Name: Podejście przezspojówkowe do wstrzyknięcia do nerwu wzrokowego szczura (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 2 min 33 s
Description: Poznaj minimalnie inwazyjną metodę przezspojówkowego wstrzyknięcia do nerwu wzrokowego szczura. Technika ta umożliwia bezpośrednią wizualizację podczas podawania terapii genowej w badaniach neurofibromatozy typu 1.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Fundacji Rodziny Gilbertów za finansowanie tego projektu.

Wszystkie procedury dla zwierząt zostały zatwierdzone przez Biuro Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Iowa. Badanie zostało sfinansowane przez Gilbert Family Foundation (grant numer 913012). Do eksperymentów wykorzystano kombinację samców i samic szczurów Sprague Dawley, w wieku 4-12 tygodni i ważących 100-400 g. Szczegółowe informacje na temat stosowanych odczynników i sprzętu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Znieczulenie
<ol>
	<li>Znieczulenie szczurów za pomocą inhalacji izofluranu. Umieść zwierzę w komorze indukcyjnej i przekręć parownik na 4%-5% w celu indukcji znieczulenia i 2%-3% w celu utrzymania znieczulenia. 
	UWAGA: Postępuj zgodnie z wytycznymi instytucji, jeśli preferowany jest również środek znieczulający miejscowo.</li>
	<li>Przed kontynuowaniem sprawdź głębokość znieczulenia, oceniając brak odruchu wycofania pedału.</li>
	<li>Nałóż sztuczny żel łzowy na powierzchnię oka.</li>
</ol>
2. Pozycjonowanie
<ol>
	<li>Po wywołaniu znieczulenia umieść zwierzę na poduszce grzewczej w bocznej pozycji leżącej. Użyj stożka do nosa, aby utrzymać znieczulenie.</li>
	<li>Ustawić orbitę pod mikroskopem operacyjnym.</li>
</ol>
3. Narażenie chirurgiczne
<ol>
	<li>Chwyć spojówkę ząbkowanymi kleszczami w kwadrancie dolno-skroniowym (<silna klasa="xfig">Ryc. 1).</li>
	<li>Użyj nożyczek Westcotta, aby utworzyć promieniowe nacięcie spojówki, a następnie otwórz powięź Tenona w kwadrancie infernosalnym (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Użyj cięcia, aby usunąć leżącą nad nim tkankę oczodołu.</li>
</ol>
4. Izolacja nerwu wzrokowego
<ol>
	<li>Obróć oko nosowo za pomocą kleszczy zębatych i poproś asystenta, aby wbił hak rdzenia kręgowego do dolno-skroniowego kwadrantu, aby wyizolować nerw wzrokowy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Uważaj, aby ominąć brzuszną żyłę oczną i mięśnie zewnątrzgałkowe.</li>
	<li>Usuń leżącą tkankę oczodołu i powięź Tenona, wykonując rozwarstwienie za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką lub kleszczy, aby odsłonić nerw wzrokowy i osłonkę.</li>
</ol>
5. Wtrysk
<ol>
	<li>Użyj igły 33 G połączonej ze strzykawką o pojemności 10 μl lub 1 ml, aby przebić osłonkę nerwu wzrokowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Wstrzyknij różne stężenia wirusa związanego z adenowirusem-eGFP lub barwnika India Ink do nerwu wzrokowego pod bezpośrednią wizualizacją, aby upewnić się, że materiał zostanie wstrzyknięty bezpośrednio do nerwu.</li>
	<li>Aby ocenić AAV-eGFP, wstrzyknąć 10 μl zawiesiny zawierającej cząsteczki wirusa AAV (2 x10 13 genomów wektorowych (vg)/ml, co daje całkowitą dawkę 2 x 1011 vg). 
	UWAGA: Badacze mogą wstrzykiwać inne barwniki lub plamy w zależności od potrzeb eksperymentalnych.</li>
</ol>
6. Kroki po zabiegu
<ol>
	<li>Ponownie zbliż spojówkę do rąbka, aby pokryć miejsce nacięcia i nałóż maść z antybiotykiem na spojówkę (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1).</li>
	<li>Pozwól zwierzętom dojść do siebie po znieczuleniu i monitoruj je pod kątem jakichkolwiek oznak infekcji.</li>
</ol>
7. Barwienie
<ol>
	<li>Siedem dni po wstrzyknięciu należy uśmiercić zwierzęta poprzez uduszenie CO2, a następnie zwichnięcie szyjki macicy11 zgodnie z wytycznymi etycznymi. Wypreparuj nerw wzrokowy.</li>
	<li>Umocuj nerwy wzrokowe w 4% paraformaldehydzie i spłucz w zwiększonym stężeniu sacharozy. Osadź krioformy w roztworze związku OCT w proporcji 2:1 do 20% sacharozy. Próbki należy błyskawicznie zamrażać w ciekłym azocie, przechowywać w temperaturze -80 °C i dzielić na sekcje o grubości 7 μm.</li>
	<li>Zablokować kriosekcje nerwu wzrokowego na 30 minut w temperaturze pokojowej w buforze immunocytochemicznym (IHC) i 3% albuminie surowicy bydlęcej. Inkubować skrawki z pierwszorzędowym przeciwciałem anty-GFP szczura rozcieńczonym w buforze IHC przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować skrawki z kozim środkiem przeciw szczurom w buforze IHC przez dodatkowy 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Podczas wtórnej inkubacji przeciwciał oznacz skrawki dichlorowodorkiem 4',6-diamidyn-2-fenyloindolu (DAPI) w celu wizualizacji jąder komórkowych. Dokładnie wypłucz sekcje za pomocą PBS i zamontuj za pomocą medium montażowego.</li>
</ol>
8. Obrazowanie
<ol>
	<li>Zobrazuj oznaczone sekcje za pomocą pionowego systemu mikroskopu konfokalnego.</li>
	<li>W szczególności użyj fioletowego lasera 405 nm do wizualizacji etykietowania DAPI i cyjanowego lasera 488 nm do wizualizacji GFP. 
	UWAGA: Ustawienia dla każdego lasera (tj. moc lasera, intensywność/wzmocnienie, filtry tła/szumów) powinny być zoptymalizowane przez każdego użytkownika dla różnych systemów mikroskopów konfokalnych. Rób zdjęcia za pomocą obiektywu o powiększeniu 20x.</li>
</ol>

<ol><li>Korn, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+neuroprotective+effects+of+methylprednisolone+and+surgical+decompression+in+a+rodent+model+of+traumatic+optic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the neuroprotective effects of methylprednisolone and surgical decompression in a rodent model of traumatic optic neuropathy.</a> Curr Eye Res. 47 (3), 461-467 (2022).</li>
<li>Lim, J. Y., Utzschneider, D. A., Sakatani, K., Kocsis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+attenuation+of+GABA+sensitivity+in+the+maturing+myelin-deficient+rat+optic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Dev+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The attenuation of GABA sensitivity in the maturing myelin-deficient rat optic nerve.</a> Brain Res Dev Brain Res. 72 (1), 15-20 (1993).</li>
<li>Singh, D., Dromel, P. C., Perepelkina, T., Baranov, P., Young, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C6+cell+injection+into+the+optic+nerve+of+long-evans+rats%3A+A+short-term+model+of+optic+pathway+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">C6 cell injection into the optic nerve of long-evans rats: A short-term model of optic pathway gliomas.</a> Cell Transplant. 29, 963689720964383(2020).</li>
<li>Schwaner, S. A., Feola, A. J., Ethier, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+optic+nerve+head+biomechanics+in+a+rat+model+of+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Factors affecting optic nerve head biomechanics in a rat model of glaucoma.</a> J R Soc Interface. 17 (165), 20190695(2020).</li>
<li>Ellouze, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+allotopic+expression+of+the+human+mitochondrial+ND4+prevents+blindness+in+a+rat+model+of+mitochondrial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Optimized allotopic expression of the human mitochondrial ND4 prevents blindness in a rat model of mitochondrial dysfunction.</a> Am J Hum Genet. 83 (3), 373-387 (2008).</li>
<li>Kwon, H., Park, M., Nepali, S., Lew, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-preconditioned+placenta-derived+mesenchymal+stem+cells+rescue+optic+nerve+axons+via+differential+roles+of+vascular+endothelial+growth+factor+in+an+optic+nerve+compression+animal+model%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-preconditioned placenta-derived mesenchymal stem cells rescue optic nerve axons via differential roles of vascular endothelial growth factor in an optic nerve compression animal model.</a> Mol Neurobiol. 57 (8), 3362-3375 (2020).</li>
<li>Pang, I. H., Clark, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+for+glaucoma+retinopathy+and+optic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Glaucoma%22%5BJournal%5D)">Rodent models for glaucoma retinopathy and optic neuropathy.</a> J Glaucoma. 16 (5), 483-505 (2007).</li>
<li>Raykova, K., Jones, M. V., Huang, H., Hoffman, P. F., Levy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimally-invasive+Technique+for+Injection+into+Rat+Optic+Nerve%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Minimally-invasive Technique for Injection into Rat Optic Nerve.</a> J Vis Exp. (99), e52249(2015).</li>
<li>Hallas, B. H., Wells, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+mulitple+injections+into+the+mamallian+optic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Kopf+Carrier%22%5BJournal%5D)">A novel technique for mulitple injections into the mamallian optic nerve.</a> Kopf Carrier. 54, 1-10 (2000).</li>
<li>Yan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+optic+nerve+transection+in+rats%3A+A+model+established+with+a+new+operative+approach+to+assess+secondary+degeneration+of+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Partial optic nerve transection in rats: A model established with a new operative approach to assess secondary degeneration of retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. (128), e56272(2017).</li>
<li>Han, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatibility+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+progenitor+cell+grafts+in+immunocompromised+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Biocompatibility of human induced pluripotent stem cell-derived retinal progenitor cell grafts in immunocompromised rats.</a> Cell Transplantation. 31, 1-25 (2022).</li>
<li>Tang, Y., Gutmann, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofibromatosis+Type+1-associated+optic+pathway+gliomas%3A+Current+challenges+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Manag+Res%22%5BJournal%5D)">Neurofibromatosis Type 1-associated optic pathway gliomas: Current challenges and future prospects.</a> Cancer Manag Res. 15, 667-681 (2023).</li>
<li>Pan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+biomimetic+polydopamine+nanocomposite+scaffold+promotes+optic+nerve+regeneration+through+modulating+inhibitory+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">Implantation of biomimetic polydopamine nanocomposite scaffold promotes optic nerve regeneration through modulating inhibitory microenvironment.</a> J Nanobiotechnol. 22 (1), 683(2024).</li>
<li>Gokoffski, K. K., Peng, M., Alas, B., Lam, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuro-protection+and+neuro-regeneration+of+the+optic+nerve%3A+recent+advances+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuro-protection and neuro-regeneration of the optic nerve: recent advances and future directions.</a> Curr Opin Neurol. 33 (1), 93-105 (2020).</li>
<li>Negishi, H., Dezawa, M., Oshitari, T., Adachi-Usami, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+nerve+regeneration+within+artificial+Schwann+cell+graft+in+the+adult+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Optic nerve regeneration within artificial Schwann cell graft in the adult rat.</a> Brain Res Bull. 55 (3), 409-419 (2001).</li>
</ol>

Brak istotnych informacji.

W artykule opisano nowatorską metodę dostępu do nerwu wzrokowego szczura w celu przeprowadzenia badań eksperymentalnych bez konieczności nacinania skóry. Takie podejście zapewnia potencjalne korzyści w postaci skuteczności i zmniejszenia ryzyka infekcji i krwawienia, biorąc pod uwagę brak konieczności nacinania skóry i mniejszą liczbę kroków w porównaniu z innymi technikami 8,9. Technika ta wykorzystuje również nowatorskie podejście polegające na izolowaniu nerwu wzrokowego za pomocą haka rdzenia kręgowego szczura, aby uniknąć urazu nerwu i otaczających tkanek.
Kluczowe kroki w tej technice obejmują wykonanie odpowiedniego nacięcia rąbka w celu uzyskania dostępu do przestrzeni podspojówkowej, użycie haka rdzenia kręgowego do odizolowania nerwu wzrokowego oraz użycie igły o małym otworze do przebicia osłonki nerwu wzrokowego i dostarczenia materiału do nerwu wzrokowego. Należy zachować ostrożność, aby obrócić hak rdzenia kręgowego w celu odizolowania nerwu. Gdy nerw nie jest wyraźnie odizolowany, może być konieczne kilkakrotne wprowadzenie haczyka, aby zapewnić izolację nerwu, a aplikator z bawełnianą końcówką może być użyty do usunięcia tkanki łącznej z osłonki nerwowej w celu lepszej wizualizacji. Narażenie na tę technikę może być trudniejsze u większych zwierząt z większą objętością tłuszczu w oczodole. W takich sytuacjach przydatne może być użycie asystenta do cofnięcia otaczających tkanek w celu odpowiedniej ekspozycji. Należy zachować ostrożność, aby uwidocznić nerw wzrokowy bezpośrednio podczas wstrzyknięcia. Zapewnienie prostopadłego ułożenia igły przez osłonkę nerwową podczas wstrzyknięcia poprawia powodzenie wstrzyknięcia.
Technika ta opiera się na wcześniejszych pracach Raykova i wsp. oraz Hallasa i Wellsa 8,9. Raykova i wsp. opisali dostęp do nerwu wzrokowego szczura przy użyciu podejścia nadrzędnego z nacięciem skóry utworzonym nad grzbietem oczodołu i przecięciem mięśnia oczodołu górnego8. Chociaż takie podejście pozwala na odsłonięcie nerwu, wymaga przecięcia mięśnia zewnątrzgałkowego, co wiąże się z większym ryzykiem krwawienia i koniecznością zszycia nacięcia skóry. Podobnie Hallas i Wells opisują boczne podejście do oczodołu szczura w celu dotarcia do nerwu wzrokowego9. Opisują one boczne nacięcie skóry, po którym następuje boczne nacięcie spojówki i szew trakcyjny służący do obracania oka i odsłonięcia nerwu wzrokowego9. Podobnie jak w przypadku podejścia nadrzędnego, technika ta obejmuje nacięcie skóry, co powoduje konieczność zamknięcia rany i zwiększa ryzyko infekcji i krwawienia 8,9. Przedstawiona tutaj technika przezspojówkowa eliminuje potrzebę nacinania skóry i mięśni, zmniejszając w ten sposób ryzyko krwawienia/infekcji i poprawiając wydajność, unikając konieczności zamykania nacięcia skóry. Zabieg powoduje minimalny stres, jest dobrze tolerowany i nie wymaga długotrwałego stosowania leków przeciwbólowych lub przeciwzapalnych. Technika przezspojówkowa jest porównywana i skontrastowana z poprzednio opublikowanymi technikami w Tabeli 1.
Ograniczenia techniki przedstawionej w tym badaniu obejmują krzywą uczenia się izolacji nerwu wzrokowego za pomocą haka rdzenia kręgowego, ale po opanowaniu technika ta pozwala na skuteczną i atraumatyczną izolację nerwu. Do tej techniki niezbędna jest znajomość obsługi mikroskopu operacyjnego. Chociaż istnieje krzywa uczenia się dla tej techniki, mniejsza liczba kroków i brak potrzeby zszywania rany sprawi, że technika ta będzie łatwiejsza do opanowania w porównaniu z innymi opublikowanymi podejściami 8,9. Konieczne jest staranne rozwarstwienie w celu odsłonięcia nerwu i osłonki, ponieważ może dojść do krwotoku z pobliskich naczyń i tkanki mięśniowej. U większych szczurów może być trudniej odsłonić duże odcinki nerwu wzrokowego ze względu na zwiększoną ilość tłuszczu/tkanki oczodołu, ale przy zachowaniu ostrożności tkankę tę można na ogół usunąć za pomocą rozwarstwienia, aby poprawić wizualizację nerwu. Dalsze prace mogą zająć się zastosowaniem tej techniki w innych systemach modelowych, takich jak mysz, i mogą bezpośrednio porównać skuteczność chirurgiczną z innymi technikami dostępu do nerwu wzrokowego.
Technika ta może być stosowana przez inne grupy, które muszą uzyskać dostęp do nerwu wzrokowego szczura w celu przeprowadzenia badań eksperymentalnych. Przedstawione tu eksperymenty były częścią większego projektu, którego celem było opracowanie sposobów dostarczania korekcji genu CRISPR do nerwu wzrokowego w szczurzych modelach nerwiakowłókniakowatości typu 1 (NF1). Ostatecznym celem tego projektu jest znalezienie sposobów dostarczania terapii genowej bezpośrednio do nerwu wzrokowego u pacjentów z NF1, aby zapobiec rozwojowi glejaków nerwu wzrokowego, które zagrażają widzeniu12. W tym badaniu barwnik India Ink lub wektor AAV-eGFP został wstrzyknięty do nerwu wzrokowego, aby upewnić się, że materiał jest dostarczany do nerwu wzrokowego i wykazać, że wektor może przeniknąć do nerwu wzrokowego. 
Technika ta może być szerzej stosowana przez innych badaczy, ponieważ może być konieczne uzyskanie dostępu do nerwu lub wstrzyknięcie nowych środków terapeutycznych w celu leczenia różnych stanów zagrażających wzrokowi, w tym nowotworów nerwu wzrokowego, procesów zwyrodnieniowych, takich jak dziedziczna neuropatia nerwu wzrokowego Lebera, urazowa neuropatia nerwu wzrokowego, jaskra i choroby autoimmunologiczne, takie jak zapalenie nerwu wzrokowego13, Rozdział 14. Na przykład Singh i wsp. opisują wstrzyknięcie komórek glejaka C6 do nerwu wzrokowego szczura jako model nerwiakowłókniakowatości typu 1 uzyskujący dostęp do nerwu za pomocą nacięcia skórnego3, Kwon i wsp. uzyskali dostęp do nerwu wzrokowego z bocznego dostępu skórnego w badaniach obejmujących kompresję i regenerację nerwu wzrokowego za pomocą komórek macierzystych6, a Negishi i wsp. uzyskali dostęp do nerwu wzrokowego szczura w celu umieszczenia przeszczepu komórek Schwanna jako modelu nerwu wzrokowego Regeneracja15. Przedstawiona tutaj technika może zapewnić bardziej efektywne i bezpieczniejsze podejście do badań takich jak te, które wymagają dostępu do nerwu wzrokowego szczura w celu udzielenia odpowiedzi na różne pytania eksperymentalne. 
Podsumowując, praca ta wykazuje skuteczność w wnikaniu do nerwu wzrokowego za pomocą igły o małej grubości oraz zdolność do penetracji osłonki nerwowej bez konieczności nacięcia skóry. Reprezentatywne obrazy pokazują, że wektor adenowirusowy skutecznie przeniknął do nerwu wzrokowego. Technika ta ma zastosowanie w różnych eksperymentach z nerwem wzrokowym w medycynie regeneracyjnej, onkologii i dziedzicznych chorobach siatkówki.

Szczur jest kluczowym modelem eksperymentalnym do badania zaburzeń nerwu wzrokowego, w tym jaskry, urazowej neuropatii nerwu wzrokowego, dziedzicznej neuropatii wzrokowej, choroby demielinizacyjnej i guzów nerwu wzrokowego,2,3,4,5,6,7. Jednak uzyskanie dostępu do nerwu wzrokowego w celu eksperymentalnego wstrzyknięcia i manipulacji może być trudne, biorąc pod uwagę mały rozmiar oczodołu i tkanek oczodołu naczyniowego.
Dwie wcześniejsze techniki, które zostały opisane w celu uzyskania dostępu do nerwu wzrokowego szczura w celu eksperymentalnych manipulacji, wykorzystują albo lepsze orbitalne, albo boczne przezskórne podejście do dostępu do orbity8,9. Raykova i wsp. opisują wstrzykiwanie barwionych koralików do nerwu wzrokowego za pomocą górnego nacięcia skóry oczodołu8. Chociaż ich technika była skuteczna, wymaga hemostazy i konieczności założenia szwu trakcyjnego do ekspozycji, co może być trudniejsze przy tym podejściu8. Inna grupa podobnie opisała podejście wykorzystujące boczne nacięcie skóry w celu uzyskania dostępu do oczodołu. Udało im się wstrzyknąć nerw wzrokowy przy użyciu tego podejścia, ale wymagało to hemostazy i zamknięcia rany9. Chociaż techniki te są skutecznymi podejściami do dostępu do nerwu wzrokowego w celu przeprowadzenia badań eksperymentalnych, obie obejmują nacięcie skóry, potrzebę hemostazy i zamknięcie rany. Te kroki wiążą się z ryzykiem infekcji i potencjalnie wydłużonym czasem pod narkozą ze względu na konieczność zamknięcia rany8,9,10.
Biorąc pod uwagę ograniczenia wcześniej opisanych technik, celem tego badania jest opisanie bardziej efektywnego i mniej traumatycznego podejścia do dostępu do nerwu do badań eksperymentalnych. Hak rdzenia kręgowego służy do izolowania nerwu wzrokowego, analogicznie do techniki chirurgicznej stosowanej u ludzi do izolowania mięśni i struktur przydatków oka za pomocą haka mięśniowego. Technika ta może być stosowana przez badaczy, którzy potrzebują dostępu do nerwu wzrokowego szczura w wielu wskazaniach, od dostarczania leków po terapię genową.
Ten artykuł opisuje nowatorskie zastosowanie podejścia przezspojówkowego w celu uzyskania dostępu do oczodołu i nerwu wzrokowego szczura do badań eksperymentalnych za pomocą haka do rdzenia kręgowego.

<table><tbody><tr><td>Dichlorowodorek 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI)</td><td>MiliporeSigma</td><td>D9542</td><td>Rozcieńczenie 1:10 000, stosowane do barwienia kriosekcji</td></tr><tr><td>Cząsteczki wirusa AAV</td><td>Vectorbuilder</td><td>N/A</td><td>Wektor używany do iniekcji nerwu wzrokowego</td></tr><tr><td>Aqua-Mount Medium montażowe</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-390-5</td><td>Służy do montażu barwionych kriosekcji</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca Albumina&nbsp;</td><td>Research Products International Corp</td><td>9048-46-8</td><td>Stosowany w procesie barwienia kriosekcji</td></tr><tr><td>Koza antyszczura Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>Rozcieńczenie Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11006</td><td>1:1000, stosowane do barwienia kriosekcji</td></tr><tr><td>Gaz izofloranowy</td><td>Primal Healthcare</td><td>66794-017-10</td><td>Gaz do znieczulenia</td></tr><tr><td>System pionowego mikroskopu konfokalnego Leica TCS SPE&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td>N/A Mikroskop</td><td>konfokalny</td></tr><tr><td>Strzykawka Luer lock</td><td>BD</td><td>309628</td><td>Strzykawka do wstrzykiwań</td></tr><tr><td>Kriostat Microm HM505E&nbsp;</td><td>Microm</td><td>M-HM360 fom Marshall Scientific</td><td>Służy do cięcia próbek szczurów</td></tr><tr><td>anty-GFP&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>338002</td><td>rozcieńczenie 1:500, stosowany do barwienia kriosekcji</td></tr><tr><td>Hak do rdzenia kręgowego</td><td>FST</td><td>10162-12</td><td>Haczyk używany do izolacji nerwu wzrokowego</td></tr><tr><td>Strzykawka o pojemności dziesięciu mikrolitrów</td><td>Strzykawka Hamilton</td><td>CAL 803901</td><td>do wstrzykiwań</td></tr><tr><td>Igła do</td> wstrzykiwań <td>JBP3308B</td><td></td> do <td>wstrzykiwań</td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT compound&nbsp;</td><td>VWR International</td><td>25608-930</td><td>Używany do obróbki kriomoldu</td></tr><tr><td>Kleszcze zębate</td><td>Bausch i Lomb</td><td>E1809</td><td>Kleszcze do chwytania spojówki</td></tr><tr><td>Zakrzywione nożyczki do tenotomii Westcotta</td><td>Bausch i Lomb</td><td>E3323-R</td><td>Nożyczki do tworzenia peritomii</td></tr></tbody></table>

podejście przezspojówkowe do wstrzyknięcia do nerwu wzrokowego szczura

Transconjunctival Approach for Injection into the Rat Optic Nerve

Szczur służy jako ważny model do badania zaburzeń nerwu wzrokowego, w tym chorób dziedzicznych, urazowych, nowotworowych i autoimmunologicznych. Dostęp do nerwu wzrokowego szczura w celu eksperymentalnych manipulacji i zastrzyków jest trudny ze względu na mały rozmiar oczodołu i unaczynienie otaczających tkanek oczodołu. Wcześniejsze techniki obejmowały nacięcie skóry, które niesie ze sobą większe ryzyko infekcji i wymaga zamknięcia rany. Badanie to ma na celu opisanie unikalnego, mniej inwazyjnego i potencjalnie bardziej skutecznego podejścia do dostępu do nerwu wzrokowego szczura. Nacięcie przezspojówkowe, wraz z hakiem rdzenia kręgowego szczura, służy do izolowania nerwu wzrokowego do eksperymentalnych zastrzyków. W tych eksperymentach wektor adenowirusowy jest wstrzykiwany do nerwu wzrokowego w celu wykorzystania tej techniki do bezpośredniego dostarczania terapii genowej w przyszłości. Technika ta może być również stosowana przez badaczy wymagających dostępu do nerwu wzrokowego szczura do innych badań eksperymentalnych, w tym dostarczania leków i badań nad uszkodzeniem nerwu wzrokowego.

Reprezentatywne wyniki eksperymentalne z zastosowaniem tej techniki w przypadku iniekcji do nerwu wzrokowego szczura przedstawiono na Rycini 2. W tym przykładzie wirus adeno-zależny niosący eGFP (AAV-eGFP) został wstrzyknięty do nerwu wzrokowego szczura przy użyciu opisanej powyżej techniki transkoniunktywalnej, z użyciem igły 33 G połączonej ze strzykawką 10 µL. Wyniki te stanowiły część eksperymentu wykorzystującego tę technikę do badania iniekcji do nerwu wzrokowego w ramach nadrzędnego celu, jakim było zastosowanie AAV do dostarczenia korekcji CRISPR do nerwów wzrokowych w szczurzym modelu neurofibromatozy typu 1 (NF1). Do opracowania techniki iniekcji wykorzystano kombinację barwnika i wektora AAV. Zwierzęta uśmiercono siedem dni po iniekcji do nerwu wzrokowego. Następnie wypreparowano nerwy i oznakowano je przeciwciałami anty-GFP, aby umożliwić obrazowanie nerwu wzrokowego za pomocą mikroskopii konfokalnej w celu potwierdzenia, że materiał pomyślnie przeniknął przez osłonkę nerwu wzrokowego i wniknął do nerwu wzrokowego. Pomyślne wprowadzenie materiału do nerwu wzrokowego potwierdzono barwieniem przeciwciałami; w mikroskopii konfokalnej materiał ten był widoczny w kolorze zielonym, co przedstawiono na Rycini 2A. W przypadkach, gdy penetracja przez osłonkę nerwu wzrokowego była niepełna lub wystąpił wyciek materiału wzdłuż toru igły, barwienie było widoczne wzdłuż krawędzi osłonki nerwu wzrokowego, a nie wewnątrz tkanki nerwowej, co pokazano na Rycini 2C.
<img alt="Seria zdjęć przedstawiająca proces usuwania woskowiny za pomocą instrumentów medycznych w warunkach klinicznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68048/68048fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Sekwencja etapów chirurgicznych. (A) Spojówkę chwyta się pęsetą z ząbkami, a za pomocą nożyczek Westcotta wykonuje się peritomię limbalną. (B) Po otwarciu i rozdzieleniu tępo powięzi Tenona, przy pomocy nożyczek Westcotta odsłania się oczodół. (C) Wprowadzany jest hak do rdzenia kręgowego, który służy do izolacji nerwu wzrokowego. (D) Po rozdzieleniu tępo nadkładających tkanek oczodołu, za pomocą haka do rdzenia kręgowego odsłania się nerw wzrokowy. (E) Igłą 33 G przebija się osłonkę nerwu wzrokowego i wstrzykuje adenowirusa lub barwnik do nerwu wzrokowego. (F) Gałka oczna zostaje przywrócona do oczodołu, a spojówkę ponownie ustawia się nad miejscem peritomii. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68048/68048fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna ekspresji AAV-eGFP w nerwie wzrokowym; zaznaczona chiasma, barwienie DAPI." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68048/68048fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Reprezentatywny panoramiczny obraz konfokalny fluorescencyjny nerwu wzrokowego szczura 7 dni po udanej iniekcji AAV-eGFP (zielony), w którym wektor transdukował neurony w pobliżu chiasmy wzrokowej. (A) Jądra komórek nerwu wzrokowego są znakowane DAPI (niebieski). ONH ze strzałką oznacza główkę nerwu wzrokowego lub koniec orbitalny nerwu, natomiast koniec chiasmy wzrokowej jest oznaczony jako „chiasm”. (B) Fotografia nerwu wzrokowego szczura od oczodołu do chiasmy, zatopionego w zamrożonym bloku kriosiecji. Nerw został wstrzyknięty tuszem indyjskim bezpośrednio za oczodołem (miejsce iniekcji zaznaczone czarną strzałką) w celu zorientowania nerwu wzrokowego. (C) Panoramiczny obraz fluorescencyjny nerwu wzrokowego szczura 7 dni po nieudanej iniekcji AAV-eGFP (zielony), w którym większość zawiesiny wektora prawdopodobnie wypłynęła z traktu nerwowego, transdukując pochewkę nerwu wzrokowego. Jądra komórek nerwu wzrokowego są znakowane DAPI (niebieski). ONH oznacza główkę nerwu wzrokowego bezpośrednio za siatkówką neuronalną i miejsce iniekcji wskazane białą strzałką. Chiasma i biała strzałka wyznaczają kierunek w stronę chiasmy wzrokowej. Paski skali = 400 μm w (A) i 200 μm w (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68048/68048fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Zmienna</td>
			<td colspan="3">Metoda</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Transkonjunktywalny</td>
			<td>Górny </td>
			<td>Boczny</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nacięcie skóry</td>
			<td>Nie</td>
			<td>Tak</td>
			<td>Tak</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nacięcie spojówki</td>
			<td>Tak</td>
			<td>Nie</td>
			<td>Nie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mikroskop</td>
			<td>Tak</td>
			<td>Tak</td>
			<td>Tak</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przecięcie mięśnia górnego oka</td>
			<td>Nie</td>
			<td>Tak</td>
			<td>Nie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Szew trakcyjny</td>
			<td>Nie</td>
			<td>Tak</td>
			<td>Tak</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haczyk do rdzenia kręgowego</td>
			<td>Tak</td>
			<td>Nie</td>
			<td>Nie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Szycie skóry</td>
			<td>Nie</td>
			<td>Tak</td>
			<td>Tak</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Porównanie z wcześniej opisanymi technikami izolacji nerwu wzrokowego szczura do badań eksperymentalnych. Zmienne, w tym konieczność wykonania nacięcia skóry, nacięcia spojówki, użycia mikroskopu operacyjnego, przecięcia górnego mięśnia gałki ocznej, zastosowania szwu trakcyjnego, haka do rdzenia kręgowego oraz szwu skóry, zostały porównane z wykorzystaniem dojścia przezspojówkowego, górnego i bocznego.

Ten protokół opisuje unikalną technikę wykorzystującą podejście przezspojówkowe do dostępu do nerwu wzrokowego szczura w celu wykonania zastrzyków.

Podejście przezspojówkowe do wstrzyknięcia do nerwu wzrokowego szczura

The rat serves as an important model for studying disorders of the optic nerve, including heritable, traumatic, neoplastic, and autoimmune conditions. ...

Badania te mają na celu opracowanie skuteczniejszych metod dostarczania terapii nerwu wzrokowego u pacjentów z nerwiakowłókniakowatością typu 1. Nasz protokół koncentruje się na badaniu lepszych technik dostępu do nerwu wzrokowego szczura w celu przeprowadzenia badań eksperymentalnych. Protokół ten ma tę zaletę, że jest minimalnie inwazyjny, eliminując potrzebę nacięcia skóry.[Demonstrator] Na początek chwyć spojówkę w kwadrancie dolno-skroniowym za pomocą kleszczy zębatych. Użyj nożyczek Westcotta, aby wykonać promieniowe nacięcie spojówki, a następnie otwórz powięź ścięgien w kwadrancie dziobowo-nosowym. Użyj cięcia, aby usunąć leżącą nad nim tkankę oczodołu. Obróć oko nosowo za pomocą kleszczy zębatych. Poproś asystenta, aby włożył hak rdzenia kręgowego do kwadrantu dolno-skroniowego, aby odizolować nerw wzrokowy. Za pomocą wypreparowania za pomocą kleszczy lub aplikatora z bawełnianą końcówką usuń pozostałą tkankę oczodołu i powięź ścięgien, aby odsłonić nerw wzrokowy i osłonkę. Za pomocą igły o rozmiarze 33 podłączonej do strzykawki o rozmiarze 10 mikrolitrów lub 1 mililitrów, przebij osłonkę nerwu wzrokowego. Wstrzyknij różne stężenia wirusa związanego z adenowirusem EGFP lub barwnikiem atramentu indyjskiego do nerwu wzrokowego pod bezpośrednią wizualizacją, aby upewnić się, że materiał zostanie wstrzyknięty bezpośrednio do nerwu. Ponownie przybliż spojówkę do rąbka, aby pokryć miejsce nacięcia. Rysunek ten ilustruje wyniki udanego i nieudanego dostarczania wirusa EGFP związanego z adenowirusem do nerwu wzrokowego szczura przy użyciu techniki wstrzyknięcia przezspojówkowego. Udana iniekcja nerwu wzrokowego spowodowała rozległy zielony sygnał fluorescencyjny w tkance nerwowej, co wskazuje na skuteczną penetrację wektora EGFP wirusa związanego z adenowirusem. Nieudane wstrzyknięcie wykazało zielony sygnał tylko wzdłuż zewnętrznej krawędzi nerwu wzrokowego, co sugeruje, że materiał przeciekał i nie wchodził do tkanki nerwowej.

transconjunctival-approach-for-injection-into-the-rat-optic-nerve

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Iniekcja doszklistkowa jest powszechnie stosowaną techniką w badaniach nad naukami o widzeniu w kontekście chorób oczu lub jako metoda bezpośredniego zastosowania miejscowego leczenia. W tym filmie zaprezentowano protokół iniekcji doszklistkowej z użyciem strzykawki o pojemności 1ml z szklaną pipetą. Przedstawiono praktyczne wskazówki dotyczące unikania masywnych krwawień oraz uszkodzeń soczewki.

Iniekcja doplastycznej w głąb ciała szklistego w celu ustanowienia modelu chorób oczu

Przecięcie nerwu wzrokowego jest powszechnie stosowanym modelem uszkodzenia OUN u osobników dorosłych. Model ten jest idealny do przeprowadzania szeregu manipulacji eksperymentalnych, które oddziałują na siatkówkę w sposób globalny lub są skierowane bezpośrednio do uszkodzonej populacji neuronów komórek zwojowych siatkówki.

Metody manipulacji eksperymentalnych po przecięciu nerwu wzrokowego w ośrodkowym układzie nerwowym ssaków

Ten film pokazuje indukcję jaskry u znieczulonego szczura poprzez wstrzyknięcie hipertonicznego roztworu soli fizjologicznej do żyły nadtwardówkowej. Sól fizjologiczna dostaje się do siatki beleczkowej przez kanał Schlemma, powodując bliznowacenie tkanek, które blokuje odpływ cieczy wodnistej i podnosi ciśnienie wewnątrzgałkowe. Podwyższone ciśnienie uszkadza komórki zwojowe siatkówki, prowadząc do jaskry.

Technika wstrzykiwania hipertonicznego roztworu soli fizjologicznej do wywoływania jaskry u szczurów

Bezpośrednia iniekcja do nerwu wzrokowego szczura jest przydatna do badań regeneracyjnych. Demonstrujemy minimalnie inwazyjną technikę bezpośredniego wstrzykiwania do nerwu wzrokowego szczura, która nie wymaga otwierania czaszki. Dzięki tej metodzie powikłania chirurgiczne są zminimalizowane, a powrót do zdrowia jest szybszy.

Minimalnie inwazyjna technika wstrzykiwania do nerwu wzrokowego szczura

Poniższy raport opisuje, jak odtworzyć model gryzoni nietętniczej przedniej niedokrwiennej neuropatii nerwu wzrokowego (rNAION), używając odpowiednich parametrów barwnika, soczewki kontaktowej i lasera. Ujawniamy również odpowiednie kroki do oceny zmiany rNAION in vivo.

Model gryzoni nonartericznej przedniej niedokrwiennej neuropatii nerwu wzrokowego (rNAION)

Zastrzyki podsiatkówkowe są najczęstszą techniką dostarczania dużych środków terapeutycznych, takich jak białka i wektory wirusowe, do fotoreceptorów i nabłonka barwnikowego siatkówki. Alternatywna metoda u myszy, która z powodzeniem celuje w przestrzeń podsiatkówkową z minimalnymi uszkodzeniami ubocznymi i krótkim czasem rekonwalescencji, jest opisana tutaj.

Alternatywna i zwalidowana metoda iniekcji umożliwiająca dostęp do przestrzeni podsiatkówkowej przez przeztwardówkowy dostęp tylny

Ten protokół ma na celu zademonstrowanie powtarzalnej drogi podawania dożylnego, która może być stosowana u szczurów i myszy przez cały okres noworodkowy. Procedura ta jest ważna dla przedklinicznych badań na gryzoniach, które mają na celu odzwierciedlenie podawania leków na oddziałach opieki neonatologicznej, głównie przy użyciu podawania dożylnego.

Model iniekcji żyły zaoczodołowej u noworodków gryzoni

Ten protokół opisuje technikę wstrzykiwania dokomorowego u szczurów za pomocą centralnego nacięcia rogówki i długiego tunelu do przedniej komory. Ta metoda iniekcji minimalizuje ryzyko wywołania niezamierzonego uszkodzenia tkanki, a tym samym poprawia precyzję i odtwarzalność.

Wstrzyknięcie dokomorowe u szczurów o niskim ryzyku wystąpienia działań niepożądanych

Ten artykuł opisuje metody iniekcji podsiatkówkowej u szczurów, wykorzystując śródoperacyjną wizualizację do kontrolowania zarówno miejsca wstrzyknięcia, jak i obszaru odwarstwienia siatkówki.

Śródoperacyjna wizualizacja wstrzyknięcia podsiatkówkowego i odwarstwienia siatkówki u szczurów

To badanie przedstawia metodologię dostarczania leków do siatkówki i nerwów wzrokowych dorosłego szczura. Dodatkowo wprowadzono unikalną metodę pobierania tkanek w celu odgórnego pobrania en bloc nerwu wzrokowego i siatkówki u dorosłego szczura.

Terapeutyczne dostarczanie do oczu i zaawansowane pobieranie tkanek u dorosłych szczurów

Poznaj minimalnie inwazyjną metodę przezspojówkowego wstrzyknięcia do nerwu wzrokowego szczura. Technika ta umożliwia bezpośrednią wizualizację podczas podawania terapii genowej w badaniach neurofibromatozy typu 1.

Podejście przezspojówkowe do wstrzyknięcia do nerwu wzrokowego szczura

Przeglądaj więcej filmów