Poszukiwanie alternatywnych rozwiązań perfuzyjnych z wykorzystaniem spolimeryzowanych nośników tlenu na bazie hemoglobiny nowej generacji w modelu perfuzji płuc ex vivo u szczurów

Perfuzja płuc ex vivo (EVLP) umożliwia rozszerzoną ocenę płuc dawcy. Istnieją dwa roztwory perfuzyjne, bezkomórkowy i komórkowy. Badanie to szczegółowo opisuje użycie spolimeryzowanego ludzkiego nośnika tlenu na bazie hemoglobiny lub PolyHb jako perfuzatu w protokole testowania tego roztworu w szczurzym modelu EVLP.

Niedawne postępy w perfuzji narządów ex vivo umożliwiły rozszerzenie puli narządów dawców o lepsze funkcjonowanie. Prace nad wydłużeniem czasów perfuzji normotermicznej za pomocą dostosowanych perfuzatów pozwolą na dalsze postępy w tej dziedzinie. Obecne techniki perfuzji wykorzystują perfuzaty komórkowe lub bezkomórkowe, z których każdy ma zalety i wady.

Kompozycja perfuzyjna ma kluczowe znaczenie dla wsparcia metabolizmu, zmniejszenia stanu zapalnego i utrzymania ciśnienia onkotycznego. Jednak istniejące rozwiązania mogą powodować obrzęk i uszkodzenie płuc, dlatego konieczne jest opracowanie nowatorskich rozwiązań perfuzyjnych, które zapobiegają nadmiernym uszkodzeniom przy jednoczesnym zachowaniu prawidłowej homeostazy komórkowej. Obiecujący nośnik tlenu oparty na hemoglobinie (HBOC) to spolimeryzowana hemoglobina ludzka syntetyzowana z przeterminowanych upakowanych czerwonych krwinek.

Nasze laboratorium opracowało PolyHb nowej generacji z minimalnymi gatunkami o niskiej masie cząsteczkowej i hemoglobiną bezkomórkową. Wykazało to poprawę właściwości biofizycznych i zmniejszyło zwężenie naczyń krwionośnych, nadciśnienie i uszkodzenia oksydacyjne w badaniach na zwierzętach. Te cechy sprawiają, że jest to obiecujący kandydat na perfuzację.

Na początek weź albuminę surowicy ludzkiej o końcowym stężeniu 3%Do niej dodaj spolimeryzowaną hemoglobinę lub PolyhHb, rozcieńczoną do końcowego stężenia 3,7 grama na decylitr za pomocą pożywki Williamsa. Następnie dodaj jeden mililitr roztworu heparyny do powstałego rozcieńczonego roztworu PolyHb. Umieść perfuzat PolyHb w zbiorniku obwodu EVLP i ustaw temperaturę łaźni wodnej na 37 stopni Celsjusza.

Następnie włącz pompy rolkowe i upewnij się, że perfuzat krąży w obwodzie. Podłącz gaz odtleniający do natleniacza z pustych włókien, aby odtlenić perfuzat. Otwórz oprogramowanie do akwizycji danych na komputerze.

Sprawdź, czy przetworniki ciśnienia w tętnicy płucnej, różnicy ciśnień w tchawicy, różnicy ciśnień w przepływie oddechowym, masy płuc i prędkości pompy są podłączone zarówno do obwodu, jak i do skrzynki konwertera danych. Dokładnie sprawdź wszystkie połączenia rurowe, aby upewnić się, że nie ma wycieków i że w całym czasie krąży ciepła woda. Naciśnij przycisk run w oprogramowaniu, aby sprawdzić, czy wszystkie przetworniki ciśnienia działają.

Gdy system działa prawidłowo, wyłącz pompy rolkowe. Aby rozpocząć, umieść narzędzia chirurgiczne w autoklawie na stole operacyjnym. Ogolić brzuch znieczulonego szczura i ułożyć go w pozycji leżącej na desce operacyjnej.

Oczyść brzuch jodonem powidonu, a następnie 70% etanolem. Umieść maść okulistyczną pod oczami szczura, aby zapobiec wysuszeniu. Zamocuj szczura na miejscu na tablicy operacyjnej.

Uruchom oprogramowanie do akwizycji danych i rozpocznij nagrywanie. Włącz wentylator przy czterech mililitrach na kilogram i upewnij się, że dodatnie i wydechowe ciśnienie wynosi około dwóch centymetrów wody. Za pomocą nożyczek wykonaj laparotomię w linii środkowej od wyrostka mieczykowatego do syntezy łonowej.

Następnie za pomocą narzędzia wykonaj przyśrodkową boczną rotację trzewną i uwidocznij podwątrobową żyłę główną dolną. Wstrzyknąć heparynę do żyły głównej dolnej za pomocą igły o rozmiarze 20G. Za pomocą nożyczek odetnij skórę od wcięcia mostka do tuż poniżej kąta żuchwy i zacznij preparować w kierunku tchawicy.

Następnie tępo wypreparuj niezbędne mięśnie paska, aby odsłonić tchawicę. Wykonaj poprzeczne nacięcie na przedniej tchawicy między pierścieniami chrzęstnymi, uważając, aby nie przeciąć tylnej części tchawicy. Umieść jedwabny szew 5-0 wokół tchawicy.

Włóż rurkę dotchawiczą do pierścieni chrzęstnych i zabezpiecz ją jedwabnym szwem 5-0. Podłącz rurkę dotchawiczą do respiratora i upewnij się, że klatka piersiowa jest prawidłowo uniesiona. Za pomocą nożyczek wykonaj sternotomię pośrodkową i wejdź do jamy klatki piersiowej.

Umieść zwijacze ściany klatki piersiowej, aby odsłonić serce i płuca, unikając niezamierzonej manipulacji płucami. Za pomocą kombinacji ostrego i rozwarstwienia usuń grasicę z przedniego śródpiersia. Zidentyfikuj tętnicę płucną i umieść wokół niej jedwabny szew 5-0, aby przygotować się do kaniulacji.

Wykonaj dwu- lub trzymilimetrowe nacięcie w drodze odpływu prawej komory za pomocą nożyczek, aby umieścić kaniulę tętniczą w tętnicy płucnej i zabezpieczyć ją szwem 5-0. Po eutanazji szczura szybko podłącz odpowietrzony płyn konserwujący płuca do kaniuli tętniczej, aby grawitacyjnie przepłukać płuca. Podłącz kaniulę tętniczą do obwodu EVLP.

Włączyć pompę rolkową i pozwolić, aby niewielka ilość perfuzatu przepłynęła przez płuco i wydostała się z lewej komory do jamy klatki piersiowej. Gdy perfuzat zacznie wypływać z lewego przedsionka, wyłącz pompę rolkową. Następnie umieść małe kleszcze w lewej komorze i delikatnie rozciągnij pierścień zastawki mitralnej.

Umieść jedwabny krawat 5-0 wokół serca i luźno zawiąż. Włóż kaniulę lewego przedsionka do lewej komory i przesuwaj kaniulę, aż będzie widoczna w przedsionku. Zabezpiecz lewy przedsionek za pomocą wstępnie zawiązanego szwu 5-0.

Zidentyfikuj przełyk i zaciśnij go hemostatem jak najbliżej przepony. Następnie przetnij przełyk poniżej hemostatu. Używając kręgosłupa jako przewodnika, odetnij nożyczkami wszystkie przyczepy więzadłowe łączące blok płuco-serce z otaczającymi strukturami.

Następnie wypreparuj tchawicę z szyi i przetnij tchawicę powyżej rurki dotchawiczej, aby uwolnić blok płuco-serce. Przenieś blok płuco-serce do kurtki piersiowej w obwodzie EVLP i przymocuj lewą kaniulę przedsionka do obwodu. Włącz pompę rolkową i podłącz monitor wentylatora.

Sprawdź pułapkę bąbelkową, aby upewnić się, że do systemu nie wprowadzają się zatory powietrzne. Powoli zmieniaj ustawienia wentylacji i perfuzji na żądane poziomy eksperymentalne w ciągu pierwszych 15 minut. Dodatkowo zwiększ natężenie przepływu perfuzji do żądanej szybkości i ciśnienia.

W wyznaczonych punktach czasowych sprawdź poziom gazu perfuzyjnego i testy czynnościowe płuc. Wszystkie badane perfuzaty wykazały niewielki spadek ciśnienia parcjalnego tlenu w lewym przedsionku, przy czym perfuzat na bazie RBC znacznie zmniejszył się po jednej godzinie. Przez następne kilka godzin zarówno PolyHb, jak i perfuzaty kontrolne miały stabilne ciśnienie parcjalne tlenu w lewym przedsionku.

Ciśnienie parcjalne tlenu delta znacznie spadło po jednej godzinie w grupie perfuzatów RBC, podczas gdy pozostaje stabilne w perfuzatorach PolyhHb i kontrolnych z nieistotnym trendem. Ciśnienie parcjalne dwutlenku węgla w lewym przedsionku było znacznie niższe w perfuzacie RBC i kontrolnym w porównaniu z PolyhHb po pierwszej godzinie i tendencja ta utrzymuje się w kolejnych godzinach. Ciśnienie parcjalne delta dwutlenku węgla zostało znacznie zwiększone w perfuzacie RBC po jednej godzinie, a następnie pozostaje stabilne zarówno w perfuzacie PolyhHb, jak i kontrolnym.

Dane fizjologiczne płuc w czasie rzeczywistym pokazują, że perfuzat RBC znacznie zwiększał opór naczyniowy płuc w ciągu pierwszej godziny, podczas gdy zarówno perfuzaty PolyhHb, jak i kontrolne utrzymywały niski i stabilny opór naczyniowy płuc w tym okresie. Zmiana masy płuc była początkowo znacząca w perfuzacie RBC, z ciągłym wzrostem wszystkich perfuzatów, nieco bardziej w PolyhHb. Podatność zmniejszyła się istotnie w przypadku perfugatu RBC w ciągu pierwszej godziny, podczas gdy zmniejszyła się nieistotnie w przypadku innych perfuzatów.

PolyhHb miał najwyższą zgodność po czterech godzinach.