Przygotowanie zamrożonych wysepek płodowych naczelnych innych niż ludzie do połączonego sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder i sekwencjonowania ATAC oraz metabolomiki masowej
8 listopada 2024
Ten protokół opisuje procedury izolowania wysokiej jakości jąder z zamrożonych wysp trzustkowych naczelnych innych niż ludzkie do użycia w jednojądrowym jednoczesnym sekwencjonowaniu RNA i sekwencjonowaniu ATAC, przy jednoczesnym zachowaniu dużej frakcji cytozolowej do analiz metabolomicznych z tych samych próbek.
Wykorzystujemy wysoce translacyjny model naczelnych innych niż człowiek, aby ocenić, w jaki sposób dieta matki i spożywanie leków w czasie ciąży wpływają na rozwój embrionalny i funkcję pourodzeniową wysp trzustkowych u potomstwa. Zmiany zaprogramowane rozwojowo mogą zmienić podatność na chorobę w późniejszym życiu. Wyzwaniem podczas pracy z trudnymi do pozyskania próbkami, takimi jak te pochodzące od naczelnych, jest skuteczna ocena wielu pytań od tego samego osobnika.
Niestety, jednoczesne wyodrębnienie informacji z metabolomu i genomu może być trudne ze względu na niezgodność odczynnika testowego i wrażliwą na czas degradację cząsteczek, które mają być określone ilościowo. Nasz protokół pozwala na ekstrapolację obfitości metabolitów, dostępności chromatyny i zróżnicowanej ekspresji genów z tego samego materiału wyjściowego. To wielowarstwowe podejście zapewnia wgląd w to, w jaki sposób metabolizm może zmieniać genom wysp trzustkowych.
Na początek rozmrozić izolowaną tkankę wyspy trzustkowej makaka rezusa na lodzie, dodać 500 mikrolitrów 0,1x buforu do lizy do osadu tkankowego. Używając jednorazowego tłuczka z granulkami RNA, delikatnie homogenizuj tkankę 15 razy na lodzie. Inkubować próbkę na lodzie przez 10 minut.
Następnie dodać 500 mikrolitrów buforu do płukania do homogenatu i delikatnie wymieszać pipetą na lodzie. Zalać 30-mikrometrowy filtr wstępnej separacji 300 mililitrami buforu płuczącego i przefiltrować jeden mililitr homogenatu komórkowego do pięciomililitrowej probówki. Wirować przefiltrowany homogenat o stężeniu 500 G przez pięć minut w wirówce z odchylanym wiadrem w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Za pomocą pipety przenieś jeden mililitr supernatantu do kriowialu na lodzie i natychmiast zamroź go w temperaturze 80 stopni Celsjusza do przyszłych eksperymentów metabolomicznych. Dodaj kroplami jeden mililitr buforu do płukania do osadu jądrowego, aby go ponownie zawiesić. Wirować umyty granulat o masie 1000 G przez pięć minut w wirówce z odchylanym wiadrem w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Po powtórzeniu płukania ponownie zawiesić jądra w jednym mililitrze buforu do płukania. Za pomocą pipety wymieszać po 10 mikrolitrów zawiesiny jąder i 0,4% błękitu trypanowego w osobnej probówce i dodać mieszaninę do automatycznego szkiełka licznika komórek. Na koniec, za pomocą licznika komórek, określ stężenie jąder.
Uzyskano idealne, nienaruszone jądro do eksperymentów sekwencjonowania. Na podstawie badań ekspresji genów uzyskano grupowanie UMAP podtypów komórkowych w obrębie izolowanych płodowych wysp trzustkowych naczelnych innych niż ludzie. Obfitość metabolitów wysp trzustkowych, takich jak fosforan dihydroksyacetonu, 3-fosforan glicerolu, 2-oksoglutar, kreatyna i glutation, została uzyskana przy użyciu frakcji cytozolowych.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metody izolacji wysokiej jakości jąder komórkowych z zamrożonych wysepek trzustkowych naczelnych innych niż człowiek w celu jednoczesnego sekwencjonowania RNA i sekwencjonowania ATAC. Metoda ta pozwala również na zachowanie frakcji cytozolowej do analiz metabolomicznych, co umożliwia kompleksowe zrozumienie interakcji metabolicznych i genomicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia
- Metabolomika
Wstęp
- Modele naczelnych innych niż ludzie są kluczowe dla badania mechanizmów ludzkich chorób.
- Dieta i leki przyjmowane przez matkę mogą wpływać na rozwój wysepek trzustkowych u potomstwa.
- Symultaniczna analiza metabolomu i genomu jest trudna ze względu na degradację próbek.
- Niniejsze badanie odpowiada na potrzebę przeprowadzania efektywnych analiz wielowarstwowych z ograniczonych ilości próbek.
Cel badania
- Ocena wpływu czynników macierzyńskich na rozwój wysp trzustkowych w zarodku.
- Zbadanie, w jaki sposób zmiany metaboliczne mogą wpływać na ekspresję genomową.
- Opracowanie protokołu umożliwiającego kompleksową analizę z tej samej próbki.
Zastosowane metody
- Izolacja jąder komórkowych z wysepek trzustkowych.
- Symultaniczne sekwencjonowanie RNA i sekwencjonowanie ATAC.
- Zachowanie frakcji cytozolowych do badań metabolomicznych.
- Wielowarstwowa analiza w celu oceny obfitości metabolitów i ekspresji genów.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja wysokiej jakości jąder komórkowych i frakcji cytozolowych.
- Wgląd w to, jak dieta matki wpływa na funkcję wysepek trzustkowych.
- Wykazana wykonalność jednoczesnych analiz genomicznych i metabolomicznych.
- Ujawnienie potencjalnych powiązań między metabolizmem a ekspresją genów w wysepkach.
Wnioski
- Niniejszy protokół umożliwia kompleksową analizę wysepek trzustkowych.
- Wyniki mogą dostarczyć informacji dla przyszłych badań nad podatnością na choroby.
- Podkreśla znaczenie wpływu matki na zdrowie potomstwa.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Integracja sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder (single-nucleus RNA-seq), ATAC-seq oraz metabolomiki masowej (bulk metabolomics) z zamrożonych wysepek niesporczakowców rozwiązuje krytyczny problem wąskiego gardła w odkryciach multiomicznych z wykorzystaniem rzadkich lub cennych próbek. Podejście to umożliwia kompleksowe profilowanie molekularne z ograniczonej ilości materiału, co zwiększa pewność predykcyjną we wczesnej walidacji celów terapeutycznych i ograniczaniu ryzyka mechanistycznego. Protokół ten maksymalizuje uzysk danych z każdej próbki, wspierając decyzje portfelowe skorygowane o ryzyko w badaniach nad chorobami metabolicznymi i rozwojowymi.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie mechanizmów metabolicznych i epigenetycznych leżących u podstaw tożsamości komórkowej w układach istotnych dla przebiegu chorób.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez powiązanie obfitości metabolitów z ekspresją genów i dostępnością chromatyny.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego dzięki integracji wielowarstwowych danych molekularnych pochodzących z tego samego źródła biologicznego.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane frakcje jąder komórkowych i cytozolu do dalszych analiz w ramach wysokoprzepustowego sekwencjonowania i metabolomiki.
- Poprawia powtarzalność i standaryzację testów poprzez minimalizację efektów serii w badaniach wieloośrodkowych.
- Umożliwia uzyskanie ilościowych wyników multiomicznych do rzetelnej oceny związków lub perturbacji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zestawia odczyty molekularne z metabolicznymi i epigenetycznymi biomarkerami istotnymi dla danej choroby w modelach translacyjnych.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkryć po walidację przedkliniczną dzięki wykorzystaniu systemów naczelnych niebędących ludźmi.
- Dostarcza predykcyjnych informacji na temat programowania rozwojowego oraz mechanizmów podatności na choroby.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół łączy wczesne etapy odkryć, walidację celów oraz badania translacyjne, umożliwiając profilowanie multiomiczne z rzadkich próbek tkanek.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących interakcji metaboliczno-epigenetycznych w rozwoju wysepek.
- Screening: Zapewnia powtarzalne preparaty jąder komórkowych i metabolitów do skalowalnych analiz omicznych.
- Analityka: Dostarcza ilościowe dane dotyczące ekspresji genów, dostępności chromatyny i zawartości metabolitów do analiz porównawczych.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia molekularne z fenotypami istotnymi dla chorób w modelach naczelnych niebędących ludźmi.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia wielorazowy schemat postępowania w celu maksymalizacji ekstrakcji danych z ograniczonej liczby próbek lub próbek archiwalnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach na wczesnym etapie.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przygotowanie próbek multiomicznych i minimalizuje efekty serii.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie lepiej uzasadnionych decyzji typu go/no-go oraz efektywne kapitałowo wykorzystanie rzadkich próbek.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację programów chorób metabolicznych i rozwojowych z uwzględnieniem poziomu ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w izolacji jąder komórkowych, sekwencjonowaniu pojedynczych jąder oraz w protokołach metabolomicznych.
- Wymaga dostępu do infrastruktury do sekwencjonowania wysokoprzepustowego oraz spektrometrii mas.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja międzyzespołowa w celu kontrolowania efektów seryjnych.
- Metoda jest możliwa do adaptacji dla innych typów tkanek, lecz może wymagać optymalizacji protokołu dla różnych matryc próbek.
- Ograniczona dostępność materiału biologicznego oraz wrażliwość na degradację nakładają praktyczne ograniczenia na przepustowość i harmonogram badań.
