Przygotowanie Mycobacterium abscessus osadzonego w paciorkach agarowych w celu śródtchawiczego inokulacji myszy immunokompetentnych

Opracowujemy mysi model przewlekłego zakażenia płuc ropniami prątków, aby przetestować skuteczność antybiotyków w badaniach przedklinicznych. Pierwszym wyzwaniem jest przezwyciężenie wewnętrznej odporności myszy na ropnie prątków. Drugim wyzwaniem jest wygenerowanie powtarzalnej partii bakterii osadzonych w agarze do infekcji dotchawiczej. Chcemy podzielić się szczegółowym protokołem przygotowania i infekcji agaru, który może być łatwo wdrożony przez inne laboratoria w celu testowania nowych leków na myszach.

Zakażenie bakteriami osadzonymi w agarze zamiast wolnych bakterii częściowo przezwycięża zdolność myszy immunokompetentnych do spontanicznego usunięcia infekcji. Model ten stanowi solidne narzędzie przedkliniczne do oceny nowych antybiotyków przeciwko Mycobacterium abscessus, ułatwiając odkrywanie i opracowywanie bardzo potrzebnych antybiotyków przeciwko infekcjom płuc.

[Instruktor] Na początek uzyskaj wykładniczo rosnące kultury zawiesinowe Mycobacterium abscessus dostosowane do gęstości optycznej 30. Przenieś 27 mililitrów stopionego tryptyku ślimaka sojowego wstępnie zrównoważonego w temperaturze 50 stopni Celsjusza do probówki zawierającej trzy mililitry zawiesiny bakteryjnej. Wymieszać zawiesinę przez pipetowanie. Ostrożnie odpipetować mieszaninę ślimaka bakteryjnego do kolby zawierającej 60 mililitrów oleju mineralnego w kolbie. Umieścić kolbę w pojemniku wtórnym i natychmiast rozpocząć mieszanie ze średnią prędkością na mieszadle magnetycznym za pomocą mieszadła magnetycznego. Upewnij się, że w mieszance ślimaka olejowego tworzy się widoczny wir i kontynuuj mieszanie przez sześć minut w temperaturze pokojowej. Umieść lód w pojemniku dodatkowym, aby zawiesina ostygła. Następnie przenieś mieszaninę gnojowicy do 250-mililitrowych probówek wirówkowych. Odwirować zawiesinę o sile 3 700 G przez sześć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pierwsze pięć cykli i ponownie zawiesić granulat ślimaka za pomocą DPBS. Zmontuj również sitko lejkowe, pierścień łączący i rurkę o pojemności 50 mililitrów w jedną jednostkę. Po 10 praniu ponownie zawiesić granulat i czterokrotnie rozcieńczyć zawiesinę kulki. Dodać rozcieńczony materiał próbki na sitko, aby przefiltrować zawiesinę kulek. Powoli pociągnij tłok 30-mililitrowej strzykawki przymocowanej do pierścienia łączącego, aby wytworzyć ssanie i poprawić filtrację. Następnie odwirować rozcieńczoną zawiesinę o stężeniu 1000 G przez dwie minuty w celu jej zagęszczenia. Po wciągnięciu granulek do 50-mililitrowej tuby, przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do jednego tygodnia, ale przygotuj świeże koraliki do każdej partii eksperymentów. Na początek powstrzymaj uspokojone myszy CD One za pomocą specjalnie zaprojektowanej trójwymiarowej, pochylonej podstawki z nadrukiem. Zabezpiecz mysz za siekacze za pomocą sznurka do szwów przymocowanego do środkowego pręta stojaka. Ułożenie myszy w brzusznej pozycji leżącej z uniesioną głową. Przymocuj metalową igłę do karmienia zwierząt o rozmiarze 24 do szklanej strzykawki wypełnionej zawiesiną ślimaka Mycobacterium abscessus. Umieść nylonowe klipsy lub korki na tłoku, aby zapewnić kontrolowaną objętość inokulum wynoszącą 50 mikrolitrów na mysz. Teraz umieść metalową igłębkę zgłębnika pionowo nad myszą. Ostrożnie włóż igłę u góry i wsuń ją dalej w dół do tchawicy. Zdejmij nylonowy klips lub korek i powoli dozuj 50 mikrolitrów zawiesiny ślimakowej Mycobacterium abscessus do płuc. Pozwól myszy odpocząć przez pięć minut. Następnie powtórz procedurę inokulacji po raz drugi, aby zapewnić głębokie i powtarzalne osadzanie się pełnego inokulum w płucach. Koraliki ślimakowe zawierające Mycobacterium abscessus wykazywały ekspresję białka fluorescencyjnego mCherry Red i różniły się wielkością od około 70 do 250 mikrometrów. Obciążenie bakteryjne w sześciu niezależnych preparatach perełek wykazało wysoką odtwarzalność. Liczenie bakterii przed i po przejściu przez szklaną strzykawkę nie wykazało znaczącej utraty obciążenia bakteryjnego. Metoda inokulacji międzytchawicy była powtarzalna w trzech niezależnych preparatach kulek, jak wykazano na podstawie liczby CFU w płucach po 24 godzinach od zakażenia. Potwierdzono powtarzalność infekcji między trzema niezależnymi operatorami, ponieważ liczba CFU w płucach po 24 godzinach od zakażenia pozostała spójna we wszystkich grupach.