Name: Poszukiwanie alternatywnych rozwiązań perfuzyjnych z wykorzystaniem spolimeryzowanych nośników tlenu na bazie hemoglobiny nowej generacji w modelu perfuzji płuc ex vivo u szczurów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T14:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Poznaj zastosowanie polimeryzowanej hemoglobiny (PolyHb) jako nośnika tlenu w modelu perfuzji płuc ex vivo u szczurów. Ta metoda może poprawić funkcję płuc i wydłużyć czas zachowania narządów dawczych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te badania były hojnie wspierane przez Jewel and Frank Benson Family Endowment oraz Jewel and Frank Benson Research Professorship. B.A.W. jest częściowo wspierany przez grant National Institutes of Health (NIH) R01HL143000. A.F.P. jest wspierany przez granty NIH R01HL126945, R01EB021926, R01HL131720 i R01HL138116 oraz grant US Army Medical Research and Materiel Command W81XWH1810059. S.M.B. jest wspierany przez NIH R01 DK123475.

Szczury Sprague-Dawley (300 g masy ciała) zostały komercyjnie pozyskane i trzymane w warunkach wolnych od patogenów w Ośrodku dla Zwierząt Uniwersytetu Stanowego Ohio w Wexner. Wszystkie procedury zostały przeprowadzone w sposób humanitarny zgodnie z NIH i Przewodnikiem Narodowej Rady ds. Badań Naukowych dotyczącym humanitarnej opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych oraz za zgodą Komitetu ds. Instytucjonalnej Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Stanowego Ohio (Protokół IACUC 2023A00000071).
1. Synteza i oczyszczanie PolyhHb
UWAGA: Produkcja i synteza materiału PolyhHb, który został użyty do następujących eksperymentów EVLP, zostały początkowo opublikowane przez Cuddington et al. w 2020 roku22. Proszę zapoznać się z tą pracą, aby uzyskać szczegółowe schematy i analizę syntezy PolyhHb. Poniżej znajduje się podsumowanie syntezy i oczyszczania PolyhHb w skali pilotażowej, a następnie jego przygotowania w postaci perfuzatu.
<ol>
	<li>Mycie RBC, liza i oczyszczanie Hb
	<ol>
		<li>Zaopatrz się w 18 jednostek przeterminowanych ludzkich PRBC i wlej je do 20-litrowego naczynia filtracyjnego, rozcieńcz 0,9% wag. soli fizjologicznej do końcowego hematokrytu 22% (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1B, C).</li>
		<li>Wykonaj sześć wymian objętości systemu (diacykli) na module filtracji stycznego (TFF) modyfikowanego sulfonu etylenu (mPES) o średnicy 0,65 μm z 0,9% soli fizjologicznej na roztworze RBC. UWAGA: Celem tego etapu mycia jest usunięcie uszkodzonych erytrocytów, fragmentów błony i innych materiałów zewnątrzkomórkowych przed hemolizą (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B, C).</li>
		<li>Roztwór RBC poddać lizie 10 l buforu fosforanowego (PB, 3,75 mM, pH 7,4) przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C, ciągle mieszając.</li>
		<li>Usunąć zlizowane fragmenty membrany i inne agregaty, filtrując roztwór przez moduł TFF o mocy 500 kDa i zbierając permeat w 30-litrowym zbiorniku reaktora wsadowego (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A-C).</li>
		<li>Gdy 480 g Hb znajdzie się w reaktorze, dodaj sól, aby przekształcić PB w sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).</li>
		<li>Recyrkulacja Hb przez kontaktor gazowy zasilany azotem, a także utrzymywanie przestrzeni nad azotem w reaktorze, w celu odtlenienia białka przez noc. Schłodzić do temperatury 14 °C, aby ograniczyć tworzenie się methemoglobiny (metHb).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Polimeryzacja Hb
	<ol>
		<li>Podgrzać roztwór Hb do temperatury fizjologicznej (37 °C), jednocześnie recyrkulując roztwór na pętli stycznika gazowego. 
		UWAGA: Celem jest odtlenienie białka do pO2 w zakresie 0-10 mmHg, aby zapewnić, że większość Hb jest w napiętym stanie czwartorzędowym (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A).</li>
		<li>W razie potrzeby dodać 1 g ładunku ditionitu sodu, aby zapewnić skuteczne odtlenienie.</li>
		<li>Utrzymując pętlę recyrkulacyjną i odgazowując roztwór Hb, dodać stosunek molowy aldehydu glutarowego (GA) do Hb rozcieńczonego w 3 l odtlenionego PBS (pH 7,4) w stosunku molowym.</li>
		<li>Dodać roztwór do zbiornika reaktora przez 3 godziny z dodatkową godziną czasu reakcji.</li>
		<li>Ugasić reakcję sieciowania stosunkiem molowym cyjanoborowodorku sodu do GA, rozcieńczonym w 3 l PBS (pH 7,4) wynoszącym 7:1. Dodawać do reaktora przez ponad 10 minut.</li>
		<li>Schłodzić reaktor w temperaturze 14 °C przez noc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie PolyhHb
	<ol>
		<li>Przepompuj zawartość reaktora do 10-litrowego naczynia filtracyjnego i rozpocznij cyrkulację przez moduł TFF z sulfonu polietylenu (PES) o wielkości 0,2 μm (stopień 1). Ten krok usunie duże agregaty i niepożądane zanieczyszczenia.</li>
		<li>Wprowadzić permeat do wtórnego naczynia filtracyjnego o pojemności 10 litrów, które po napełnieniu będzie krążyć po module TFF polisulfonu (PS) o mocy 500 kDa (stopień 2). Kontynuuj, aż reaktor zostanie opróżniony (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B,D).</li>
		<li>Po opróżnieniu reaktora do obiegu oczyszczania należy rozpocząć wymianę substancji pomocniczej na etapie 1 ze zmodyfikowanym roztworem Ringera z mleczanami (pH 7,4). Po każdej pełnej wymianie objętości należy zmierzyć stężenie białka w permeacie etapu 1 za pomocą spektroskopii w zakresie widzialnym UV.</li>
		<li>Gdy stężenie permeatu etapu 1 jest mniejsze niż 1 mg Hb/ml, przenieś zmodyfikowany roztwór Ringera do etapu 2. Wszelkie przestoje na etapie 1 są odpadami i powinny być odpowiednio zutylizowane. W sumie upewnij się, że na obu etapach wykonano 12 pełnych wymian objętości zmodyfikowanego roztworu Ringera.</li>
		<li>Po zakończeniu diacykli skoncentrować zawartość etapu 2 do co najmniej 10 g/dl w module TFF o stężeniu 500 kDa.</li>
		<li>Zapakować stężony roztwór w stożkowe probówki o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Preparat perfuzatu
<ol>
	<li>Przygotować perfuzat do końcowej objętości 165 ml. Rozcieńczyć PolyhHb do końcowego stężenia 3,7 g/dl za pomocą pożywki E Williama.</li>
	<li>Dodać albuminę surowicy ludzkiej (HSA) do końcowego stężenia 3% HSA wagowo. Dodać 1 ml heparyny do końcowego roztworu.</li>
</ol>
3. Konfiguracja obwodu perfuzji płuc ex vivo 
<ol>
	<li>Umieść perfuzat PolyhHb w zbiorniku obwodu EVLP i włącz ciepłą łaźnię wodną do 37 °C. Upewnij się, że perfuzat krąży w obwodzie, włączając pompy rolkowe.</li>
	<li>Podłącz gaz odtleniający (tj. 6% O2, 8% CO2, 84% N2) do natleniacza z pustych włókien, aby odtlenić perfuzat. Ma to na celu ocenę zdolności płuc do natleniania perfuzatu.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie do akwizycji danych na pobliskim komputerze. Upewnij się, że przetworniki ciśnienia w tętnicy płucnej, różnicy ciśnień w tchawicy, różnicy ciśnień w przepływie oddechowym, masy płuc i prędkości pompy są podłączone zarówno do obwodu, jak i do skrzynki konwertera danych.</li>
	<li>Upewnij się, że w całym systemie nie ma wycieków, dokładnie sprawdzając wszystkie połączenia rur i że ciepła woda krąży w całym systemie (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Naciśnij Uruchom w oprogramowaniu do akwizycji danych, aby upewnić się, że wszystkie przetworniki ciśnienia działają. Gdy system działa prawidłowo, wyłącz pompy rolkowe.</li>
</ol>
4. Pobranie bloku płuc od dawcy szczura
<ol>
	<li>Ustaw stół chirurgiczny i ułóż narzędzia (<silna klasa="xfig">Rysunek 3). Wszystkie narzędzia należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Przygotuj 1200 j./kg heparyny, mieszaninę ketaminy i ksylazyny do znieczulenia (60 mg/kg ketaminy i 5 mg/kg), a także nici jedwabne o długości 5-10 cm (3-0 lub 4-0).</li>
	<li>Wstrzyknąć szczurowi dootrzewnowo roztwór ketaminy/ksylazyny. Odczekaj 5-10 minut, aż rozwinie się płaszczyzna znieczulająca. Aby zapewnić odpowiedni poziom znieczulenia, uszczypnij szczura u nogi, aby wywołać reakcję. Jeśli nie ma reakcji, oznacza to, że został spełniony odpowiedni poziom znieczulenia.</li>
	<li>Ogol brzuch szczura i ułóż go w pozycji leżącej na desce operacyjnej. Oczyść brzuch jodonem powidonu i 70% etanolem. Umieść maść okulistyczną pod oczami szczura, aby zapobiec wysuszeniu.</li>
	<li>Przenieś szczura na deskę chirurgiczną i zabezpiecz go na miejscu (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A). Włącz oprogramowanie do akwizycji danych i rozpocznij nagrywanie. Włączyć wentylator przy 4 ml/kg i upewnić się, że dodatnie końcowe ciśnienie wydechowe (PEEP) wynosi około 2 cm/h2O. 
	UWAGA: Te początkowe ustawienia są specyficzne dla eksperymentu. Do wszystkich badaczy należy określenie najlepszych strategii wentylacji dla poszczególnych eksperymentów.</li>
	<li>Po osiągnięciu odpowiedniej głębokości znieczulenia należy wykonać laparotomię w linii środkowej od wyrostka mieczykowatego do spojenia łonowego za pomocą nożyczek. Następnie wykonaj przyśrodkowo-boczną rotację trzewną i uwidocznij podwątrobową żyłę główną dolną za pomocą narzędzia (IVC)36,37,38 (<silna klasa="xfig">Rysunek 4B). Wstrzyknąć heparynę do IVC za pomocą igły 20G (<silna klasa="xfig">Ryc. 4C).</li>
	<li>Zwróć uwagę na szyję i odetnij skórę od wcięcia mostka do tuż poniżej kąta żuchwy za pomocą nożyczek. Następnie zacznij analizować w kierunku tchawicy (<silna klasa="xfig">Rysunek 5A).</li>
	<li>W szyi tępo wyciąć niezbędne mięśnie paska, aby odsłonić tchawicę (<silna klasa="xfig">Ryc. 5B). Wykonaj poprzeczne nacięcie nożyczkami na przedniej tchawicy między pierścieniami chrzęstnymi wystarczająco dużymi, aby zmieścić się w rurce dotchawiczej (ET) (kilka milimetrów), ale nie przecinaj tylnej części tchawicy. Umieść jedwabny szew 5-0 wokół tchawicy (<silna klasa="xfig">Ryc. 5C).</li>
	<li>Włóż rurkę dotchawiczą i zabezpiecz ją na miejscu za pomocą wspomnianego jedwabnego szwu 5-0 (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 5D). Podłącz rurkę ET do respiratora i upewnij się, że klatka piersiowa jest prawidłowo uniesiona.</li>
	<li>Wykonaj sternotomię pośrodkową i ponownie wejdź do jamy klatki piersiowej za pomocą nożyczek. Umieść zwijacze ściany klatki piersiowej, aby odsłonić serce i płuca (<silna klasa="xfig">Rysunek 6A). Unikaj przypadkowych manipulacji płucami, ponieważ są one niezwykle kruche.</li>
	<li>Usuń grasicę z przedniego śródpiersia za pomocą kombinacji ostrych (nożyczek) i rozwarstwienia. Uważaj, aby nie uszkodzić wielkich naczyń krwionośnych lub płuc.</li>
	<li>Zidentyfikuj tętnicę płucną (PA; <silna klasa="xfig">Rysunek 6B) i umieść wokół niego jedwabny szew 5-0, aby przygotować się do kaniulacji (<silna klasa = "xfig">Rysunek 6C). Ze względu na mikroskopijną anatomię wielkich naczyń krwionośnych szczura, często łatwiej jest umieścić szew wokół PA i aorty w tym samym czasie.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie 2-3 mm na ścieżce odpływu prawej komory (RVOT) za pomocą nożyczek (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 6D-E), aby umieścić kaniulę tętniczą w PA i zabezpieczyć ją na miejscu za pomocą szwu 5-0 opisanego krok wcześniej (<silna klasa = "xfig">Ryc. 6F).</li>
	<li>Wykonaj 5-milimetrowe nacięcie w lewej komorze (LV), a także IVC podwątrobowym za pomocą nożyczek, aby poddać szczura eutanazji. Szybko podłącz płyn zachowujący płuca do kaniuli tętniczej, aby grawitacyjnie przepłukać płuca około 20 ml (<silna klasa = "xfig">Rysunek 7A-B). Upewnij się, że płyn konserwujący płuca jest odpowietrzeny przed podłączeniem go do kaniuli tętniczej, ponieważ zatory powietrzne są bardzo szkodliwe dla płuc.</li>
	<li>Podłącz kaniulę tętniczą do obwodu EVLP. Włączyć pompę rolkową i pozwolić, aby niewielka ilość perfuzatu przepłynęła przez płuco i wydostała się z lewej komory do jamy klatki piersiowej. Gdy perfuzat zacznie wypływać z lewego przedsionka, wyłącz pompę rolkową (<silna klasa="xfig">Rysunek 7C). Pozwalając na przepływ perfuzatu, upewnij się, że ciśnienie PA nie wzrasta - co wskazywałoby na zablokowanie lub nieprawidłowe umieszczenie.</li>
	<li>Umieść małe kleszcze w lewej komórce i delikatnie rozciągnij pierścień zastawki mitralnej, co pozwoli na wprowadzenie kaniuli lewego przedsionka (LA) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 8A). Umieść jedwabny krawat 5-0 wokół serca i luźno zawiąż (Rysunek 8B).</li>
	<li>Włóż kaniulę LA do lewej komnaty i przesuń kaniulę LA, aż będzie widoczna w przedsionku. Zakończ zabezpieczanie LA za pomocą wstępnie zawiązanego szwu 5-0 (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 8C).</li>
	<li>Zidentyfikuj przełyk i zaciśnij go hemostatem jak najbliżej przepony. Przeciąć przełyk poniżej hemostatu, aby upewnić się, że nie dojdzie do rozlania się do jamy klatki piersiowej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 9A).</li>
	<li>Używając kręgosłupa jako przewodnika, przetnij wszystkie przyczepy więzadłowe łączące blok płuco-serce z otaczającymi strukturami za pomocą nożyczek (<silna klasa = "xfig">Rysunek 9B). Gdy blok płuco-serce jest swobodnie ruchomy, wypreparuj tchawicę z szyi i na koniec przetnij tchawicę powyżej rurki ET za pomocą nożyczek, aby uwolnić blok płuco-serce (<silna klasa = "xfig">Rysunek 9C).</li>
	<li>Przenieś blok płuco-serce do kurtki piersiowej w obwodzie EVLP i przymocuj kaniulę LA do obwodu EVLP (<silna klasa = "xfig">Rysunek 9D). Włącz pompę rolkową i podłącz monitor wentylatora.</li>
	<li>Sprawdź pułapkę bąbelkową, aby upewnić się, że do systemu nie wprowadzają się zatory powietrzne.</li>
	<li>Powoli zmieniaj ustawienia wentylacji i perfuzji na żądane poziomy eksperymentalne podczas początkowych 15 minut36,37,38. Dodatkowo, podczas tej początkowej fazy rozruchu, zwiększ szybkość przepływu perfuzji do żądanej szybkości i/lub ciśnienia.</li>
	<li>W wyznaczonych przez eksperyment punktach czasowych sprawdź poziomy gazu perfuzyjnego, a także testy czynnościowe płuc.</li>
</ol>

Advancing Lung Transplantation with PolyhHb-Based Perfusion in Rat EVLP Models

<ol><li>Valapour, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OPTN%2FSRTR+2021+annual+data+report%3A+Lung%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">OPTN/SRTR 2021 annual data report: Lung.</a> Am J Transplant. 23, 2 Suppl 1 S379-S442 (2023).</li>
<li>Gouchoe, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+lung+perfusion+in+donation+after+circulatory+death%3A+A+post+hoc+analysis+of+the+normothermic+Ex+Vivo+lung+perfusion+as+an+assessment+of+extended%2Fmarginal+donors+lungs+trial%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Cardiovasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Ex vivo lung perfusion in donation after circulatory death: A post hoc analysis of the normothermic Ex Vivo lung perfusion as an assessment of extended/marginal donors lungs trial.</a> J Thorac Cardiovasc Surg. , 10.1016/j.jtcvs.2024.03.011 (2024).</li>
<li>Bobba, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+donation+after+circulatory+death+in+lung+transplantation+in+the+United+States%3A+Impact+of+era%5BTitle%5D)+AND+%22Transpl+Int%22%5BJournal%5D)">Trends in donation after circulatory death in lung transplantation in the United States: Impact of era.</a> Transpl Int. 35, 10172(2022).</li>
<li>Steen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+lungs+from+a+non-heart-beating+donor%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Transplantation of lungs from a non-heart-beating donor.</a> Lancet. 357 (9259), 825-829 (2001).</li>
<li>Cypel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normothermic+ex+vivo+lung+perfusion+in+clinical+lung+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Normothermic ex vivo lung perfusion in clinical lung transplantation.</a> N Engl J Med. 364 (15), 1431-1440 (2011).</li>
<li>Cypel, M., Neyrinck, A., Machuca, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+perfusion+techniques%3A+state+of+the+art+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Intens+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Ex vivo perfusion techniques: state of the art and potential applications.</a> Intens Care Med. 45 (3), 354-356 (2019).</li>
<li>Gouchoe, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XPS%E2%84%A2+Jensen+lung+as+a+low-cost%2C+high-fidelity+training+adjunct+to+ex-vivo+lung+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Artif+Organs%22%5BJournal%5D)">XPS™ Jensen lung as a low-cost, high-fidelity training adjunct to ex-vivo lung perfusion.</a> Artif Organs. , 10.1111/aor.14623 (2023).</li>
<li>Van Raemdonck, D., Rega, F., Rex, S., Neyrinck, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Machine+perfusion+of+thoracic+organs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Dis%22%5BJournal%5D)">Machine perfusion of thoracic organs.</a> J Thorac Dis. 10, Suppl 8 S910-S923 (2018).</li>
<li>Andreasson, A. S., Dark, J. H., Fisher, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+lung+perfusion+in+clinical+lung+transplantation--state+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cardiothorac+Surg%22%5BJournal%5D)">Ex vivo lung perfusion in clinical lung transplantation--state of the art.</a> Eur J Cardiothorac Surg. 46 (5), 779-788 (2014).</li>
<li>Ahmad, K., Pluhacek, J. L., Brown, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+lung+perfusion%3A+A+review+of+current+and+future+application+in+lung+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Pulm+Ther%22%5BJournal%5D)">Ex vivo lung perfusion: A review of current and future application in lung transplantation.</a> Pulm Ther. 8 (2), 149-165 (2022).</li>
<li>Kim, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biometric+profiling+to+quantify+lung+injury+through+ex+vivo+lung+perfusion+following+warm+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Asaio+j%22%5BJournal%5D)">Biometric profiling to quantify lung injury through ex vivo lung perfusion following warm ischemia.</a> Asaio j. 69 (8), e368-e375 (2023).</li>
<li>Jeon, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acellular+ex+vivo+lung+perfusate+silences+pro-inflammatory+signaling+in+human+lung+endothelial+and+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Acellular ex vivo lung perfusate silences pro-inflammatory signaling in human lung endothelial and epithelial cells.</a> J Transl Med. 21 (1), 729(2023).</li>
<li>Baciu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+purine+metabolism+at+reperfusion+affects+clinical+outcome+in+lung+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Altered purine metabolism at reperfusion affects clinical outcome in lung transplantation.</a> Thorax. 78 (3), 249-257 (2023).</li>
<li>Peel, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+impact+of+ex+vivo+lung+perfusion+on+organ+transplantation%3A+A+retrospective+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg%22%5BJournal%5D)">Evaluating the impact of ex vivo lung perfusion on organ transplantation: A retrospective cohort study.</a> Ann Surg. 278 (2), 288-296 (2023).</li>
<li>Peel, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+impact+of+ex+vivo+lung+perfusion+on+hospital+costs+for+lung+transplantation%3A+A+retrospective+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Lung+Transpl%22%5BJournal%5D)">Determining the impact of ex vivo lung perfusion on hospital costs for lung transplantation: A retrospective cohort study.</a> J Heart Lung Transpl. 42 (3), 356-367 (2023).</li>
<li>Warnecke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normothermic+ex+vivo+preservation+with+the+portable+Organ+Care+System+Lung+device+for+bilateral+lung+transplantation+%28INSPIRE%29%3A+a+randomised%2C+open-label%2C+non-inferiority%2C+phase+3+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Respir+Med%22%5BJournal%5D)">Normothermic ex vivo preservation with the portable Organ Care System Lung device for bilateral lung transplantation (INSPIRE): a randomised, open-label, non-inferiority, phase 3 study.</a> Lancet Respir Med. 6 (5), 357-367 (2018).</li>
<li>Loor, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Portable+normothermic+ex+vivo+lung+perfusion%2C+ventilation%2C+and+functional+assessment+with+the+Organ+Care+System+on+donor+lung+use+for+transplantation+from+extended-criteria+donors+%28EXPAND%29%3A+a+single-arm%2C+pivotal+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Resp+Med%22%5BJournal%5D)">Portable normothermic ex vivo lung perfusion, ventilation, and functional assessment with the Organ Care System on donor lung use for transplantation from extended-criteria donors (EXPAND): a single-arm, pivotal trial.</a> Lancet Resp Med. 7 (11), 975-984 (2019).</li>
<li>Loor, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+EVLP+using+OCS+lung%3A+Cellular+and+acellular+perfusates%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Prolonged EVLP using OCS lung: Cellular and acellular perfusates.</a> Transplantation. 101 (10), 2303-2311 (2017).</li>
<li>Bansal, S., Biswas, G., Avadhani, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria-targeted+heme+oxygenase-1+induces+oxidative+stress+and+mitochondrial+dysfunction+in+macrophages%2C+kidney+fibroblasts+and+in+chronic+alcohol+hepatotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondria-targeted heme oxygenase-1 induces oxidative stress and mitochondrial dysfunction in macrophages, kidney fibroblasts and in chronic alcohol hepatotoxicity.</a> Redox Biol. 2, 273-283 (2014).</li>
<li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+investigation+on+the+feasibility+of+porcine+red+blood+cells+from+genetically+modified+pigs+as+an+alternative+to+human+red+blood+cells+for+transfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Initial investigation on the feasibility of porcine red blood cells from genetically modified pigs as an alternative to human red blood cells for transfusion.</a> Front Immunol. 14, 1298035(2023).</li>
<li>Ellingson, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continued+decline+in+blood+collection+and+transfusion+in+the+United+States-2015%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Continued decline in blood collection and transfusion in the United States-2015.</a> Transfusion. 57, Suppl 2 1588-1598 (2017).</li>
<li>Cuddington, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pilot+scale+production+and+characterization+of+next+generation+high+molecular+weight+and+tense+quaternary+state+polymerized+human+hemoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Pilot scale production and characterization of next generation high molecular weight and tense quaternary state polymerized human hemoglobin.</a> Biotechnol Bioeng. 119 (12), 3447-3461 (2022).</li>
<li>Moore, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+polymerized+hemoglobin+for+the+treatment+of+hemorrhagic+shock+when+blood+is+unavailable%3A+the+USA+multicenter+trial%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Surg%22%5BJournal%5D)">Human polymerized hemoglobin for the treatment of hemorrhagic shock when blood is unavailable: the USA multicenter trial.</a> J Am Coll Surg. 208 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Shonaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+human-derived+hemoglobin+based+oxygen+vesicles+as+a+machine+perfusion+solution+for+liver+donation+after+cardiac+death+in+a+pig+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Impact of human-derived hemoglobin based oxygen vesicles as a machine perfusion solution for liver donation after cardiac death in a pig model.</a> PLoS One. 14 (12), e0226183(2019).</li>
<li>Chen, G., Palmer, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemoglobin-based+oxygen+carrier+and+convection+enhanced+oxygen+transport+in+a+hollow+fiber+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Hemoglobin-based oxygen carrier and convection enhanced oxygen transport in a hollow fiber bioreactor.</a> Biotechnol Bioeng. 102 (6), 1603-1612 (2009).</li>
<li>Bucci, E., Kwansa, H., Koehler, R. C., Matheson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+zero-link+polymers+of+hemoglobin%2C+which+do+not+extravasate+and+do+not+induce+pressure+increases+upon+infusion%5BTitle%5D)+AND+%22Artif+Cells+Blood+Substit+Immobil+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Development of zero-link polymers of hemoglobin, which do not extravasate and do not induce pressure increases upon infusion.</a> Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol. 35 (1), 11-18 (2007).</li>
<li>Schaer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haptoglobin+preserves+vascular+nitric+oxide+signaling+during+hemolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Haptoglobin preserves vascular nitric oxide signaling during hemolysis.</a> Am J Respir Crit Care Med. 193 (10), 1111-1122 (2016).</li>
<li>Muller, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+efficacy+of+human+polymerized+hemoglobin+on+guinea+pig+resuscitation+from+hemorrhagic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Safety and efficacy of human polymerized hemoglobin on guinea pig resuscitation from hemorrhagic shock.</a> Sci Rep. 12 (1), 20480(2022).</li>
<li>Greenfield, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+analysis+and+preclinical+pharmacokinetics-pharmacodynamics+of+tangential+flow+filtration+fractionated+polymerized+human+hemoglobin+as+a+red+blood+cell+substitute%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Biophysical analysis and preclinical pharmacokinetics-pharmacodynamics of tangential flow filtration fractionated polymerized human hemoglobin as a red blood cell substitute.</a> Biomacromolecules. 24 (4), 1855-1870 (2023).</li>
<li>Cuddington, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerized+human+hemoglobin-based+oxygen+carrier+preserves+lung+allograft+function+during+normothermic+ex+vivo+lung+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Asaio+j%22%5BJournal%5D)">Polymerized human hemoglobin-based oxygen carrier preserves lung allograft function during normothermic ex vivo lung perfusion.</a> Asaio j. , 10.1097/mat.0000000000002118 (2024).</li>
<li>Cabrales, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+molecular+mass+of+tense-state+polymerized+bovine+hemoglobin+on+blood+pressure+and+vasoconstriction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of the molecular mass of tense-state polymerized bovine hemoglobin on blood pressure and vasoconstriction.</a> J Appl Physiol. 107 (5), 1548-1558 (2009).</li>
<li>Baek, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down+selection+of+polymerized+bovine+hemoglobins+for+use+as+oxygen+releasing+therapeutics+in+a+guinea+pig+model%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Down selection of polymerized bovine hemoglobins for use as oxygen releasing therapeutics in a guinea pig model.</a> Toxicol Sci. 127 (2), 567-581 (2012).</li>
<li>Williams, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resuscitation+from+hemorrhagic+shock+with+fresh+and+stored+blood+and+polymerized+hemoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Resuscitation from hemorrhagic shock with fresh and stored blood and polymerized hemoglobin.</a> Shock. 54 (4), 464-473 (2020).</li>
<li>Muller, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resuscitation+from+hemorrhagic+shock+after+traumatic+brain+injury+with+polymerized+hemoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Resuscitation from hemorrhagic shock after traumatic brain injury with polymerized hemoglobin.</a> Sci Rep. 11 (1), 2509(2021).</li>
<li>Lamb, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+size+of+bioengineered+oxygen+carriers+determines+tissue+oxygenation+in+a+hypercholesterolemia+guinea+pig+model+of+hemorrhagic+shock+and+resuscitation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">The molecular size of bioengineered oxygen carriers determines tissue oxygenation in a hypercholesterolemia guinea pig model of hemorrhagic shock and resuscitation.</a> Mol Pharm. 20 (11), 5739-5752 (2023).</li>
<li>Bobba, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+negative+pressure-flow+waveform+to+ventilate+lungs+for+normothermic+ex+vivo+lung+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Asaio+j%22%5BJournal%5D)">A novel negative pressure-flow waveform to ventilate lungs for normothermic ex vivo lung perfusion.</a> Asaio j. 67 (1), 96-103 (2021).</li>
<li>Nelson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+of+isolated+ex+vivo+lung+perfusion+in+a+rat+model%3A+lessons+learned+from+developing+a+rat+EVLP+program%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: lessons learned from developing a rat EVLP program.</a> J Vis Exp. (96), e52309(2015).</li>
<li>Nelson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+ex+vivo+lung+perfusion+as+a+platform+for+transplantation+research%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research.</a> World J Exp Med. 4 (2), 7-15 (2014).</li>
<li>Wong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+therapeutic+targets+for+lung+repair+during+human+ex+vivo+lung+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Potential therapeutic targets for lung repair during human ex vivo lung perfusion.</a> Eur Respir J. 55 (4), 1902222(2020).</li>
<li>Machuca, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+endothelin-1+pathway+as+a+biomarker+for+donor+lung+assessment+in+clinical+ex+vivo+lung+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Lung+Transpl%22%5BJournal%5D)">The role of the endothelin-1 pathway as a biomarker for donor lung assessment in clinical ex vivo lung perfusion.</a> J Heart Lung Transpl. 34 (6), 849-857 (2015).</li>
<li>Gouchoe, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitsugumin+53+Mitigation+of+ischemia+reperfusion+injury+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Cardiovasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Mitsugumin 53 Mitigation of ischemia reperfusion injury in a mouse model.</a> J Thorac Cardiovasc Surg. 10, 10.1016/j.jtcvs.2023.08.005 (2023).</li>
<li>Gouchoe, D. A., Whitson, B. A., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+next+frontier+in+lung+transplantation%3A+Protecting+the+endothelium+and+repairing+organs+for+transplant+utilizing+MG53%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Dis%22%5BJournal%5D)">The next frontier in lung transplantation: Protecting the endothelium and repairing organs for transplant utilizing MG53.</a> Clin Transl Dis. 3 (6), e255(2023).</li>
<li>Gouchoe, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MG53+mitigates+warm+ischemic+lung+injury+in+a+murine+model+of+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Cardiovasc+Surg%22%5BJournal%5D)">MG53 mitigates warm ischemic lung injury in a murine model of transplantation.</a> J Thorac Cardiovasc Surg. , 10.1016/j.jtcvs.2023.10.056 (2023).</li>
</ol>

W przypadku materiału przedstawionego w tej pracy, A.F.P., A.G. i C.C. są wynalazcami w amerykańskim zgłoszeniu patentowym PCT/US2022/041743. A.F.P., C.C., B.A.W. i S.M.B. są wynalazcami w amerykańskim zgłoszeniu patentowym PCT/US2023/017765.

Opracowywanie i testowanie roztworów perfuzyjnych to nowatorskie przedsięwzięcie, które podejmuje wiele osób na całym świecie. Tradycyjnie, standardowe perfuzaty oferują możliwość zawieszenia czasu niedokrwienia i złagodzenia związanych z nim urazów związanych z niedokrwieniem, a także reperfuzją18. Jednak kolejną ewolucją EVLP jest ulepszenie obecnej technologii perfuzacji, a także włączenie terapii naprawczych i regeneracyjnych 39,40,41,42,43.
PolyhHb opisany w tej pracy jest umieszczony w nawiasie od 500 kDa do 0,2 μm, aby zapobiec wynaczynieniu materiału z obwodu do płuc, co zapobiegnie zwężeniu naczyń krwionośnych i wzrostowi ciśnienia PA30. Bardzo ważne jest, aby na wszystkich etapach polimeryzacji tej syntezy ciśnienie parcjalne tlenu (pO2) było utrzymywane na odpowiednim poziomie dla pożądanego iloczynu powinowactwa tlenowego PolyhHb. Obejmuje to wszystkie roztwory dodane w trakcie reakcji (tj. środek sieciujący, roztwór hartowniczy itp.) o dopasowanym pO2 do bioreaktora (tj. odgazowane azotem, natlenione itp.). Główną zaletą tej procedury syntezy jest to, że produkt końcowy ma modyfikowalną równowagę tlenową, co pozwala na różne zastosowania przy różnym zapotrzebowaniu na tlen (tj. niskie powinowactwo tlenowe PolyhHb do transfuzji, umiarkowane powinowactwo tlenowe do perfuzji płuc lub wysokie powinowactwo tlenowe do ukierunkowanego dostarczania tlenu). Ważne jest również, aby upewnić się, że w bioreaktorze znajduje się mechanizm grzewczy, który nie powoduje nadmiernego nagrzewania się punktów kontaktowych, co skutkuje powstawaniem uszkodzonych białek. Odkryliśmy, że miedziana cewka w całym zbiorniku zapewnia bardziej równomierne i mniej szkodliwe ogrzewanie/chłodzenie niż izolowany płaszcz grzewczy na zewnątrz statku (rysunek 1A).
Chociaż opracowanie modelu szczura EVLP nie jest niczym nowym37,38, zauważyliśmy kilka obszarów, które mogą prowadzić do poprawy wyników. Po pierwsze, konieczne jest wykonanie małych nacięć w IVC po złożeniu ofiary, aby upewnić się, że nie ma dodatkowego powietrza, które mogłoby dostać się do płuc przez krążenie. Podczas przepłukiwania alloprzeszczepu płuc roztworem do konserwacji płuc, jednolity bladobiały kolor płuc informuje mikrochirurga, że proces pobierania jest technicznie udany. Jeśli w miąższu nadal znajduje się płuco o różowym zabarwieniu, czasami zaleca się wyregulowanie kaniuli PA tak, aby całe płuco było równomiernie ukrwione. Podczas gdy kaniula PA jest często łatwiejszą częścią procedury do wykonania, wprowadzenie kaniuli LA jest nieco trudniejsze. Zawsze konieczne jest rozszerzenie pierścienia zastawki mitralnej, aby kaniula LA dotarła do LA. Należy to jednak zrobić z najwyższą ostrożnością, ponieważ łatwo jest przebić komorę lub przedsionki. Gdy końcówka kaniuli znajdzie się w przedsionkach, często może zostać zgubiona podczas zabezpieczania szwu wokół komory. Często konieczne jest wyregulowanie kąta stołu (bardziej poziomo) lub umieszczenie kawałka gazy na dnie kaniuli, aby pozostała na swoim miejscu.
Ograniczenia Ten model ma pewne ograniczenia. Chociaż pomocna jest ocena skuteczności perfudatów i ich zdolności do poprawy potencjalnych przeszczepów allogenicznych, nie jest to model przeszczepu, który byłby w stanie dostarczyć nam wyników in vivo dotyczących różnych perfuzatów i technologii. Ponadto, chociaż PolyhHb jest ekscytującą nową technologią perfuzyjnym, jej zastosowanie, skuteczność i potencjalne ograniczenia będą musiały zostać dodatkowo uzasadnione w dodatkowych przedklinicznych i klinicznych eksperymentach perfuzyjnych, zanim będzie można rozważyć powszechne zastosowanie tej technologii.
Wnioski W tym miejscu zademonstrowaliśmy zastosowanie perfuzatu PolyhHb nowej generacji oraz protokół, za pomocą którego ten roztwór perfuzyjny może być testowany w modelu EVLP szczura. Wraz z postępem technologii perfuzatu korzystne będzie zbadanie możliwości wykorzystania PolyhHb jako potencjalnego substytutu tradycyjnych perfuzatów30. Poprzednie generacje PolyhHb doprowadziły do szkodliwych skutków ubocznych w oparciu o ich skład; Jednak ulepszenia syntezy stworzyły polimer, który jest mniej podatny na wynaczynienie, prowadzenie do obrzęku, a tym samym powodowanie uszkodzenia komórek30. Dzięki PolyhHb możliwe jest wykonanie EVLP bez konieczności stosowania erytrocytów, przy jednoczesnym zaspokojeniu zapotrzebowania metabolicznego alloprzeszczepów płuc. Niewątpliwie pozwoli to na lepsze funkcjonowanie przeszczepu allogenicznego ex vivo. Konieczna jest jednak dalsza walidacja PolyhHb zarówno w warunkach przedklinicznych, jak i klinicznych. Mamy nadzieję, że ten protokół dostarczy społeczności transplantacyjnej płuc kluczowych informacji w projektowaniu i opracowywaniu nowatorskich rozwiązań perfuzyjnych, a także odpowiednich protokołów do testowania ich w klinicznie istotnych, translacyjnych modelach transplantacyjnych.

Jak każda dziedzina transplantacji narządów stałych, transplantacja płuc cierpi na niedobór organów dawców. Aby zwiększyć pulę dawców, przeprowadzono szeroko zakrojone badania nad potencjałem przeszczepów allogennych, które kiedyś uważano za nienadające się do przeszczepu, tj. dawców o rozszerzonych kryteriach (ECD). Te przeszczepy allogeniczne mogą być uważane za ECD z wielu powodów, w tym wątpliwej jakości, słabego funkcjonowania, infekcji, urazu, przedłużającego się ciepłego lub zimnego niedokrwienia oraz zaawansowanego wieku1,2. W niektórych przypadkach, gdy płuca te nadają się do natychmiastowego przeszczepienia3, często korzystne jest zarówno dla świadczeniodawców, jak i biorców, aby ocenić te płuca przez dodatkowy czas w celu ustalenia, czy nadają się do przeszczepienia. Perfuzja płuc ex vivo (EVLP) to taka technologia, która pozwala na rozszerzoną ocenę potencjalnych alloprzeszczepów płuc w zamkniętym obiegu poza dawcą2,4,5,6,7, dając dostawcy przeszczepów możliwość określenia przydatności do przeszczepu. EVLP wykazał zdolność do odpowiedniej oceny narządów dawcy8,9,10,11, zmniejszać skutki niedokrwiennego uszkodzenia reperfuzyjnego (IRI)12,13 i zwiększyć pulę dawców14,15, dzięki czemu przeszczep płuc staje się bardziej dostępny dla wszystkich..
Ogólnie rzecz biorąc, system EVLP to zamknięty system z obwodem wentylacyjnym (osiągniętym przez podłączenie respiratora do tchawicy w celu wprowadzenia powietrza do systemu) i obwodem naczyniowym (osiągniętym przez połączenie lewego przedsionka (LA) z tętnicą płucną (PA) za pomocą rurki)7. Obwód naczyniowy ma perfuzat biegnący przez rurkę, aby dostarczyć płucom niezbędne składniki odżywcze i tlen, jednocześnie ograniczając czas niedokrwienia zimna (CIT)5,8,16,17. To rozwiązanie jest oparte na krwi (tj. poprzez dodanie upakowanych czerwonych krwinek (PRBC))16,17 lub acellular (tj. bez PRBC)4,5. Istnieje jednak kilka godnych uwagi wad korzystania z PRBC. W przypadku stosowania PRBC od dawców, którzy zmarli z powodu urazu lub dawców w stanie śmierci mózgowej (BDD), płyny te często zawierają duże ilości cytokin zapalnych, które mogą zwiększać uszkodzenia komórek podczas EVLP, a także zwiększać poziom hemoglobiny bezkomórkowej (Hb), hemu, żelaza i fragmentów komórek, które powodują dodatkowe uszkodzenia komórek18,19. Ponadto, ponieważ dawcy ci są często wielonarządowi, pobranie PRBC przed pobraniem może prowadzić do zmniejszenia objętości krwi u dawcy, a następnie do zwiększenia niedokrwienia wszystkich narządów. W przypadku korzystania z PRBC z innego źródła, dostawcy mogą stanąć w obliczu niedoborów krwi, ponieważ jest to materiał rzadki sam w sobie20,21. Wreszcie, PRBC są podatne na mechaniczną lizę obwodu EVLP niezależnie od ich źródła, uwalniając Hb i inne składniki, które przyczyniają się do uszkodzenia komórek.
Dlatego, z wielu powodów, korzystne może być użycie sztucznego substytutu czerwonych krwinek, tj. nośników tlenu na bazie hemoglobiny (HBOC), jako suplementu perfuzyjnego. Jednym ze szczególnie obiecujących HBOC jest spolimeryzowana hemoglobina ludzka (PolyhHb). PolyhHb jest syntetyzowany z Hb oczyszczonego z przeterminowanych PRBC, które zostały uznane za nieodpowiednie do natychmiastowej transfuzji22. Wykazano, że są one żywotnymi substytutami krwi we wstrząsie krwotocznym23 i transplantation24 i mogą być produkowane w dużych ilościach22. Jednak przyjęcie PolyhHb na dużą skalę nie powiodło się z powodu nieprzewidzianych komplikacji, takich jak zwężenie naczyń krwionośnych, wzrost ciśnienia krwi i zatrzymanie akcji serca23,25. Przyczyny tych odkryć były prawdopodobnie spowodowane obecnością bezkomórkowych polimerów Hb lub Hb o niskiej masie cząsteczkowej (< 500 kDa) w roztworze PolyhHb, ponieważ mają one skłonność do wynaczynienia do przestrzeni tkankowej, co skutkowało zmniejszoną dostępnością tlenku azotu, późniejszym zwężeniem naczyń krwionośnych, nadciśnieniem układowym i ostatecznie oksydacyjnym uszkodzeniem tkanki26,27. Aby rozwiązać te problemy, Laboratorium Palmera pracowało nad opracowaniem PolyhHb nowej generacji, który zawiera minimalną ilość gatunków o niskiej MW i Hb jest wolny od komórek, co wykazało lepsze właściwości biofizyczne i odpowiedzi in vivo22,28,29,30. Kilka badań transfuzji na zwierzętach wykazało, że jeśli polimery Hb o niskiej masie cząsteczkowej zostaną wyeliminowane z HBOC, można złagodzić zwężenie naczyń krwionośnych, nadciśnienie ogólnoustrojowe i uszkodzenia oksydacyjne28,29,31,32,33,34,35. W związku z tym, co czyni ten PolyhHb nowej generacji obiecującym kandydatem na perfuzyjny.
Tutaj opisujemy zastosowanie PolyhHb nowej generacji do użycia w perfuzacie oraz protokół, za pomocą którego ten roztwór perfuzyjny może być testowany na modelu EVLP szczura. Celem tego badania jest dostarczenie społeczności transplantacyjnej płuc kluczowych informacji w zakresie projektowania i opracowywania nowatorskich rozwiązań perfuzyjnych, a także dostarczenie protokołów do testowania ich w klinicznie istotnych translacyjnych modelach transplantacyjnych.

<table><tbody><tr><td>Strzykawka insulinowa 10 ml Igła 29 G x 1/2"</td><td>BD</td><td>309301</td><td></td></tr><tr><td>30 L Szklany bioreaktor wsadowy</td><td>Ace Glass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>30g</td><td>Igły medyczne</td><td>BD-305106</td><td></td></tr><tr><td>Baytril (enrofloksacyna) Tabletki antybakteryjne</td><td>Elanco</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny (CaCl2.2H2O)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10035-04-8</td><td>Do zmodyfikowanego wzmacniacza</td></tr><tr><td>mostka nośnego mleczanu Ringera CFBA typ 672</td><td>Zestaw</td> Harvard <td>Apparatus 731747</td><td></td></tr><tr><td>Connect D150</td><td>Cole-Parmer</td><td>&nbsp; VK 73-3763</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>11252-50</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont Medical #5/45 - kątowe 45&deg;</td><td>Narzędzia Fine Science</td><td>11253-25</td><td></td></tr><tr><td>Ecoline Star Edition 003, E100 Podgrzewacz wody</td><td>Lauda</td><td>LCK 1879</td><td></td></tr><tr><td>Przeterminowana ludzka leukozredukowana, zapakowane jednostki RBC</td><td>Centrum Medyczne Wexner Kanadyjska Służba Krwi Zen-Bio Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiberoxygenator D150</td><td>Hugo Sachs Elektronik</td><td>PY2 73-3762</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Narzędzia</td> <td>do nauki11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy (C5H8O2 70 % wag%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>111-30-8 (G7776)</td><td></td></tr><tr><td>Halsted-Mosquito Hemostat</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-7112</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna 30 000 jednostek na 30 ml</td><td>APP Pharmaceuticals Albumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>surowicy ludzkiej (HSA)</td><td>OctaPharma Osocze</td><td></td><td>Dodatek do perfuzatu</td></tr><tr><td>IL2 Zestaw probówek do perfuzacji</td><td>Aparat Harvard</td><td>733842</td><td></td></tr><tr><td>IPL-2 Podstawowy system perfuzji płuc</td><td>Aparat Harvarda Ketamina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>500 mg na 5 ml</td><td>JHP Pharmaceuticals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaniula lewego przedsionka</td><td>Aparat Harvarda</td><td>730712</td><td></td></tr><tr><td>Stycznik membranowy Liqui-Cel serii EXF G420</td><td>3M</td><td>G420</td><td>stycznik gazowy</td></tr><tr><td>Roztwór glukozy o niskiej zawartości dekstranu potasu (Perfadex)</td>Roztwór <td>XVIVO</td><td></td><td>przepłukujący płuca</td></tr><tr><td>Rurki pokryte platyną Masterflex (Rozmiar: 73,17,16,24)</td>C-acetylo-L-cysteina <td>Cole'a-Palmera</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(NALC, C5H9NO3S)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>616-91-1 (A7250)</td><td>Do zmodyfikowanych naczyń mleczanowych Ringera</td></tr><tr><td>Nalgene ( 10L, 20L)</td><td>Naczynia filtracyjne</td> <td>Nalgene</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>&nbsp; Ismatec</td><td>&nbsp; ISM 827B</td><td></td></tr><tr><td>PES, 0,65 &mikro; m Moduł TFF</td><td>Repligen</td><td>N02-E65U-07-N</td><td></td></tr><tr><td>PhysioSuite</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>PS-MSTAT-RT</td><td></td></tr><tr><td>polieterosulfosulfon (PES), 0,2 i mikro; m Moduł TFF</td><td>Repligen</td><td>N02-S20U-05-N</td><td></td></tr><tr><td>Polisulfon (PS), moduł TFF 500 kDa</td><td>Repligen</td><td>N02-P500-05-N</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>7447-40-7</td><td>Dla PBS</td></tr><tr><td>PowerLab 8/35</td><td>&nbsp; ADInstruments</td><td>730045</td><td></td></tr><tr><td>Kaniula tętnicy płucnej</td><td>Aparat Harvard</td><td>730710</td><td></td></tr><tr><td>Rurka głowicy pompy (rozmiar: 73,17,16,24)</td><td>PharMed BPT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puralube&nbsp; Maść okulistyczna</td><td>Dechra</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>SCP Kontroler serwo do perfuzji typu 704</td><td>Aparat Harvarda</td><td>732806</td><td></td></tr><tr><td>Respirator dla małych zwierząt model 683</td><td>Aparat Harvarda</td><td>55-000</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5 (S271-10)</td><td>Do PBS i soli fizjologicznej</td></tr><tr><td>Sicyjanoborowodorek sodu (NaCNBH3)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>25895-60-7</td><td></td></tr><tr><td>Ditionian sodu (Na2S2O4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7775-14-6</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>1310-73-2</td><td>Do modyfikowanego mleczanu</td></tr> <tr><td>RingeraMleczan sodu (NaC3H5O3)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>867-56-1</td><td>Do modyfikowanego mleczanu Ringera</td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy (Na2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>7558-79-4</td><td>Do PBS</td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy (NaH2PO4)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>7558-80-7</td><td>Do</td></tr><tr><td>systemu znieczulenia małych zwierząt PBS SomnoSuite</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>Moduł</td><td></td>SS-MVG</tr><tr><td>Szczury Sprague-Dawley</td> Moduł wzmacniacza przetwornika <td>Envigo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TAM-A typ 705/1</td><td>Aparatura Harvarda</td><td>73-0065</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz przetwornika TAM-D typ 705/2</td><td>Aparatura Harvarda</td><td>&nbsp; 73-1793</td><td></td></tr><tr><td>Moduł kontroli czasu TCM typ 686</td><td>Aparat Harvard</td><td>731750</td><td></td></tr><tr><td>Kaniula tchawicy</td><td>Aparat Harvard</td><td>733557</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw rurek do komory wilgotnej</td><td>Aparat Harvard</td><td>&nbsp; 73V83157</td><td></td></tr><tr><td>Kaseta z rurkami</td><td>Cole-Parmer</td><td>IS 0649</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta #5 Dumostar</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>&nbsp; INS500085-A</td> Pęseta #5 ze stali nierdzewnej, zakrzywiona Kent Scientific Corporation IND500232 Pęseta <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> #7 Tytan Kent Scientific Corporation&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> </td><td></td>INS600187</tr><tr><td>Rurka Tygon E-3603 2,4 mm ID</td><td>Harvard Apparatus</td><td>721017</td><td>linia perfuzacyjna wchodząca do płuc</td></tr><tr><td>Tygon E-3603 Rurka 3,2 mm ID</td><td>Harvard Apparatus</td><td>721019</td><td>linia perfuzacyjna opuszczająca płuco</td></tr><tr><td>Vannas-Tubingen Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15008-08</td><td></td></tr><tr><td>Moduł sterujący respiratorem VCM typ 681</td><td>Harvard Apparatus</td><td>731741</td><td></td></tr><tr><td>William's E Media</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>A12176-01</td><td>Dodatek perfuzatu</td></tr><tr><td>Ksylazyna 100 mg na 1 ml</td><td>Akorn</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

poszukiwanie alternatywnych rozwiązań perfuzyjnych z wykorzystaniem spolimeryzowanych nośników tlenu na bazie hemoglobiny nowej generacji w modelu perfuzji płuc ex vivo u szczurów

Exploring Alternative Perfusion Solutions Using Next-Generation Polymerized Hemoglobin-Based Oxygen Carriers in a Model of Rat Ex Vivo Lung Perfusion

Przeszczep płuc jest utrudniony z powodu braku odpowiednich dawców. Wcześniej dawcy, którzy byli uważani za marginalnych lub nieodpowiednich, byli odrzucani. Jednak nowa i ekscytująca technologia, taka jak perfuzja płuc ex vivo (EVLP), oferuje dostawcom przeszczepów płuc rozszerzoną ocenę alloprzeszczepów brzeżnych dawców. Ta dynamiczna platforma oceny doprowadziła do wzrostu liczby przeszczepów płuc i umożliwiła świadczeniodawcom korzystanie z dawców, którzy wcześniej byli odrzucani, rozszerzając w ten sposób pulę dawców. Obecne techniki perfuzji wykorzystują perfuzaty komórkowe lub bezkomórkowe i obie mają wyraźne zalety i wady. Skład perfuzyjny ma kluczowe znaczenie dla utrzymania środowiska homeostatycznego, zapewnienia odpowiedniego wsparcia metabolicznego, zmniejszenia stanu zapalnego i śmierci komórek, a ostatecznie poprawy funkcji narządów. Roztwory perfuzyjne muszą zawierać wystarczające stężenie białka, aby utrzymać odpowiednie ciśnienie onkotyczne. Jednak obecne roztwory perfuzyjne często prowadzą do wynaczynienia płynu przez śródbłonek płuc, co skutkuje niezamierzonym obrzękiem i uszkodzeniem płuc. W związku z tym konieczne jest opracowanie nowatorskich rozwiązań perfuzyjnych, które zapobiegają nadmiernym uszkodzeniom przy jednoczesnym zachowaniu prawidłowej homeostazy komórkowej. W tym miejscu opisujemy zastosowanie spolimeryzowanego nośnika tlenu na bazie ludzkiej hemoglobiny (PolyhHb) jako perfuzatu oraz protokół, w którym ten roztwór perfuzyjny może być testowany w modelu EVLP szczura. Celem tego badania jest dostarczenie społeczności transplantacyjnej płuc kluczowych informacji w projektowaniu i opracowywaniu nowatorskich rozwiązań perfuzyjnych, a także odpowiednich protokołów do testowania ich w klinicznie istotnych translacyjnych modelach transplantacyjnych.

Walidacja naszego perfuzatu opartego na PolyhHb, a ponadto stabilność tego perfuzatu przez kilka godzin, została wykazana w Rycina 10W ciągu pierwszej godziny we wszystkich badanych perfuzatach (PolyhHb, kontrolnym (pożywka Williamsa + 5% HSA) oraz opartym na RBC) odnotowano niewielki spadek pO2 w tętnicy płucnej (LA).2 (Post pO2). Jednak w przypadku perfuzatu opartego na erytrocytach (RBC) odnotowano istotny spadek po 1 h w porównaniu z PolyhHb (p &lt; 0,05). W testach przeprowadzonych w ciągu kolejnych kilku godzin oba perfuzaty, PolyhHb i kontrolny, wykazyły stabilne pO2 w tętnicy płucnej (LA pO2)2, podczas gdy w przypadku PolyhHb odnotowano nieistotny trend (p &gt; 0,05) wyższego pO22 (Rycina 10A). Delta pO2t.j. zmiana pO2 w tętnicy płucnej (LA pO2)2 z PA pO2, ponownie uległy znacznemu obniżeniu po 1 h w grupie z perfuzatem RBC (p &lt; 0,05), podczas gdy w perfuzatach PolyhHb i kontrolnych pozostał on stabilny z nieistotnym trendem (p &gt; 0,05) wyższego pO₂2 w grupie PolyhHb (Rysunek 10B). LA pCO2 było znacznie niższe w perfuzacie z RBC oraz w perfuzacie kontrolnym w porównaniu z perfuzatem z PolyhHb po pierwszej godzinie (p &lt; 0,05), i pozostało to aktualne przez kolejne kilka godzin przy porównaniu perfuzatu PolyhHb i kontrolnego (Rysunek 10C). Na koniec delta pCO2 (tj. zmiana pCO2 w tętnicy płucnej względem pCO2 w tętnicy płucnej) uległa znacznemu zwiększeniu w perfuzacie z RBC po 1 h (p &lt; 0,05) i po kilku godzinach pozostał stabilny zarówno w perfuzacie PolyhHb, jak i w perfuzacie kontrolnym (Rycina 10D).
Dane fizjologiczne płuc zbierane w czasie rzeczywistym za pomocą oprogramowania akwizycyjnego dostarczają informacji uzupełniających do poziomów gazów w perfuzacie (Rysunek 11). Opór naczyniowy płuc (PVR) ponownie wykazał, że w przypadku perfuzatu z RBC nastąpił istotny wzrost w ciągu pierwszej godziny (p &lt; 0.05). Przez kilka pozostałych godzin zarówno w perfuzacie PolyhHb, jak i kontrolnym odnotowano stabilny i niski PVR (Rysunek 11A). Zmiana masy płuc również istotnie wzrosła w perfuzacie z RBC w ciągu pierwszej godziny (p &lt; 0.05) i wzrosła w obu perfuzatach, PolyhHb i kontrolnym, w pozostałych godzinach, przy nieco wyższej masie w perfuzacie PolyhHb (Rysunek 11B). Wreszcie, podatność zmalała istotnie w grupie perfuzatu z RBC w ciągu pierwszej godziny (p &lt; 0.05), podczas gdy w perfuzatach PolyhHb i kontrolnym zaobserwowano nieistotny spadek (p &gt; 0.05), przy czym PolyhHb wykazał najwyższą podatność po 4 h (Rysunek 11C).
W odniesieniu do sukcesu i/lub niepowodzenia technicznego (Rycina 12), należy zwrócić uwagę na kilka istotnych kwestii. Na Rycynie 12A widoczne jest odrzucenie allograftu spowodowane martwicą prawego płata górnego, co mogło wynikać z obecności skrzepliny w naczyniach płucnych. Na Rycynie 12B odnotowano również silny obrzęk tkanki w prawym płacie, co doprowadziło do niepowodzenia eksperymentu. Ryciny 12C-E przedstawiają prawidłową konserwację i wygląd tkanek w odpowiednich warunkach eksperymentalnych. Na koniec, na Rycynie 12F widoczna jest idealna konserwacja tkanki po przepłukaniu roztworem do konserwacji płuc.
<img alt="Układy bioreaktorów do badań nad oczyszczaniem białek, kolumny chromatograficzne, sprzęt laboratoryjny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66702/66702fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Synteza i oczyszczanie PolyhHb w skali pilotowej. (A) Bioreaktor do polimeryzacji. (B) Układy do filtracji stycznej (TFF) umieszczone w lodówce o temperaturze 4 °C. (C) Zbliżenie na równoległy układ TFF do płukania erytrocytów (RBC) i oczyszczania hemoglobiny (Hb). (D) Zbliżenie na dwustopniowy szeregowy system TFF do oczyszczania PolyhHb. Zbiorniki dla etapu pierwszego i drugiego znajdują się odpowiednio po lewej i prawej stronie filtrów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66702/66702fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Eksperyment hemodynamiki serca; schemat i układ z systemem płuca-serce myszy; analiza przepływu krwi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66702/66702fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Przegląd obwodu perfuzji płuc ex vivo (EVLP). (A) Schemat obwodu EVLP. (B) Umiejscowienie kaniuli tętnicy płucnej i kaniuli lewego przedsionka in vivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66702/66702fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Układ instrumentów chirurgicznych do zabiegów; obejmuje pęsety, nożyczki, rozieracze na sterylnej ściereczce." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66702/66702fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Instrumenty chirurgiczne stosowane podczas perfuzji płuc ex vivo .(A) Szew jedwabny. (B) Pęseta precyzyjna (średnia długość). (C) Pęseta precyzyjna (duża długość). (D) Zakrzywiona pęseta precyzyjna. (E) Nożyczki Mayo. (F) Kaniula tchawicza. (G) Kaniula do tętnicy płucnej (PA). (H) Kaniula do lewego przedsionka (LA). (I) Rozieracze klatki piersiowej. (J) Nożyczki sprężynowe. (K) Pęseta DeBakeya. (L) Hemostat. (M) Małe nożyczki. (N) Mała zakrzywiona pęseta precyzyjna. (O) Pęseta Adsona. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66702/66702fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Proces sekcji szczura pokazujący odsłonięcie IVC do badań chirurgicznych; sekwencja eksperymentu anatomicznego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66702/66702fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Pozycjonowanie chirurgiczne i odsłanianie żyły głównej dolnej (IVC). (A) Pozycjonowanie szczura do pobrania płuc. (B) Odsłanianie IVC poniżej wątroby. (C) Kanulacja IVC i wstrzykiwanie heparyny za pomocą igły 27G. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66702/66702fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Kroki procedury chirurgicznej na tkance zwierzęcej; obejmuje narzędzia do szycia i sekcji w schemacie sekwencyjnym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66702/66702fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Kanulacja tchawicy za pomocą rurki endotrachealnej (ET). (A) Rozpoczęcie od nacięcia skóry w okolicy szyi. (B) Precyzyjne rozdzielenie mięśni pasmowych i tkanki łącznej w celu odsłonięcia tchawicy. (C) Wykonanie cięcia poprzecznego na przedniej ścianie tchawicy, pomiędzy pierścieniami chrzęstnymi, o wielkości umożliwiającej wprowadzenie rurki ET. (D) Wprowadzenie rurki ET do tchawicy i jej unieruchomienie za pomocą szwu jedwabnego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66702/66702fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat procedury chirurgicznej przedstawiający izolację tętnicy płucnej za pomocą klem i szwów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66702/66702fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Umieszczenie kaniuli w tętnicy płucnej. (A) Odsłonięcie jamy klatki piersiowej w celu uwidocznienia serca i płuc. (B) Identyfikacja i izolacja tętnicy płucnej (PA). (C) Założenie szwu wokół PA. (D) Wycięcie małego otworu w drodze odpływu prawej komory (RVOT) dla kaniuli PA. (E) Prawidłowe umieszczenie kaniuli PA wewnątrz PA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66702/66702fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazy procedury chirurgicznej: szycie i łączenie drenów medycznych w układzie do transplantacji serca." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66702/66702fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 7"> 
Rysunek 7Przepłukiwanie płuc roztworem konserwującym. (A) Podłączenie kaniuli płucznej do kaniuli tętnicy płucnej (PA). (B) Z lewego przedsionka (LA) powinien wypłynąć przejrzysty płyn. (C) Podłączenie kaniuli PA do ex vivo obwód perfuzji płucnej w celu zapewnienia prawidłowego przepływu i odpowiedniego umiejscowienia kaniuli tętnicy płucnej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66702/66702fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Technika anastomozy chirurgicznej; kolejne kroki; szycie naczyń krwionośnych; edukacja w zakresie procedur medycznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66702/66702fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8: Umieszczanie kaniuli w lewym przedsionku (LA). (A) Delikatne rozszerzanie pierścienia zastawki mitralnej za pomocą pęsety. (B) Luźne założenie szwu jedwabnego wokół lewej komory (LV). Umieszczanie kaniuli LA w lewym przedsionku. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66702/66702fig08large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Procedura sekcji z użyciem narzędzi chirurgicznych; izolacja tkanki serca; przygotowanie eksperymentu biologicznego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66702/66702fig09.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 9"> 
Rysunek 9: Wycinanie bloku serce-płuca. (A) Podwiązywanie przełyku poniżej kleszczyków hemostatycznych. (B) Disekcja uwalniająca blok serce-płuca od kręgosłupa. (C) Disekcja uwalniająca tchawicę. (D) Prawidłowe połączenia i umiejscowienie kaniuli do perfuzji płuc ex vivo (EVLP). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66702/66702fig09large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Zmiany gazowe w krwi po perfuzji; wykresy słupkowe przedstawiające PO₂, O₂, PCO₂ oraz ciśnienie CO₂ w czasie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66702/66702fig10.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 10"> 
Rycina 10. Poziomy gazów w perfuzacie w czasie. (A) pO2 po perfuzji, tj. pO2 w lewym przedsionku (LA), podczas 4 h perfuzji. (B) Delta pO2, tj. zmiana pO2 w LA względem pO2 w tętnicy płucnej (PA) podczas 4 h perfuzji. (C) pCO2 po perfuzji, tj. pO2 w LA, podczas 4 h perfuzji. (D) Delta pCO2, tj. zmiana pO2 w LA względem pO2 w PA podczas 4 h perfuzji. Kolor niebieski oznacza perfuzat PolyhHb, czarny oznacza perfuzat kontrolny (standardowe medium William's), a czerwony oznacza perfuzat oparty na RBC. N=6 na grupę. Słupki błędów oznaczają odchylenie standardowe. Istotność została przetestowana za pomocą testu t Studenta i jest oznaczona symbolem *, p &lt; 0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66702/66702fig10large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy z badań nad naczyniami płucnymi: PVR, masa płuc, podatność w czasie analizowane w badaniu perfuzji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66702/66702fig11.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 11"> 
Rycina 11. Dane fizjologiczne płuc w czasie rzeczywistym. (A) Opór naczyniowy płuc (PVR) podczas 4 h reperfuzji. (B) Zmiana (oznaczona jako Δ) masy płuc w czasie. (C) Podatność podczas 4 h reperfuzji. Kolor niebieski reprezentuje perfuzat PolyhHb, czarny reprezentuje perfuzat kontrolny (standardowe podłoże William's), a czerwony reprezentuje perfuzat oparty na RBC. N=6 na grupę. Słupki błędu oznaczają odchylenie standardowe. Istotność statystyczną przetestowano za pomocą testu t Studenta i oznaczono symbolem *, p &lt; 0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66702/66702fig11large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat sekwencji procedury przeszczepu serca przedstawiający fazy przygotowania organu i połączenia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66702/66702fig12.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 12"> 
Rycina 12: Reprezentatywne wyniki techniczne. (A) Niepowodzenie przeszczepu z powodu zawału górnego płata prawego. (B) Niepowodzenie przeszczepu z powodu ciężkiego obrzęku płata prawego. (C) Pomyślna kanulacja i perfuzja alloprzeszczepu płuca perfuzatem RBC. (D) Pomyślna kanulacja i perfuzja alloprzeszczepu płuca perfuzatem PolyhHb. (E) Pomyślna kanulacja i perfuzja alloprzeszczepu płuca standardowym perfuzatem. (F) Idealna konserwacja tkanki po przepłukaniu roztworem do konserwacji płuc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66702/66702fig12large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Tutaj opisujemy zastosowanie nośnika tlenu na bazie spolimeryzowanej ludzkiej hemoglobiny (PolyhHb) jako perfuzatu oraz protokół, w którym ten roztwór perfuzyjny może być testowany na modelu perfuzji płuc ex vivo u szczurów.

Poszukiwanie alternatywnych rozwiązań perfuzyjnych z wykorzystaniem spolimeryzowanych nośników tlenu na bazie hemoglobiny nowej generacji w modelu perfuzji płuc ex vivo u szczurów

Lung transplantation is hampered by the lack of suitable donors. Previously, donors that were thought to be marginal or inadequate were discarded. ...

Perfuzja płuc ex vivo (EVLP) umożliwia rozszerzoną ocenę płuc dawcy. Istnieją dwa roztwory perfuzyjne, bezkomórkowy i komórkowy. Badanie to szczegółowo opisuje użycie spolimeryzowanego ludzkiego nośnika tlenu na bazie hemoglobiny lub PolyHb jako perfuzatu w protokole testowania tego roztworu w szczurzym modelu EVLP.Niedawne postępy w perfuzji narządów ex vivo umożliwiły rozszerzenie puli narządów dawców o lepsze funkcjonowanie. Prace nad wydłużeniem czasów perfuzji normotermicznej za pomocą dostosowanych perfuzatów pozwolą na dalsze postępy w tej dziedzinie. Obecne techniki perfuzji wykorzystują perfuzaty komórkowe lub bezkomórkowe, z których każdy ma zalety i wady.Kompozycja perfuzyjna ma kluczowe znaczenie dla wsparcia metabolizmu, zmniejszenia stanu zapalnego i utrzymania ciśnienia onkotycznego. Jednak istniejące rozwiązania mogą powodować obrzęk i uszkodzenie płuc, dlatego konieczne jest opracowanie nowatorskich rozwiązań perfuzyjnych, które zapobiegają nadmiernym uszkodzeniom przy jednoczesnym zachowaniu prawidłowej homeostazy komórkowej. Obiecujący nośnik tlenu oparty na hemoglobinie (HBOC) to spolimeryzowana hemoglobina ludzka syntetyzowana z przeterminowanych upakowanych czerwonych krwinek.Nasze laboratorium opracowało PolyHb nowej generacji z minimalnymi gatunkami o niskiej masie cząsteczkowej i hemoglobiną bezkomórkową. Wykazało to poprawę właściwości biofizycznych i zmniejszyło zwężenie naczyń krwionośnych, nadciśnienie i uszkodzenia oksydacyjne w badaniach na zwierzętach. Te cechy sprawiają, że jest to obiecujący kandydat na perfuzację.Na początek weź albuminę surowicy ludzkiej o końcowym stężeniu 3%Do niej dodaj spolimeryzowaną hemoglobinę lub PolyhHb, rozcieńczoną do końcowego stężenia 3,7 grama na decylitr za pomocą pożywki Williamsa. Następnie dodaj jeden mililitr roztworu heparyny do powstałego rozcieńczonego roztworu PolyHb. Umieść perfuzat PolyHb w zbiorniku obwodu EVLP i ustaw temperaturę łaźni wodnej na 37 stopni Celsjusza.Następnie włącz pompy rolkowe i upewnij się, że perfuzat krąży w obwodzie. Podłącz gaz odtleniający do natleniacza z pustych włókien, aby odtlenić perfuzat. Otwórz oprogramowanie do akwizycji danych na komputerze.Sprawdź, czy przetworniki ciśnienia w tętnicy płucnej, różnicy ciśnień w tchawicy, różnicy ciśnień w przepływie oddechowym, masy płuc i prędkości pompy są podłączone zarówno do obwodu, jak i do skrzynki konwertera danych. Dokładnie sprawdź wszystkie połączenia rurowe, aby upewnić się, że nie ma wycieków i że w całym czasie krąży ciepła woda. Naciśnij przycisk run w oprogramowaniu, aby sprawdzić, czy wszystkie przetworniki ciśnienia działają.Gdy system działa prawidłowo, wyłącz pompy rolkowe. Aby rozpocząć, umieść narzędzia chirurgiczne w autoklawie na stole operacyjnym. Ogolić brzuch znieczulonego szczura i ułożyć go w pozycji leżącej na desce operacyjnej.Oczyść brzuch jodonem powidonu, a następnie 70% etanolem. Umieść maść okulistyczną pod oczami szczura, aby zapobiec wysuszeniu. Zamocuj szczura na miejscu na tablicy operacyjnej.Uruchom oprogramowanie do akwizycji danych i rozpocznij nagrywanie. Włącz wentylator przy czterech mililitrach na kilogram i upewnij się, że dodatnie i wydechowe ciśnienie wynosi około dwóch centymetrów wody. Za pomocą nożyczek wykonaj laparotomię w linii środkowej od wyrostka mieczykowatego do syntezy łonowej.Następnie za pomocą narzędzia wykonaj przyśrodkową boczną rotację trzewną i uwidocznij podwątrobową żyłę główną dolną. Wstrzyknąć heparynę do żyły głównej dolnej za pomocą igły o rozmiarze 20G. Za pomocą nożyczek odetnij skórę od wcięcia mostka do tuż poniżej kąta żuchwy i zacznij preparować w kierunku tchawicy.Następnie tępo wypreparuj niezbędne mięśnie paska, aby odsłonić tchawicę. Wykonaj poprzeczne nacięcie na przedniej tchawicy między pierścieniami chrzęstnymi, uważając, aby nie przeciąć tylnej części tchawicy. Umieść jedwabny szew 5-0 wokół tchawicy.Włóż rurkę dotchawiczą do pierścieni chrzęstnych i zabezpiecz ją jedwabnym szwem 5-0. Podłącz rurkę dotchawiczą do respiratora i upewnij się, że klatka piersiowa jest prawidłowo uniesiona. Za pomocą nożyczek wykonaj sternotomię pośrodkową i wejdź do jamy klatki piersiowej.Umieść zwijacze ściany klatki piersiowej, aby odsłonić serce i płuca, unikając niezamierzonej manipulacji płucami. Za pomocą kombinacji ostrego i rozwarstwienia usuń grasicę z przedniego śródpiersia. Zidentyfikuj tętnicę płucną i umieść wokół niej jedwabny szew 5-0, aby przygotować się do kaniulacji.Wykonaj dwu- lub trzymilimetrowe nacięcie w drodze odpływu prawej komory za pomocą nożyczek, aby umieścić kaniulę tętniczą w tętnicy płucnej i zabezpieczyć ją szwem 5-0. Po eutanazji szczura szybko podłącz odpowietrzony płyn konserwujący płuca do kaniuli tętniczej, aby grawitacyjnie przepłukać płuca. Podłącz kaniulę tętniczą do obwodu EVLP.Włączyć pompę rolkową i pozwolić, aby niewielka ilość perfuzatu przepłynęła przez płuco i wydostała się z lewej komory do jamy klatki piersiowej. Gdy perfuzat zacznie wypływać z lewego przedsionka, wyłącz pompę rolkową. Następnie umieść małe kleszcze w lewej komorze i delikatnie rozciągnij pierścień zastawki mitralnej.Umieść jedwabny krawat 5-0 wokół serca i luźno zawiąż. Włóż kaniulę lewego przedsionka do lewej komory i przesuwaj kaniulę, aż będzie widoczna w przedsionku. Zabezpiecz lewy przedsionek za pomocą wstępnie zawiązanego szwu 5-0.Zidentyfikuj przełyk i zaciśnij go hemostatem jak najbliżej przepony. Następnie przetnij przełyk poniżej hemostatu. Używając kręgosłupa jako przewodnika, odetnij nożyczkami wszystkie przyczepy więzadłowe łączące blok płuco-serce z otaczającymi strukturami.Następnie wypreparuj tchawicę z szyi i przetnij tchawicę powyżej rurki dotchawiczej, aby uwolnić blok płuco-serce. Przenieś blok płuco-serce do kurtki piersiowej w obwodzie EVLP i przymocuj lewą kaniulę przedsionka do obwodu. Włącz pompę rolkową i podłącz monitor wentylatora.Sprawdź pułapkę bąbelkową, aby upewnić się, że do systemu nie wprowadzają się zatory powietrzne. Powoli zmieniaj ustawienia wentylacji i perfuzji na żądane poziomy eksperymentalne w ciągu pierwszych 15 minut. Dodatkowo zwiększ natężenie przepływu perfuzji do żądanej szybkości i ciśnienia.W wyznaczonych punktach czasowych sprawdź poziom gazu perfuzyjnego i testy czynnościowe płuc. Wszystkie badane perfuzaty wykazały niewielki spadek ciśnienia parcjalnego tlenu w lewym przedsionku, przy czym perfuzat na bazie RBC znacznie zmniejszył się po jednej godzinie. Przez następne kilka godzin zarówno PolyHb, jak i perfuzaty kontrolne miały stabilne ciśnienie parcjalne tlenu w lewym przedsionku.Ciśnienie parcjalne tlenu delta znacznie spadło po jednej godzinie w grupie perfuzatów RBC, podczas gdy pozostaje stabilne w perfuzatorach PolyhHb i kontrolnych z nieistotnym trendem. Ciśnienie parcjalne dwutlenku węgla w lewym przedsionku było znacznie niższe w perfuzacie RBC i kontrolnym w porównaniu z PolyhHb po pierwszej godzinie i tendencja ta utrzymuje się w kolejnych godzinach. Ciśnienie parcjalne delta dwutlenku węgla zostało znacznie zwiększone w perfuzacie RBC po jednej godzinie, a następnie pozostaje stabilne zarówno w perfuzacie PolyhHb, jak i kontrolnym.Dane fizjologiczne płuc w czasie rzeczywistym pokazują, że perfuzat RBC znacznie zwiększał opór naczyniowy płuc w ciągu pierwszej godziny, podczas gdy zarówno perfuzaty PolyhHb, jak i kontrolne utrzymywały niski i stabilny opór naczyniowy płuc w tym okresie. Zmiana masy płuc była początkowo znacząca w perfuzacie RBC, z ciągłym wzrostem wszystkich perfuzatów, nieco bardziej w PolyhHb. Podatność zmniejszyła się istotnie w przypadku perfugatu RBC w ciągu pierwszej godziny, podczas gdy zmniejszyła się nieistotnie w przypadku innych perfuzatów.PolyhHb miał najwyższą zgodność po czterech godzinach.

exploring-alternative-perfusion-solutions-using-next-generation

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Perfuzja płuc Ex-Vivo (EVLP) umożliwiła przeszczep płuc u ludzi dzięki umożliwieniu oceny narządów i rozszerzeniu puli dawców. W tym miejscu opisujemy rozwój programu EVLP dla szczurów i udoskonalenia, które pozwalają na stworzenie powtarzalnego modelu do przyszłej rozbudowy.

Metoda izolowanej perfuzji płuc ex vivo w modelu szczurzym: wnioski wyciągnięte z opracowania programu EVLP dla szczurów

Ten artykuł opisuje, jak przeprowadzić obejście krążeniowo-oddechowe u myszy. Ten nowatorski model ułatwi badanie mechanizmów molekularnych związanych z uszkodzeniem narządów.

Obejście krążeniowo-oddechowe w modelu mysim: nowatorskie podejście

Istnieje znaczny niedobór dawców wątroby, a kryteria dla dawców wątroby zostały rozszerzone. Normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) został opracowany w celu oceny i modyfikacji funkcji narządów. Badanie to demonstruje szczurzy model NEVLP i testuje zdolność pegylowanej katalazy do łagodzenia uszkodzeń wątroby.

Mały zwierzęcy model normacyjnej perfuzji wątroby ex vivo

Preparat z izolowanych płuc królika jest złotym standardem w badaniach płuc. Niniejsza publikacja ma na celu opisanie techniki opracowanej do badania fizjologicznych i patologicznych mechanizmów związanych z reaktywnością dróg oddechowych, zachowaniem płuc oraz badaniami przedklinicznymi w zakresie transplantacji płuc i obrzęku płuc.

Izolowany system perfuzji płuc w modelu królika

Płuca ex vivo są przydatne do różnych eksperymentów do zbierania danych fizjologicznych, jednocześnie wykluczając zmienne zakłócające eksperymentów in vivo. Konfiguracje komercyjne są często drogie i mają ograniczone rodzaje danych, które mogą gromadzić. Opisujemy metodę budowania w pełni modułowej konfiguracji, którą można dostosować do różnych projektów badań.

Opracowanie i wdrożenie szczurzego modelu perfuzji płuc ex vivo

Tutaj prezentujemy protokół oceny heterotopowo wszczepionego serca po normotermicznym zachowaniu ex situ w modelu szczurzym.

Szczurzy model normomicznego heterotopowego przeszczepu serca z perfuzją ex-situ

Dla mysich wątrob stworzono normotermiczny system perfuzji wątroby ex vivo (NEVLP). System ten wymaga doświadczenia w mikrochirurgii, ale pozwala na uzyskanie powtarzalnych wyników perfuzji. Możliwość wykorzystania wątroby myszy ułatwia badanie szlaków molekularnych w celu identyfikacji nowych dodatków perfuzatu i umożliwia przeprowadzanie eksperymentów skoncentrowanych na naprawie narządów.

Normothermiczna perfuzja płuc ex vivo w wątrobie u myszy

Tutaj opisujemy niezbędne kroki do ustanowienia modelu EVLP u szczurów oraz pokazujemy profil zapalny związany z przekroczonymi płucami. Celem jest propagowanie wiedzy i doświadczeń na temat modelu EVLP szczurów, umożliwiając integralne zrozumienie biologicznych odpowiedzi związanych z tą rewolucyjną techniką.

Ustanowienie modelu szczura perfuzyjnego płuc ex vivo dla wglądów translacyjnych w transplantację płuc

Celem jest opracowanie nowego modelu perfuzji płuc ex vivo (EVLP) u szczurów, który może utrzymać stałą czynność płuc przez 4 godziny przez cały czas trwania EVLP i dostarczyć branży specyfiki implementacji, która zapewni solidną metodę stosowania EVLP na modelach gryzoni.

Opracowanie nowatorskiego systemu perfuzji płuc ex vivo dla płuc szczurów po śmierci krążeniowej

Przeszczepy marginalne, takie jak stłuszczone wątroby, przeszczepy od starszych dawców lub wątroby pobrane po śmierci sercowej (DCD) źle znoszą tradycyjne, zimne przechowywanie statyczne. Opracowaliśmy nowatorski model subnormotermicznej perfuzji wątroby ex vivo w celu zachowania, oceny i naprawy brzeżnych przeszczepów wątroby przed przeszczepem.

Technika subnormotermicznej perfuzji wątroby ex vivo do przechowywania, oceny i naprawy brzeżnych przeszczepów wątroby

Poznaj zastosowanie polimeryzowanej hemoglobiny (PolyHb) jako nośnika tlenu w modelu perfuzji płuc ex vivo u szczurów. Ta metoda może poprawić funkcję płuc i wydłużyć czas zachowania narządów dawczych.

Poszukiwanie alternatywnych rozwiązań perfuzyjnych z wykorzystaniem spolimeryzowanych nośników tlenu na bazie hemoglobiny nowej generacji w modelu perfuzji płuc ex vivo u szczurów (Wideo) | JoVE Journal

Poszukiwanie alternatywnych rozwiązań perfuzyjnych z wykorzystaniem spolimeryzowanych nośników tlenu na bazie hemoglobiny nowej generacji w modelu perfuzji płuc ex vivo u szczurów

Przeglądaj więcej filmów