Separacja i charakterystyka różnicowa pęcherzyków zewnątrzkomórkowych drobnoustrojów jelitowych u szczurów wrażliwych na sól w warunkach diety bogatej w sól
June 6th, 2025
Protokół opisuje izolację mikrobiologicznych EV jelitowych od wrażliwych na sól szczurów karmionych HSD za pomocą wirowania w gradiacji gęstości. EV scharakteryzowano za pomocą śledzenia nanocząstek, testów TEM, LPS/BCA i sekwencjonowania 16S rRNA w celu analizy wielkości, morfologii, składu i pochodzenia mikrobioty.
Badania te badają rolę pęcherzyków zewnątrzkomórkowych drobnoustrojów jelitowych u wrażliwych na sól szczurów z nadciśnieniem tętniczym na diecie bogatej w sól, badając, w jaki sposób dieta bogata w sól zmienia pęcherzyki i wpływa na interakcje nadciśnieniowe i immunologiczne. Ostatnie postępy w tej dziedzinie obejmują zrozumienie roli pęcherzyków zewnątrzkomórkowych drobnoustrojów jelitowych w nadciśnieniu, ocenę wpływu diety bogatej w sól na różnorodność mikrobiologiczną oraz wdrażanie interwencji roślinnych ukierunkowanych na pęcherzyki w wyniku regulacji metabolicznej i immunologicznej. Obecne wyzwania eksperymentalne obejmują izolowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych o wysokim priorytecie, odróżnianie pęcherzyków pochodnych od pęcherzyków mikrobiomu, minimalizowanie utraty próbki w standardowych protokołach barwienia w celu zapewnienia odtwarzalności we wszystkich badaniach. Ta siatka gęstości i protokół wirowania zapewniają wyższy priorytet pęcherzykom zewnątrzkomórkowym o lepszej integralności i odtwarzalności w porównaniu z tradycyjnymi metodami, umożliwiając bardziej wiarygodne badania mikrobiomu jelitowego pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w badaniach nadciśnienia.
[Narrator] Na początek przenieś pięć gramów kału do wstępnie zważonej 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Dodaj 50 mililitrów podgrzanego PBS wolnego od endotoksyn o temperaturze 37 stopni Celsjusza do probówki i obracaj probówkę przez 30 minut. Schłodzić wirówkę wysokoobrotową do 4 stopni Celsjusza. Następnie umieść próbkę symetrycznie w wirówce i wiruj z prędkością 8 000 G przez 15 minut. Po odwirowaniu odessać supernatant i przenieść go do nowej sterylnej probówki wirówkowej. Po ponownym odwirowaniu przez 15 minut, ostrożnie odessać supernatant i użyć go do dalszej analizy. Umieść sterylny filtr o średnicy 0.22 mikrometra na lodzie. Przenieś supernatant na górną część filtra i włącz pompę próżniową, aby zebrać przefiltrowane próbki. Przenieść filtrat do filtra odśrodkowego o odcięciu 10 kilodaltonów i pojemności 15 mililitrów. Wirować w temperaturze 4 stopni Celsjusza 3000G przez 30 minut, aby zagęścić próbkę do co najmniej 1,400 mikrolitrów. Natychmiast umieścić próbkę na lodzie. Zmieszać jedną objętość buforu gradientowego A z pięcioma objętościami pożywki o gradiencie gęstości, aby przygotować roztwór roboczy. Przygotować 10% roztwór jodiksanolu, mieszając jedną jednostkę roztworu roboczego z czterema jednostkami buforu B. Podobnie, zmieszać dwie jednostki roztworu roboczego z trzema jednostkami buforu B dla 20% roztworu jodiksanolu i czterema jednostkami roztworu roboczego z jedną jednostką buforu B dla 40% roztworu jodiksanolu. Teraz wymieszaj przygotowaną wcześniej zagęszczoną próbkę z siedmioma mililitrami podłoża o gradiencie gęstości, aby uzyskać 50% roztwór jodu. Aby przygotować gradient gęstości, dodaj roztwór błękitu trypanowego do 40% i 10% roztworów jodiksanolu. Przenieś osiem mililitrów 50% roztworu jodu, na dno cienkościennej probówki wirówkowej z polipropylenu. Przechyl rurkę do 70 stopni i przenieś osiem mililitrów 40% roztworu jodiksanolu na powierzchnię cieczy. Następnie dodaj osiem mililitrów 20% roztworu jodu, a następnie siedem mililitrów 10% roztworu jodiksanolu i dwa mililitry PBS wolnego od endotoksyn. Weź przygotowaną rurkę gradientu gęstości i umieść ją we wstępnie schłodzonej ultrawirówce. Ustaw parametry ultrawirowania na 100 000 G 20 godzin i 10 stopni Celsjusza i rozpocznij bieg. W przypadku ręcznej separacji gęstości gradientu dla kolekcji, gradient gęstości wynosi około 34 mililitry cieczy. Dwa mililitry roztworu są powoli ekstrahowane ze środka powierzchni cieczy, a każdy dwumililitrowy roztwór jest gradientem. Tak więc rozwiązanie gradientu gęstości jest podzielone na 17 gradientów. Na koniec, za pomocą pipety, przenieś frakcje gęstości do sterylnych probówek z próbkami i natychmiast umieść je na lodzie. Analiza śledzenia nanocząstek ujawniła profile wielkości, rozmieszczenia i stężenia pęcherzyków zewnątrzkomórkowych zebranych z różnych frakcji gradientu gęstości. Większość pęcherzyków zewnątrzkomórkowych we wszystkich frakcjach była skoncentrowana w zakresie wielkości od 30 do 100 nanometrów zgodnie z typowym wzorcem rozmieszczenia. Stężenie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych osiągnęło najwyższy poziom we frakcji dziewiątej, osiągając szczyt około 3,85 razy 10 do mocy dziewięciu cząstek na mililitr. Zawartość białka, mierzona za pomocą zestawu kwasu bicinchoninowego, była również najwyższa we frakcji dziewiątej i wynosiła 0,417 mikrograma na mikrolitr. Dodatkowo poziomy ekspresji lipopolisacharydów, określone za pomocą zestawu do wykrywania endotoksyn, były znacznie podwyższone we frakcjach 9 i 10. Większe ilości białka zaobserwowano również we frakcji dziewiątej podczas analizy elektroforezy w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu. Transmisyjna mikroskopia elektronowa lub obrazy TEM ujawniły pęcherzyki zewnątrzkomórkowe posiadające morfologię przypominającą błonę kołową.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie bada rolę dodatkowych zewnątrzkomórkowych pęcherzyków mikrobiomu jelitowego (EV) u szczurów nadwrażliwych na sól, karmionych dietą wysokosolną. Badania pokazują, jak dieta wysokosolna zmienia te pęcherzyki i ich wpływ na interakcje nadciśnieniowe i odpornościowe.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Mikrobiologia
- Badania nad nadciśnieniem
Tło
- Dodatkowe zewnątrzkomórkowe pęcherzyki mikrobiomu jelitowego są związane z nadciśnieniem.
- Diety wysokosolne wpływają na różnorodność mikrobiomu i skład pęcherzyków.
- Interwencje oparte na roślinach mogą mieć na celu pęcherzyki dla regulacji metabolicznej i odpornościowej.
- Wyzwania obejmują izolację pęcherzyków EV o wysokim priorytecie i zapewnienie powtarzalności.
Cel badania
- Izolacja dodatkowych zewnątrzkomórkowych pęcherzyków mikrobiomu jelitowego od szczurów nadwrażliwych na sól.
- Zcharakteryzowanie wielkości, morfologii i składu tych EV.
- Analiza pochodzenia mikrobioty EV.
Stosowane metody
- Centrifugacji gradientowej gęstości do izolacji EV.
- Analizy nanocząstek w celu określenia wielkości i koncentracji.
- Mikroskopii elektronowej transmisyjnej (TEM) do oceny morfologii.
- Asawy LPS/BCA i sekwencjonowanie rRNA 16S do analizy składu.
Główne wyniki
- EV były przeważnie w zakresie wielkości od 30 do 100 nanometrów.
- Najwyższa koncentracja EV została znaleziona we frakcji dziewiątej.
- Zawartość białka i poziomy lipopolisacharydów były znacząco podwyższone w określonych frakcjach.
- Zdjęcia TEM potwierdziły okrągłą morfologię przypominającą błonę EV.
Wnioski
- Metoda wirowania gradientem gęstości poprawia integralność EV i powtarzalność.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia interakcji mikrobiomu jelitowego w nadciśnieniu.
- Przyszłe badania mogą skupić się na interwencjach terapeutycznych ukierunkowanych na EV.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Efficient separation and characterization of gut microbial extracellular vesicles (EVs) under high-salt dietary conditions addresses a critical gap in understanding hypertension mechanisms at the molecular level. This workflow enables precise profiling of EVs, supporting predictive confidence in linking microbiome-derived factors to disease-relevant pathways. The approach strengthens early discovery and target validation for microbiome-influenced cardiovascular risk portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of gut microbiota-derived EVs as mechanistic contributors to hypertension.
- Supports biological de-risking by distinguishing microbial from host vesicle populations.
- Facilitates functional target validation through compositional and quantitative EV profiling.
- Improves predictive confidence for prioritizing microbiome-related targets in cardiovascular research.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible EV isolation for downstream molecular and functional assays.
- Delivers quantitative outputs on EV size, concentration, and protein content for assay calibration.
- Enables reliable screening of EV-associated biomarkers or modulators in preclinical models.
- Supports platform reuse for comparative studies across dietary or genetic backgrounds.
Translational & Preclinical Research
- Aligns EV compositional analysis with disease-relevant phenotypes in salt-sensitive hypertension models.
- Enables continuity from discovery to preclinical validation of microbiome-derived risk factors.
- Supports risk-adjusted advancement of microbiome-targeted interventions.
- Provides mechanistic de-risking for translational biomarker development.
Pipeline & Workflow Integration
This density gradient EV isolation method integrates into the discovery-to-preclinical continuum for microbiome-cardiovascular research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on gut microbiota EVs in hypertension pathogenesis.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative EV fractions for downstream molecular and functional assays.
- Analytics: Provides size, concentration, protein, and LPS measurements to compare experimental conditions.
- Translational Research: Links EV compositional shifts to disease phenotypes in preclinical models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized protocol adaptable to diverse microbiome and dietary studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in microbiome-cardiovascular research.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of EV isolation and analysis.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for microbiome-targeted discovery programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of microbiome-derived targets and biomarkers.
Implementation Considerations
- Requires expertise in density gradient centrifugation and nanoparticle analytics.
- Needs access to ultracentrifugation, nanoparticle tracking, and molecular characterization platforms.
- Demands cross-team standardization for reproducible EV isolation and quantification.
- Adaptable to various preclinical models and dietary interventions with protocol optimization.
- Sample loss and vesicle integrity must be managed to ensure reliable outputs.
