (Rysunek 1A), jest rzadką i zagrożoną rośliną unikalną dla Chin9. BFH ma obfite antocyjany, polifenole, flawonoidy i silne zdolności przeciwutleniające10. BFH ma działanie lecznicze, w tym usuwanie ciepła, chłodzenie krwi, nawilżanie płuc, łagodzenie kaszlu, rozpraszanie zastojów, łagodzenie obrzęków, łagodzenie letnich upałów i eliminowanie ciepła. Niewiele badań koncentrowało się na składzie chemicznym BFH11. Polifenole i flawonoidy zawierają liczne izomery, które utrudniają identyfikację złożonych związków w BFH. Konieczne jest opracowanie uniwersalnej metody identyfikacji składników chemicznych, która będzie mogła być stosowana do wszystkich rodzajów TCM. Badanie to miało na celu przedstawienie systematycznego protokołu badania składników chemicznych BFH w oparciu o ekstrakcję rozpuszczalnikową i zintegrowane dane za pośrednictwem UPLC-Q-TOF-MS.

<table><tbody><tr><td>chloroform</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>CAS 67-66-3</td><td></td></tr><tr><td>etanol</td><td>ChuandongChemical</td><td>CAS 64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>octan etylu</td><td>ChuandongChemical</td><td>CAS 141-78-6</td><td></td></tr><tr><td>chromatograf cieczowy</td><td>Waters</td><td>ACQUITY Class 1 plus</td><td></td></tr><tr><td>oprogramowanie</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>sterujące MassLynx Waters V4.2 MSAlkohol n-butylowy</td><td>ChuandongChemical</td><td>CAS 71-36-3</td><td></td></tr><tr><td>eter naftowy</td><td>ChuandongChemical</td><td>CAS 8032-32-4</td><td></td></tr><tr><td>Kwadrupolowa spektrometria mas czasu przelotu</td><td>Wody</td><td>SYNAPT XS</td><td></td></tr><tr><td>UNIFI</td><td>Waters</td><td></td><td>Oprogramowanie do analizy danych</td></tr></tbody></table>

tandemowa spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości do badania składników chemicznych gynura bicolor dc

High-resolution Tandem Mass Spectrometry for Studying Chemical Constituents of Gynura bicolor DC

Separacja i analiza pożądanych składników chemicznych są ważnymi tematami dla podstawowych badań tradycyjnej medycyny chińskiej (TCM). Ultra-wysokosprawna chromatografia cieczowa z kwadrupolową tandemową spektrometrią mas czasu przelotu (UPLC-Q-TOF-MS/MS) stopniowo stała się wiodącą technologią identyfikacji składników TCM. Gynura dwukolorowa DC. (BFH), wieloletnie zioło bez łodyg używane w medycynie i żywności w Chinach, ma działanie lecznicze, takie jak usuwanie ciepła, nawilżanie płuc, łagodzenie kaszlu, rozpraszanie zastojów i łagodzenie obrzęków. Polifenole i flawonoidy zawierają liczne izomery, które utrudniają identyfikację złożonych związków w BFH. W artykule przedstawiono systematyczny protokół badania składników chemicznych BFH w oparciu o ekstrakcję rozpuszczalnikową i zintegrowane dane za pośrednictwem UPLC-Q-TOF-MS.
Opisana tutaj metoda obejmuje systematyczne protokoły wstępnej obróbki próbek, kalibracji MS, akwizycji MS, przetwarzania danych i analizy wyników. Wstępna obróbka próbki obejmuje zbieranie, czyszczenie, suszenie, kruszenie i ekstrakcję. Kalibracja MS składa się z korekcji wielopunktowej i jednopunktowej. Przetwarzanie danych obejmuje import danych, ustalanie metody, przetwarzanie analizy i prezentację wyników. W artykule przedstawiono reprezentatywne wyniki typowego wzorca fragmentacji kwasów fenolowych, estrów i glikozydów w Gynura bicolor DC. (BFH). Ponadto szczegółowo omówiono wybór rozpuszczalników organicznych, ekstrakcję, integrację danych, wybór energii zderzeń i doskonalenie metod. Ten uniwersalny protokół może być szeroko stosowany do identyfikacji złożonych związków w TCM.

Do prezentacji reprezentatywnych wyników wykorzystano identyfikację składu chemicznego BFH jako modelu. Chromatogramy pików bazowych Gynura bicolor DC. ekstrahowanych rozpuszczalnikiem przedstawiono w Supplemental File 1-Supplemental Figure S1-S6, a zaobserwowany czas retencji (RT), nazwę składnika, wzór, stosunek masy do ładunku (m/z) oraz błąd masy wymieniono w tabelach S1-S6. W ZBTK zidentyfikowano wszystkie 35 rodzajów związków z rozdzielonych pików w UPLC-TOF-MS. Jak pokazano w Supplemental File 1-Supplemental Table S1, główne substancje chemiczne obejmowały kwasy (kwas chinowy, kwas DL-jabłkowy, kwas cytrynowy, kwas o-kumarowy oraz kwas 3-O-trans-kumaroilchinowy), glikozydy (gentiopikryna, pikrosyd II, suffrutykozyda J, kopolina oraz borneol-2-O-β-D-apiofuranozylo-(1→6)-β-D-glukozyd) oraz estry (bilobalid, cytrynian trimetylu i trans-O-glukozyl-metylo-trans-cynamian). W ZBTK-CT wykryto 25 dodatkowych rodzajów związków (Supplemental File 1-Supplemental Table S2), co łącznie dało 45 rodzajów zaobserwowanych związków. 
Przy zastosowaniu chloroformu jako ekstrahenta zidentyfikowano wszystkie 50 związków. Wśród nich 28 dodatkowych związków obejmowało kwas koronarykowy, kwas sanlengowy, agrimol A oraz metyloartemizant (Supplemental File 1-Supplemental Table S3). Gdy jako ekstrahent zastosowano eter ropa naftowa, zaobserwowano łącznie 44 rodzaje związków. Znaleziono 17 dodatkowych związków, w tym notopterol, onjisaponinę i cnideol B (Supplemental File 1-Supplemental Table S4). W rozpuszczalniku z wykorzystaniem octanu etylu jako ekstrahenta uzyskano łącznie 65 związków. W porównaniu z poprzednimi czterema ekstraktami odnotowano 37 dodatkowych związków, takich jak daphnetyna, acetowanillona B i stigmasterol-3-O-β-D-glukozyd (Supplemental File 1-Supplemental Table S5). W ekstrakcie z alkoholu butylowego znaleziono łącznie 67 rodzajów związków, wśród których znajdowało się 26 dodatkowych związków, w tym rengyozyd C, chromony, aturametelin F oraz deacetylmatricarin-8-O-β-D-glukopiranozyd (Supplemental File 1-Supplemental Table S6). Podsumowując, na podstawie wyników dla wszystkich sześciu ekstrahentów zidentyfikowano 168 związków.
Aby szczegółowo zrozumieć ścieżkę fragmentacji różnych typów związków w UPLC-TOF-MS, wybrano trzy związki jako przykłady. W przypadku kwasów, kwas 3-O-trans-kumaroilochinowy o m/z = 337,09222 mógł utracić grupę C7H10O5 lub C9H8O2 w drodze reakcji hydrolizy, tworząc odpowiednio produkty pośrednie o m/z = 163,04116 lub 199,05557 (Rysunek 4D). W przypadku estrów, trans-O-glukozylometylotrans-cynamian o m/z = 385,11308 mógł zostać przekształcony w produkt pośredni o m/z = 153,07485 lub 135,04679 poprzez rozszczepienie wiązania C-C w różnych miejscach (Rysunek 4E). W przypadku glikozydów, citrusyna C o m/z = 385,11308 przekształciła się w produkt pośredni o m/z = 272,09174 poprzez rozszczepienie wiązania C-C w łańcuchu alifatycznym, natomiast utrata grupy C7H6O2 doprowadziła do powstania produktu pośredniego o m/z = 113,02534 (Rysunek 4F). W innej ścieżce, rozerwanie wiązania C-O-C w pierścieniu benzenowym doprowadziło do powstania produktu pośredniego o m/z = 163,11245, przy jednoczesnym zaniku jednostki heksozy.
Reprezentatywne wyniki dokowania molekularnego ujawniły struktury 2D i 3D odpowiednio na Rysunku 4G,H. Analiza wzbogacenia ontologii genów wykazała wyniki funkcji genów w odniesieniu do procesów biologicznych (BP), komponentów komórkowych (CC) i funkcji molekularnych (MF; Rysunek 4I). Analiza adnotacji ścieżek Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes wykazała wyniki ścieżek genów o różnej ekspresji, które mogą posłużyć do dalszego zrozumienia funkcji genów (Rysunek 4J). Szczegółowe wyniki dokowania molekularnego przedstawiono w Supplemental File 1-Supplemental Table S7 oraz Supplemental File 1-Supplemental Figure S7-S9.
<img alt="Schemat procesu ekstrakcji roślin; przedstawiono suszenie, pulweryzację, ultradźwięki, wirowanie i filtrację." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66612/66612fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Metoda wstępnego przygotowania tradycyjnego leku chińskiego. (A) Gynura bicolor DC. (B) Czyszczenie i suszenie. (C) Pulweryzacja. (D) Dodawanie rozpuszczalnika organicznego. (E) Ekstrakcja ultradźwiękowa. (F) Wirowanie mieszaniny. (G) Filtracja nadsączu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66612/66612fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Sprzęt laboratoryjny, etapy kalibracji, fiolki do chromatografii, spektrometria mas, wyniki widm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66612/66612fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Procedura obsługi UPLC-Q-TOF-MS/MS. (A) Przygotowanie mrówczanu sodu. (B) Kalibracja osi masy. (C) Strojenie MS. (D) Umieszczenie próbek. (E) Nabywanie widma masowego. (F) Wyświetlanie widma masowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66612/66612fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat przepływu oprogramowania do przetwarzania i analizy danych; zawiera ustawienia przetwarzania i arkusz wyników." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66612/66612fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Przetwarzanie i integracja danych. (A) Konwersja danych. (B) Modyfikacja metody. (C) Przetwarzanie danych. (D) Analiza statystyczna wyników. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66612/66612fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat analizy spektrometrii mas; identyfikacja struktury chemicznej, dopasowanie widma, wzbogacenie KEGG." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66612/66612fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Pogłębiona analiza wyników. (A) Wtórne widmo mas. (B) Wyświetlanie wtórnych jonów fragmentacyjnych. (C) Wyświetlanie miejsc pęknięcia. (D) Wzorzec fragmentacji 1. (E) Wzorzec fragmentacji 2. (F) Wzorzec fragmentacji 3. (G) Demonstracja celu działania substancji czynnej. (H) Struktura 3D celu działania substancji czynnej. (I) Analiza wzbogacenia GO. (J) Analiza adnotacji ścieżek KEGG. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66612/66612fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Plik uzupełniający 1: Identyfikacja związków, wyniki dokowania molekularnego, chromatogramy piku bazowego i analiza sieciowa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66612/66612_Supp%20File%201.zip" target="_blank">Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.</a>

Opisujemy ogólny protokół, który integruje analizę spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości i dokowanie molekularne w badaniach tradycyjnej medycyny chińskiej.

Tandemowa spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości do badania składników chemicznych Gynura bicolor DC

The separation and analysis of the desired chemical components are important subjects for the fundamental research of traditional Chinese medicine (TCM). ...

Rozpocznij od wstępnej obróbki próbki. Umyj całe ziele BFH w czystej wodzie, aż nie będzie widocznych osadów i zanieczyszczeń. Umieść czysty BFH w naczyniu, a następnie wstaw do piekarnika w temperaturze 50 stopni Celsjusza na 24 godziny.Zmiażdż wysuszony BFH w wielofunkcyjnej kruszarce o dużej prędkości. Przenieś gruboziarnisty proszek na sito o oczkach 50. Zbierz drobny proszek w hermetycznej torbie i przechowuj go w wieży suszącej.Następnie dokładnie zważ sześć próbek BFH po 0,25 grama każda i umieść je w sześciu stożkowych kolbach. Dodać 30 mililitrów rozpuszczalnika organicznego do każdej kolby stożkowej. Przenieść mieszaninę do sonikatora do kąpieli ultradźwiękowej na 30 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza.Następnie odwirować próbkę o masie 14 000 g przez pięć minut. Za pomocą strzykawki iniekcyjnej i organicznego filtra z mikroporowatą membraną o średnicy 0,22 mikrometra przefiltrować wszystkie supernatanty do dwumililitrowych butelek na próbki.

high-resolution-tandem-mass-spectrometry-for-studying-chemical

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Laserowa ablacja z jonizacją elektrosprayową (LAESI) jest źródłem jonów dla spektrometrii mas pracującym pod ciśnieniem atmosferycznym. W trybie obrazowania laser średniofalowy w podczerwieni bada rozkład cząsteczek w przekroju tkanki lub biofilmie. Technika ta stanowi nowe podejście do różnorodnych badań bioanalitycznych prowadzonych w natywnych warunkach doświadczalnych.

Obrazowanie molekularne tkanek biologicznych i biofilmów w ciśnieniu atmosferycznym przy użyciu spektrometrii mas LAESI

Nieukierunkowana metabolomika dostarcza hipotezy generującej migawkę profilu metabolicznego.  Protokół ten zademonstruje ekstrakcję i analizę metabolitów z komórek, surowicy lub tkanki.  Szereg metabolitów jest badany za pomocą ekstrakcji ciecz-faza cieczowa, ultraprzepływowej chromatografii cieczowej/spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS) w połączeniu z oprogramowaniem do analizy różnicowej.

Nieukierunkowana metabolomika ze źródeł biologicznych przy użyciu ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS)

Przedstawiono metodę identyfikacji gatunków materiału botanicznego poprzez bezpośrednią analizę w czasie rzeczywistym - spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości i wielowymiarowa analiza statystyczna.

Szybka, wysokoprzepustowa identyfikacja gatunków materiału botanicznego za pomocą bezpośredniej analizy w czasie rzeczywistym Spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości

Tutaj opisujemy ogólny protokół i projekt, który może być zastosowany do identyfikacji śladowych ilości i drobnych składników w złożonych preparatach produktów naturalnych (matrycach) w medycynie tybetańskiej.

Standaryzowana identyfikacja struktury związku w medycynie tybetańskiej za pomocą spektrometrii mas z pułapką jonową i wieloetapowej analizy fragmentacji

Ten protokół miał na celu opisanie szczegółowych wytycznych dotyczących przygotowania sekcji próbek twardych nasion o niskiej zawartości wody do analizy MALDI-IMS, utrzymania pierwotnego rozkładu i obfitości analitów oraz zapewnienia wysokiej jakości sygnału i rozdzielczości przestrzennej.

Przygotowanie twardych nasion palmy do analizy spektrometrii mas metodą desorpcji laserowej/jonizacji wspomaganej matrycowo

Opracowana metoda znakowania 13C6-Glucose w połączeniu z chromatografią cieczową o wysokiej rozdzielczości spektrometrią mas jest wszechstronna i stanowi podstawę do przyszłych badań nad pierwotnymi organami i szlakami zaangażowanymi w syntezę metabolitów wtórnych w roślinach leczniczych, jak również kompleksowe wykorzystanie tych wtórnych metabolitów.

13C6-Znakowanie glukozy związane z LC-MS: Identyfikacja pierwotnych organów roślinnych w syntezie metabolitów wtórnych

Prezentujemy metodę szybkiej spektrometrii mas (MS)/spektrometrii mas (MS) opartej na adnotacji i klasyfikacji alkaloidów tropanowych, przydatną zarówno do wstępnej dereplikacji próbek zawierających tropan jak i odkrywania nowych alkaloidów do izolacji.

Zastosowania tandemowej spektrometrii mas chromatografii cieczowej w badaniach nad produktami naturalnymi: alkaloidy tropanowe jako studium przypadku

Ten protokół opisuje specyficzne techniki używane do strukturalnej charakterystyki sekwencji glikozylu na końcu redukującym (RE) i obszarze wewnętrznym heteroksylanów poprzez znakowanie RE 2 aminobenzamidem przed hydrolizą enzymatyczną (endoksylanazą), a następnie analizę powstałych oligosacharydów za pomocą spektrometrii mas (MS) i magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR).

Sekwencjonowanie heteroksylanów ścian roślin z wykorzystaniem technik enzymatycznych, chemicznych (metylacja) i fizycznych (spektrometria mas, magnetyczny rezonans jądrowy)

Ekstrakcja gazowana to nowa technika laboratoryjna do analizy związków lotnych i półlotnych. Gaz nośny rozpuszcza się w ciekłej próbce poprzez zastosowanie nadciśnienia i wymieszanie próbki. Komora na próbkę jest następnie dekompresowana. Gatunki analitów są uwalniane do fazy gazowej w wyniku musowania.

Ekstrakcja gazowana lotnych związków organicznych w połączeniu z ciśnieniem atmosferycznym Jonizacja chemiczna Kwadrupolowa spektrometria mas

Pokazano protokół charakteryzujący skład chemiczny wydychanego powietrza w czasie rzeczywistym za pomocą wtórnej jonizacji nanoelectrospray sprzężonej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości.

Analiza oddechu w czasie rzeczywistym przy użyciu wtórnej jonizacji nanoelektronizacyjnej sprzężonej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości

Poznaj protokół analizy związków chemicznych Gynura bicolor DC przy użyciu tandemowej spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości i dokowania molekularnego. Ta metoda umożliwia identyfikację składników aktywnych w badaniach fitochemicznych.

Tandemowa spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości do badania składników chemicznych Gynura bicolor DC

Przeglądaj więcej filmów