Name: Separacja i charakterystyka różnicowa pęcherzyków zewnątrzkomórkowych drobnoustrojów jelitowych u szczurów wrażliwych na sól w warunkach diety bogatej w sól (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-06T15:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Poznaj izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych drobnoustrojów jelitowych u szczurów wrażliwych na sól przy diecie bogatej w sól. Metoda gradientu gęstości umożliwia analizę wielkości, morfologii i składu białkowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82205240), Fundację Nauk Przyrodniczych Prowincji Syczuan (2025ZNSFSC1836) oraz Podstawowy Projekt Kliniczny Prowincjonalnego Szpitala Ortopedycznego w Syczuanie (PY202414).

To eksperymentalne badanie na zwierzętach jest zgodne z odpowiednimi wytycznymi etycznymi i międzynarodowymi standardami. Badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Dobrostanu i Etyki Zwierząt Laboratoryjnych Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Chengdu (instytucja: Uniwersytet Medycyny Chińskiej w Chengdu; numer protokołu: 2018-21).
1. Przygotowanie zwierząt i reżim żywieniowy
<ol>
	<li>Aklimatyzować 6-tygodniowe samce szczurów wrażliwych na sól Dahla, o masie ciała 180-200 g, poprzez hodowlę w wilgotności 50% ± 10%; 12 godzin / 12 godzin cyklu świetlnego; 20,0 ± 2,0 °C przez 1 tydzień w określonych warunkach wolnych od patogenów.</li>
	<li>Następnie podziel szczury równo na dwie grupy (n = 6). Zapewnij każdej grupie inną dietę, która trwa 6 tygodni: normalną dietę solną (NSD) z 0,5% chlorkiem sodu i HSD z 8% chlorkiem sodu, która jest powszechnie stosowana w opublikowanych badaniach29,30,31. Myszy miały nieograniczony dostęp do jedzenia i wody przez cały czas trwania badania.</li>
</ol>
2. Monitorowanie ciśnienia krwi
UWAGA: Pletyzmografia mankietu ogonowego była używana jako nieinwazyjna metoda pomiaru ciśnienia krwi, a wolumetryczny zapis ciśnienia (VPR) był używany, gdy ciśnienie krwi było mierzone na podstawie objętości krwi w ogonie.
<ol>
	<li>Szczury należy umieszczać pojedynczo w małych klatkach z trocinami, podgrzewanych przez 10 minut w temperaturze około 37 °C i umieszczać w specjalnie zaprojektowanym układzie unieruchamiającym dla gryzoni z regulowanym nosem i drzwiami do wprowadzania zwierząt. Umieść szczury na poduszce grzewczej w pozycji leżącej, aby utrzymać temperaturę ich ciała na poziomie 37 °C.</li>
	<li>Podłącz czujnik VPR do dolnej części ogona i ustaw co najmniej 10 cykli adaptacyjnych, aby ustabilizować klasę BP<sup="xref">28.
	<ol>
		<li>Napełnij nadmuchiwany mankiet na nasadzie ogona i umieść czujnik pletyzmograficzny (lub czujnik fotoelektryczny) poniżej. Powoli napompuj do ciśnienia skurczowego powyżej (zwykle 200 mmHg), a następnie powoli zwolnij. Przyrząd automatycznie wykrywa wartość ciśnienia zaniku fali tętna (skurczowe ciśnienie krwi) i powrotu do zdrowia (rozkurczowe ciśnienie krwi). Zmierz 3-5 razy z rzędu i przyjmij wartość średnią.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeszkolić wszystkie szczury, aby dostosowały się do procedury krępowania i przeprowadzić to badanie w cichym laboratorium około 9 rano, aby zminimalizować skutki zmienności okołodobowej.</li>
	<li>Mierz skurczowe ciśnienie krwi (SBP) i rozkurczowe ciśnienie krwi (DBP) co drugi dzień przed ofiarą. Oszacować średnie ciśnienie tętnicze (MAP) z SBP i DBP 
	MAPA = (SBP + 2 DBP)/3</li>
</ol>
3. Wydobycie EV
<ol>
	<li>Pobieranie próbek
	<ol>
		<li>Zanurz sterylny bawełniany wacik w 75% alkoholu i użyj go do stymulacji odbytu szczura. Stymulacja miała na celu pobudzenie perystaltyki jelit i rozluźnienie zwieracza odbytu, a tym samym wspomaganie wypróżniania. Po wydaleniu kału należy go zebrać za pomocą sterylnych kleszczy do sterylnych pojemników o odpowiedniej wielkości i natychmiast przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie próbki
	<ol>
		<li>Za pomocą łyżki przenieś 5 g kału do wstępnie zważonej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Dodać 50 ml podgrzanego PBS o temperaturze 37 °C wolnego od endotoksyn (maksymalne stężenie próbki 10%) do probówki i obracać przez 30 minut. Schłodzić wirówkę wysokoobrotową do temperatury 4 °C.</li>
		<li>Wirować przy 8 000 x g przez 15 minut po symetrycznym umieszczeniu próbek, aby umożliwić zrównoważenie wirówki. Po odwirowaniu odessać supernatant i przenieść go do nowej sterylnej probówki wirówkowej.</li>
		<li>Ponownie odwirować przy 8 000 x g przez 15 minut. Odessać supernatant i użyć go do dalszej analizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie ekstraktu surowego
	<ol>
		<li>Użyj sterylnego filtra 0,22 μm. Umieść jednostkę filtrującą na lodzie i mocno przytrzymaj pompę próżniową. Przenieść otrzymany supernatant na wierzch filtra. Włącz pompę próżniową, aby zebrać przefiltrowane próbki.</li>
		<li>Przenieść filtrat do filtra odśrodkowego (10 kDa, 15 ml), odwirować w temperaturze 4 °C, 3 000 x g przez 30 minut i zagęścić próbkę do co najmniej 1400 μl.</li>
		<li>Zebrać zagęszczoną próbkę i, jeśli to konieczne, rozcieńczyć ją do 1400 μl, używając wstępnie schłodzonego, wolnego od endotoksyn PBS. Natychmiast po rozcieńczeniu próbkę należy przechowywać na lodzie. 
		UWAGA: Surowy ekstrakt może być natychmiast zużyty lub przechowywany w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Separacja pojazdów elektrycznych
	<ol>
		<li>Przygotuj bufor gradientu A i bufor gradientu B zgodnie z poniższym opisem. Przygotuj bufor z jednodniowym wyprzedzeniem, ponieważ całkowite rozpuszczenie związku zajmuje kilka godzin. Przygotowany bufor można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 6 miesięcy.
		<ol>
			<li>Przygotowanie buforu gradientowego A: Rozpuścić 0,25 M sacharozy, 6 mM EDTA i 60 mM Tris w 800 ml wody wolnej od endotoksyn za pomocą mieszadła magnetycznego, mieszając mieszadłem magnetycznym, przy pH dostosowanym do 7,4 za pomocą kwasu solnego. Rozcieńczyć do 1 l wodą wolną od endotoksyn. Użyj filtra butelkowego 0,22 μm, aby przefiltrować bufor.</li>
			<li>Przygotowanie buforu gradientowego B: Rozpuścić 0,25 M sacharozy, 1 mM EDTA i 10 mM Tris w 800 ml wody wolnej od endotoksyn za pomocą mieszadła magnetycznego, przy pH dostosowanym do 7,4 za pomocą kwasu solnego. Rozcieńczony do 1 l wodą wolną od endotoksyn. Użyj filtra butelkowego 0,22 μm, aby przefiltrować bufor.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zmieszać 1 objętość buforu gradientowego A i 5 objętości pożywki o gradiencie gęstości (podłoże to 60% roztwór jodiksanalu) w celu przygotowania roztworu roboczego.</li>
		<li>Przygotowanie roztworu jodiksanolu (10%, 20%, 40%): Aby przygotować 10% roztwór jodiksanolu, zmieszaj 1 jednostkę roztworu roboczego i 4 jednostki buforu B; aby uzyskać 20% roztwór jodiksanolu, zmieszaj 2 jednostki roztworu roboczego i 3 jednostki buforu B; Aby uzyskać 40% roztwór jodiksanolu, zmieszaj 4 jednostki roztworu roboczego i 1 jednostkę buforu B. Przygotuj każdy roztwór świeży i przechowuj na lodzie. 
UWAGA: Do każdego eksperymentu należy przygotować świeże roztwory robocze, a dodatkowe 10% objętości roztworów można przygotować w celu uwzględnienia błędu eksperymentalnego.</li>
		<li>Zmieszać roztwór przygotowany w kroku 3.3.3 z 7 ml pożywki o gradiencie gęstości, aby uzyskać 50% roztwór jodiksanolu.</li>
		<li>Aby przygotować gradient gęstości, dodaj roztwór błękitu trypanowego do 40% roztworu i 10% (wag./obj.) roztworu jodiksanolu, aby uzyskać wyraźny zarys między różnymi warstwami.</li>
		<li>Przenieść 8 ml 50% roztworu jodu na dno cienkościennej probówki wirówkowej z polipropylenu. Przechylić probówkę pod kątem 70° i przenieść 8 ml 40% roztworu jodixanolu na powierzchnię cieczy. Dodaj 8 ml 20% roztworu jodu, następnie 7 ml 10% roztworu jodiksanolu, a na koniec 2 ml wolnego od endotoksyn PBS. 
		UWAGA: Przygotowanie gradientu gęstości wymaga wprawy. Jakość gradientu gęstości ma duży wpływ na wyniki eksperymentów. Nie należy umieszczać rurki pionowo między różnymi etapami procesu dodawania, ponieważ wpływa to negatywnie na jakość gradientu gęstości.</li>
		<li>Wcześniej schłodzić wirówkę i umieścić przygotowany gradient gęstości w ultrawirówce. Parametry wejściowe do rozpoczęcia, wartości parametrów: 100 000 x g, 20 h, 10 °C.</li>
		<li>W przypadku ręcznego rozdzielania gęstości w gradiacji należy powoli pobrać 2 ml roztworu ze środka powierzchni układu zawierającego łącznie 34 ml cieczy. Każde 2 ml to gradient, dzieląc w ten sposób roztwór gradientu gęstości na 17 gradientów.</li>
		<li>Przenieść frakcje gęstości do sterylnej probówki z próbką za pomocą pipety i natychmiast umieścić je na lodzie. Clamp probówkę wirówkową między kciukiem a palcem wskazującym, aby upewnić się, że pozostaje w pozycji pionowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odzysk pojazdów elektrycznych
	<ol>
		<li>Korzystając z w pełni zautomatyzowanego systemu ekstrakcji pojazdów elektrycznych, który stosuje oscylacje podciśnieniowe poprzez system oscylacji ultradźwiękowej z podwójnym sprzężeniem na chipie ultrafiltracyjnym, usuń kwasy nukleinowe i zanieczyszczenia białkowe w próbce przez nanopory i przechwyć EV, prowadząc do wzbogacenia i oczyszczenia EV.
		<ol>
			<li>Usuń filtrat z kroku 3.4.7 i dodaj go do chipa ultrafiltracyjnego.</li>
			<li>Uruchom urządzenie zgodnie z instrukcją urządzenia i zbierz przefiltrowany filtrat, a mianowicie roztwór wzbogacony egzosomem. Główny proces jest pokazany w Rysunek 1.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Identyfikacja EV
<ol>
	<li>Wykrywanie wielkości i stężenia cząstek
	<ol>
		<li>Oceń rozkład wielkości i potencjał zeta za pomocą licznika nanokulometru opartego na rezystancyjnym czujniku impulsów (RPS). Do tego eksperymentu wybierz chipy nanoporowe o zakresie pomiarowym 60-200 nm. Następnie oceń rozkład wielkości cząstek i potencjał zeta EV za pomocą licznika nanobiblioteki.
		<ol>
			<li>Weź odpowiednią ilość roztworu EVs i rozcieńcz go w (1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000).</li>
			<li>Na przyrząd do testów umieszczono różne rozcieńczenia roztworów EV.</li>
			<li>Wielokrotność rozcieńczenia o lepszej stabilności została wybrana i ponownie przetestowana w celu uzyskania dokładniejszych danych.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test LPS i BCA
	<ol>
		<li>Test BCA: Lizuj EV za pomocą buforu RIPA, a następnie oddziel białka. Określ zawartość białka w EV za pomocą zestawu do oznaczania stężenia białka BCA.</li>
		<li>Test LPS: Korzystając z zestawu do wykrywania endotoksyn, dodaj próbki, detektor endotoksyn i chromogenne zgodnie z krokami zestawu. Zmierzyć absorbancję przy 545 nm i obliczyć ekspresję LPS pęcherzyków zewnętrznych zgodnie z krzywą wzorcową.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena TEM: W celu barwienia ujemnego i analizy TEM należy nanieść próbki na luminescencyjną miedzianą kratkę pokrytą ciągłą folią węglową i zabarwić 0,75% mrówczanem uranylu. W przypadku cryo-EM należy zaabsorbować pojazdy elektryczne w siatkę węglową EM o oczkach 300 z hydrofilową powierzchnią i zamrozić w ciekłym azocie. Obserwuj i analizuj siatki za pomocą Cryo-TEM i rejestruj obrazy w powiększeniach 22 00032.</li>
	<li>Charakterystyka białek: Lizuje EV za pomocą buforu RIPA, a następnie oddziela białka. Określ stężenie białka za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA, oddziel równe ilości białka z każdej próbki za pomocą SDS-PAGE i wybarwić roztworem niebieskiego barwnika Coomassie po elektroforezie, aby uwidocznić profile białek33,34.</li>
	<li>Sekwencjonowanie i analiza S: Ekstrakcja genomowego DNA z próbek kału za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA kału. Ocenić integralność i stężenie DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym i spektrofotometru. Amplifikuj region V3 - V4 genu 16S rRNA za pomocą uniwersalnych starterów, oczyść produkty PCR, określ je ilościowo i zsekwencjonuj na platformie Illumina. Przeprowadź analizę danych przy użyciu potoku QIIME235.
	<ol>
		<li>Klasyfikuj warianty sekwencji amplikonów (ASV) za pomocą DADA2 i dopasuj do bazy danych Silva za pomocą algorytmu VSEARCH. Analiza różnorodności α służy do oceny bogactwa i różnorodności gatunków w próbkach, głównie przy użyciu wskaźników, takich jak indeks Shannona i indeks Chao1. Analiza różnorodności β polega na porównaniu składu zbiorowiska drobnoustrojów między próbkami i jest zwykle wizualizowana za pomocą analizy współrzędnych głównych (PCoA). Wykorzystanie metod analizy różnicowej, takich jak liniowa analiza dyskryminacyjna wielkości efektu (LEfSe) i analiza wykresu wulkanicznego, w celu zidentyfikowania taksonów drobnoustrojów o znacznie różniących się warunkach lub między grupami.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Thursby, E., Juge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+the+human+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Introduction to the human gut microbiota.</a> Biochem J. 474 (11), 1823-1836 (2017).</li>
<li>Aschtgen, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotation+of+Vibrio+fischeri+Flagella+Produces+Outer+Membrane+Vesicles+That+Induce+Host+Development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Rotation of Vibrio fischeri Flagella Produces Outer Membrane Vesicles That Induce Host Development.</a> J Bacteriol. 198 (16), 2156-2165 (2016).</li>
<li>Gurung, S., Perocheau, D., Touramanidou, L., Baruteau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exosome+journey%3A+from+biogenesis+to+uptake+and+intracellular+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Comm+Signal%22%5BJournal%5D)">The exosome journey: from biogenesis to uptake and intracellular signalling.</a> Cell Comm Signal. 19 (1), 47(2021).</li>
<li>Avila-Calderón, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+Membrane+Vesicles+of+Gram-Negative+Bacteria%3A+An+Outlook+on+Biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Outer Membrane Vesicles of Gram-Negative Bacteria: An Outlook on Biogenesis.</a> Front Microbiol. 12, 557902(2021).</li>
<li>Melo-Marques, I., Cardoso, S. M., Empadinhas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+extracellular+vesicles+at+the+interface+of+gut+microbiota+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Bacterial extracellular vesicles at the interface of gut microbiota and immunity.</a> Gut Microbes. 16 (1), 2396494(2024).</li>
<li>Kim, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+gut+microbiota-derived+metabolites+and+extracellular+vesicles+on+neurodegenerative+disease+in+a+gut-brain+axis+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Converg%22%5BJournal%5D)">Effect of gut microbiota-derived metabolites and extracellular vesicles on neurodegenerative disease in a gut-brain axis chip.</a> Nano Converg. 11 (1), 7(2024).</li>
<li>Ahmadi Badi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiota-Derived+Extracellular+Vesicles+as+New+Systemic+Regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microbiota-Derived Extracellular Vesicles as New Systemic Regulators.</a> Front Microbiol. 8, 1610(2017).</li>
<li>Barathan, M., Ng, S. L., Lokanathan, Y., Ng, M. H., Law, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Profound+Influence+of+Gut+Microbiome+and+Extracellular+Vesicles+on+Animal+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">The Profound Influence of Gut Microbiome and Extracellular Vesicles on Animal Health and Disease.</a> Int J Mol Sci. 25 (7), 4024(2024).</li>
<li>Maukonen, J., Saarela, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gut+microbiota%3A+does+diet+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nutri+Soc%22%5BJournal%5D)">Human gut microbiota: does diet matter.</a> Proc Nutri Soc. 74 (1), 23-36 (2015).</li>
<li>Bier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High+Salt+Diet+Modulates+the+Gut+Microbiota+and+Short+Chain+Fatty+Acids+Production+in+a+Salt-Sensitive+Hypertension+Rat+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">A High Salt Diet Modulates the Gut Microbiota and Short Chain Fatty Acids Production in a Salt-Sensitive Hypertension Rat Model.</a> Nutrients. 10 (9), 1154(2018).</li>
<li>Aghamohammad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+and+immunomodulatory+effects+of+Lactobacillus+spp.+as+a+preservative+and+therapeutic+agent+for+IBD+control%5BTitle%5D)+AND+%22Immun+Inflamm+Dis%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory and immunomodulatory effects of Lactobacillus spp. as a preservative and therapeutic agent for IBD control.</a> Immun Inflamm Dis. 10 (6), e635(2022).</li>
<li>Dong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effects+of+High-Salt+Gastric+Intake+on+the+Composition+of+the+Intestinal+Microbiota+in+Wistar+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Sci+Monit%22%5BJournal%5D)">The Effects of High-Salt Gastric Intake on the Composition of the Intestinal Microbiota in Wistar Rats.</a> Med Sci Monit. 26, e922160(2020).</li>
<li>Yan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+Flora+Modulates+Blood+Pressure+by+Regulating+the+Synthesis+of+Intestinal-Derived+Corticosterone+in+High+Salt-Induced+Hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Intestinal Flora Modulates Blood Pressure by Regulating the Synthesis of Intestinal-Derived Corticosterone in High Salt-Induced Hypertension.</a> Circ Res. 126 (7), 839-853 (2020).</li>
<li>Wang, X., Lang, F., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Salt+Diet+and+Intestinal+Microbiota%3A+Influence+on+Cardiovascular+Disease+and+Inflammatory+Bowel+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">High-Salt Diet and Intestinal Microbiota: Influence on Cardiovascular Disease and Inflammatory Bowel Disease.</a> Biology. 13 (9), 674(2024).</li>
<li>Qi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiome-metabolome+analysis+insight+into+the+effects+of+high-salt+diet+on+hemorheological+functions+in+SD+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Nutri%22%5BJournal%5D)">Microbiome-metabolome analysis insight into the effects of high-salt diet on hemorheological functions in SD rats.</a> Front Nutri. 11, 1408778(2024).</li>
<li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+unique+roles+of+extracellular+vesicles+for+gut+health+modulation%3A+Mechanisms%2C+challenges%2C+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Res+Microb+Sci%22%5BJournal%5D)">Insights into the unique roles of extracellular vesicles for gut health modulation: Mechanisms, challenges, and perspectives.</a> Curr Res Microb Sci. 7, 100301(2024).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+bacterial+extracellular+vesicles+derived+from+oral+and+gastrointestinal+pathogens+on+systemic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of bacterial extracellular vesicles derived from oral and gastrointestinal pathogens on systemic diseases.</a> Microbiol Res. 285, 127788(2024).</li>
<li>Wang, H. X., Wang, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+Microbiota-brain+Axis%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Med+J%22%5BJournal%5D)">Gut Microbiota-brain Axis.</a> Chinese Med J. 129 (19), 2373-2380 (2016).</li>
<li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cross-tissue+transcriptome+association+study+identifies+key+genes+in+essential+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">A cross-tissue transcriptome association study identifies key genes in essential hypertension.</a> Front Genet. 14, 1114174(2023).</li>
<li>Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+DNA+Enrichment+Promotes+Adrenomedullary+Inflammation%2C+Catecholamine+Secretion%2C+and+Hypertension+in+Obese+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Heart+Assoc%22%5BJournal%5D)">Microbial DNA Enrichment Promotes Adrenomedullary Inflammation, Catecholamine Secretion, and Hypertension in Obese Mice.</a> J Am Heart Assoc. 11 (4), e024561(2022).</li>
<li>Chen, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChen%2C+P+%22Gut+Microbiota+and+Pathogenesis+of+Organ+Injury%22">Gut Microbiota and Pathogenesis of Organ Injury</a>. , Springer. Singapore. (2020).</li>
<li>Xie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hPSCs-derived+brain+organoids+for+disease+modeling%2C+toxicity+testing+and+drug+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">hPSCs-derived brain organoids for disease modeling, toxicity testing and drug evaluation.</a> Exp Neurol. 385, 115110(2024).</li>
<li>Liu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+underlying+mechanisms+of+DNA+methylation+in+high+salt+memory+in+hypertensive+vascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The underlying mechanisms of DNA methylation in high salt memory in hypertensive vascular disease.</a> Sci Rep. 14 (1), 925(2024).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wheat+%CE%B2-glucan+reduces+obesity+and+hyperlipidemia+in+mice+with+high-fat+and+high-salt+diet+by+regulating+intestinal+flora%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Macromol%22%5BJournal%5D)">Wheat β-glucan reduces obesity and hyperlipidemia in mice with high-fat and high-salt diet by regulating intestinal flora.</a> Int J Biol Macromol. 288, 138754(2024).</li>
<li>Kerem, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+intestinal+microbiota+composition+altered+in+obesity-T2DM+mice+with+high+salt+fed%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Small intestinal microbiota composition altered in obesity-T2DM mice with high salt fed.</a> Sci Rep. 13 (1), 8256(2023).</li>
<li>Díez-Sainz, E., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Lorente-Cebrián, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+gut+microbiota-derived+extracellular+vesicles+on+obesity+and+diabetes+and+their+potential+modulation+through+diet%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Effects of gut microbiota-derived extracellular vesicles on obesity and diabetes and their potential modulation through diet.</a> J Physiol Biochem. 78 (2), 485-499 (2022).</li>
<li>Wu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liuzijue+training+improves+hypertension+and+modulates+gut+microbiota+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Liuzijue training improves hypertension and modulates gut microbiota profile.</a> Front Cardiovasc Med. 10, 1075084(2023).</li>
<li>Qi, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salvia+miltiorrhiza+bunge+extract+improves+the+Th17%2FTreg+imbalance+and+modulates+gut+microbiota+of+hypertensive+rats+induced+by+high-salt+diet%5BTitle%5D)+AND+%22J+Funct+Foods%22%5BJournal%5D)">Salvia miltiorrhiza bunge extract improves the Th17/Treg imbalance and modulates gut microbiota of hypertensive rats induced by high-salt diet.</a> J Funct Foods. 117, 106211(2024).</li>
<li>Wilck, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salt-responsive+gut+commensal+modulates+T%28H%2917+axis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Salt-responsive gut commensal modulates T(H)17 axis and disease.</a> Nature. 551 (7682), 585-589 (2017).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+Gastrin%2FCCKBR+%28Cholecystokinin+B+Receptor%29+Ameliorates+Salt-Sensitive+Hypertension+by+Inhibiting+Intestinal+Na%28%2B%29%2FH%28%2B%29+Exchanger+3+Activity+Through+a+PKC+%28Protein+Kinase+C%29-Mediated+NHERF1+and+NHERF2+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Intestinal Gastrin/CCKBR (Cholecystokinin B Receptor) Ameliorates Salt-Sensitive Hypertension by Inhibiting Intestinal Na(+)/H(+) Exchanger 3 Activity Through a PKC (Protein Kinase C)-Mediated NHERF1 and NHERF2 Pathway.</a> Hypertension. 79 (8), 1668-1679 (2022).</li>
<li>Zheng, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertension+of+liver-yang+hyperactivity+syndrome+induced+by+a+high+salt+diet+by+altering+components+of+the+gut+microbiota+associated+with+the+glutamate%2FGABA-glutamine+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Nutr%22%5BJournal%5D)">Hypertension of liver-yang hyperactivity syndrome induced by a high salt diet by altering components of the gut microbiota associated with the glutamate/GABA-glutamine cycle.</a> Front Nutr. 9, 964273(2022).</li>
<li>Mulligan, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+TEM+Specimen+Preparation+and+Analysis+of+Plasmonic+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Microanal%22%5BJournal%5D)">Multiplexed TEM Specimen Preparation and Analysis of Plasmonic Nanoparticles.</a> Microsc Microanal. 21 (4), 1017-1025 (2015).</li>
<li>Olson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+for+Determination+of+Protein+Concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Assays for Determination of Protein Concentration.</a> Curr Protoc Pharmacol. 73, A.3a.1-a.3a.32 (2016).</li>
<li>Matsumoto, H., Haniu, H., Komori, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Protein+Molecular+Weights+on+SDS-PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Determination of Protein Molecular Weights on SDS-PAGE.</a> Methods Mol Biol. 1855, 101-105 (2019).</li>
<li>Sanschagrin, S., Yergeau, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+Sequencing+of+16S+Ribosomal+RNA+Gene+Amplicons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons.</a> J Vis Exp. (90), e51709(2014).</li>
<li>Tulkens, J., De Wever, O., Hendrix, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+bacterial+extracellular+vesicles+in+human+body+fluids+by+orthogonal+biophysical+separation+and+biochemical+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analyzing bacterial extracellular vesicles in human body fluids by orthogonal biophysical separation and biochemical characterization.</a> Nat Protoc. 15 (1), 40-67 (2020).</li>
<li>Ruhal, R., Kataria, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+patterns+in+gram-positive+and+gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Res%22%5BJournal%5D)">Biofilm patterns in gram-positive and gram-negative bacteria.</a> Microbiol Res. 251, 126829(2021).</li>
<li>Maldonado, R. F., Sá-Correia, I., Valvano, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+modification+in+Gram-negative+bacteria+during+chronic+infection%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbio+Rev%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide modification in Gram-negative bacteria during chronic infection.</a> FEMS Microbio Rev. 40 (4), 480-493 (2016).</li>
<li>Honda, K., Littman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbiota+in+adaptive+immune+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The microbiota in adaptive immune homeostasis and disease.</a> Nature. 535 (7610), 75-84 (2016).</li>
<li>Guzik, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+T+cell+in+the+genesis+of+angiotensin+II+induced+hypertension+and+vascular+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction.</a> J Exp Med. 204 (10), 2449-2460 (2007).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+a+novel+mediator+of+interkingdom+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as a novel mediator of interkingdom communication.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 73, 173-184 (2023).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alleviation+of+colitis+by+honeysuckle+MIR2911+via+direct+regulation+of+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Alleviation of colitis by honeysuckle MIR2911 via direct regulation of gut microbiota.</a> J Control Release. 376, 123-137 (2024).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie są im znane żadne konkurencyjne interesy finansowe ani powiązania osobiste, które mogłyby mieć wpływ na pracę opisaną w tym artykule.

W tym badaniu skupiliśmy się na EV mikrobioty jelitowej u wrażliwych na sól szczurów z HSD i osiągnęliśmy szereg kluczowych osiągnięć. Po pierwsze, udało się opracować wydajną metodę ekstrakcji opartą na wirowaniu w gradionym gradiencie gęstości w celu wyizolowania EV z wrażliwej na sól mikroflory jelitowej szczura na HSD, a większość składników innych niż EV wyizolowano za pomocą skrupulatnego, ustandaryzowanego procesu eksperymentalnej manipulacji na zwierzętach i przetwarzania próbek. Metoda ekstrakcji EVs wirowania w...

Mikrobiota jelitowa, znana również jako mikroflora mikrobioty jelitowej lub mikroekologia jelitowa, to kompleks dziesiątek tysięcy mikroorganizmów zlokalizowanych w biologicznym przewodzie pokarmowym i odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu zdrowia ludzkiego1. W ostatnich latach, dzięki dalszym badaniom, stwierdzono, że mikrobiota jelitowa może wytwarzać pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs)2. EV to małe pęcherzyki uwalniane przez komórki, które przenoszą różne cząsteczki w komórce, takie jak białka, kwasy nukleinowe i lipidy3,4. Mogą wchodzić w interakcje z innymi drobnoustrojami5, komórkami nabłonka jelitowego, a nawet odległymi tkankami i narządami6, wpływając w ten sposób na zdrowie ludzkiego ciała7,8. Istnieje ścisły związek między EV wytwarzanymi przez mikrobiotę jelitową a dietą9.
EV wytwarzane przez mikrobiotę jelitową mogą być istotnymi czynnikami, dzięki którym dieta o wysokiej zawartości soli (HSD) wpływa na zdrowie organizmu. HSD nie tylko bezpośrednio zaburza równowagę mikrobioty jelitowej10, prowadząc do znacznego zmniejszenia liczby pożytecznych bakterii (takich jak Lactobacillus)11, ale także sprzyja namnażaniu się szkodliwych bakterii (takich jak Bacteroides itp.)12. Ta nierównowaga zmniejsza funkcję bariery jelitowej i zwiększa ryzyko zapalenia jelit. Ponadto HSD dodatkowo wpływa na równowagę kwasowo-zasadową i wchłanianie składników odżywczych w jelicie, zmieniając aktywność metaboliczną 13 mikrobioty jelitowej, np. zmniejszając produkcję krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych14,15 z wieloma funkcjami fizjologicznymi.
Te zmiany nie tylko wpływają na zdrowie jelit, ale mogą również pośrednio regulować produkcję i uwalnianie EV oraz zmieniać skład i funkcję EV. Środowisko o wysokiej zawartości soli może wpływać na normalne funkcje fizjologiczne komórek jelitowych, w tym na uwalnianie i transport EV, zaburzając w ten sposób rolę EV w międzykomórkowym przekazywaniu informacji i regulacji immunologicznej. W tym samym czasie zapalenie jelit może sprzyjać różnym EV o specjalnych funkcjach16 i rozprzestrzeniać się na całe ciało przez oś jelitowo-narządową i w inny sposób17,18, co jest ściśle związane z występowaniem i rozwojem nadciśnienia tętniczego19,20, sercowo-naczyniowe21 i choroby naczyń mózgowych22,23, otyłość24,25, cukrzyca<klasa sup='xref'>26 i inne choroby przewlekłe.
Dlatego ogólnym celem tego badania było opracowanie efektywnej i niezawodnej metody ekstrakcji EVs z mikrobioty jelitowej wrażliwych na sól szczurów karmionych HSD oraz systematyczne badanie ich właściwości fizycznych, składu i funkcji. Ze względu na cechy znacznego wzrostu ciśnienia krwi po diecie bogatej w sól, wybrano szczury wrażliwe na sól, które ujawniły wpływ HSD na mikrobiotę jelitową EV poprzez skonstruowanie skutecznej metody ekstrakcji. Metoda opierała się na wirowaniu w gradiencie gęstości i łączyła różne techniki identyfikacji dynamicznej, takie jak wykrywanie wielkości cząstek, pomiar LPS/BCA, transmisyjna mikroskopia elektronowa i analiza proteomiczna. Protokół ma na celu ujawnienie wpływu HSD na mikrobiotę jelitową EV i jej mechanizmy w chorobach sercowo-naczyniowych. Dzięki wysokiej skuteczności, powtarzalności i szerokiemu zastosowaniu, podejście to nie tylko stanowi ważne narzędzie do badania mechanizmu EV mikrobioty jelitowej w nadciśnieniu wywołanym solą, ale także stanowi teoretyczne podstawy do opracowania strategii interwencji w chorobie opartych na EV. Mamy nadzieję, że dzięki temu badaniu otworzymy nowe możliwości zapobiegania i leczenia chorób sercowo-naczyniowych, takich jak nadciśnienie27,28.

<table><tbody><tr><td>Essential Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy (10nkDa 2 mL)</td>Wirówka do <td>UFC903096</td><td></td> <td>Millipore</td></tr><tr><td>Tude(50 mL)</td>Wirówka <td>20220404</td><td></td> <td>BKMAN</td></tr><tr><td>Tudes</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>Z30815SCA</td><td></td></tr><tr><td>System filtracji próżniowej</td><td>Biosharp</td><td>24902581</td><td></td></tr><tr><td>Reodczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chromogenic LAL Endotoxin</td> Assay Kit <td>Beyotime</td><td>022124240705</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blue Fast Staining Solution</td><td>Beyotime</td><td>Z972241010</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Damas-beta</td><td>P3117308</td><td></td></tr><tr><td>Ulepszony zestaw do oznaczania białek BCA</td><td>Beyotime</td><td>A006241112</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>KESH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep (60% wag./obj., jodiksanol)</td><td>Serumwerk</td><td>00124</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Labshark</td><td>130114005</td><td></td></tr><tr><td>kwas fosfowolframowy</td><td>RUIXIN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Damas-beta</td><td>P1917057</td><td></td></tr><tr><td>Tris (VWR)</td><td>Damas-beta</td><td>P3061764</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór barwiący błękit trypanowy (0,4%)</td><td>Beyotime</td><td>BD07242904</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Absorbance Microplate Reader</td><td>Biomikroskop SpectraMax</td><td>ABP01690</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Motic</td><td>BA210Cyfrowa</td><td></td></tr><tr><td>wirówka biurkowa</td><td>Cence</td><td>CHT210R</td><td></td></tr><tr><td>Desktop szybkoobrotowa mikrowirówka</td><td>DLAB</td><td>D3024</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiowy wirnik o stałym kącie nachylenia + kubek odśrodkowy 500 ml</td><td>Cence</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Precyzyjna waga elektroniczna</td><td>SKR</td><td>BN-200</td><td></td></tr><tr><td>Komora z przepływem laminarnym</td><td>Nantong Hunan Scientific Instrument Co., Ltd.</td><td>SW-CJ-2FDS</td><td></td></tr><tr><td>SW 32.1 Ti Łyżka obrotowa obrotowa+ SW 32.1 Ti Łyżka wirnika</td><td>BECKMAN COULTER</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy</td><td>JEOL</td><td>JEM-1400FLASH</td><td></td></tr><tr><td>Rotator</td><td></td><td></td><td></td>rurowy</tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>Optima XE-100</td><td></td></tr><tr><td>System wody ultraczystej</td><td>ULPHW</td><td>UPR-II-15TNZ</td><td></td></tr><tr><td>Wielofunkcyjna pompa próżniowa z wodą</td><td>Qiang Qiang</td><td>SHZ-D(III)</td><td></td></tr></tbody></table>

separacja i charakterystyka różnicowa pęcherzyków zewnątrzkomórkowych drobnoustrojów jelitowych u szczurów wrażliwych na sól w warunkach diety bogatej w sól

Separation and Differential Characterization of Gut Microbial Extracellular Vesicles in Salt-Sensitive Rats under High-Salt Diet Conditions

Wysokie spożycie soli jest głównym czynnikiem ryzyka nadciśnienia, a jego mechanizm leżący u jego podstaw może być ściśle związany z pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi (EV) wydzielanymi przez mikrobiotę jelitową. Te EV, wytwarzane przez mikrobiotę jelitową, zawierają różne składniki bioaktywne, które mogą odgrywać kluczową rolę w rozwoju nadciśnienia indukowanego przez dietę bogatą w sól (HSD). Aby zbadać ten mechanizm, opracowaliśmy skuteczną metodę ekstrakcji opartą na wirowaniu w gradifikacji gęstości w celu wyizolowania EV z mikrobioty jelitowej wrażliwych na sól szczurów karmionych HSD. Dzięki analizie wielkości cząstek, transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) i wykrywaniu lipopolisacharydów (LPS) zidentyfikowaliśmy rozkład gradientu EV mikrobioty jelitowej i uzyskaliśmy precyzyjną ekstrakcję. Ponadto sekwencjonowanie genu 16S rRNA wykorzystano do analizy różnic w pochodzeniu i składzie EV między grupą normalną a grupą HSD, ujawniając wpływ wysokiego spożycia soli na cechy genetyczne EV mikrobioty jelitowej. Badanie to dostarcza cennych narzędzi i informacji naukowych na temat mechanizmów mikrobioty jelitowej leżących u podstaw nadciśnienia wywołanego solą i oferuje nowe perspektywy w zakresie zapobiegania i leczenia chorób pokrewnych.

Stężenia EV określono w różnych frakcjach (Rysunek 2A). Wyniki eksperymentalne wykazały, że stężenie EV wykazywało typowy wzorzec rozkładu normalnego w serii roztworów gradientu gęstości (Rysunek 2B). W szczególności we frakcji 9 stężenie EV osiągnęło najwyższą wartość (3,85 x 109), co sugeruje, że główną frakcją rozkładu EV może być frakcja 936.
W celu oznaczenia zawartości białka wykorzystano zesta...

Protokół opisuje izolację mikrobiologicznych EV jelitowych od wrażliwych na sól szczurów karmionych HSD za pomocą wirowania w gradiacji gęstości. EV scharakteryzowano za pomocą śledzenia nanocząstek, testów TEM, LPS/BCA i sekwencjonowania 16S rRNA w celu analizy wielkości, morfologii, składu i pochodzenia mikrobioty.

Separacja i charakterystyka różnicowa pęcherzyków zewnątrzkomórkowych drobnoustrojów jelitowych u szczurów wrażliwych na sól w warunkach diety bogatej w sól

High salt intake is a major risk factor for hypertension, and its underlying mechanism may be closely linked to extracellular vesicles (EVs) secreted by ...

Badania te badają rolę pęcherzyków zewnątrzkomórkowych drobnoustrojów jelitowych u wrażliwych na sól szczurów z nadciśnieniem tętniczym na diecie bogatej w sól, badając, w jaki sposób dieta bogata w sól zmienia pęcherzyki i wpływa na interakcje nadciśnieniowe i immunologiczne. Ostatnie postępy w tej dziedzinie obejmują zrozumienie roli pęcherzyków zewnątrzkomórkowych drobnoustrojów jelitowych w nadciśnieniu, ocenę wpływu diety bogatej w sól na różnorodność mikrobiologiczną oraz wdrażanie interwencji roślinnych ukierunkowanych na pęcherzyki w wyniku regulacji metabolicznej i immunologicznej. Obecne wyzwania eksperymentalne obejmują izolowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych o wysokim priorytecie, odróżnianie pęcherzyków pochodnych od pęcherzyków mikrobiomu, minimalizowanie utraty próbki w standardowych protokołach barwienia w celu zapewnienia odtwarzalności we wszystkich badaniach. Ta siatka gęstości i protokół wirowania zapewniają wyższy priorytet pęcherzykom zewnątrzkomórkowym o lepszej integralności i odtwarzalności w porównaniu z tradycyjnymi metodami, umożliwiając bardziej wiarygodne badania mikrobiomu jelitowego pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w badaniach nadciśnienia.[Narrator] Na początek przenieś pięć gramów kału do wstępnie zważonej 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Dodaj 50 mililitrów podgrzanego PBS wolnego od endotoksyn o temperaturze 37 stopni Celsjusza do probówki i obracaj probówkę przez 30 minut. Schłodzić wirówkę wysokoobrotową do 4 stopni Celsjusza. Następnie umieść próbkę symetrycznie w wirówce i wiruj z prędkością 8 000 G przez 15 minut. Po odwirowaniu odessać supernatant i przenieść go do nowej sterylnej probówki wirówkowej. Po ponownym odwirowaniu przez 15 minut, ostrożnie odessać supernatant i użyć go do dalszej analizy. Umieść sterylny filtr o średnicy 0.22 mikrometra na lodzie. Przenieś supernatant na górną część filtra i włącz pompę próżniową, aby zebrać przefiltrowane próbki. Przenieść filtrat do filtra odśrodkowego o odcięciu 10 kilodaltonów i pojemności 15 mililitrów. Wirować w temperaturze 4 stopni Celsjusza 3000G przez 30 minut, aby zagęścić próbkę do co najmniej 1,400 mikrolitrów. Natychmiast umieścić próbkę na lodzie. Zmieszać jedną objętość buforu gradientowego A z pięcioma objętościami pożywki o gradiencie gęstości, aby przygotować roztwór roboczy. Przygotować 10% roztwór jodiksanolu, mieszając jedną jednostkę roztworu roboczego z czterema jednostkami buforu B. Podobnie, zmieszać dwie jednostki roztworu roboczego z trzema jednostkami buforu B dla 20% roztworu jodiksanolu i czterema jednostkami roztworu roboczego z jedną jednostką buforu B dla 40% roztworu jodiksanolu. Teraz wymieszaj przygotowaną wcześniej zagęszczoną próbkę z siedmioma mililitrami podłoża o gradiencie gęstości, aby uzyskać 50% roztwór jodu. Aby przygotować gradient gęstości, dodaj roztwór błękitu trypanowego do 40% i 10% roztworów jodiksanolu. Przenieś osiem mililitrów 50% roztworu jodu, na dno cienkościennej probówki wirówkowej z polipropylenu. Przechyl rurkę do 70 stopni i przenieś osiem mililitrów 40% roztworu jodiksanolu na powierzchnię cieczy. Następnie dodaj osiem mililitrów 20% roztworu jodu, a następnie siedem mililitrów 10% roztworu jodiksanolu i dwa mililitry PBS wolnego od endotoksyn. Weź przygotowaną rurkę gradientu gęstości i umieść ją we wstępnie schłodzonej ultrawirówce. Ustaw parametry ultrawirowania na 100 000 G 20 godzin i 10 stopni Celsjusza i rozpocznij bieg. W przypadku ręcznej separacji gęstości gradientu dla kolekcji, gradient gęstości wynosi około 34 mililitry cieczy. Dwa mililitry roztworu są powoli ekstrahowane ze środka powierzchni cieczy, a każdy dwumililitrowy roztwór jest gradientem. Tak więc rozwiązanie gradientu gęstości jest podzielone na 17 gradientów. Na koniec, za pomocą pipety, przenieś frakcje gęstości do sterylnych probówek z próbkami i natychmiast umieść je na lodzie. Analiza śledzenia nanocząstek ujawniła profile wielkości, rozmieszczenia i stężenia pęcherzyków zewnątrzkomórkowych zebranych z różnych frakcji gradientu gęstości. Większość pęcherzyków zewnątrzkomórkowych we wszystkich frakcjach była skoncentrowana w zakresie wielkości od 30 do 100 nanometrów zgodnie z typowym wzorcem rozmieszczenia. Stężenie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych osiągnęło najwyższy poziom we frakcji dziewiątej, osiągając szczyt około 3,85 razy 10 do mocy dziewięciu cząstek na mililitr. Zawartość białka, mierzona za pomocą zestawu kwasu bicinchoninowego, była również najwyższa we frakcji dziewiątej i wynosiła 0,417 mikrograma na mikrolitr. Dodatkowo poziomy ekspresji lipopolisacharydów, określone za pomocą zestawu do wykrywania endotoksyn, były znacznie podwyższone we frakcjach 9 i 10. Większe ilości białka zaobserwowano również we frakcji dziewiątej podczas analizy elektroforezy w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu. Transmisyjna mikroskopia elektronowa lub obrazy TEM ujawniły pęcherzyki zewnątrzkomórkowe posiadające morfologię przypominającą błonę kołową.

separation-differential-characterization-gut-microbial-extracellular

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Źródło: Cian, M. B. et al., Separation of the cell envelope for Gram-negative bacteria into Inner and Outer membrane fractions with Technical Adjustment for Acinetobacter baumannii. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje oddzielenie wewnętrznej i zewnętrznej frakcji błonowej bakterii Gram-ujemnych za pomocą ultrawirowania w gradionym poziomie sacharozy. Frakcje membranowe są oczyszczane i przechowywane w niskich temperaturach w celu ukierunkowanej analizy składników specyficznych dla membrany.

Separacja wewnętrznych i zewnętrznych frakcji błonowych bakterii Gram-ujemnych

Źródło: Watson, D. C., et.al. Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje izolację i koncentrację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pochodzących z zewnętrznej błony genetycznie zmodyfikowanych bakterii. Proces ten obejmuje hodowlę bakterii w celu uwolnienia EV, a następnie sekwencyjne etapy wirowania i filtracji w celu usunięcia komórek i zanieczyszczeń. Wreszcie, ultrafiltracja jest stosowana...

Izolacja i wzbogacanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z błony zewnętrznej od bakterii

Mycobacterium tuberculosis wykazuje zwiększoną produkcję i uwalnianie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w odpowiedzi na warunki niskiego poziomu żelaza. Praca ta szczegółowo opisuje protokół generowania warunków o niskiej zawartości żelaza oraz metody oczyszczania i charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków uwalnianych w odpowiedzi na niedobór żelaza.

Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wytwarzanych przez prątki o ograniczonej zawartości żelaza

Pęcherzyki bakteryjne odgrywają ważną rolę w patogenezie i mają obiecujące zastosowania biotechnologiczne. Niejednorodność pęcherzyków komplikuje analizę i użytkowanie; Dlatego konieczna jest prosta, powtarzalna metoda oddzielania pęcherzyków o różnych rozmiarach. Tutaj pokazujemy zastosowanie chromatografii wykluczania wielkości do oddzielania heterogenicznych pęcherzyków wytwarzanych przez Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

Chromatografia wykluczania wielkości do analizy niejednorodności pęcherzyków błony zewnętrznej bakterii

Bakterie wydzielają nanometrowe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) przenoszące bioaktywne cząsteczki biologiczne. Badania nad EV koncentrują się na zrozumieniu ich biogenezy, roli w interakcjach i chorobach między drobnoustrojami a gospodarzem-mikroorganizmem, a także na ich potencjalnych zastosowaniach terapeutycznych. Przedstawiono proces pracy do skalowalnej izolacji pojazdów elektrycznych od różnych bakterii, aby ułatwić standaryzację badań nad pojazdami elektrycznymi.

Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii

Obecny protokół zawiera szczegółowe opisy izolacji, koncentracji i charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z kultur sinic. Omówiono również podejścia do oczyszczania pęcherzyków z kultur w różnych skalach, kompromisy między metodologiami oraz rozważania dotyczące pracy z próbkami terenowymi.

Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych sinic

Celem jest tutaj nakreślenie protokołu do badania mechanizmów dysbiozy w chorobach sercowo-naczyniowych. W artykule omówiono, jak aseptycznie pobierać i przeszczepiać próbki kału myszy, izolować jelita i stosować metodę "Swiss-roll", a następnie techniki barwienia immunologicznego w celu zbadania zmian w przewodzie pokarmowym.

Izolacja kału myszy i przeszczep mikrobioty

To badanie opisuje metodę izolacji i oczyszczania bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (BEV) wzbogaconych z ludzkiego kału poprzez wirowanie w gradifikacji gęstości (DGC), identyfikuje fizyczne cechy BEV na podstawie morfologii, wielkości cząstek i stężenia, oraz omawia potencjalne zastosowania podejścia DGC w badaniach klinicznych i naukowych.

Izolacja i oczyszczanie bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkiego kału za pomocą wirowania w gradiacji gęstości

W tym artykule opisano: (1) dostarczanie cząsteczek testowych do noworodków już od DOL 6; oraz (2) ocenę ex vivo funkcji bariery nabłonkowej okrężnicy w biopsjach od DOL 10 do młodych odstawianych od odstawienia (DOL 20) poprzez ocenę przepuszczalności parakomórkowej i transkomórkowej za pomocą komór Ussinga.

Oralna gavacja u noworodkowych myszy i funkcjonalna ocena integralności bariery jelitowej za pomocą komór

Interakcje między gospodarzem a mikroorganizmem jelitowym zostały ocenione przy użyciu nowatorskiego podejścia łączącego syntetyczną społeczność doustną, trawienie in vitro przewodu pokarmowego i model nabłonka jelita cienkiego. Przedstawiamy metodę, którą można zaadaptować do oceny inwazji komórek patogenów i biofilmów wielogatunkowych, a nawet do badania przeżywalności preparatów probiotycznych.

Ocena żywotności konsorcjum bakterii syntetycznych na granicy faz gospodarz-mikroorganizm w jelitach in vitro

Poznaj izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych drobnoustrojów jelitowych u szczurów wrażliwych na sól przy diecie bogatej w sól. Metoda gradientu gęstości umożliwia analizę wielkości, morfologii i składu białkowego.

Separacja i charakterystyka różnicowa pęcherzyków zewnątrzkomórkowych drobnoustrojów jelitowych u szczurów wrażliwych na sól w warunkach diety bogatej w sól (Wideo) | JoVE Journal

Separacja i charakterystyka różnicowa pęcherzyków zewnątrzkomórkowych drobnoustrojów jelitowych u szczurów wrażliwych na sól w warunkach diety bogatej w sól

Przeglądaj więcej filmów