Separacja i charakterystyka różnicowa pęcherzyków zewnątrzkomórkowych drobnoustrojów jelitowych u szczurów wrażliwych na sól w warunkach diety bogatej w sól

Badania te badają rolę pęcherzyków zewnątrzkomórkowych drobnoustrojów jelitowych u wrażliwych na sól szczurów z nadciśnieniem tętniczym na diecie bogatej w sól, badając, w jaki sposób dieta bogata w sól zmienia pęcherzyki i wpływa na interakcje nadciśnieniowe i immunologiczne. Ostatnie postępy w tej dziedzinie obejmują zrozumienie roli pęcherzyków zewnątrzkomórkowych drobnoustrojów jelitowych w nadciśnieniu, ocenę wpływu diety bogatej w sól na różnorodność mikrobiologiczną oraz wdrażanie interwencji roślinnych ukierunkowanych na pęcherzyki w wyniku regulacji metabolicznej i immunologicznej. Obecne wyzwania eksperymentalne obejmują izolowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych o wysokim priorytecie, odróżnianie pęcherzyków pochodnych od pęcherzyków mikrobiomu, minimalizowanie utraty próbki w standardowych protokołach barwienia w celu zapewnienia odtwarzalności we wszystkich badaniach. Ta siatka gęstości i protokół wirowania zapewniają wyższy priorytet pęcherzykom zewnątrzkomórkowym o lepszej integralności i odtwarzalności w porównaniu z tradycyjnymi metodami, umożliwiając bardziej wiarygodne badania mikrobiomu jelitowego pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w badaniach nadciśnienia.

[Narrator] Na początek przenieś pięć gramów kału do wstępnie zważonej 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Dodaj 50 mililitrów podgrzanego PBS wolnego od endotoksyn o temperaturze 37 stopni Celsjusza do probówki i obracaj probówkę przez 30 minut. Schłodzić wirówkę wysokoobrotową do 4 stopni Celsjusza. Następnie umieść próbkę symetrycznie w wirówce i wiruj z prędkością 8 000 G przez 15 minut. Po odwirowaniu odessać supernatant i przenieść go do nowej sterylnej probówki wirówkowej. Po ponownym odwirowaniu przez 15 minut, ostrożnie odessać supernatant i użyć go do dalszej analizy. Umieść sterylny filtr o średnicy 0.22 mikrometra na lodzie. Przenieś supernatant na górną część filtra i włącz pompę próżniową, aby zebrać przefiltrowane próbki. Przenieść filtrat do filtra odśrodkowego o odcięciu 10 kilodaltonów i pojemności 15 mililitrów. Wirować w temperaturze 4 stopni Celsjusza 3000G przez 30 minut, aby zagęścić próbkę do co najmniej 1,400 mikrolitrów. Natychmiast umieścić próbkę na lodzie. Zmieszać jedną objętość buforu gradientowego A z pięcioma objętościami pożywki o gradiencie gęstości, aby przygotować roztwór roboczy. Przygotować 10% roztwór jodiksanolu, mieszając jedną jednostkę roztworu roboczego z czterema jednostkami buforu B. Podobnie, zmieszać dwie jednostki roztworu roboczego z trzema jednostkami buforu B dla 20% roztworu jodiksanolu i czterema jednostkami roztworu roboczego z jedną jednostką buforu B dla 40% roztworu jodiksanolu. Teraz wymieszaj przygotowaną wcześniej zagęszczoną próbkę z siedmioma mililitrami podłoża o gradiencie gęstości, aby uzyskać 50% roztwór jodu. Aby przygotować gradient gęstości, dodaj roztwór błękitu trypanowego do 40% i 10% roztworów jodiksanolu. Przenieś osiem mililitrów 50% roztworu jodu, na dno cienkościennej probówki wirówkowej z polipropylenu. Przechyl rurkę do 70 stopni i przenieś osiem mililitrów 40% roztworu jodiksanolu na powierzchnię cieczy. Następnie dodaj osiem mililitrów 20% roztworu jodu, a następnie siedem mililitrów 10% roztworu jodiksanolu i dwa mililitry PBS wolnego od endotoksyn. Weź przygotowaną rurkę gradientu gęstości i umieść ją we wstępnie schłodzonej ultrawirówce. Ustaw parametry ultrawirowania na 100 000 G 20 godzin i 10 stopni Celsjusza i rozpocznij bieg. W przypadku ręcznej separacji gęstości gradientu dla kolekcji, gradient gęstości wynosi około 34 mililitry cieczy. Dwa mililitry roztworu są powoli ekstrahowane ze środka powierzchni cieczy, a każdy dwumililitrowy roztwór jest gradientem. Tak więc rozwiązanie gradientu gęstości jest podzielone na 17 gradientów. Na koniec, za pomocą pipety, przenieś frakcje gęstości do sterylnych probówek z próbkami i natychmiast umieść je na lodzie. Analiza śledzenia nanocząstek ujawniła profile wielkości, rozmieszczenia i stężenia pęcherzyków zewnątrzkomórkowych zebranych z różnych frakcji gradientu gęstości. Większość pęcherzyków zewnątrzkomórkowych we wszystkich frakcjach była skoncentrowana w zakresie wielkości od 30 do 100 nanometrów zgodnie z typowym wzorcem rozmieszczenia. Stężenie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych osiągnęło najwyższy poziom we frakcji dziewiątej, osiągając szczyt około 3,85 razy 10 do mocy dziewięciu cząstek na mililitr. Zawartość białka, mierzona za pomocą zestawu kwasu bicinchoninowego, była również najwyższa we frakcji dziewiątej i wynosiła 0,417 mikrograma na mikrolitr. Dodatkowo poziomy ekspresji lipopolisacharydów, określone za pomocą zestawu do wykrywania endotoksyn, były znacznie podwyższone we frakcjach 9 i 10. Większe ilości białka zaobserwowano również we frakcji dziewiątej podczas analizy elektroforezy w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu. Transmisyjna mikroskopia elektronowa lub obrazy TEM ujawniły pęcherzyki zewnątrzkomórkowe posiadające morfologię przypominającą błonę kołową.