Name: Paradygmaty oceny behawioralnej w modelu zaburzenia ze spektrum autyzmu Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Poznaj pięć paradygmatów behawioralnych w modelu Drosophila do badania zaburzeń ze spektrum autyzmu. Metody obejmują testy agresji, zachowań społecznych i nawykowych, umożliwiając precyzyjną kwantyfikację deficytów behawioralnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy niezmiernie wdzięczni Mani Ramaswamiemu (NCBS, Bangalore) i Baskarowi Bakthavachalu (IIT Mandi) za przygotowanie testu habituacji i wyboru zapachu, Pavanowi Agrawalowi (MAHE) za cenne sugestie dotyczące testu agresji, Amitava Majumdar (NCCS, Pune) za podzielenie się swoim prototypem komory testowej do zalotów i linii mutantów Fmr1 oraz Gaurav Das (NCCS, Pune) za udostępnienie linii MB247-GAL4. Dziękujemy Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC, Indiana, USA), National Institute of Genetics (NIG, Kioto, Japonia), Banaras Hindu University (BHU, Varanasi, Indie) i National Center for Biological Science (NCBS, Bangalore, Indie) za linie Drosophila. Prace w laboratorium były wspierane przez granty z SERB-DST (ECR/2017/002963) dla AD, stypendium DBT Ramalingaswami przyznane AD (BT/RLF/Re-entry/11/2016) oraz wsparcie instytucjonalne z IIT Kharagpur z Indii. SD i SM otrzymują stypendia doktoranckie w ramach CSIR-Senior Research Fellowship; PM otrzymuje stypendium doktoranckie w MHRD w Indiach.

Drosophila Models for Genetic and Behavioral Traits of Autism Spectrum Disorder

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Drosophila jest wykorzystywana jako doskonały organizm modelowy do badań nad zaburzeniami neurologicznymi człowieka ze względu na wysoki stopień zachowania sekwencji genów między genami chorób muchowychi ludzkich 9. Liczne solidne paradygmaty behawioralne sprawiają, że jest to atrakcyjny model do badania fenotypów manifestujących się w mutantach rekapitulujących ludzkie choroby. Ponieważ setki genów są zaangażowane w zaburzenia ze spektrum autyzmu (ASD), nie istnieje żaden wspólny model ASD w żadnym organizmie modelowym. Dlatego dla każdego mutanta naukowcy muszą najpierw ustalić fenotypy podobne do ASD u muchy. W tym artykule staraliśmy się usprawnić ten proces, proponując zastosowanie pięciu paradygmatów behawioralnych much w połączeniu do takiej oceny. Paradygmaty te są stosowane u much do oceny głównych i powszechnie występujących deficytów behawioralnych u pacjentów z ASD: deficytów społecznych i komunikacyjnych, wzmocnienia powtarzających się zachowań i wady przyzwyczajenia. Jeśli mutacja genu muchy wykazuje defekty we wszystkich lub większości z tych pięciu paradygmatów, może to być silnym wskaźnikiem scenariusza podobnego do ASD.
Większość opisanych tu paradygmatów behawioralnych była wielokrotnie wykorzystywana w dotychczasowej literaturze do rozwiązywania różnorodnych pytań badawczych. Nierzadko zdarza się, że w różnych badaniach można znaleźć różnice w technikach. Poprawki w technikach zostały wprowadzone w celu dopasowania do potrzeb badawczych i wymagań konkretnego pytania, które jest rozwiązywane. Na przykład w teście zalotów wrodzone i wyuczone zachowania związane z zalotami można określić ilościowo w stosunku do muchy testowej, którą może być niedojrzały samiec65, dziewicza samica 66,67, samica w wieku 68,69,70, zamrożona dziewicza samica 65, a nawet samica pozbawiona głowy19. W metodzie opisanej w tym artykule, wstępnie kryte samice typu dzikiego zostały użyte jako tester do sprawdzenia wzorca zalotów samca muchy modelowej z ASD. Receptywność wysiękowa samicy przed kryciem jest stosunkowo niższa niż u dziewiczej muchy71. W rezultacie liczba męskich zalotów i czas ich trwania są bardziej w kierunku pokrytej samicy niż dziewicy; Podobnie, opóźnienie do kopulacji jest również dłuższe niż u dziewiczych samic testujących, w którym to przypadku wczesna kopulacja prowadzi do zmniejszonego wskaźnika zalotów, zmniejszając zakres skutecznego porównania genotypów. W związku z tym użycie premated samicy jako testera zapewnia lepszą analizę porównawczą zachowań godowych muchy ASD w porównaniu z muchą typu dzikiego. Z drugiej strony, wykorzystanie dziewiczych samic może dostarczyć dodatkowych informacji, które mogą być zamaskowane, gdy wykorzystywane są kryte samice. Wykorzystanie krytych samic może również wpływać i zmieniać zachowania samców związane z zalotami. Podsumowując, sugeruje się, aby badacze wybrali strategię i szczegóły eksperymentu w zależności od konieczności konkretnego eksperymentu.
Należy być ostrożnym przed zastosowaniem tej techniki na którymkolwiek lub wszystkich homologach genów ASD u much. Wszystkie te paradygmaty behawioralne są regulowane przez specyficzną i niewielką liczbę neuronów. Ekspresja określonego genu musi zostać najpierw ustalona przed przejściem do określonego paradygmatu behawioralnego. Na przykład, jeśli homolog muchy genu związanego z ASD nie ulega ekspresji w neuronach ciała grzyba lub neuronach glutaminergicznym, to zachowanie związane z zalotami i pielęgnacją może nie być zakłócone w jego mutancie.
Kolejną kwestią, na którą naukowcy muszą uważać, jest to, że brak defektu nie zawsze oznacza, że mutacja nie odgrywa żadnej roli. Na przykład w eksperymentach z zachowaniem uwodzenia z mutantami Fmr1 całkowita liczba napadów uwodzenia nie jest znacząco niższa u mutantów niż u grupy kontrolnej, podczas gdy inne parametry, takie jak wskaźnik pielęgnacji itp., wykazują defekt w zachowaniu pielęgnacyjnym. Można to wytłumaczyć przedłużeniem każdego ataku uwodzenia u mutantów Fmr1 , co skutkuje niską liczbą całkowitych ataków, mimo że całkowity czas trwania ataku jest znacznie dłuższy. Podkreśla to potrzebę kwantyfikacji wielu parametrów dla każdego wzorca zachowania. Ponadto należy pamiętać, że termin ASD obejmuje szeroki zakres chorób spowodowanych zmianami w jednym z setek genów, co skutkuje niejednorodnymi fenotypami o różnym stopniu penetracji wśród dotkniętych nimi osób. Na przykład deficyt habituacji obserwuje się u niektórych pacjentów, ale nie u wszystkich. Tego samego można się spodziewać w modelach muchowych choroby.
Do analizy zachowań agresywnych w tym badaniu wzięto pod uwagę różne rodzaje parametrów agresywnych: rzucanie się, zagrożenie skrzydłami, szarpanie się itp. (Ryc. 1)30. Każda walka musi być zidentyfikowana i liczona albo jako indywidualny typ walki, albo jako całkowita liczba walk. Ważne jest, aby najpierw zapoznać się z wzorcami agresji samców much, które są opisane w 59,72 i pokazane na rysunku 1. Podczas liczenia liczby agresywnych ataków, punkty początkowe i końcowe pojedynczego zdarzenia agresji muszą być wyraźnie określone; Wiele rodzajów wzorców agresji może być pokazanych w jednym ataku, po którym następuje koniec walki. Atak agresji uważa się za zakończony, gdy mucha albo przestaje wykazywać jakiekolwiek agresywne zachowania lub ruchy na 2 sekundy, albo przerywa atak i zaczyna odchodzić.
Większość z tych paradygmatów behawioralnych ma wiele odmian i postępów opisanych przez wiele laboratoriów. Każda z konkretnych modyfikacji została stworzona z myślą o zaspokojeniu potrzeb konkretnego celu. Podobnie, zautomatyzowane i oparte na algorytmach techniki kwantyfikacji lub analizy uwolniły te techniki od ryzyka błędów ręcznych. W tym artykule zademonstrowano najbardziej podstawowe techniki przy najmniejszych wymaganiach materiałowych, w nadziei, że techniki te mogą być łatwo przyjęte i wykorzystane przez maksymalną liczbę badaczy.

Zaburzenie ze spektrum autyzmu (ASD) obejmuje niejednorodną grupę zaburzeń neurologicznych. Obejmuje szereg złożonych zaburzeń neurorozwojowych charakteryzujących się wielokontekstowymi i uporczywymi deficytami w komunikacji społecznej i interakcjach społecznych oraz obecnością ograniczonych, powtarzających się wzorców zachowań i aktywności oraz zainteresowań1. Według Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) u 1 na 100 dzieci na całym świecie diagnozuje się ASD, a stosunek mężczyzn do kobiet wynosi 4,22. Choroba ujawnia się w drugim lub trzecim roku życia. Dzieci z ASD wykazują brak zainteresowania wzajemnością społeczno-emocjonalną, komunikacją niewerbalną i umiejętnościami relacyjnymi. Wykazują powtarzające się zachowania, takie jak stereotypowe ruchy motoryczne, nieelastyczne i zrytualizowane podążanie za rutyną oraz intensywne skupienie się na ograniczonych zainteresowaniach. Dzieci z ASD wykazują wysoki stopień reakcji na dotyk, zapach, dźwięk i smak, podczas gdy reakcja na ból i temperaturę jest stosunkowo niska1. Penetracja tego zaburzenia jest również różna u różnych pacjentów cierpiących na ASD, a co za tym idzie, zmienność wzrasta.
Obecna diagnoza kliniczna ASD opiera się na ocenie behawioralnej osób, ponieważ nie ma potwierdzającego testu opartego na biomarkerach ani wspólnego testu genetycznego, który obejmowałby wszystkie formy ASD3. Rozszyfrowanie podstaw genetycznych i neurofizjologicznych byłoby pomocne w ukierunkowaniu strategii leczenia. W ciągu ostatniej dekady wiele badań zaowocowało identyfikacją setek genów, które są albo usunięte, albo zmutowane, albo których poziom ekspresji jest zmieniony u pacjentów z ASD. Trwające badania kładą nacisk na walidację wkładu tych genów kandydujących przy użyciu organizmów modelowych, takich jak mysz lub muszka owocowa, w których geny te są nokautowane lub powalane, a następnie przeprowadzane są testy na deficyty behawioralne podobne do ASD i wyjaśnienie podstawowych szlaków genetycznych i molekularnych powodujących anomalie. Model mysi rekapitulujący warianty liczby kopii (CNV) w ludzkich loci chromosomowych 16p11.2 pokazuje niektóre z wad behawioralnych ASD4,5,6. Prenatalna ekspozycja na teratogenny lek kwas walproinowy (VPA) to kolejny model myszy przedstawiający cechy przypominające ludzkie ASD7,8. Ponadto istnieje szereg modeli mysich, które wykazują autyzm związany z zespołem genetycznym, na przykład jednogenowe modele syndromiczne spowodowane mutacjami w Fmr1, Pten, Mecp2, Cacna1c i jednogenowe modele niesyndromiczne spowodowane mutacjami w genach takich jak Geny Cntnap2, Shank, Neurexin lub Neuroligin5.
Muszka owocowa (Drosophila melanogaster) to kolejny ważny organizm modelowy do badania komórkowych, molekularnych i genetycznych podstaw wielu ludzkich zaburzeń9, w tym ASD. Drosophila i ludzie dzielą wysoce konserwatywne procesy biologiczne na poziomie molekularnym, komórkowym i synaptycznym. Muszki owocowe zostały z powodzeniem wykorzystane w badaniach nad ASD10,11,12 do scharakteryzowania genów związanych z ASD i rozszyfrowania ich dokładnej roli w synaptogenezie, funkcji synaptycznej i plastyczności, tworzeniu obwodów nerwowych i dojrzewaniu; Stwierdzono, że homologi genów związanych z ASD odgrywają rolę w regulacji zachowań społecznych i/lub powtarzalnych11,13,14,15,16,17,18,19,20,21. Muszka owocowa sprawdziła się również jako model do badań przesiewowych genów ASD i ich wariantów15,22,23. Największym wyzwaniem w badaniach nad ASD u much jest to, że w przeciwieństwie do innych modeli chorób, nie ma jednego modelu muchy ASD. Aby zrozumieć wpływ mutacji lub powalenia określonego genu ASD, badacz musi zweryfikować, czy fenotypy behawioralne wystarczająco naśladują objawy pacjentów z ASD, a następnie przejść do zrozumienia molekularnych lub fizjologicznych podstaw fenotypów.
Stąd, wykrywanie fenotypów podobnych do ASD jest niezbędne do badań nad ASD w modelu muchowym. Na przestrzeni lat pojawiło się kilka technik behawioralnych, które pozwalają nam wykryć nieprawidłowości, takie jak deficyty w zachowaniach / interakcjach społecznych, komunikacji, powtarzających się zachowaniach i reagowaniu na bodźce. Ponadto w różnych laboratoriach dokonano kilku modyfikacji i ulepszeń tych technik behawioralnych, aby spełnić określone wymagania, takie jak skalowanie, automatyzacja testów, odczyty, kwantyfikacja i metody porównawcze. W tym artykule wideo przedstawiono najbardziej podstawowe wersje pięciu paradygmatów behawioralnych, które w połączeniu można wykorzystać do wykrywania wyników behawioralnych podobnych do ASD w najprostszy sposób.
Agresja to ewolucyjnie zachowane wrodzone zachowanie wpływające na przetrwanie i reprodukcję24. Na agresywne zachowanie w stosunku do współplemieńców wpływa 'motywacja do socjalizacji'25,26 oraz 'communication'27, oba są zagrożone u osób dotkniętych ASD. Agresywne zachowanie jest dobrze opisane u Drosophila, a jego kwantyfikowalność dzięki solidnemu testowi agresji28,29,30 oraz dobrze poznane podstawy genetyczne i neurobiologiczne31 sprawia, że jest to odpowiedni paradygmat behawioralny32 do oceny fenotypu ASD w modelu muchy. Na agresję wpływa izolacja społeczna z dala od środowiska społecznego, co prowadzi do nasilenia agresji; To samo zaobserwowano, gdy samce much są trzymane w izolacji przez kilka dni33,34. Innym testem behawioralnym, który określa ilościowo towarzyskość u much, jest Social Space Assay35, który mierzy odległości między najbliższymi sąsiadami i odległości między muchami w małej grupie much, dzięki czemu doskonale nadaje się do testowania ról ortologów genu ASD w fly12,21,36,37, a także modeli muchy ASD wywołanych przez środowisko38,39.
Test zalotów Drosophila to kolejny paradygmat behawioralny często używany do testowania zmian w umiejętnościach społecznych i komunikacyjnych po obwodzie lub manipulacji genetycznej, w tym genów związanych z autyzmem18,19,21,40. Powtarzające się wzorce zachowań są powszechne u pacjentów z ASD, co jest rekapitulowane u much poprzez zachowanie pielęgnacyjne - serię odrębnych, stereotypowych czynności wykonywanych w celu czyszczenia i innych celów. Został z powodzeniem wykorzystany do badania wpływu mutacji genu ASD na muchy21,41, a także narażenia na chemikalia38,39. Wiele postępów i automatyzacji w teście zostało opisanych wcześniej16,41,42,43; Tutaj demonstrujemy najbardziej podstawowy wzór testu, który jest łatwy do przyjęcia i określenia ilościowego.
ASD jest znane z tego, że wpływa na zdolność do habituacji, uczenia się i pamięci u niektórych pacjentów44,45,46,47,48,49,50, organizmy modelowe ASD51,52 a także powoduje deficyty w różnych zachowaniach węchowych<klasa sup="xref">50. Habituacja Drosophila do lekkiego skoku była wcześniej używana do badań przesiewowych w kierunku genów ASD23. Habituację można ocenić za pomocą prostej metody testu habituacji węchowej53,54,55. Opisujemy metodę wywoływania habituacji węchowej i oznaczania wyniku za pomocą klasycznego binarnego testu wyboru zapachu opartego na labiryncie Y56, który można wykorzystać do wykrywania defektów habituacji w mutancie genu ASD lub stanie knockdown genu. Aby ocenić, czy wpływ mutacji (lub knock-downu genu) lub leczenia farmakologicznego na zachowanie muchy jest równoznaczny z fenotypem podobnym do ASD, można użyć kombinacji tych 5 opisanych tutaj testów.

<table><tbody><tr><td>< silna>Arena agresji:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standardowa 24-dołkowa płytka wykonana z przezroczystego polistyrenu</td><td></td><td></td><td>12 cm x 8 cm x 2 cm. Średnica pojedynczego dołka = 18 cm. Sigma-aldrich #Z707791; głębokość = 1 cm</td></tr><tr><td>Przezroczysty arkusz</td><td></td><td></td> z tworzywa sztucznego/akrylu <td>Alternatywnie: perforowana pokrywa płytki do hodowli komórkowej</td></tr><tr><td><silny>Test przestrzeni społecznej:</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spinki do segregatorów</td><td></td><td></td><td>19 mm</td></tr><tr><td>Arkusze szkła i arkusze akrylowe o niestandardowych rozmiarach</td><td></td><td></td><td>Grubość = 5 mm</td></tr><tr><td>Test zalotów:</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nakrętka i śruba z gwintem</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arkusze pleksiglasu o niestandardowych kształtach</td><td></td><td></td><td>i) Pokrywka: Wykonana na zamówienie okrągła przezroczysta tarcza z pleksiglasu (grubość 2-3 mm, średnica 70 mm) z jednym otworem załadowczym w obszarze obwodowym i drugim otworem na pośrodku (średnica ~ 3 mm dla każdego); ii) Drugi przezroczysty, grubszy krążek z pleksiglasu (grubość 3-4 mm, średnica 70 mm), z 6-8 perforacjami o średnicy 15 mm, w równej odległości od środka; iii) Podstawa: taka sama jak pokrywa, z wyjątkiem braku otworu załadowczego</td></tr><tr><td>< mocny> Test pielęgnacji: < / mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Rozproszony panel</td><td></td><td></td> LED pokryty szkłem <td>10 & ndash; 15-watowy panel LED do montażu na suficie</td></tr><tr><td><mocny> Habituacja i test labiryntu Y</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komory wspinaczkowe</td><td></td><td></td><td>x2, Adapter ze szkła borokrzemianowego</td></tr><tr><td>do podłączenia labiryntu Y z fiolką wejściową</td><td></td><td></td><td>Perspex, wykonany na zamówienie, wymiary w <mocny>Rysunek 5A</td></tr><tr><td>Przezroczyste butelki z odczynnikami</td><td></td><td></td><td>Borosil #1500017</td></tr><tr>Korek <td></td><td></td><td>do płukania gazem</td><td>Borosil #1761021</td></tr><tr><td>Fiolka szklana</td><td></td><td></td><td>OD= 25 mm x Wysokość= 85 mm; Środek zapachowy ze szkła borokrzemianowego</td></tr><tr><td>(maślan etylu)</td><td></td><td></td><td>Merck #E15701</td></tr><tr><td>Wosk parafinowy (płynny) lekki</td><td></td><td></td><td>SRL #18211</td></tr><tr><td>Zaciski rolkowe</td><td></td><td></td><td>Polymed #14098</td></tr><tr><td>Rurki silikonowe</td><td></td><td></td><td>OD = 0,6 cm, ID = 0,3 cm; zaciski rolkowe do kontroli przepływu</td></tr><tr><td>Pompa</td><td></td><td></td> próżniowa <td>Hana #HN-648 (Dowolna pompa akwariowa z kierunkiem przepływu odwrócone ręcznie)</td></tr> <tr><td>Y-maze</td><td></td><td></td><td>Szkło borokrzemianowe</td></tr><tr><td>Szklana rurka w kształcie litery Y (szkło borokrzemianowe)</td><td></td><td></td> <td>Wykonane na zamówienie, pomiary w <mocny>Rysunek 5A< / mocny></td></tr><tr><td><silny>Typowe elementy: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dowolne oprogramowanie do odtwarzania wideo (np. Odtwarzacz multimedialny VLC)</td><td></td><td></td><td>https://www.videolan.org/vlc/</td></tr><tr><td>Komputer do analizy</td><td></td><td></td><td></td>danych wideo</tr><tr><td>Butelki na muchy</td><td></td><td></td><td>OD= 60 mm x Wysokość= 140 mm; szkło/polipropylen</td></tr><tr><td>Fiolki na muchy</td><td></td><td></td><td>OD= 25 mm x Wysokość= 85 mm; Szkło borokrzemianowe</td></tr><tr><td>Graph-pad Prism oprogramowanie</td><td></td><td></td><td>https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/www.graphpad.com/scientific-software/prism/</td></tr> <tr><td>ImageJ oprogramowanie</td><td></td><td></td><td>https://imagej.net/downloads</td></tr><tr><td>Timer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kamera wideo z konfiguracją</td><td></td><td></td> nagrywania wideo <td>Kamera lub kamera w telefonie komórkowym będzie działać</td></tr><tr><td>< mocny> Do aspiratora much: < / mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>bawełniany</td><td></td><td></td><td>chłonny, autoklawowany</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td>Sigma-aldrich #P7793</td></tr><tr><td>Końcówki</td><td></td><td></td> do pipet <td>200 i mikro; L lub 1000 &mikro; L, wybierz depensację na zewnętrznej średnicy rurki silikonowej</td></tr><tr>Długość<td>rurki</td><td></td><td></td> silikonowej / gumowej <td>= 30-50 cm. Tuba powinna być bezwonna</td></tr><tr><td><mocna>Skład pokarmu dla much:</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Składniki (ilość na 1 L karmy)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar (8 g)</td><td></td><td></td><td>SRL # 19661 (CAS: 9002-18-0)</td></tr><tr><td>Mąka kukurydziana (80 g)</td><td></td><td></td><td>Organiczna, lokalnie pozyskiwana</td></tr><tr><td>D-glukoza (20 g)</td><td></td><td></td><td>SRL # 51758 (CAS: 50-99-7)</td></tr><tr><td>Kwas propionowy (4 g)</td><td></td><td></td><td>SRL # 43883 (CAS: 79-09-4)</td></tr><tr><td>Sacharoza (40 g)</td><td></td><td></td><td>SRL # 90701 (CAS: 57-50-1)</td></tr><tr><td>Tego (Hydroksybenzoesan metylu) (1,25 g)</td><td></td><td></td><td>SRL # 60905 (CAS: 5026-62-0)</td></tr><tr><td>Drożdże w proszku (10 g)</td><td></td><td></td><td>HIMEDIA # RM027</td></tr><tr><td>Fly linki używane w eksperymentach w tym badaniu:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Typ dziki (Canton S lub CS)</td><td></td><td></td><td>BDSC # 64349</td></tr><tr><td>w1118</td><td></td><td></td><td>BDSC # 3605</td></tr><tr><td>w[1118]; Fmr1[&Delta; 50M]/TM6B, Tb[+]</td><td></td><td></td><td>BDSC # 6930</td></tr><tr><td>w[*]; Fmr1[&Delta; 113M]/TM6B, Tb[1]</td><td></td><td></td><td>BDSC # 67403</td></tr><tr><td>MB247-GAL4 (Gaurav Das, NCCS Pune, Indie)</td><td></td><td></td><td>BDSC # 50742</td></tr><tr><td>LN1-GAL4</td><td></td><td></td><td>NP1227, konsorcjum NP, Japonia</td></tr><tr><td>row-shRNA</td><td></td><td></td><td>BDSC # 25971</td></tr></tbody></table>

paradygmaty oceny behawioralnej w modelu zaburzenia ze spektrum autyzmu drosophila

Paradigms for Behavioral Assessment in Drosophila Model of Autism Spectrum Disorder

Zaburzenie ze spektrum autyzmu (ASD) obejmuje niejednorodną grupę zaburzeń neurorozwojowych z typowymi objawami behawioralnymi, w tym deficytami w interakcjach społecznych i zdolnościach do komunikacji, wzmocnionymi ograniczeniami lub powtarzającymi się zachowaniami, a także, w niektórych przypadkach, trudnościami w uczeniu się i deficytem motorycznym. Drosophila posłużyła jako niezrównany organizm modelowy do modelowania wielu chorób ludzkich. Ponieważ wiele genów jest związanych z ASD, muszki owocowe stały się potężnym i skutecznym sposobem testowania genów przypuszczalnie związanych z tym zaburzeniem. Ponieważ setki genów o różnych rolach funkcjonalnych są zaangażowane w ASD, pojedynczy genetyczny model muchy ASD jest niewykonalny; zamiast tego indywidualne mutanty genetyczne, knockdowny genów lub badania oparte na nadekspresji homologii much genów związanych z ASD są powszechnymi sposobami uzyskania wglądu w szlaki molekularne leżące u podstaw tych produktów genowych. U Drosophila dostępnych jest wiele technik behawioralnych, które zapewniają łatwy odczyt deficytów w określonych komponentach behawioralnych. Wykazano, że test przestrzeni społecznej oraz testy agresji i zalotów u much są przydatne w ocenie wad w interakcjach społecznych lub komunikacji. Zachowanie pielęgnacyjne u much to doskonały odczyt powtarzających się zachowań. Test habituacji jest stosowany u much w celu oszacowania zdolności do uczenia się habituacji, która okazuje się być zaburzona u niektórych pacjentów z ASD. Połączenie tych paradygmatów behawioralnych można wykorzystać do dokładnej oceny stanu chorobowego podobnego do ASD u much. Używając zmutowanych much Fmr1, rekapitulując zespół Fragile-X u ludzi i knockdown rzędu homologu POGZ w neuronach much, wykazaliśmy wymierne deficyty w odstępach społecznych, agresji, zachowaniach godowych, zachowaniach pielęgnacyjnych i przyzwyczajeniu. Te paradygmaty behawioralne są tutaj demonstrowane w ich najprostszych i najprostszych formach z założeniem, że ułatwi to ich powszechne wykorzystanie w badaniach nad ASD i innymi zaburzeniami neurorozwojowymi w modelach much.

Test agresji 
Jako model muchy w ASD, Fmr1 wykorzystano muchy mutanty63,64. W1118 samce wykorzystano jako grupę kontrolną i Fmr1 trans-heterozygota Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M57 samce much jako much doświadczalnych; dorosłe samce przetrzymywano w probówkach izolacyjnych przez 5 dni. Samce homotypowe (ten sam genotyp, te same warunki utrzymania) wprowadzono do areny agresji, a ich zachowanie rejestrowano przez 20 min. Dla każdego genotypu policzono całkowitą liczbę epizodów agresji w ciągu 20 min. Stwierdzono, że liczba epizodów agresji w ciągu 20 min była istotnie niższa w przypadku samców mutantów niż u samców kontrolnych (Rysunek 1E). Ta zmniejszona agresywność w Fmr1 muchy mogą wynikać ze zmniejszonego zainteresowania interakcją społeczną z inną muchą. W przeciwieństwie do tego, w przypadku osobników utrzymywanych w grupach/warunkach społecznych Fmr1 mutant męskie muchy wykazują liczbę starć agresywnych porównywalną do liczby starć u osobników utrzymywanych w grupach społecznych Wskazówka: Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia.1118 muchy (dane nie przedstawiono), co prawdopodobnie wskazuje na pozycyjną rolę środowiska społecznego w indukcji zachowań społecznych.
Analiza przestrzeni społecznej 
Analizę przestrzeni społecznej przeprowadzono u much w1118 oraz w modelu ASD (Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M). Dla każdej muchy obliczono dystans do najbliższego sąsiada, a dla każdego genotypu wykonano 10 powtórzeń biologicznych. Muchy mutanty wykazują znacząco większe odległości od najbliższego sąsiada niż osobniki kontrolne (Rysunek 2D), co wskazuje na preferencję do zachowania większego dystansu od innych much.
Test zalotów 
Test zalotów u samców much utrzymywanych pojedynczo przeprowadzono w celu ilościowego określenia wrodzonego zachowania godowego u dwóch oddzielnych modeli much ASD. Po pierwsze, zachowanie godowe much transheterozygotycznych Fmr1 porównano z zachowaniem much w1118; muchy Fmr1 wykazały znacznie niższy indeks zalotów, a także zmniejszoną liczbę prób kopulacji (Rysunek 3E1). W drugim eksperymencie wyciszono ekspresję row, ortologa genu POGZ u ludzi u Drosophila (genu o wysokim ryzyku wystąpienia ASD20), poprzez ekspresję krótkiego mikroRNA w formie spinki (shRNA) przeciwko row w neuronach ciał grzybowatych przy użyciu linii drivera MB247-GAL4. Te modelowe muchy ASD z wyciszonym genem row przebadano pod kątem wszelkich defektów wrodzonego wzorca zalotów; indeks zalotów oraz liczbę prób kopulacji obliczono na podstawie 15-minutowych nagrań wideo. Muchy z wyciszonym genem row wykazały znacznie obniżony indeks zalotów oraz mniejszą liczbę prób kopulacji (Rysunek 3E2), co wskazuje na zaburzenia w komunikacji z samicami.
Zachowanie pielęgnacyjne 
Zachowanie pielęgnacyjne jest wykorzystywane jako wskaźnik zachowań powtarzalnych u Drosophila16,42,43. Zachowanie pielęgnacyjne zostało ilościowo określone u much transheterozygot Fmr1 i porównane z zachowaniem much w1118. Czas oczekiwania do pierwszego aktu pielęgnacyjnego jest znacznie skrócony u much Fmr1, natomiast średni czas trwania jednego aktu pielęgnacyjnego oraz indeks pielęgnacji są znacznie zwiększone u much Fmr1 (Rycina 4C), co wskazuje na nasilone zachowania pielęgnacyjne (lub powtarzalne) u much w modelu ASD. Z kolei całkowita liczba aktów pielęgnacyjnych u much mutantów nie wykazuje istotnych zmian w porównaniu z muchami kontrolnymi.
Test habituacji węchowej 
Wykazano, że habituacja jest upośledzona u wielu osób z autyzmem, co pozwala wykorzystać ją jako test w przypadku Drosophila23. W niniejszej pracy habituację węchową w modelu ASD testowano poprzez wyciszenie ekspresji genu row w lokalnych interneuronach węchowych sterowanych przez LN1-GAL4. W eksperymentach tych, w celu wywołania habituacji u much, zastosowano awersyjny substancję zapachową – 20% maślan etylu. Wyniki pokazują, że muchy z wyciszonym genem row nie uległy habituacji po 3-dniowej ekspozycji na zapach (ostatnie dwa słupki na wykresie na Rysunku 5E nie wykazują istotnej różnicy między muchami naiwnymi a habituowanymi) w porównaniu do much typu dzikiego, które wykazały typową habituację po 3-dniowej ekspozycji na maślan etylu (muchy eksponowane wykazały istotny spadek indeksu wydajności w porównaniu do much naiwnych). Wskazuje to, że muchy z wyciszonym genem row nie ulegają habituacji po 3-dniowej ekspozycji na maślan etylu i są odpychane przez ten awersyjny zapach, co dowodzi, że te muchy w modelu ASD wykazują deficyt habituacji.
<img alt="Test agresji u Drosophila: ustawienie, etapy, wyniki; rurka silikonowa, pipeta, wykres zachowań, graf." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66649/66649fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Arena agresji i reprezentatywne wzorce behawioralne. (A) Ustawienie areny agresji w płytce 24-dołkowej z perforowaną pokrywką umożliwiającą wprowadzenie much. Wstawka: Wymiary pojedynczej areny z pożywką dla much. (B) Zdjęcie rurki do indywidualnego utrzymywania zawierającej pojedynczą, izolowaną samca muchy oraz fiolki do zbiorowego utrzymywania zawierającej muchy płci męskiej i żeńskiej, odtwarzającej środowisko społeczne. (C) Aspirator do przenoszenia much za pomocą aspiracji ustnej. Elementy wymagane do złożenia aspiratora do much z zaznaczeniem strony rurki służącej do pobierania much (koniec dla much) oraz strony wkładanej do ust (koniec ustny) (C1) oraz złożony aspirator do much (C2). (D) Reprezentatywne wzorce agresywnych zachowań samców: podejście, groźba skrzydłami, szermierka, trzymanie, wypad, boksowanie i przepychanie się. (E) Samce much z mutacją Fmr1 wykazują zmniejszoną agresję wobec innych samców w porównaniu do grupy kontrolnej. Wykres pudełkowy przedstawiający liczbę epizodów agresji dla izolowanych społecznie samców w1118 (kontrola) w porównaniu do trans-heterozygotycznych much Fmr1 (Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66649/66649fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Ustawienie i wyniki eksperymentu dotyczącego dystansu społecznego much; trójkątna konstrukcja komory; naklejka z linijką; wykres danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66649/66649fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Konfiguracja areny do testu przestrzeni społecznej. (A) Schemat przedstawiający wymiary oraz rozmieszczenie szklanych tafli i akrylowych dystansowników. (B) Końcowy układ elementów areny, w którym dystansowniki akrylowe są umieszczone pomiędzy szklanymi elementami, pozostawiając na dole małą szczelinę umożliwiającą wejście much. Trójkątna przestrzeń utworzona między szkłem a dystansownikami stanowi arenę SSA dla much; w tej konfiguracji muchy mogą poruszać się tylko w dwóch wymiarach. (C) Zdjęcie końcowej konfiguracji areny SSA z muchami wewnątrz komory. Skrót: SSA = social space array (układ przestrzeni społecznej). (D) Muchy w modelu ASD (Fmr1 transheterozygotyczne) wykazują zwiększony dystans między sobą w teście przestrzeni społecznej w porównaniu do w1118. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66649/66649fig02large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Analiza zachowań godowych u much; układ doświadczalny, etapy obserwacji, wykresy behawioralne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66649/66649fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Arena godowa i reprezentatywne wzorce behawioralne.Schematy przedstawiające (A) projekt i (B) rozmieszczenie dysków w arenie do testów godowych. (C) Zdjęcie areny godowej po końcowym rozmieszczeniu. (D) Reprezentatywne obrazy przedstawiające wzorce zachowań godowych naiwnego samca wobec sparowanej samicy: pościg, orientacja, drganie skrzydeł, lizanie, próba kopulacji oraz kopulacja. (E) Wykresy przedstawiające indeks godowy i liczbę prób kopulacji w dwóch modelach ASD: (E1) muchy mutanty Fmr1 wykazujące znaczną redukcję indeksu godowego i prób kopulacji w porównaniu z kontrolą w1118. (E2) muchy z wyciszeniem genu row użyte jako kolejny model ASD, w których row-shRNA był wyrażany w neuronach ciał grzybowych (MB247-GAL4); po wyciszeniu genu row zaobserwowano znaczną redukcję zachowań godowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66649/66649fig03largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Zachowania pielęgnacyjne u Drosophila; układ eksperymentalny, etapy zachowań much oraz wykresy analizy danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66649/66649fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4Konfiguracja areny i reprezentatywne wzorce zachowań pielęgnacyjnych. (A) Arena w kształcie tarczy lub koła (ta sama arena do zalotów pokazana w Rysunek 3) ustawiono na panelu LED z dyfuzorem w celu zapewnienia równomiernego oświetlenia od dołu, a obraz wideo rejestrowano z góry. Zapewnia to wyższy kontrast, niezbędny do zidentyfikowania subtelnych ruchów wyrostków podczas pielęgnacji. (B) Fotografie wzorców zachowań pielęgnacyjnych obserwowanych u dorosłych samców much. T1 = 1Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. para nóg, T2 = 2nd para nóg, T3 = trzecia para nóg. W odniesieniu do wzorców pielęgnacji (grooming patterns) zastosowano intuicyjną nomenklaturę skróconą w B: T1-head = pocieranie głowy pierwszą parą nóg; T1-T1 = pocieranie o siebie pierwszej pary nóg i tak dalej. Skrót: LED = dioda emitująca światło. (C) Wykresy przedstawiające wyniki testu pielęgnacyjnego przeprowadzonego w Fmr1 muchy trans-heterozygotyczne i porównano je z w1118. Fmr1 muchy mutanty wykazały znacznie krótszy czas utajenia do pierwszej serii pielęgnacji, co wskazuje na wcześniejsze rozpoczęcie pielęgnacji w porównaniu z grupą kontrolną. Ponadto średni czas trwania serii pielęgnacji oraz indeks pielęgnacji były znacznie zwiększone w Fmr1 mutantów, co wskazuje na nasilenie zachowań repetytywnych u much w modelu ASD. W przeciwieństwie do tego, całkowita liczba epizodów pielęgnacji (grooming) nie uległa istotnej zmianie u much mutantów w porównaniu z grupą kontrolną. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66649/66649fig04large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układ i wyniki testu węchowego w labiryncie Y; ekspozycja much na substancję zapachową, analiza habituacji, wykres wyników." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66649/66649fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rysunek 5Indukcja i przygotowanie badania do testu habituacji węchowej oraz reprezentatywny wynik po przeprowadzeniu badania. (A) Elementy układu do testu binarnego wyboru zapachowego: (A1) labirynt w kształcie litery Y, (A2) adapter, (A3) układ tych dwóch, (A4) para probówek zbiorczych do zamocowania na końcach ramion labiryntu w kształcie litery Y, (A5) szklana butelka i szklane rurki służące do przechowywania roztworu substancji zapachowej lub wody, przez którą przepływa powietrze przed przedostaniem się do labiryntu w kształcie litery Y. (B) Przygotowanie butelek z pożywką dla muszek w celu indukcji habituacji węchowej; schemat (B1) przedstawia sposób zawieszenia probówki do wirówki zawierającej substancję zapachową na miedzianym drucie w połowie wysokości wnętrza butelki; (B2na koniec otwór butelki zostaje przykryty watą i zabezpieczony brązową kopertą papierową.C) Zdjęcie całkowitego układu zestawu labiryntu w kształcie litery Y. (D) Fotografie przedstawiające rozmieszczenie much w komorach zbierających po zakończeniu eksperymentu. (D1) Muchy naiwne (eksponowane wyłącznie na bezwonny parafinię, grupa kontrolna) wykazują odrazę do awersyjnego substancji zapachowej (w niniejszym badaniu do indukcji habituacji użyto 20% maślanu etylu) i wybierają ramię labiryntu w kształcie litery Y wypełnione zwykłym powietrzem, podczas gdy (D2) wystawione (oswojone) muchy rozmieszczają się równomiernie w obu ramionach. Skrót: ID = średnica wewnętrzna. (E) wyniki testu habituacji węchowej u rzęd-muchy z wyciszonym ekspresją genu wykazywały deficyt habituacji. Muchy typu dzikiego (Canton S), po 3-dniowej ekspozycji na maślan etylu, wykazały istotny spadek indeksu wydajności w porównaniu z muchami naiwnymi, co wskazuje na habituację. Gdy potomstwo LN1-GAL4 x rowMuchy shRNA poddano ekspozycji przez 3 dni; nie stwierdzono istotnych różnic w indeksie wydajności w porównaniu z muchami naiwnymi; dowodzi to, że muchy z wyciszeniem genu row nie uległy habituacji podczas 3-dniowej ekspozycji na substancję zapachową, co odzwierciedla objaw przypominający ludzkie ASD. Skróty: ASD = zaburzenia spektrum autyzmu; shRNA = krótkie kręcone RNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66649/66649fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>

Zaburzenie ze spektrum autyzmu (ASD) wiąże się z zaburzeniami zachowań społecznych i komunikacyjnych oraz pojawieniem się powtarzających się zachowań. W celu zbadania wzajemnych relacji między genami ASD a deficytami behawioralnymi w modelu Drosophila, w tym artykule opisano pięć paradygmatów behawioralnych do oceny odstępów społecznych, agresji, zalotów, pielęgnacji i zachowań habituacyjnych.

Paradygmaty oceny behawioralnej w modelu zaburzenia ze spektrum autyzmu Drosophila

Autism Spectrum Disorder (ASD) encompasses a heterogeneous group of neurodevelopmental disorders with common behavioral symptoms including deficits in ...

Zaburzenie ze spektrum autyzmu dotyka dzieci, prowadząc do upośledzenia komunikacji, zachowań społecznych i nasilenia powtarzających się zachowań. Drosophila jest coraz bardziej popularnym modelem w badaniach nad autyzmem w celu rozszyfrowania podstawowych szlaków molekularnych. Opisujemy zestaw standardowych technik charakterystyki behawioralnej modeli autyzmu much.Aby rozszyfrować molekularne podstawy zaburzeń ze spektrum autyzmu u muszek, należy precyzyjnie ustalić ich objawy behawioralne. Kwantyfikacja cech behawioralnych autyzmu u Drosophila melanogaster jest dość trudnym zadaniem. Nie ma jednego paradygmatu behawioralnego u much, który odnosi się do wszystkich anomalii behawioralnych tego zaburzenia.Opisaliśmy zestaw pięciu dobrze ugruntowanych paradygmatów behawioralnych u Drosophila, a mianowicie test agresji, test przestrzeni społecznej, zaloty, uwodzenie i test habituacji. Wszystko to można wykorzystać w modelach much ASD do scharakteryzowania i ilościowego określenia poziomu upośledzenia zachowań komunikacyjnych, powtarzalnych zachowań i zachowań społecznych. Opisujemy te pięć technik w ich najprostszej formie, tak aby każde laboratorium z minimalnym zapleczem badawczym muchowym mogło je z łatwością przyjąć i przeprowadzać eksperymenty na modelu muchowym zaburzeń ze spektrum autyzmu i przyczyniać się do postępu w naszym zrozumieniu tej choroby.Na początek weź standardową 24-dołkową płytkę i napełnij połowę każdej studzienki zwykłym pokarmem dla much. Pozostaw żywność do wyschnięcia na noc. Zrób mały 2,5-milimetrowy otwór na przezroczystym plastikowym lub akrylowym arkuszu i umieść go na dobrze przygotowanej płycie.Za pomocą mikroskopu stereoskopowego oddziel nowo zamknięte muchy o pożądanym genotypie na podstawie ich płci. Włóż połowę samców much pojedynczo do pojedynczych rurek obudowy. Drugą połowę samców much należy trzymać w grupie 10 sztuk z samicami much w zwykłej fiolce do trzymania grupowego, tworząc warunki społeczne.Przechowuj wszystkie fiolki w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez pięć dni. Pysk zasysa dwa samce much z pojedynczej lub grupowej komory trzymania do płytki areny agresji przez otwór w pokrywie. Natychmiast odsuń otwór, aby upewnić się, że muchy nie mogą uciec.Po jednej do dwóch minut aklimatyzacji uruchom minutnik na 20 minut. Upewnij się, że nagrałeś muchy na wideo. Odtwórz film na komputerze i policz całkowitą liczbę agresywnych ataków dla każdej muchy.Liczba agresywnych ataków w ciągu 20 minut była znacznie zmniejszona w przypadku zmutowanych samców niż u samców kontrolnych. Na początek oddziel samce much od mieszanej populacji much na lodzie i umieść je w fiolce do zbierania. Aby przygotować arenę, umieść dwie trójkątne akrylowe przekładki płasko na prostokątnej tafli szkła, tak aby kąty proste akrylowych przekładek były wyrównane z rogami tafli szkła.Następnie umieść dwie prostokątne przekładki akrylowe płasko na tafli szkła wyrównane z podstawami dwóch trójkątnych przekładek. Upewnij się, że cztery akrylowe przekładki otaczają trójkątną arenę na prostokątnej szklanej tafli, która nie jest pokryta przekładkami. Umieść naklejkę linijki na jednym z trójkątnych przekładek, upewniając się, że jest widoczna od góry.Teraz umieść drugą prostokątną taflę szkła na akrylowych przekładkach, aby wyrównać ją z taflą szkła na dole. Za pomocą czterech małych spinaczy do segregatorów zabezpiecz szyby i przekładki. Do testu usuń prawy dolny zacisk do segregatora i lekko przesuń prostokątną przekładkę na zewnątrz, aby utworzyć szczelinę.Aby przenieść muchy z fiolki kolekcjonerskiej na arenę przestrzeni społecznej, delikatnie zassaj je przez utworzoną przestrzeń. Natychmiast przesuń prostokątną podkładkę dystansową i zabezpiecz klips do segregatora z powrotem na swoim miejscu. Trzymając komorę w pozycji pionowej, delikatnie uderz nią trzy razy w miękką podkładkę, aby wszystkie muchy osiadły u podstawy.Clamp komorę w pozycji pionowej i uruchom timer. Zrób wyraźne zdjęcie areny po 20 minutach. Analizuj za pomocą ImageJ, aby wyświetlić listę odległości najbliższego sąsiada między przelotami.Zmutowane muchy wykazują znacznie większe odległości od najbliższych sąsiadów niż ich odpowiedniki z grupy kontrolnej, co wskazuje na preferencję dla większej odległości od innych much. Aby rozpocząć, złóż wszystkie cztery części komnaty zalotów razem. Za pomocą aspiratora delikatnie przenieś pięciodniowego izolowanego samca muchy testowej z pojedynczej rurki do komory godowej, w której znajduje się pojedyncza, wstępnie pokryta samica.Szybko obróć pokrywę, aby zamknąć komorę. Rejestruj zachowanie much przez 15 minut, aby obliczyć wskaźnik zalotów i całkowitą liczbę prób kopulacji. Po ustawieniu areny testowej przenieś pojedynczego samca muchy trzymanej w domu na arenę za pomocą aspiratora.Natychmiast odsuń otwór w pokrywie, aby zapobiec ucieczce muchy. Umieść arenę do pielęgnacji na rozproszonym panelu LED i pozwól muchy zaaklimatyzować się przez minutę. Nagrywaj wideo muchę przez 10 minut.Przeanalizuj filmy i oblicz wskaźnik pielęgnacji, opóźnienie pielęgnacji, liczbę napadów pielęgnacji i średni czas trwania pielęgnacji. Zmutowane muchy wykazywały znacznie niższy wskaźnik zalotów, a także mniejszą liczbę prób kopulacji. Opóźnienie do pierwszej pielęgnacji było znacznie zmniejszone u zmutowanych much, podczas gdy średni czas trwania pielęgnacji i wskaźnik pielęgnacji były znacznie zwiększone.Na początek zdobądź muchy przygotowane do testu habituacji. Umieść jeden mililitr preferowanego środka zapachowego rozcieńczonego ciekłą parafiną w 1.5 mililitrowej probówce do mikrofuge. Wiruj rurkę przez 10 minut i przykryj ją równomiernie perforowaną folią.Za pomocą drutu zawieś rurki ze środkiem zapachowym w oddzielnych butelkach z pożywką zawierających muchy. Przykryj butelkę dobrze bawełną i owiń ją papierem rzemieślniczym, aby zapobiec dyfuzji oparów nawaniacza. Oznacz butelki kontrolne i zawierające zapach odpowiednio jako naiwne i narażone na zapach.Butelki indukcyjne należy przechowywać w inkubatorze przez trzy dni. W przypadku testu labiryntu Y przymocuj labirynt Y do adaptera, przymocuj spód labiryntu Y do fiolki wejściowej, a następnie przymocuj komory wspinaczkowe do dwóch ramion labiryntu Y. Za pomocą bezwonnych silikonowych rurek połącz zwężający się koniec każdej komory wspinaczkowej z butelką z odczynnikiem zawierającą środek zapachowy.Za pomocą pompy próżniowej skieruj nawaniacz z butli gazowych do dwóch ramion Y i pozwól mu się nasycić przez 15 minut. Delikatnie wprowadź wygłodzone muchy z każdej fiolki do fiolki wejściowej zestawu Y-maze. Po krótkiej aklimatyzacji podłącz fiolkę wejściową do adaptera Y-maze, aby rozpocząć test.Pozwól muchom wspiąć się na ramiona labiryntu Y i zostać uwięzionymi w dwóch komorach zbiorczych na ponad minutę. Po zakończeniu postukaj muchami na dno fiolki wejściowej i zmień pozycję ramion labiryntu Y, aby uniknąć stronniczości bocznej. Zapisz liczbę much wspinających się na każde z dwóch ramion labiryntu Y w czasie trwania eksperymentu.Muchy powalające, które powalają, nie przyzwyczajały się po trzydniowej ekspozycji na substancje zapachowe w porównaniu z muchami typu dzikiego.

paradigms-for-behavioral-assessment-drosophila-model-autism-spectrum

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Tutaj prezentujemy protokół do ilościowego określenia unikania osób zestresowanych. Ten paradygmat jest potężny, ale przyjazny dla użytkownika i może być wykorzystany do oceny wpływu genów i środowiska na jeden rodzaj interakcji społecznych u Drosophila melanogaster.

Prosty test do ilościowego oznaczania unikania społecznego u Drosophila melanogaster

Bardziej ograniczone, powtarzające się zachowania (RRB) zakłócają życie osób dotkniętych tym problemem.  Zachowania te są trudne do modelowania u gryzoni, co utrudnia podstawowe badania biomedyczne nad potencjalnymi terapiami lub interwencjami w przypadku RRB.  W tym miejscu opisujemy eksplorację nowych obiektów jako potencjalny test dla RRB wyższego rzędu u myszy.

Eksploracja nowych obiektów jako potencjalny test dla powtarzających się zachowań wyższego rzędu u myszy

Modele gryzoni są cennymi narzędziami do badania podstawowych zachowań związanych z zaburzeniami ze spektrum autyzmu (ASD). W tym artykule wyjaśniamy dwa testy behawioralne do modelowania podstawowych cech ASD u myszy: samopielęgnację, który ocenia powtarzające się zachowanie, oraz trzykomorowy test interakcji społecznych, który dokumentuje upośledzenia społeczne.

Strategie oceny zachowań podobnych do autystycznych u myszy

Procedura opisana w niniejszym protokole wykazuje, że podawanie testosteronu oraz powszechne przekonania na jego temat mogą być powiązane z bezpośrednio przeciwstawnymi zachowaniami społecznymi.

Połączenie endokrynologii behawioralnej i ekonomii eksperymentalnej: testosteron a podejmowanie decyzji społecznych

Intensywnie badany nicień Caenorhabditis elegans może zostać zmodyfikowany transgenicznie w celu ekspresji ludzkiego peptydu β-amyloidu (Aβ). Indukowana ekspresja Aβ w mięśniach C. elegans prowadzi do szybkiego, powtarzalnego fenotypu paraliżu, który może być wykorzystany do monitorowania terapii modulujących toksyczność Aβ.

Oznaczanie toksyczności β-amyloidu z wykorzystaniem transgenicznego modelu C. elegans

Ponieważ sprawność manualna jest domeną głównie naczelnych, w badaniach nad małpami makakami opracowano zadania behawioralne. Cztery zadania dotyczące sięgania i chwytania, mierzące siłę oraz zdolność manipulacji dłonią, pozwalają na ustalenie stopnia regeneracji funkcjonalnej po uszkodzeniu ośrodkowego układu nerwowego oraz na przetestowanie efektów zastosowanego leczenia.

Behawioralna ocena sprawności manualnej u naczelnych innych niż człowiek

Reagowanie na sygnały powiązane z pokarmem lub lekiem nasila się w czasie okresu abstynencji, co może wiązać się ze zwiększoną podatnością na zachowania nawrotowe. W niniejszym materiale szczegółowo opisujemy procedurę oceny tej „inkubacji głodu” (ang. incubation of craving) u szczurów, które podawały sobie samodzielnie sacharozę.

Ogólna metoda oceny inkubacji głodu sacharozy u szczurów

Rytmy okołodobowe w dobrowolnej aktywności biegania kołem u ssaków są ściśle powiązane z molekularnymi oscylacjami głównego zegara w mózgu.  W związku z tym te codzienne rytmy zachowania można wykorzystać do badania wpływu czynników genetycznych, farmakologicznych i środowiskowych na funkcjonowanie tego zegara okołodobowego.

Rejestracja i analiza rytmów okołodobowych w aktywności kół biegowych u gryzoni

Ten protokół opisuje prosty, ekonomiczny sposób indywidualnej identyfikacji Drosophila lub innych owadów. Dane demonstracyjne badające sukces godowy trzech gatunków Drosophila pokazują, że metoda ta jest porównywalna lub lepsza niż zastosowanie znieczulenia CO2 .

Barwienie owadów do testów behawioralnych: zachowanie godowe znieczulonych Drosophila

Aby zidentyfikować nowe mutacje wpływające na mechanosensację, zaprojektowaliśmy test, który mierzy reakcję behawioralną na stymulację dotykową szczeciny muchy u zmutowanych klonów generowanych metodą MARCM. Połączenie technik pozwala na identyfikację mutacji mechanowrażliwych, które w przeciwnym razie byłyby śmiertelne.

Test behawioralny do mechanosensacji klonów opartych na MARCM u Drosophila melanogaster

Poznaj pięć paradygmatów behawioralnych w modelu Drosophila do badania zaburzeń ze spektrum autyzmu. Metody obejmują testy agresji, zachowań społecznych i nawykowych, umożliwiając precyzyjną kwantyfikację deficytów behawioralnych.

Paradygmaty oceny behawioralnej w modelu zaburzenia ze spektrum autyzmu Drosophila

Przeglądaj więcej filmów