Name: Przygotowanie Mycobacterium abscessus osadzonego w paciorkach agarowych w celu śródtchawiczego inokulacji myszy immunokompetentnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-25T13:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 40 s
Description: Poznaj metodę przygotowania paciorków agarowych z Mycobacterium abscessus do śródtchawicznej inokulacji myszy immunokompetentnych. Ten model umożliwia testowanie nowych antybiotyków w badaniach przedklinicznych zakażeń płucnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Fundację Mukowiscydozy, nagroda DICK24XX0, dla TD i VD, oraz R01-AI132374 od NIH-NIAID dla TD i VD.

Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych National Institutes of Health za zgodą Institutional Animal Care and Use Committee of the NIAID (NIH), Bethesda, MD. Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania. Wszystkie badania z udziałem M. abscessus przeprowadzono w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2.
1. Przygotowanie inokulu M. abscessus z kulką agarową
<ol>
	<li>Przygotować wstępną hodowlę M. abscessus ATCC 19977, zaszczepiając 1,5 ml gęstości optycznej (OD600) 1 (przy użyciu spektrofotometru) kultury w 200 ml pożywki Middlebrook 7H9 uzupełnionej 0,05% (v/v) Tween 80, 0,5% (v/v) glicerolem i 10% (v/v) wzbogacaniem w albuminę-dekstrozę-katalazę Middlebrooka (ADC).</li>
	<li>Inkubować kultury w butelce rolkowej w temperaturze 37 °C przez 24 godziny, aż do osiągnięcia środkowej fazy logarytmicznej (OD600 = 0,4-0,6).</li>
	<li>Zawiesić 1,2 g bulionu sojowego tryptycznego (TSB) w 40 ml ultraczystej wody i dodać 0,6 g agaru Difco do końcowego stężenia 1,5%.</li>
	<li>Przenieść 60 ml ciężkiego oleju mineralnego do kolby Erlenmeyera o pojemności 500 ml i sterylizować zarówno olej mineralny, jak i agar sojowy tryptyczny (TSA) w temperaturze 121 °C przez 15 minut, a następnie równoważyć w temperaturze 50 °C w piecu.</li>
	<li>Pobrać próbkę z 1 ml kultury i zmierzyć OD600.</li>
	<li>Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 3700 g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić komórki w 4 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco, aby osiągnąć OD600 około 30.</li>
	<li>Zmieszać 3 ml zawiesiny bakteryjnej z 27 ml stopionego TSA wstępnie zrównoważonego w temperaturze 50 °C w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Szybko wymieszać, wirując lub pipetując.</li>
	<li>Ostrożnie wlać mieszaninę bakterii i agaru (30 ml) do 60 ml oleju mineralnego i umieścić kolbę w pojemniku wtórnym. Szybko ustawić mieszaninę tak, aby wirowała ze średnią prędkością (420 obr./min) na mieszadle magnetycznym ustawionym na 50 °C, za pomocą mieszadła magnetycznego. Upewnij się, że w mieszance olejowo-agarowej tworzy się widoczny wir. Mieszaj przez 6 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Schłodzić mieszaninę, umieszczając lód w dodatkowym pojemniku i kontynuować mieszanie przez 35 minut.</li>
	<li>Przerwij mieszanie i pozwól zawiesinie z kulek agaru odpocząć przez 20 minut (w razie potrzeby uzupełnij lód).</li>
	<li>Przenieść mieszaninę zawiesiny do dwóch probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i przemyć 10 razy jedną objętością DPBS w celu usunięcia oleju i wolnych bakterii (3700 g, 6 min, 4 °C, przez pierwsze 5 cykli).
	<ol>
		<li>Połącz zawiesiny kulek agarowych w jedną probówkę przy trzecim praniu. Podczas pierwszych 5 cykli prania użyj pipety serologicznej, aby delikatnie zawiesić kulki.</li>
		<li>Dla kolejnych 5 cykli płukania należy stosować następujące parametry wirowania: 2000 g przez 5 minut, a następnie 1000 g odpowiednio przez 4, 3, 2 i 2 minuty.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zawiesić kulki agarowe w DPBS do końcowej objętości 40 ml, przenieść do sterylnej butelki o pojemności 125 ml i rozcieńczyć 4x, dodając 120 ml DPBS.</li>
	<li>Przepuścić zawiesinę przez sitko o wielkości 200 μm.
	<ol>
		<li>Podłącz sitko do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Następnie dodaj próbkę materiału na sitko i przefiltruj zawiesinę kulek.</li>
		<li>Aby ułatwić proces filtracji, połącz sitko do komórek, lejek, pierścień łączący i probówkę o pojemności 50 ml w jednostkę. Zmontuj części w kolejności lejka, sitka do komórek, pierścienia łączącego i probówki 50 ml i powoli pociągnij tłok strzykawki 30 ml przymocowanej do pierścienia łączącego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W razie potrzeby przepłucz sitko z przeciwnej strony DPBS, aby zmyć wszelkie zatrzymane większe kulki. Rozcieńczoną zawiesinę zagęścić wirując z prędkością 1000 g przez 2 minuty lub pozwalając kulkom osiąść grawitacyjnie. Po zbiorach przechowuj kulki agarowe w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia. Do każdej partii eksperymentów zaleca się świeże przygotowanie.</li>
	<li>Odpipetować 5 μl zawiesiny kulki na szkiełko podstawowe, przykryć szkiełkiem nakrywkowym i wykonać zdjęcia w kilku losowych miejscach za pomocą mikroskopu świetlnego lub fluorescencyjnego z soczewką obiektywową 10×. Zapisz obrazy i zmierz średnicę ściegu za pomocą ImageJ (żądany zakres rozmiarów: 200 ± 50 μm).</li>
</ol>
2. Miareczkowanie inokulu M. abscessus zatopionego w koraliku agarowym
<ol>
	<li>Dodać 1 ml zawiesiny kulek do probówki M i przeprowadzić aseptyczną homogenizację w celu uwolnienia bakterii osadzonych w kulkach za pomocą dysocjatora ustawionego na wstępnie zdefiniowany program RNA.02.01.</li>
	<li>Pobrać 100 μl homogenatu i rozcieńczyć seryjnie w stosunku 1:10 do 1 × rozcieńczeniu 10-5. Rozcieńczyć na agarze 7H10 uzupełnionym 10% kwasem oleinowym, albuminą, dekstrozą-katalazą (OADC) i 2% glicerolem. Wyliczyć jtk macierzysty po 3 do 5 dniach inkubacji.</li>
	<li>Dostosuj miano inokulum w razie potrzeby. Na przykład, jeśli każda mysz otrzyma 100 μl zawiesiny kulek zawierającej 1 × 105 CFU na 10 myszy, przygotowuje się łącznie 2 ml zawiesiny zawierającej 1 × 106 CFU/ml plus ~25%, aby uwzględnić straty w strzykawkach.</li>
</ol>
3. Testowanie dozowania koralików przez strzykawkę i igłę
UWAGA: Następujące kroki zostały uwzględnione, aby upewnić się, że koraliki nie przylegają do powierzchni strzykawki lub igły. Stwierdzono, że ważne jest, aby używać szklanej strzykawki i metalowej igły do karmienia 24 G, aby zapobiec utracie kulek z powodu przylegania do powierzchni plastikowych.
<ol>
	<li>Przygotować PBST, dodając 1,25 ml sterylnego Tween 80 do 500 ml sterylnego PBS.</li>
	<li>Dodać 900 μl PBST do pięciu probówek M w celu zbadania kulek agarowych przechodzących przez igłę do karmienia, a także 900 μl PBST do sterylnych probówek o pojemności 2 ml, aby przygotować od -2 do -6 rozcieńczeń każdej próbki przepychanej.</li>
	<li>Wymieszaj przygotowany wcześniej koralik agarowy M. abscessus za pomocą pipety P1000, aby upewnić się, że wszystkie kulki są równomiernie rozproszone.</li>
	<li>Przymocuj metalową igłę do karmienia 24 G do szklanej strzykawki i odessaj zawiesinę z kulek agaru, uważając, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Gdy strzykawka jest pełna i nie ma pęcherzyków powietrza, umieścić nylonowe klipsy lub korki na tłoku strzykawki, nie zachowując odstępu między klipsami. Zatyczki pozwalają na dokładne dozowanie 50-100 μL. Możliwe jest zamontowanie do 6 klipsów wzdłuż tłoka.</li>
	<li>Dozować 100 μl kulek ("push-through") do probówek M w odpowiedniej kolejności.</li>
	<li>Po zebraniu 5 przepchnięć homogenizować kulki za pomocą dysocjatora tkankowego dostosowanego do ustawienia RNA.02.01, odpowiedniego do przygotowania RNA z zamrożonych narządów, który okazał się skutecznie uwalniać M. abscessus z kulek bez wpływu na żywotność komórek.</li>
	<li>Przeprowadzić seryjne rozcieńczanie homogenatów w zakresie od -1 do -6. Rozcieńczenia rozcieńczyć na płytkach agarowych 7H11 uzupełnionych OADC. Policz CFU po 5 dniach.</li>
</ol>
4. Inokulacja dotchawicza myszy
<ol>
	<li>Przygotuj myszy CD-1 w wieku od 6 do 8 tygodni.</li>
	<li>Uspokoić myszy za pomocą systemu ekspozycji na aerozol izofluranowy, przy natężeniu przepływu 1-5%, jak opisano wcześniej1. 
	UWAGA: Dodaj maść okulistyczną do zwierzęcia po znieczuleniu. Zwierzę nie jest leczone izofluranem w masce na twarz; Dlatego nie ma dużo czasu na wykonanie tej procedury.</li>
	<li>Ogranicz myszy za pomocą trójwymiarowej (3D) drukowanej pochylonej podstawki (specjalnie zaprojektowanej i wyprodukowanej). Pręt na środku stojaka ma sznurek do szycia, który utrzymuje mysz pionowo za siekacze, umieszczając mysz w brzusznej pozycji leżącej z uniesioną głową.</li>
	<li>Przymocuj metalową igłę do karmienia zwierząt 24 G do szklanej strzykawki wypełnionej kulką agarową zatopioną w M. abscessus. Umieść nylonowe klipsy lub korki na tłoku strzykawki, aby zarazić każdą mysz 50 μl inokulum.</li>
	<li>Gdy uspokojona mysz zostanie unieruchomiona na żądle szwu, przesuń język na bok jamy ustnej za pomocą aplikatora do bawełnianego wacika.</li>
	<li>Wizualizuj tylną część ust myszy, aby wyraźnie zidentyfikować białą część z tyłu jamy ustnej i celować w tchawicę myszy.</li>
	<li>Ustaw metalową igłębkę pod kątem pionowo nad myszą i włóż ją w górną część tchawicy. Podczas przechodzenia przez nagłośnię może wystąpić niewielki opór. 
	UWAGA: Potwierdzenie umieszczenia zgłębnika w tchawicy można potwierdzić poprzez wyczucie grzbietów tchawicy podczas wkładania zgłębnika.</li>
	<li>Wsuń igłębkę w dół do tchawicy, wyjmij nylonowy klips lub korek i dozuj 50 μl kulki agarowej zatopionej w M. abscessus.</li>
	<li>Pozwól myszy odpocząć przez 5 minut i powtórz kroki 4.2-4.8 po raz drugi. Celem dwuetapowej procedury inokulacji jest zapewnienie powtarzalnego i głębokiego osadzania pełnego inokulum w płucach. 
	UWAGA: Dodaj wsparcie cieplne pod klatką, gdy zwierzęta dochodzą do siebie po znieczuleniu.</li>
	<li>Pozwól infekcji postępować przez 24 godziny, po czym mysz jest uśpiona w celu wyliczenia odkładania się bakterii w płucach.</li>
</ol>

<ol><li>Dartois, V., Dick, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+development+challenges+in+nontuberculous+mycobacterial+lung+disease%3A+Tb+to+the+rescue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Drug development challenges in nontuberculous mycobacterial lung disease: Tb to the rescue.</a> J Exp Med. 219 (6), e20220445(2022).</li>
<li>Martiniano, S. L., Nick, J. A., Daley, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nontuberculous+mycobacterial+infections+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chest+Med%22%5BJournal%5D)">Nontuberculous mycobacterial infections in cystic fibrosis.</a> Clin Chest Med. 43 (4), 697-716 (2022).</li>
<li>Maurer, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+antimicrobial+bactericidal+activity+in+mycobacterium+abscessus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Lack of antimicrobial bactericidal activity in mycobacterium abscessus.</a> Antimicrob Agents Chemother. 58 (7), 3828-3836 (2014).</li>
<li>Wu, M. L., Aziz, D. B., Dartois, V., Dick, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ntm+drug+discovery%3A+Status%2C+gaps+and+the+way+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Ntm drug discovery: Status, gaps and the way forward.</a> Drug Discov Today. 23 (8), 1502-1519 (2018).</li>
<li>Egorova, A., Jackson, M., Gavrilyuk, V., Makarov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pipeline+of+anti-mycobacterium+abscessus+small+molecules%3A+Repurposable+drugs+and+promising+novel+chemical+entities%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Pipeline of anti-mycobacterium abscessus small molecules: Repurposable drugs and promising novel chemical entities.</a> Med Res Rev. 41 (4), 2350-2387 (2021).</li>
<li>Nuermberger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+animal+models+to+develop+new+treatments+for+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Using animal models to develop new treatments for tuberculosis.</a> Semin Respir Crit Care Med. 29 (5), 542-551 (2008).</li>
<li>Nuermberger, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+efficacy+testing+of+new+drug+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Preclinical efficacy testing of new drug candidates.</a> Microbiol Spectr. 5 (3), (2017).</li>
<li>Nicola, F., Cirillo, D. M., Lore, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+murine+models+to+study+lung+infection+with+mycobacterium+abscessus+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis+%28Edinb%29%22%5BJournal%5D)">Preclinical murine models to study lung infection with mycobacterium abscessus complex.</a> Tuberculosis (Edinb). 138, 102301(2023).</li>
<li>Dartois, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+murine+models+for+the+testing+of+antimicrobials+against+mycobacterium+abscessus+pulmonary+infections%3A+Current+practices+and+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis+%28Edinb%29%22%5BJournal%5D)">Preclinical murine models for the testing of antimicrobials against mycobacterium abscessus pulmonary infections: Current practices and recommendations.</a> Tuberculosis (Edinb). 147, 102503(2024).</li>
<li>Obregon-Henao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+of+mycobacterium+abscessus+to+antimycobacterial+drugs+in+preclinical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Susceptibility of mycobacterium abscessus to antimycobacterial drugs in preclinical models.</a> Antimicrob Agents Chemother. 59 (11), 6904-6912 (2015).</li>
<li>Lerat, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+evaluation+of+antibiotic+activity+against+mycobacterium+abscessus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">In vivo evaluation of antibiotic activity against mycobacterium abscessus.</a> J Infect Dis. 209 (6), 905-912 (2014).</li>
<li>Saliu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+infection+by+nontypeable+haemophilus+influenzae+fuels+airway+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22ERJ+Open+Res%22%5BJournal%5D)">Chronic infection by nontypeable haemophilus influenzae fuels airway inflammation.</a> ERJ Open Res. 7 (1), (2021).</li>
<li>Rodgers, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biologically+relevant+murine+models+of+chronic+pseudomonas+aeruginosa+respiratory+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Biologically relevant murine models of chronic pseudomonas aeruginosa respiratory infection.</a> Pathogens. 12 (8), 1053(2023).</li>
<li>Hoover, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+pneumonia+model+in+immunocompetent+rodents+to+evaluate+antibacterial+efficacy+against+s.+Pneumoniae%2C+h.+Influenzae%2C+k.+Pneumoniae%2C+p.+Aeruginosa+or+a.+Baumannii%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A robust pneumonia model in immunocompetent rodents to evaluate antibacterial efficacy against s. Pneumoniae, h. Influenzae, k. Pneumoniae, p. Aeruginosa or a. Baumannii.</a> J Vis Exp. (119), e55068(2017).</li>
<li>Lore, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+aminoglycoside-modifying+enzyme+eis2+represents+a+new+potential+in+vivo+target+for+reducing+antimicrobial+drug+resistance+in+mycobacterium+abscessus+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">The aminoglycoside-modifying enzyme eis2 represents a new potential in vivo target for reducing antimicrobial drug resistance in mycobacterium abscessus complex.</a> Eur Respir J. 60 (6), 2201541(2022).</li>
<li>Riva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+of+chronic+mycobacterium+abscessus+lung+infection+in+immunocompetent+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">A new model of chronic mycobacterium abscessus lung infection in immunocompetent mice.</a> Int J Mol Sci. 21 (18), 6590(2020).</li>
<li>Chang, V., Phillips, P. P. J., Imperial, M. Z., Nahid, P., Savic, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+clinical+development+pathways+to+advance+tuberculosis+regimen+development%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">A comparison of clinical development pathways to advance tuberculosis regimen development.</a> BMC Infect Dis. 22 (1), 920(2022).</li>
<li>Yang, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+granuloma+fibrosis+induced+by+agar-embedded+mycobacterium+abscessus+in+c57bl%2F6jnarl+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Pathological granuloma fibrosis induced by agar-embedded mycobacterium abscessus in c57bl/6jnarl mice.</a> Front Immunol. 14, 1277745(2023).</li>
<li>Poerio, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+host-+and+pathogen-directed+therapy+for+the+control+of+mycobacterium+abscessus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Combined host- and pathogen-directed therapy for the control of mycobacterium abscessus infection.</a> Microbiol Spectr. 10 (1), e0254621(2022).</li>
<li>Pearce, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhaled+tigecycline+is+effective+against+mycobacterium+abscessus+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Inhaled tigecycline is effective against mycobacterium abscessus in vitro and in vivo.</a> J Antimicrob Chemother. 75 (7), 1889-1894 (2020).</li>
<li>De Groote, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gm-csf+knockout+mice+for+preclinical+testing+of+agents+with+antimicrobial+activity+against+mycobacterium+abscessus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Gm-csf knockout mice for preclinical testing of agents with antimicrobial activity against mycobacterium abscessus.</a> J Antimicrob Chemother. 69 (4), 1057-1064 (2014).</li>
<li>Facchini, M., De Fino, I., Riva, C., Bragonzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+chronic+pseudomonas+aeruginosa+airway+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Long term chronic pseudomonas aeruginosa airway infection in mice.</a> J Vis Exp. (85), e51019(2014).</li>
<li>Degiacomi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+novel+drug+candidate+vomg+kills+mycobacterium+abscessus+and+other+pathogens+by+inhibiting+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Antimicrob+Agents%22%5BJournal%5D)">The novel drug candidate vomg kills mycobacterium abscessus and other pathogens by inhibiting cell division.</a> Int J Antimicrob Agents. 64 (4), 107278(2024).</li>
<li>Rimal, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T405%2C+a+new+penem%2C+exhibits+in+vivo+efficacy+against+m.+Abscessus+and+synergy+with+beta-lactams+imipenem+and+cefditoren%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">T405, a new penem, exhibits in vivo efficacy against m. Abscessus and synergy with beta-lactams imipenem and cefditoren.</a> Antimicrob Agents Chemother. 66 (6), e0053622(2022).</li>
<li>Maggioncalda, E. C., Story-Roller, E., Ammerman, N. C., Nuermberger, E. L., Lamichhane, G. Progressive mycobacterium abscessus lung infection in c3heb/fej mice associated with corticosteroid administration. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMaggioncalda%2C+EC+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2018).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów

Aby zapewnić równomierne rozmieszczenie bakterii w kulkach agarowych, ważne jest, aby równomiernie zawiesić stopioną mieszaninę agaru i bakterii przed dodaniem jej do fazy olejowej. Stosunek objętości oleju do bakterii agarowych ma kluczowe znaczenie w kontrolowaniu wielkości kulek. Wyższy stosunek oleju do agaru prowadzi do tworzenia mniejszych kulek agaru. Podczas mieszania zawiesiny agarowo-bakteryjnej z fazą olejową kontrola temperatury ma kluczowe znaczenie. Mieszanina oleju i agaru musi być wystarczająco ciepła, aby umożliwić emulgację i tworzenie kropel, ale wystarczająco chłodna, aby nie zaszkodzić bakteriom. Ciągłe mieszanie podczas schładzania mieszaniny do temperatury pokojowej lub niższej umożliwia tworzenie się i zestalanie kropelek agaru.
Właściwa kalibracja płytki mieszającej, rozmiar mieszadła oraz kształt i rozmiar kolby są ważnymi wyznacznikami jednolitego wiru. Mieszadło umieszczone w środku kolby tworzy symetryczny wir, zapewniając równomierne mieszanie. Mieszadło poza środkiem może prowadzić do niestabilnego wiru, co skutkuje koralikami o nieregularnych kształtach i wprowadzaniem pęcherzyków powietrza do kulek. Zalecane jest monitorowanie w czasie rzeczywistym i regulacja położenia mieszadła. Objętość kolby musi być proporcjonalna do objętości mieszaniny oleju i agaru. Kolba o pojemności 500 ml jest idealna do wirowania mieszaniny oleju i agaru o pojemności 90 ml, wytwarzając widoczny wir. W przypadku stosowania większych kolb ważne jest, aby dostosować objętość mieszaniny olejowo-agarowej, wielkość mieszadła i prędkość wirowania, aby osiągnąć równowagę między skutecznym mieszaniem a stabilnym wirem. Utrzymanie stałej prędkości wirowania podczas procesu i podczas przygotowywania kulek ma kluczowe znaczenie dla powtarzalności między partiami.
Proces przygotowania kulek agarowych, w szczególności prędkość wirowania i stosunek oleju do agaru, są dostosowane do16,22, z niewielkimi modyfikacjami. Siły ścinające w wirującym wirze z natury wytwarzają koraliki o różnych rozmiarach. Aby zminimalizować tę zmienność wielkości, etap zbierania kulek został zmodyfikowany poprzez wprowadzenie kilku etapów mycia, wykorzystując gradient zmniejszającej się prędkości i czasu wirowania, aby zapewnić usunięcie kulek o małych rozmiarach (i wolnych bakterii). Zastosowano filtr z mikrosiatką, aby wzbogacić kulki o pożądanym rozmiarze, skutecznie odfiltrowując większe kulki i te, które mogły powstać w wyniku przypadkowej koalescencji. Aby uniknąć strat kulek lub bakterii, gdy zawiesina kulek przechodzi przez strzykawkę i podłączoną rurkę do inokulacji dotchawiczej myszy, ważne jest, aby użyć szklanej strzykawki, metalowych igieł do karmienia 24 G i rurki połączonej z metalem.
Głównym ograniczeniem metody jest złożoność techniczna przygotowania kulek i inokulacji dotchawiczej w celu uzyskania powtarzalnego obciążenia kulkami i implantacji płuc. Wymagana jest dbałość o szczegóły i umiejętność rozwiązywania problemów. Ponadto model nie został w pełni zwalidowany poprzez testowanie skuteczności standardowych antybiotyków i najczęstszych kombinacji antybiotyków podawanych pacjentom z MAB.
Obecnie żaden mysi model przewlekłego zakażenia Mab nie został zwalidowany w takim stopniu, aby skuteczność pojedynczych leków i kombinacji leków u pacjentów można racjonalnie przewidzieć za pomocą modelu9. Mysi system C57BL/6 z zatopionymi kulkami agarowymi został wykorzystany do przetestowania skuteczności leczenia przeciwbakteryjnego 15,19,23. Najbliższą alternatywą dla systemu mysiego C57BL/6 osadzonego w kulkach agarowych jest mysi model C3HeB/FeJ, który opiera się na immunosupresji deksametazonu w celu uzyskania trwałej przewlekłej infekcji24,25. Zaletą opisanego tutaj protokołu jest to, że (i) można użyć w pełni immunokompetentnych i najbardziej przystępnych cenowo myszy C57BL/6, (ii) można uzyskać produktywną i przewlekłą infekcję za pomocą dobrze scharakteryzowanego szczepu typu ATCC 19977 oraz (iii) nie ma chemicznie indukowanej potrzeby immunosupresji, co pozwala obejść potrzebę codziennych zastrzyków deksametazonu, unikając w ten sposób potencjalnych interakcji lek-lek i wpływu na immunopatologię płuc.
Biorąc pod uwagę brak zwalidowanych mysich modeli przewlekłego zakażenia Mab do oceny nowych kandydatów na leki i schematów leczenia 8,9, opisana tutaj technika ma potencjał, aby posunąć tę dziedzinę do przodu, poprawić wartość predykcyjną przedklinicznych danych dotyczących skuteczności, pomóc w ustaleniu priorytetów schematów leczenia o największym potencjale w celu zapewnienia trwałego wyleczenia i ogólnie przyspieszyć odkrywanie i opracowywanie leków na chorobę płuc Mab. Metoda może być stosowana do innych patogenów płuc i ma ugruntowaną historię w przypadku P. aeruginosa lub Haemophilus influenza. Głównym celem opisanego tutaj protokołu jest dostarczenie wystarczających szczegółów i zaleceń, aby zapewnić łatwość wdrożenia i doskonałą odtwarzalność między laboratoriami.

Opcje leczenia choroby płuc Mycobacterium abscessus (Mab) są ograniczone i obejmują całoroczne wielolekowe schematy z doustnymi, pozajelitowymi i czasami wziewnymi antybiotykami, z których większość nie ma optymalnej aktywności bakteriobójczej i wiąże się ze znaczną toksycznością1,2,3,4,5. Pilnie potrzebne są krótsze, bezpieczniejsze i skuteczniejsze terapie. Mysie modele zakażeń prątkami odegrały zasadniczą rolę w odkrywaniu i optymalizacji skutecznych leków i schematów leczenia6,7. Jednak przedkliniczna ocena antybiotyków przeciwko zakażeniom Mab okazała się trudna ze względu na trudności w ustaleniu postępujących i utrzymujących się infekcji płuc u myszy8,9.
Zakażenie immunokompetentnych szczepów myszy Mab w dużej mierze prowadzi do przejściowej kolonizacji, po której następuje szybkie usunięcie patogenu10,11. Aby osiągnąć przewlekłe zakażenie, jak obserwowano klinicznie, środki unieruchamiające, takie jak agaroza lub agar, były stosowane w celu promowania trwałości i odpowiedzi immunopatologicznej na oportunistyczne patogeny, takie jak Pseudomonas aeruginosa lub Haemophilus influenza u myszy immunokompetentnych12,13,14. Model ten został niedawno zaadaptowany do osiągnięcia przewlekłej infekcji dróg oddechowych przez Mab ATCC 19977 u immunokompetentnych myszy C57BL/6N 15,16,17,18. Metoda indukowała uporczywą infekcję przez okres do 45 dni po inokulacji dotchawiczej ~1 × 104 do 1 × 106 jednostek tworzących kolonie (CFU), z częstością przewlekłej infekcji wśród zakażonych myszy wynoszącą 90%-100%19 i tworzeniem się zorganizowanych ziarniniaków wokół rozpadającego się koralika agarowego18. Wygląda na to, że osadzenie Mab w kulkach chroni przed szybkim usunięciem przez wrodzony układ odpornościowy i że kulki wypełnione bakteriami stanowią ogniska rekrutacji komórek odpornościowych, co prowadzi do powstawania ziarniniaków i powstawania przewlekłej infekcji18. Koraliki agaru/agarozy stanowią stosunkowo obojętny biomateriał, który wywołuje minimalne reakcje zapalne. Ponadto kulki rozpadają się powoli, unikając problemów z reakcjami alergicznymi na ciała obce lub wywołanym zwłóknieniem. Zakażenie dotchawicze z urządzeniem do mikrorozpylania lub bez niego zapewnia skuteczne osadzanie inokulum w płucach8,20,21 i odtwarza kliniczne narażenie i infekcję lepiej niż inokulacja dożylna lub donosowa.
Model oferuje zatem wiele zalet. Wiąże się to jednak również z kilkoma wyzwaniami natury technicznej, a mianowicie: (i) osiągnięciem powtarzalnego rozmiaru kulki, (ii) uzyskaniem powtarzalnego obciążenia bakteryjnego koralików oraz (iii) zapewnieniem stałego dostarczania inokulum do tchawicy. W tym miejscu zapewniamy szczegółowe protokoły, aby niezawodnie osiągnąć te cele i zapewnić odtwarzalność między laboratoriami.

<table><tbody><tr><td>Butelka 125 ml</td><td>Corning</td><td>8388</td><td>Sterylny</td></tr><tr><td>stojak na probówki 3 x 3</td><td>Fisher</td><td>5972-0030PK</td><td>Dezynfekowany przed użyciem</td></tr><tr><td>Wydrukowany w 3D stojak na mysz</td><td>Transworld Marketing&nbsp;</td><td>specjalnie zaprojektowana i wyprodukowana</td><td>Dezynfekowana przed użyciem</td></tr><tr><td>48-dołkowa płytka rozcieńczająca</td><td>Celltreat&nbsp;</td><td>229192</td><td>Sterylne</td></tr><tr><td>probówki wirówkowe 50 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td>Sterylna</td></tr><tr><td>maszyna do znieczulania</td><td>E-Z Systems</td><td>EZ-AF9000 SYSTEM</td><td>nie dotyczy</td></tr><tr><td>Avanti J-15R&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>&nbsp; B99517</td> Końcówki do pipet <td>z barierą wirówkową</td></tr><tr><td>w stojaku z podnoszoną pokrywą 1000G</td><td>Thermo Scientific ART&nbsp;</td><td>21-236-2A</td><td>Sterylna</td></tr><tr><td>torba Biohazard</td><td>Fisherbrand</td><td>22-044561</td><td></td></tr><tr><td>Pierścień łączący&nbsp;</td><td>pluriSelect</td><td>41-50000-03</td><td></td></tr><tr><td>Aplikatory z bawełnianą końcówką</td><td>Puritan&nbsp;</td><td>22-029-571</td><td>Sterylne</td></tr><tr><td>jednorazowe pętle do zaszczepiania Żółte sterylne 100 w torbie</td><td>strunowej Cole-Parmer Essentials&nbsp;</td><td>03-391-562</td><td>Sterylna</td></tr><tr><td>jednorazowa serweta na ręczniki z podszewką poliestrową</td><td>Dynarex</td><td>19-310-671</td><td>Sterylna</td></tr><tr><td>sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco</td><td>Thomas Scientific</td><td>21-031-CM</td><td>Sterylny</td></tr><tr><td>lejek</td><td>pluriSelect</td><td>42-50000</td><td>Sterylny</td></tr><tr><td>spektrofotometr</td><td>GE Ultrospec 10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE80211630</td></tr><tr><td>Gentlemacs Dysocjator tkanek</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-427</td><td>Nie aktywowana termicznie</td></tr><tr><td>strzykawka Hamiltona&nbsp;</td><td>Hamilton&nbsp;</td><td>80801</td><td>Zdezynfekowany przed użyciem</td></tr><tr><td>Ciężki olej mineralny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>330760-1L</td><td>Sterylny</td></tr><tr><td>roztwór izofluranu Butelka 250 ml</td><td>Covetrus</td><td>29405</td><td>Działanie/drażniące na skórę: Kategoria 2, Poważne uszkodzenie oczu/Działanie drażniące na oczy: Kategoria 2A, Specyficzny toksyczny wpływ na narządy docelowe (jednorazowe narażenie): Kategoria 3 Może powodować senność i zawroty głowy, Działa drażniąco na oczy, Działa drażniąco na skórę. Nie wdychać, stosować w dobrze wentylowanym pomieszczeniu.</td></tr><tr><td>M Tubes (gentleMACS)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-335</td><td>Sterylne</td></tr><tr><td>mieszadło magnetyczne MR Hei-Connect&nbsp;</td><td>Heidolph</td><td>505-40000-13-1</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne</td><td>Thomas Scientific</td><td>&nbsp; 1181L08</td><td>Sterylna</td></tr><tr><td>pipeta mechaniczna 100&ndash; 1000 &mikro; L&nbsp;</td><td>Gilson PIPETMAN L&nbsp;</td><td>FA10006M</td><td>Zdezynfekowany przed użyciem</td></tr><tr><td>Pipeta mechaniczna 20&ndash; 200 i mikro; L&nbsp;</td><td>Gilson PIPETMAN L&nbsp;</td><td>FA10003MG</td><td>Zdezynfekowane przed użyciem</td></tr><tr><td>Metalowa igła do karmienia zwierząt 24 G</td><td>Braintree Scientific</td><td>N-VP 24G-1S</td><td>Musi być sterylizowana (autoklawowana)</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H10 Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0303-500G</td><td>Sterylizowana (autoklawowana)</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H11 Agar</td><td>Thermo Fisher</td><td>R4554002</td><td>Sterylizowana (autoklawowana)</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 średnia</td><td>Beckton Dickinson</td><td>271310</td><td>Sterylizowane (autoklawowane)</td></tr> <tr><td>części stojaka na mysz</td><td>TriMech Solutions&nbsp;</td><td>SRV-AMS-FDM</td><td>Zdezynfekowany przed użyciem</td></tr><tr><td>Niewchłanialny szew jedwabny</td><td>Fisher Scientific</td><td>18020-50</td><td>n/a</td></tr><tr><td>Płyn OADC Wzbogacony płynem do stosowania z Middlebrook Media 500 ml</td><td>Thermo Scientific Remel&nbsp;</td><td>R450605</td><td>Sterylny</td></tr><tr><td>PBS (10x), pH 7,4 Sterylny filtrowany 500 ml</td><td>Gibco</td><td>70-011-044</td><td>Sterylne</td></tr><tr><td>chusteczki</td><td>Peroxiguard Peroxigard</td><td>29221</td><td>n/a</td></tr><tr><td>Szalki Petriego z przezroczystą pokrywką okrągłe 100mmx 15mm</td><td>Fisherbrand&nbsp;</td><td>FB0875712</td><td>Sterylne</td></tr><tr><td>sitko PluriStrainer 200 mm</td><td>pluriSelect</td><td>43-50200-03</td><td>Sterylne; sitko do komórek</td></tr><tr><td>Butelki rolkowe</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>Sterylna</td></tr><tr><td>pipeta serologiczna</td><td>Corning</td><td>4489</td><td>Sterylne</td></tr><tr><td>kuwety spektrofotometru 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955127</td><td>Sterylizowane (autoklawowane)</td></tr> <tr><td>Korki do strzykawek lub klipsy (nylonowe)</td><td>Trimech&nbsp;</td><td>SRV-AMS-MJF</td><td>Zdezynfekowany przed użyciem</td></tr><tr><td>Tryptyczny bulion sojowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8907-500G</td><td>Sterylny</td></tr><tr><td>Tween 80&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>170793</td><td>Filtr sterylizowany&nbsp;</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet z filtrem o szerokim otworze Stojak z podnoszoną pokrywą 200G&nbsp;</td><td>Thermo Scientific ART</td><td>21-236-1A</td><td>Sterylne</td></tr></tbody></table>

przygotowanie mycobacterium abscessus osadzonego w paciorkach agarowych w celu śródtchawiczego inokulacji myszy immunokompetentnych

Preparation of Agar Bead Embedded Mycobacterium abscessus to Inoculate Immunocompetent Mice Intratracheally

Solidne mysie modele przewlekłego zakażenia Mycobacterium abscessus, patogenem środowiskowym, który najchętniej infekuje płuca, są bardzo potrzebne. Trwające rok terapie wielolekowe zapewniają niedopuszczalnie niski wskaźnik wyleczenia u pacjentów, wynoszący około 50%, stąd potrzeba predykcyjnych narzędzi przedklinicznych w celu opracowania lepszych antybiotyków. Jednak myszy immunokompetentne są ogólnie odporne na infekcję płuc przez M. abscessus. W literaturze opisano liczne próby ustalenia trwałego zakażenia M. abscessus u myszy immunokompetentnych. Spośród nich najbardziej obiecujące okazały się metody oparte na bakteriach osadzonych w kulkach agaru zaszczepionych u myszy C57BL/6 drogą dotchawiczą. Głównym ograniczeniem tego podejścia jest wyzwanie techniczne związane z przygotowaniem kulek agarowych o powtarzalnej wielkości i liczbie bakterii, a następnie inokulacją dotchawiczą. W tym miejscu najpierw przedstawiamy szczegółowy opis zoptymalizowanego protokołu, który dostarcza koraliki agarowe obciążone M. abscessus o optymalnej średnicy i powtarzalnym obciążeniu bakteryjnym. Następnie przedstawiamy szczegółowy protokół inokulacji dotchawiczej, zoptymalizowany w celu uniknięcia strat kulek i bakterii spowodowanych przyleganiem do powierzchni urządzeń do zaszczepiania oraz uzyskania powtarzalnego osadzania się w płucach M. abscessus zatopionego w agarze . Celem jest zapewnienie łatwości wdrożenia i doskonałej powtarzalności między laboratoriami.

Rozmiar i obciążenie kulek 
Aby zwizualizować kulki agarowe oraz ich obciążenie bakteryjne, w szczepie referencyjnym Mab ATCC 19977 wyeksponowano czerwone białko fluorescencyjne mCherry pod kontrolą konstytutywnego promotora Hsp60, a następnie szczep ten osadzono w kulkach agarowych zgodnie z powyższym opisem. Rycina 1A przedstawia zakres rozmiarów kulek (pasek skali = 200 μm). Rycina 1B pokazuje obciążenie w 6 niezależnych preparatach kulek, co potwierdza powtarzalność opisanego procesu.
Wysiew próbek po przepchnięciu przez strzykawkę i implantacja bakterii po inokulacji wewnątrztachealnej 
Inokulację wewnątrztachealną zoptymalizowano w dwóch etapachach. Liczbę CFU/mL w inokulum wyliczono przed i po przepchnięciu przez szklaną strzykawkę, aby upewnić się, że podczas przechodzenia kulek przez strzykawkę i podłączoną rurkę nie doszło do strat kulek ani bakterii. Tabela 1 przedstawia początkowy miano bakterii dla dwóch niezależnych preparatów kulek (próba 1 i 2) oraz liczbę odzyskanych CFU na 100 mL próbek „przepchniętych” z pojedynczego załadunku strzykawki. Aby uniknąć strat kulek i bakterii, wymagane jest zastosowanie szklanej strzykawki połączonej z metalową rurką. Kulki agarowe mają tendencję do przylegania do powierzchni plastikowych.
Zliczanie CFU w czasie w preparacie z kuleczkami wykazało, że obciążenie bakteryjne kuleczek pozostawało stabilne w temperaturze 4 °C przez 1 tydzień, z około 2-krotnym spadkiem obciążenia bakteryjnego na każde 2 tygodnie, przy zachowaniu niezakłóconego osadzania się w płucach. Następnie grupy od 5 do 8 myszy zainfekowano trzema niezależnymi preparatami z kuleczkami, aby przetestować powtarzalność procedury inokulacji dotchawiczej. Tabela 2 przedstawia liczbę CFU w płucach na mysz, zliczoną 24 h po infekcji zgodnie z opisem.
Na koniec oceniono powtarzalność zakażenia między różnymi operatorami, zakażając trzy grupy po 10 myszy CD-1, przy czym każdą procedurę przeprowadził inny operator. Liczbę CFU w płucach wyznaczoną 24 h po zakażeniu przedstawiono na Rysunku 2.
<img alt="Obraz mikroskopowy kolonii bakterii, analiza tabeli CFU; wyniki eksperymentu mikrobiologicznego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67602/67602fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Eksperyment pilotażowy w celu oceny wielkości kuleczek, wizualizacji i kwantyfikacji ładunku bakteryjnego M. abscessus. (A) Kuleczki agarowe zawierające szczep M. abscessus ATCC 19977, zmodyfikowany w celu ekspresji czerwonego białka fluorescencyjnego mCherry pod konstytutywnym promotorem hsp60. Pięć µl zawiesiny kuleczek naniesiono na szkiełko przedmiotowe i obrazowano za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w kamerę (obiektyw 10x). Każda czerwona kropka to fluorescencyjna komórka bakteryjna zamknięta w kuleczkach agarowych o średnicach w zakresie ~70-250 µm. (B) Obciążenie bakteryjne, w CFU/mL, dla 6 indywidualnych preparatów kuleczek, wykazujące powtarzalność metody. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67602/67602fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Porównanie wzrostu bakterii, wykres CFU/mysz, badanie mikrobiologiczne, grupy eksperymentalne O1, O2, O3." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67602/67602fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Powtarzalność infekcji między operatorami. Grupy po 10 samic myszy CD-1 zostały zainfekowane przez tchawicę przez trzech niezależnych operatorów zgodnie z opisem, przy użyciu tej samej preparacji kuleczek. Przedstawiono liczbę CFU w płucach wyliczoną 24 h po infekcji. O1, O2, O3: operatorzy 1, 2 i 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67602/67602fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="2">JCF/100 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Przygotowanie kulek</td>
			<td>Próba 1</td>
			<td>Próba 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,13E+05</td>
			<td>2,40E+05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Próbka podawana strzykawką</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>1,14E+05</td>
			<td>5,10E+05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>1,36E+05</td>
			<td>4,10E+05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>9,30E+04</td>
			<td>3,90E+05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>9,80E+04</td>
			<td>3,60E+05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>1,14E+05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Średnia</td>
			<td>1,11E+05</td>
			<td>4,18E+05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD</td>
			<td>1,69E+04 (15%)</td>
			<td>6,50E+04 (16%)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Jednostki tworzące kolonie (CFU) na 100 µL próbki po przejściu przez szklaną strzykawkę i metalną igłę podawczą.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Próba 1</td>
			<td colspan="2">Próba 2</td>
			<td colspan="2">Próba 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ID myszy</td>
			<td>CFU w płucach/mysz</td>
			<td>Identyfikator myszy</td>
			<td>CFU w płucach/mysz</td>
			<td>Identyfikator myszy</td>
			<td>CFU w płucach/mysz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-1</td>
			<td>6,50E+03</td>
			<td>M-6</td>
			<td>2,20E+05</td>
			<td>M-11</td>
			<td>6,80E+04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-2</td>
			<td>1,10E+04</td>
			<td>M-7</td>
			<td>2,70E+05</td>
			<td>M-12</td>
			<td>1,70E+05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-3</td>
			<td>1,40E+04</td>
			<td>M-8</td>
			<td>8,10E+04</td>
			<td>M-13</td>
			<td>2,10E+05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-4</td>
			<td>3,20E+03</td>
			<td>M-9</td>
			<td>1,40E+05</td>
			<td>M-14</td>
			<td>4,40E+04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-5</td>
			<td>4,50E+03</td>
			<td>M-10</td>
			<td>1,30E+05</td>
			<td>M-15</td>
			<td>7,50E+04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>M-16</td>
			<td>1,01E+05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>M-17</td>
			<td>7,00E+04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>M-18</td>
			<td>5,80E+03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Średnia</td>
			<td>7,84E+03</td>
			<td>Średnia</td>
			<td>1,68E+05</td>
			<td>Średnia</td>
			<td>9,30E+04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD</td>
			<td>4,54E+03 (58%)</td>
			<td>SD</td>
			<td>7,57E+04 (45%)</td>
			<td>SD</td>
			<td>6,67E+04 (72%)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Implantacja kulek agarowych z zatopionymi M. abscessus w płucach myszy 24h po inokulacji

Myszy są ogólnie odporne na infekcje Mycobacterium abscessus, co komplikuje odkrycie i opracowanie bardzo potrzebnych antybiotyków przeciwko infekcjom płuc. W tym miejscu opisujemy metodę przygotowania inokulum i zakażenia dotchawiczego, która, jak wykazano, zapewnia trwałą infekcję u myszy immunokompetentnych.

Przygotowanie Mycobacterium abscessus osadzonego w paciorkach agarowych w celu śródtchawiczego inokulacji myszy immunokompetentnych

Robust mouse models of chronic infection with Mycobacterium abscessus, an environmental pathogen that preferably infects the lungs, are badly needed. ...

Opracowujemy mysi model przewlekłego zakażenia płuc ropniami prątków, aby przetestować skuteczność antybiotyków w badaniach przedklinicznych. Pierwszym wyzwaniem jest przezwyciężenie wewnętrznej odporności myszy na ropnie prątków. Drugim wyzwaniem jest wygenerowanie powtarzalnej partii bakterii osadzonych w agarze do infekcji dotchawiczej. Chcemy podzielić się szczegółowym protokołem przygotowania i infekcji agaru, który może być łatwo wdrożony przez inne laboratoria w celu testowania nowych leków na myszach.Zakażenie bakteriami osadzonymi w agarze zamiast wolnych bakterii częściowo przezwycięża zdolność myszy immunokompetentnych do spontanicznego usunięcia infekcji. Model ten stanowi solidne narzędzie przedkliniczne do oceny nowych antybiotyków przeciwko Mycobacterium abscessus, ułatwiając odkrywanie i opracowywanie bardzo potrzebnych antybiotyków przeciwko infekcjom płuc.[Instruktor] Na początek uzyskaj wykładniczo rosnące kultury zawiesinowe Mycobacterium abscessus dostosowane do gęstości optycznej 30. Przenieś 27 mililitrów stopionego tryptyku ślimaka sojowego wstępnie zrównoważonego w temperaturze 50 stopni Celsjusza do probówki zawierającej trzy mililitry zawiesiny bakteryjnej. Wymieszać zawiesinę przez pipetowanie. Ostrożnie odpipetować mieszaninę ślimaka bakteryjnego do kolby zawierającej 60 mililitrów oleju mineralnego w kolbie. Umieścić kolbę w pojemniku wtórnym i natychmiast rozpocząć mieszanie ze średnią prędkością na mieszadle magnetycznym za pomocą mieszadła magnetycznego. Upewnij się, że w mieszance ślimaka olejowego tworzy się widoczny wir i kontynuuj mieszanie przez sześć minut w temperaturze pokojowej. Umieść lód w pojemniku dodatkowym, aby zawiesina ostygła. Następnie przenieś mieszaninę gnojowicy do 250-mililitrowych probówek wirówkowych. Odwirować zawiesinę o sile 3 700 G przez sześć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pierwsze pięć cykli i ponownie zawiesić granulat ślimaka za pomocą DPBS. Zmontuj również sitko lejkowe, pierścień łączący i rurkę o pojemności 50 mililitrów w jedną jednostkę. Po 10 praniu ponownie zawiesić granulat i czterokrotnie rozcieńczyć zawiesinę kulki. Dodać rozcieńczony materiał próbki na sitko, aby przefiltrować zawiesinę kulek. Powoli pociągnij tłok 30-mililitrowej strzykawki przymocowanej do pierścienia łączącego, aby wytworzyć ssanie i poprawić filtrację. Następnie odwirować rozcieńczoną zawiesinę o stężeniu 1000 G przez dwie minuty w celu jej zagęszczenia. Po wciągnięciu granulek do 50-mililitrowej tuby, przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do jednego tygodnia, ale przygotuj świeże koraliki do każdej partii eksperymentów. Na początek powstrzymaj uspokojone myszy CD One za pomocą specjalnie zaprojektowanej trójwymiarowej, pochylonej podstawki z nadrukiem. Zabezpiecz mysz za siekacze za pomocą sznurka do szwów przymocowanego do środkowego pręta stojaka. Ułożenie myszy w brzusznej pozycji leżącej z uniesioną głową. Przymocuj metalową igłę do karmienia zwierząt o rozmiarze 24 do szklanej strzykawki wypełnionej zawiesiną ślimaka Mycobacterium abscessus. Umieść nylonowe klipsy lub korki na tłoku, aby zapewnić kontrolowaną objętość inokulum wynoszącą 50 mikrolitrów na mysz. Teraz umieść metalową igłębkę zgłębnika pionowo nad myszą. Ostrożnie włóż igłę u góry i wsuń ją dalej w dół do tchawicy. Zdejmij nylonowy klips lub korek i powoli dozuj 50 mikrolitrów zawiesiny ślimakowej Mycobacterium abscessus do płuc. Pozwól myszy odpocząć przez pięć minut. Następnie powtórz procedurę inokulacji po raz drugi, aby zapewnić głębokie i powtarzalne osadzanie się pełnego inokulum w płucach. Koraliki ślimakowe zawierające Mycobacterium abscessus wykazywały ekspresję białka fluorescencyjnego mCherry Red i różniły się wielkością od około 70 do 250 mikrometrów. Obciążenie bakteryjne w sześciu niezależnych preparatach perełek wykazało wysoką odtwarzalność. Liczenie bakterii przed i po przejściu przez szklaną strzykawkę nie wykazało znaczącej utraty obciążenia bakteryjnego. Metoda inokulacji międzytchawicy była powtarzalna w trzech niezależnych preparatach kulek, jak wykazano na podstawie liczby CFU w płucach po 24 godzinach od zakażenia. Potwierdzono powtarzalność infekcji między trzema niezależnymi operatorami, ponieważ liczba CFU w płucach po 24 godzinach od zakażenia pozostała spójna we wszystkich grupach.

preparation-agar-bead-embedded-mycobacterium-abscessus-to-inoculate

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Źródło: Bernut, A. i in., Rozszyfrowanie i obrazowanie patogenezy oraz układania korzeni Mycobacterium abscessus w embrionach danio pręgowanego. J. Vis. Exp. (2015).Ten film pokazuje protokół izolowania i ilościowego określania ropnia Mycobacterium z zakażonego zarodka danio pręgowanego. Procedura obejmuje eutanazję zarodków, lizę tkanek oraz homogenizację w celu uwolnienia bakterii, a następnie wirowanie i ponowną zawiesinę w buforze powierzchniowo czynnym. Na koniec zawiesina bakteryjna jest...

Izolacja i hodowla bakterii z zarodków danio dano w celu oceny obciążenia infekcją

Ten film pokazuje indukcję ogólnoustrojowego stanu zapalnego u znieczulonej myszy. Wstrzyknięcie zapasów antygenu prątkowego z adiuwantem wyzwala uwalnianie cytokin i miejscowy stan zapalny. Naczynia limfatyczne otwierają się, umożliwiając wnikanie komórek odpornościowych do węzłów chłonnych i aktywację limfocytów T, które uwalniają cytokiny prozapalne, prowadząc do rozległego stanu zapalnego.

Podskórne wstrzyknięcie antygenu bakteryjnego w celu wywołania ogólnoustrojowego stanu zapalnego w modelu mysim

Ten film demonstruje metodę generowania mysiego modelu mysiego zapalenia błony naczyniowej oka (PMU) do badania poinfekcyjnego zapalenia błony naczyniowej oka. Po indukcji PMU przez wstrzyknięcie do ciała szklistego zabitych termicznie Mycobacterium tuberculosis u myszy uprzednio uodpornionej tym samym immunogenem, postęp przewlekłego stanu zapalnego w oku jest analizowany za pomocą obrazowania i badania...

Mysi model prątkowego zapalenia błony naczyniowej oka do badania poinfekcyjnego zapalenia błony naczyniowej oka

Opisujemy metodę koralików agarowych w celu ustalenia trwałego, długotrwałego przewlekłego zakażenia dróg oddechowych Pseudomonas aeruginosa w modelu mysim.

Długotrwałe przewlekłe zakażenie dróg oddechowych Pseudomonas aeruginosa u myszy

Optycznie przezroczyste embriony danio pręgowanego są szeroko stosowane do badania i wizualizacji w czasie rzeczywistym interakcji między patogennymi mikroorganizmami a wrodzonymi komórkami odpornościowymi. Mikroiniekcja Mycobacterium abscessus, w połączeniu z obrazowaniem fluorescencyjnym, służy do badania podstawowych cech chorobotwórczych, takich jak tworzenie się pępowiny w zarodkach danio pręgowanego.

Rozszyfrowywanie i obrazowanie patogenezy i sznurowania Mycobacterium abscessus w zarodkach danio pręgowanego

Opisano test na myszach do śledzenia migracji komórek ze skóry do drenującego węzła chłonnego, który umożliwia scharakteryzowanie komórek dendrytycznych skóry zmobilizowanych do węzła chłonnego po zakażeniu opuszki stopy Bacille Calmette-Guérin.

Test oparty na CFSE do badania migracji komórek dendrytycznych skóry myszy do drenujących węzłów chłonnych podczas zakażenia Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin

Opisujemy obrazowanie optyczne myszy zakażonych Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) za pomocą fluorescencji enzymu reporterowego (REF). Protokół ten ułatwia czułe i swoiste wykrywanie M. tuberculosis w przedklinicznych modelach zwierzęcych do celów patogenezy, terapii i badań nad szczepionkami.

Obrazowanie Mycobacterium tuberculosis u myszy z fluorescencją enzymu reporterowego

Tutaj prezentujemy dwa protokoły do badania interakcji Phagocyte-Mycobacterium abscessus: badanie przesiewowe biblioteki mutantów transpozonów pod kątem bakteryjnego niedoboru wewnątrzkomórkowego oraz określenie bakteryjnego transkryptomu wewnątrzkomórkowego na podstawie sekwencjonowania RNA. Oba podejścia zapewniają wgląd w zalety genomu i adaptacje transkryptomiczne, poprawiając sprawność bakterii wewnątrzkomórkowych.

Identyfikacja markerów wirulencji Mycobacterium abscessus do replikacji wewnątrzkomórkowej w fagocytach

W tym raporcie prezentujemy protokół, który pozwala badaczowi na wygenerowanie mysiego modelu wewnątrzgałkowego zapalenia błony naczyniowej oka. Ten uznany model, częściej określany jako eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka (EAU), obejmuje wiele aspektów chorób u ludzi. W tym miejscu opiszemy, jak indukować i monitorować postęp choroby za pomocą kilku odczytów.

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka: wewnątrzgałkowy model zapalny myszy

Ten protokół opisuje kroki do wywołania Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) u myszy. Ta metoda przedstawia kroki, które pomogą w wytworzeniu niezawodnego i solidnego zapalenia oka w systemie modelu mysiego. Korzystając z tego protokołu, wygenerowaliśmy oczy błony naczyniowej oka i nieobjęte stanem zapalnym inne oczy od pojedynczych zwierząt w celu dalszej oceny za pomocą testów immunologicznych, transkryptomicznych i proteomicznych.

Przygotowanie mykobakteryjnego zapalenia błony naczyniowej oka (PMU) jako model poinfekcyjnego zapalenia błony naczyniowej oka

Tutaj prezentujemy protokół przeprowadzania śródskórnej inokulacji Mycobacterium avium w uchu myszy w niskiej dawce, aby odzwierciedlić warunki podobne do ekspozycji.

Śródskórne inokulowanie Mycobacterium avium w uchu myszy

Poznaj metodę przygotowania paciorków agarowych z Mycobacterium abscessus do śródtchawicznej inokulacji myszy immunokompetentnych. Ten model umożliwia testowanie nowych antybiotyków w badaniach przedklinicznych zakażeń płucnych.

Przygotowanie Mycobacterium abscessus osadzonego w paciorkach agarowych w celu śródtchawiczego inokulacji myszy immunokompetentnych (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie Mycobacterium abscessus osadzonego w paciorkach agarowych w celu śródtchawiczego inokulacji myszy immunokompetentnych

Przeglądaj więcej filmów